JP2022123828A - 発光酵素活性を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】分子量が小さい新たな発光酵素を提供する。【解決手段】発光酵素活性を有する、（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸残基が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列。【選択図】図１

Description

本発明は、発光酵素活性を有するポリペプチドに関する。

基礎生物学分野、診断技術、検査技術において、標的タンパク質を検出するためにレポータータンパク質として発光酵素が利用される。レポータータンパク質としては、発光酵素の他に、蛍光タンパク質、蛍光色素、ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ、ペルオキシダーゼ等が汎用されている。蛍光タンパク質、蛍光色素およびｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔは、蛍光強度が高いものの、励起光が必要であるため、（１）細胞への光毒性がある、（２）励起光スペクトルが蛍光スペクトルに重なり、Ｓｉｇｎａｌ／Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ比が低くなりやすく、微量検出に不適である、（３）検出器に励起光照射機および分光フィルターを内蔵する必要がある等の短所があった。発光酵素は励起光を要しないため、上記の短所がない。また、発光酵素による検出はペルオキシダーゼ等を利用した比色法よりも微量検出に適している。

これまでに、発光酵素として野生型ホタル由来発光酵素（ＦＬｕｃ）、ＮａｎｏＬｕｃ、ＴｕｒｂｏＬｕｃ、カイアシ類（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）由来発光酵素（ＧＬｕｃ）、ウミシイタケ科（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来発光酵素（）、カイアシ類（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）由来発光酵素（ＭＬｕｃ）が報告されている。特開２０１４－１００１３７号公報（特許文献１）および国際公開第２０１７／０５７７５２号（特許文献２）には、カイアシ類の発光酵素のアミノ酸配列から頻出アミノ酸を選定して作製した人工発光酵素（Ａｌｕｃ）が開示されている。

特開２０１４－１００１３７号公報 国際公開第２０１７／０５７７５２号

発光酵素と標的タンパク質との融合タンパク質を細胞内で発現させる場合、発光酵素が大きいと、融合タンパク質が正常に発現しなかったり、立体障害により標的タンパク質が正常に機能しないことがある。また、サイズが大きい発光酵素は、発光値が低分子化合物の影響を受けやすいことが報告されており、薬剤スクリーニングに適さない。生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を利用して分子間相互作用の解析を行う場合、シグナルの強度は、発光酵素と蛍光タンパク質との間の距離の６乗に反比例するため、発光酵素が小さい方がシグナルが強くなる。

従って、発光酵素のサイズが小さいことは、発光酵素の利用に際して有用である。本発明は、分子量が小さい新たな発光酵素を提供することを目的とする。

本発明は、発光酵素活性を有する、（Ａ）または（Ｂ）に記載のポリペプチドに関する。
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸残基が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列。

本発明によれば、分子量が小さい発光酵素が提供される。

実施例において作製したＡＬｕｃ３０の変異体の構造を示す図である。 ｐｉｃＡＬｕｃ３０とｐｉｃＡＬｕｃ１６とのアミノ酸配列同一性を示す図である。 ｐｉｃＡＬｕｃ３０とｐｉｃＡＬｕｃ４８とのアミノ酸配列同一性を示す図である。 ｐｉｃＡＬｕｃ４８とｐｉｃＡＬｕｃ１６とのアミノ酸配列同一性を示す図である。 実験２において、ｐｉｃＡＬｕｃの発光値を示すグラフである。エラーバーは±１ ＳＤ（ｎ＝３）を示す。 ｐｉｃＡＬｕｃ３０の立体構造を示す図である。 実験４において、ΔｌｏｏｐＮ１の発光値を示すグラフである。 実験５において、発光酵素に基質としてセレンテラジン（０．５μＭ）を添加したときの発光値を示すグラフである。エラーバーは±１ ＳＤ（ｎ＝３）を示す。 実験５において、発光酵素に基質としてセレンテラジン（５μＭ）を添加したときの発光値を示すグラフである。エラーバーは±１ ＳＤ（ｎ＝３）を示す。 実験５において、発光酵素に基質としてセレンテラジンｈ（５μＭ）を添加したときの発光値を示すグラフである。エラーバーは±１ ＳＤ（ｎ＝３）を示す。 実験５において、発光酵素に基質としてセレンテラジンｈ（２５μＭ）を添加したときの発光値を示すグラフである。エラーバーは±１ ＳＤ（ｎ＝３）を示す。 実験５において、発光酵素に基質としてフリマジンを添加したときの発光値を示すグラフである。エラーバーは±１ ＳＤ（ｎ＝３）を示す。 実験５において、発光酵素に基質としてフリマジンを添加したときの発光値を示すグラフである。エラーバーは±１ ＳＤ（ｎ＝３）を示す。 実験６において、上清中の酵素タンパク質をウエスタンブロットにより検出した図である。左の図はｆｌａｇ－ｔａｇを、右の図はＨｉｓ－ｔａｇを検出した。 実験７において、発光酵素に基質としてセレンテラジンを添加したときの比活性を示すグラフである。 実験７において、発光酵素に基質としてセレンテラジンｈを添加したときの比活性を示すグラフである。 実験８において、発光酵素に基質としてセレンテラジンを添加したときの発光スペクトルを示す図である。 実験８において、発光酵素に基質としてセレンテラジンｈを添加したときの発光スペクトルを示す図である。 実験９において、分泌発現させたｐｉｃＡＬｕｃの熱処理後の発光値を示すグラフである。 実験１０において、分泌発現させたｐｉｃＡＬｕｃおよび大腸菌発現させたｐｉｃＡＬｕｃの発光値を示すグラフである。 実験１０において、大腸菌発現させたｐｉｃＡＬｕｃの熱処理後の発光値を示すグラフである。エラーバーは±１ ＳＤ（ｎ＝３）を示す。 実験１１において使用したプラスミドマップを示す図である。 実験１１において、ＮａｎｏＬｕｃとＹＦＰとの融合タンパク質に基質としてセレンテラジンｈを添加したときのスペクトルを示す図である。 実験１１において、ｐｉｃＡＬｕｃ３０とＹＦＰとの融合タンパク質に基質としてセレンテラジンｈを添加したときのスペクトルを示す図である。 実験１１において、ＮａｎｏＬｕｃとＹＦＰとの融合タンパク質のＢＲＥＴシグナルを示す図である。 実験１１において、ｐｉｃＡＬｕｃ３０とＹＦＰとの融合タンパク質のＢＲＥＴシグナルを示す図である。

