JPWO2008140060A1 - 活性化プロテアーゼインジケーター - Google Patents
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Abstract
Description
なお、前記の活性化プロテアーゼインジケーターを発現する発現ベクターが、プロテアーゼ活性化をモニターするためのプロテアーゼ活性化インジケーターを発現することは本発明の一態様である。
1-1.プラスミドの構築
大腸菌DH5・/SUB>株を宿主に用いて全てのプラスミドを構築した。DnaEのC末端断片cDNAをPCRにより開始コドンと酵素部位BamHIおよびMunIをそれぞれ導入した。FlucのC末端断片(399-550aa)cDNAをSalI部位を用いてFlucのN末端断片(2-416aa)のcDNAに繋ぎ、MunIおよびHindIII部位をこのキメラDNAの5'-ならびに3'-末端にそれぞれ導入した。DnaEのN末端断片cDNAをPCRによりPEST配列と酵素部位HindIIIおよびXhoIを導入した。PCR産物はDNAシーケンサーABI prism 310(PE Biosystems, Tokyo, Japan)を用いて配列解析し、忠実性を確認した。これらの断片を結合させ、発現ベクターpcDNA3.1(+)(Invitrogen, Carlsbad, CA)中のBamHIとXhoI部位にサブクローニングした。カスパーゼ-3 cDNAは高橋良輔氏
(RIKEN, Japan)からの供与を受けた。pRL-TKはPromega Co.(Madison, WI)より入手した。pX8lucは既報(Kanno, A. et al. (2006) Anal. Chem. 78, 556-60)に従って構築した。
HeLaならびにCOS-7細胞の培養は、10%ウシ胎児血清(FBS)(Gibco BRL)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco BRL)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(Gibco BRL, Rockville, MD)中、5% CO2、37条件下で行った。MCF-7細胞の培養は、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL)、0.1 mM非必須アミノ酸溶液(Gibco BRL)を添加した基礎培地(Gibco BRL)中、5% CO2、37条件下で行った。細胞へのcDNAのトランスフェクションは、TransIT-LT1試薬(Mirus Bio Co. Madison, WI)を用いて行った。
COS-7細胞にpcFluc-DEVDをトランスフェクションし、48時間にわたり培養した。細胞はスタウロスポリン(STS; Sigma, St. Louis, MO)を用いて刺激し、溶解緩衝液(1% SDS、10%グリセロール、10% 2-メルカプトエタノール、0.001%ブロモフェノールブルー、50 mM Tris/HCl、pH 6.8)中で細胞破砕した。試料は10% SDSポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜(Hybond-ECL, GE Healthcare, Buckinghamshire, England)上に転写した。ポリクローナル抗ルシフェラーゼ抗体(Promega)を用いてFlucを検出し、免疫反応性の評価は抗ヤギIgG抗体に結合させた西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Promega)を用いて行った。HRP活性の可視化は、ECL advance western blotting detection kit(GE Healthcare)を用いて、LAS-1000 plus image analyzer(Fuji Film Co., Tokyo, Japan)により行った。