＜ポリペプチド＞
本発明に係るポリペプチドは、発光酵素活性を有する。発光酵素（ルシフェラーゼ）とは、発光基質（ルシフェリン）を酸化する酵素であり、その酸化過程において発光を生ずる。本明細書における発光酵素活性とは、発光酵素と基質による酵素反応の活性を表し、基質が発光酵素との酵素反応によって励起状態になった後、基底状態に戻る際に発する光（発光スペクトル）を検出することによって測定される。基底状態に戻る際に発する光は、公知のルミノメーター（例えばＰｒｏｍｅｇａ社製、「ＧｌｏＭａｘ」シリーズ）、または分光光度計（例えばＴＥＣＡＮ社製、「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯ」）を用いて検出することができる。特定の波長での強度を毎分計測することで、発光の経時的変化およびその安定性を検出できる。発光の長波長へのシフトは、全波長を測定することにより検出することができる。

発光酵素活性の至適ｐＨおよび至適温度は、公知の発光酵素（例えばカイアシ類の発光酵素または人工発光酵素）と同じであってよい。発光酵素活性は、好ましくはカイアシ類の発光酵素活性と同じである。発光酵素活性の至適ｐＨは５．０～８．０であり、好ましくはｐＨ７．０であり、至適温度は４℃～３０℃であり、好ましくは２５℃である。

発光基質は特に限定されず、発光酵素に合わせて適宜選択すればよい。発光基質は、セレンテラジン系、ホタルルシフェリン系、ウミホタルルシフェリン系、フリマジン等公知の基質であってよいが、好ましくはセレンテラジン系の基質である。セレンテラジン系の基質としては、天然型のセレンテラジン、セレンテラジンｉｐ、セレンテラジンｉ、セレンテラジンｈｃｐ、セレンテラジン４００Ａ、セレンテラジン、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｎ等が挙げられる。発行基質は、好ましくはセレンテラジンまたはセレンテラジンｈを含む。

本発明に係るポリペプチドの一態様は、
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を含む。

本発明に係るポリペプチドの一態様は、
（Ａ１）配列番号１に示されたアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が１４０個以下であってもよい。本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸残基からなってもよい。

（Ａ２）本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸残基を含み、ポリペプチドの分子量が２０ｋＤａ以下であってもよい。

本発明に係るポリペプチドの一態様は、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸残基が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列を含む。

本発明に係るポリペプチドの一態様は、
（Ｂ１）配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～２２１位のアミノ酸残基を含み、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列であってよい。本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～２２１位のアミノ酸残基からなり、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたポリペプチドであってもよい。

本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損していてもよく、７０位～７４位のアミノ酸残基の全てが欠損していてもよい。

本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の１４６位～１５６位のアミノ酸残基が、好ましくは２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上または７個以上欠損している。欠損した部位に１～数塩基のリンカー配列が挿入されていてもよい。本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の１４６位～１５６位の間のアミノ酸残基数が６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下または０個であってもよい。