COS-7またはHeLa細胞にpcFluc-DEVDとpRL-TKをトランスフェクションし、48時間にわたり培養した。この細胞をSTSまたはカスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-FMKで処理し、既報(Ozawa, T. et al. (2001) Anal. Chem. 73, 2516-21;Kanno, A. et al. (2006) Anal. Chem. 78, 556-60)のとおりルシフェラーゼ活性を測定した。FlucならびにRenilla reniformisルシフェラーゼ(Rluc)活性の測定時間は20秒であった。Flucからの発光(LF)をRlucからの発光(LR)に対して正規化した値を相対発光単位と名付けた(RLU; RLU=LF/LR)。全ての測定はMiniLumat LB9506ルミノメーター(Berthold GmbH & Co. KG, Wildbad, Germany)を用いて行い、培養プレートの異なるウェルを用いて3重に測定した。結果は溶媒(0.1% DMSO)で処理した細胞のRLU値に対するRLU値の平均比率として、標準偏差と共に示した。
10 cm皿中でHeLa細胞にpcFluc-DEVDをトランスフェクションし、24時間にわたり培養した。細胞をはぎ取り、5個の3 cm皿に取り分け、24時間にわたり培養した。培地を、500 ・ D-ルシフェリンと5% FBSを含むハンクス平衡塩類溶液(Gibco)に置換した。5個の3 cm皿をフォトカウンター(CRONOS, ATTO, Tokyo, Japan)にセットしてから、STSまたはアクチノマイシンD(ActD, Sigma)を用いて細胞を刺激した。蛍光強度の測定を、皿ごとに累積時間45秒で5分ごとに行った。
HeLa細胞にpX8lucまたはpcFluc-DEVDをトランスフェクションし、48時間にわたり培養した。緩衝液セルスクレイパーで細胞を回収し、リン酸緩衝液(PBS)中に懸濁し、1.0 x 106個の細胞を、BALB/c-ヌードマウス(メス、5週齢、体重約17〜20 g)の背中の異なる2箇所の部位に移植した。細胞の移植後にDMSOに溶かしたSTSを腹腔内注射した。すぐにD-ルシフェリン(600 mg/kg体重)を含むPBS緩衝液を腹腔内注入し、CCDカメラ(IVIS200 system, Xenogen, Alameda, CA)を用いてマウスの発光測定を行った。移植細胞から放射されたフォトンを収集し、1分間にわたり積算した。画像処理はLIVING IMAGEソフトウェア(Xenogen)を用いて行った。測定した発光を定量するため、細胞移植領域から興味の対象となる領域を抜き出し、発光強度(フォトン・秒-1・cm-2)を評価した。
2-1.カスパーゼ-3活性検出に用いる環状ルシフェラーゼの設計
Flucの結晶構造によるとルシフェラーゼは折り畳まれて2個の緻密な領域、すなわち大きなN末端領域と小さなC末端領域、とになる(図1B)(Conti, E. et al. (1996) Structure. 4, 287-98)。これらの領域は大きな裂け目により分割されており、その中にFlucの活性中心が位置している。結晶構造中に位置するFlucのN末端とC末端はあまり近接していない(Asp3とLys544残基間の距離が約4 nm)。FlucのN末端とC末端はいずれも活性中心の裏側の同じ面に位置している。本実施例では、Flucの構造情報を元に、カスパーゼ-3の基質配列であるDEVDによってFlucのN末端とC末端が結合しており、その結果Fluc活性が大きく減弱していると考えた。N末端とC末端を結合させるため、ここではSynechocystis sp. PCC6803に由来するもともと分割しているDnaEインテイン(Wu, H. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 9226-31)を選んだが、その理由は、このDnaEインテインにより高収率で環状ペプチドやタンパク質が得られることが既に報告されているからである(Scott, C. P. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 13638-43;1Scott, C. P. et al. (2001) Chem. Biol. 8, 801-15;Nichols, N. M. & Evans, T. C., Jr. (2004) Biochemistry. 43, 10265-76;Evans, T. C., Jr. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 9091-4)。DnaEのC末端とN末端の断片をルシフェラーゼのC末端とN末端にそれぞれ結合させた(図2)。またPEST配列はタンパク質の分解を加速することが知られているが(Rogers, S. et al. (1986) Science. 234, 364-8; Ghoda, L. et al. (1989) Science. 243, 1493-5)、これを融合DNAのC末端に接続した。このPEST配列によってタンパク質スプライシングを受けていない未反応物のみが分解することになる一方、環状FlucはこのPEST配列を保有していない。結果的に環状Flucのみが細胞内に蓄積する。カスパーゼ-3が環状Flucを発現している細胞内で活性化されれば、それは活性型に変化して発光活性を回復する。従って、環状Flucを発現する細胞は、発光シグナルに基づいてカスパーゼ-3活性をモニターすることを可能とする。
pcFluc-DEVDから発現された融合タンパク質がタンパク質スプライシングにより環状Flucを産生しているかどうかを評価するため、ここではCOS-7細胞にpcFluc-DEVDをトランスフェクションし、48時間にわたってキメラタンパク質を一過性発現させた。タンパク質スプライシングを受けた生成物をウエスタンブロットにより調べた(図3)。アポトーシスを誘導するためにここではアポトーシス誘導試薬のスタウロスポリン(STS)を用いたが、これはカスパーゼ-3によるDEVDアミノ酸配列分解のきっかけになる物質である。細胞内のカスパーゼ-3活性の確認は、DEVD配列を含むポリADPリボースポリメラーゼ(PARP)をブロッティングすることにより行った。STS非存在下の細胞破砕物において、60 kDa付近に2種類の成分がルシフェラーゼ抗体により認識されたが、その主要生成物の分子量は環状Flucに対応しており、もう一つの生成物の分子量より大きかった。STSの存在下でルシフェラーゼ抗体は直鎖状Flucに対応する低分子量の生成物を強く認識したが、高分子量の生成物は非常に弱かった。直鎖状Flucの形成はSTS濃度に依存していた(図4)。この結果から直鎖状Flucはカスパーゼ-3の活性化により生じ、環状のDEVD配列が消化されたことが示される。
2-3.カスパーゼ-3活性のリアルタイムin vitro分析
細胞外刺激に応じたカスパーゼ-3活性化に必要とされる時間は、化学物質のタイプと濃度により変化することが知られている。スクリーニング時間を決定するためにはアポトーシス薬剤を用いた刺激後にカスパーゼ-3活性が最大反応を生じる時間を知ることが重要である。本実施例では、以下の一連の実験で生細胞内におけるカスパーゼ-3活性のリアルタイム分析を示す。まずHeLa細胞内で環状Flucインジケーターを一過的に発現させ、各種濃度のSTSを用いた刺激に応じて5分ごとに時間経過に沿った発光強度をモニターした(図9)。細胞は最初25分間にわたり発光シグナルのゆるやかな増加を示した。発光の増加率はSTSの濃度に依存していた。発光シグナルはSTSによる刺激後100分の時点で最大反応に達することが分かったが、特筆すべきことにシグナルは徐々に減少した。この発光シグナルの減少は、HeLa細胞中でのタンパク質分解による活性ルシフェラーゼの減弱を示している。環状Flucを含むHeLa細胞を強力な抗腫瘍剤であるアクチノマイシンD(ActD)を用いて刺激した場合にも、発光シグナルは同様に25分から120分まで増加して徐々に減少した(図10)。これらの全てのデータから、最大の発光を示す時間は化学物質を用いた刺激後およそ120分間であり、これが化学物質のハイスループットスクリーニングを行う場合に最も適した時間となる。
2-4.生体マウス中でのカスパーゼ-3活性のリアルタイムin vivoイメージング
環状Flucのさらなる応用を示すため、ここではこのインジケーターを用いて生体マウスの臓器内における化学物質の分布を調べ、またカスパーゼ-3活性に対する影響を定量した。一般的な関心としては、化学物質と薬剤候補物質が血流により標的臓器に運ばれるかどうか、マウスが物質に曝露された時に臓器内にその物質が豊富であるかまたは代謝されているか、また標的臓器内でその物質が実際にカスパーゼ-3活性に影響しているかどうかという問題が挙げられる。今回の生物発光イメージング技術を用いてこのような情報を得ることが可能である。
(%)=LumR/LumLとした。この計算ではトランスフェクション効率、移植細胞の分解、マウス循環中の注入D-ルシフェリン量などの実験条件に見られるばらつきは排除されている。図12に示すのはRLUの時間的変化であり、表示時点における生物発光イメージを元に評価したものである。STSの腹腔内注射の2時間後に、RLU比率はSTSによる刺激前のバックグラウンドRLUと比較して約300〜400%という最大値に達した。従って外因性化学物質を用いた刺激時のカスパーゼ-3活性が、環状Flucを用いた光学的イメージングによりリアルタイムにうまく検出された。
3.考察