本発明に係るポリペプチドの分子量は、好ましくは２０ｋＤａ以下であり、より好ましくは１８ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは１５ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは１４ｋＤａ以下であり、特に好ましくは１３ｋＤａ以下である。本発明に係るポリペプチドの分子量は、例えば１０ｋＤａ以上である。

本発明に係るポリペプチドのアミノ酸残基数は、例えば１６０個以下であり、好ましくは１５５個以下、１５０個以下、１４６個以下、１４３個以下、１４０個以下、１３６個以下、１３３個以下、１３０個以下、１２６個以下、１２３個以下、１２２個以下、１２１個以下、１２０個以下、１１９個以下、１１８個以下、１１７個以下である。本発明に係るポリペプチドのアミノ酸残基数は、例えば１００個以上である。

配列番号１中のＸａａで表されるアミノ酸のうち、３，２０－２９，３１，３２，３５，３７，６４－６６，６９，７６－７７，８５－８６，８９－９０，１２９，１４０－１４４，１４８－１５１，１５９，１６１，１８８，１９１，２０２，２０６位のアミノ酸残基はどのようなアミノ酸であってもよい。このうち、２２－２３，３９－４０，７６－７７，１４０，１４８－１５１位のアミノ酸残基は欠失していてもよい。好ましくは、３位のアミノ酸残基がＥまたはＧであり、２０－２９位のアミノ酸残基がＰＴＥＮＫＤＤＩ配列（２残基欠失、配列番号２），ＡＴＩＮＥＥＤＩ配列（２残基欠失、配列番号３），ＡＴＩＮＥＮＦＥＤＩ配列（配列番号４），ＨＨＨＨＨＨＨＨ配列（２残基欠失、配列番号５），ＥＫＬＩＳＥＥ配列（２残基欠失、配列番号６），ＭＭＹＰＹＤＶＰ配列（２残基欠失、配列番号７）またはＭＭＤＹＫＤＤＤ配列（２残基欠失、配列番号８）であり、３１位のアミノ酸残基がＩ，Ｌ，ＹまたはＫであり、３２位のアミノ酸残基がＶまたはＡであり、３５位のアミノ酸残基がＥまたはＧであり、３７位のアミノ酸残基がＫまたはＳであり、６４－６６位のアミノ酸残基がＡＮＳ配列またはＤＡＮ配列であり、６９位のアミノ酸残基がＤまたはＧであり、７６－７７位のアミノ酸残基がＧＧ配列若しくはＫ（１残基欠失）であるかまたは欠失していてもよく、８５－８６位のアミノ酸残基がＬＥ，ＫＡまたはＫＥ配列であり、８９－９０位のアミノ酸残基がＫＥ配列，ＩＥ配列，ＬＥ配列またはＫＩ配列であり、１２９位のアミノ酸残基がＥ，ＧまたはＡであり、１４０－１４４位のアミノ酸残基がＴＥＥＥＴ配列（配列番号９），ＧＥＡＩ配列（１残基欠失、配列番号１０）またはＶＧＡＩ配列（１残基欠失、配列番号１１）であり、１４８－１５１位のアミノ酸残基がＧＶＬＧ配列（配列番号１２）もしくはＩ（３残基欠失）であるかまたはすべて欠失してもよく、１５９位のアミノ酸残基がＤ，Ｅ，Ｎ，Ｆ，ＹまたはＷであり、１６１位のアミノ酸残基がＥ，ＡまたはＬであり、１８８位のアミノ酸残基がＫ，Ｆ，ＹまたはＷであり、１９１位のアミノ酸残基がＤ，Ａ，Ｎ，Ｆ，ＹまたはＷであり、２０２位のアミノ酸残基がＡまたはＫであり、２０６位のアミノ酸残基はＳ，Ｄ，Ｎ，Ｆ，ＹまたはＷである。

配列番号１の１３，１６，１７４，２１８位のアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸（例えば、Ｖ，Ｆ，Ａ，Ｌ，Ｉ，Ｇ。）であって、好ましくは、１３位のアミノ酸残基がＶまたはＦであり、１６位のアミノ酸残基がＶまたはＡであり、１７４位のアミノ酸残基がＶまたはＡであり、２１８位のアミノ酸残基がＡまたはＬである。