本実施例では、タンパク質スプライシングにより生成された環状Flucという、遺伝子コードされた新規のインジケーターを用いて、in vitroならびにin vivoでカスパーゼ-3活性を検出する方法を示した。このインジケーターを用いた細胞ベースのセンシング方法によって、細胞外刺激に応答するカスパーゼ-3活性の程度を定量的かつリアルタイムに測定することができた。さらに環状Flucインジケーターによって、生体マウス内におけるカスパーゼ-3活性を時間依存的な方法で非侵襲的にイメージングすることが出来た。
な利点になる。
またFlucをレポーターとして用いたNF-鵤シグナル伝達の検出が報告されており、ここでFlucはI鵤痰ノ結合し、ユビキチン修飾後にタンパク質分解されている(Gross, S. & Piwnica-Worms, D. (2005) Nat. Methods. 2, 607-14)。従って環状Flucをタンパク質スプライシングにより作り出す方法は、方法論的に独自のものであり、これを用いて他のプロテアーゼを検出するためのルシフェラーゼインジケーターをさらに設計することが可能である。
Claims (11)
- ルシフェラーゼのCハーフ断片(Luc-C)とルシフェラーゼのNハーフ断片(Luc-N)とがプロテアーゼ基質ペプチドによって連結された環状体であり、プロテアーゼによる基質ペプチドの切断によって、Luc-NとLuc-Cが活性化ルシフェラーゼを再構成することを特徴とする活性化プロテアーゼインジケーター。
- プロテアーゼ活性化をモニターするためのプロテアーゼ活性化インジケーターであることを特徴とする請求項1に記載の活性化プロテアーゼインジケーター。
- 請求項1記載の活性化プロテアーゼインジケーターを発現する発現ベクターであって、発現カセット内に、Luc-CをコードするDNA、Luc-NをコードするDNA、基質ペプチドをコードするDNA、インテインのCハーフ断片(Int-C)をコードするDNA、インテインのNハーフ断片(Int-N)をコードするDNAを含むことを特徴とする発現ベクター。
- 前記活性化プロテアーゼインジケーターが、細胞におけるプロテアーゼ活性化をモニターするためのプロテアーゼ活性化インジケーターであることを特徴とする請求項3に記載の発現ベクター。
- 発現カセットが、5’から3’方向に、Int-CをコードするDNA、Luc-CをコードするDNA、基質ペプチドをコードするDNA、Luc-NをコードするDNA、Int-NをコードするDNAの順番で連結されている請求項3の発現ベクター。
- 発現カセット内の5’側または3’側に、PEST配列をコードするDNAが連結されている請求項3の発現ベクター。
- in vitroのアッセイ系または細胞内において活性化プロテアーゼを検出する方法であって、
請求項1に記載の活性化プロテアーゼインジケーターをin vitroのアッセイ系または細胞内に導入し、
基質ペプチドが分解された際に生じる活性化ルシフェラーゼのシグナルを測定することを特徴とする活性化プロテアーゼ検出方法。 - 請求項3の発現ベクターを細胞内に導入し、この発現ベクターから、インテインのタンパク質スプライシングによって最終的に環状化した請求項1に記載の活性化プロテアーゼインジケーターを発現させることによって、細胞内に活性化プロテアーゼインジケーターを導入することを特徴とする請求項7に記載の活性化プロテアーゼ検出方法。
- in vitroのアッセイ系または細胞内においてプロテアーゼの活性化に影響を及ぼす因子をスクリーニングする方法であって、
請求項1に記載の活性化プロテアーゼインジケーターを不活性化プロテアーゼ及び/又は活性化プロテアーゼを含有するin vitroのアッセイ系または細胞内に導入し、このin vitroのアッセイ系またはこの細胞に候補因子を接触させる工程を含み、
候補因子の接触前後で、基質ペプチドが分解された際に生じる活性化ルシフェラーゼのシグナルを測定し、
シグナルが増加した場合には候補因子がプロテアーゼを活性化させる因子であると判定し、
シグナルが減少した場合には候補因子がプロテアーゼを不活性化させる因子であると判定することを特徴とするスクリーニング方法。 - 請求項3の発現ベクターを細胞内に導入し、この発現ベクターから、インテインのタンパク質スプライシングによって最終的に環状化した請求項1に記載の活性化プロテアーゼインジケーターを発現させることによって、細胞内に活性化プロテアーゼインジケーターを導入することを特徴とする請求項9に記載のスクリーニング方法。
- 活性化プロテアーゼを検出するキットであって、
請求項1に記載の活性化プロテアーゼインジケーターまたは請求項3に記載の発現ベクターを含有することを特徴とするキット。
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