配列番号１の５，６７，７５，１０１，１１９，２１４位のアミノ酸残基は、親水性アミノ酸（例えばＱ，Ｋ，Ｄ，Ｒ，Ｈ，Ｅ，Ｔ。）であって、好ましくは、５位のアミノ酸残基がＱまたはＫであり、６７位のアミノ酸残基がＤまたはＲであり、７５位のアミノ酸残基がＫ，Ｈ，ＲまたはＥであり、１０１位のアミノ酸残基がＴまたはＨであり、１１９位のアミノ酸残基がＫ，ＥまたはＱであり、２１１位のアミノ酸残基がＫまたはＴである。

配列番号１の４，６，７，１０，１１，１５，３３，３４，３９－４１，６３，６８，７４，７８，８３，１３７，１６０，２０３位のアミノ酸残基は、脂肪族アミノ酸である。ただし、３９，４０，７０位のアミノ酸残基は、欠失していてもよい。４，６，７，１０，１１，１５，３４，６３，７８，８３，１６０位のアミノ酸残基は、好ましくは高分子量脂肪族アミノ酸（例えば、Ｉ，Ｖ，Ｌ，Ｍ。）であるが、低頻度に低分子量脂肪族アミノ酸が入る場合もある。より好ましくは、４位のアミノ酸残基がＩまたはＶであり、６位のアミノ酸残基がＶまたはＬであり、７位のアミノ酸残基がＬまたはＩであり、１０位のアミノ酸残基がＬまたはＶであり、１１位のアミノ酸残基がＩまたはＬであり、１５位のアミノ酸残基がＬまたはＶであり、３４位のアミノ酸残基がＩまたはＶであり、６３位のアミノ酸残基がＬまたはＶであり、７８位のアミノ酸残基がＬまたはＭであり、８３位のアミノ酸残基がＬまたはＭであり、１６０位のアミノ酸残基がＬまたはＭである。３３，３９－４１，６８，７４，１３７，２０３位のアミノ酸残基は、好ましくは低分子量脂肪族アミノ酸（例えば、Ａ，Ｇ，Ｔ）であるが、低頻度に高分子量脂肪族アミノ酸が入る場合もある。より好ましくは、３３位のアミノ酸残基がＧ，ＬまたはＡであり、３９位のアミノ酸残基がＧもしくはＡであるかまたは欠失していてもよく，ＳまたはＦであり、４０位のアミノ酸残基がＴであるかまたは欠失していてもよく、４１位のアミノ酸残基がＴまたはＡであり、６８位のアミノ酸残基がＡまたはＧであり、７４位のアミノ酸残基がＧであるかまたは欠失していてもよく、１３７位のアミノ酸残基がＧまたはＡであり、２０３位のアミノ酸残基がＴまたはＧである。

配列番号１の７２，７３，９７，１１０位のアミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸。例えば、Ｋ，Ｒ，Ｈ。）である。ただし、７２位および７３位のアミノ酸残基は、欠失していてもよい。好ましくは、７２位および７３位のアミノ酸残基がＲであるかまたは欠失していてもよく、９７位のアミノ酸残基がＫまたはＲであり、１１０位のアミノ酸残基がＨまたはＫである。

配列番号１の６２位および２１１位のアミノ酸残基は、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸。例えば、Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ。）であり、好ましくは、６２位のアミノ酸残基がＮまたはＤであり、２１１位のアミノ酸残基がＱまたはＥである。

配列番号１に示されたアミノ酸配列を有する発光酵素の具体例として、ＡＬｕｃ１０（配列番号１３），ＡＬｕｃ１５（配列番号１４），ＡＬｕｃ１６（配列番号１５），ＡＬｕｃ１７（配列番号１６），ＡＬｕｃ１８（配列番号１７），ＡＬｕｃ１９（配列番号１８），ＡＬｕｃ２１（配列番号１９），ＡＬｕｃ２２（配列番号２０），ＡＬｕｃ２３（配列番号２１），ＡＬｕｃ２４（配列番号２２），ＡＬｕｃ２５（配列番号２３），ＡＬｕｃ２６（配列番号２４），ＡＬｕｃ２７（配列番号２５），ＡＬｕｃ２８（配列番号２６），ＡＬｕｃ２９（配列番号２７），ＡＬｕｃ３０（配列番号２８），ＡＬｕｃ３１（配列番号２９），ＡＬｕｃ３２（配列番号３０），ＡＬｕｃ３３（配列番号３１）、ＡＬｕｃ３４（配列番号３２）、ＡＬｕｃ４１（配列番号３３）、Ａｌｕｃ４２（配列番号３４）、ＡＬｕｃ４３（配列番号３５）、Ａｌｕｃ４４（配列番号３６）、ＡＬｕｃ４５（配列番号３７）、Ａｌｕｃ４６（配列番号３８）、ＡＬｕｃ４７（配列番号３９）、ＡＬｕｃ４８（配列番号４０）、ＡＬｕｃ４９（配列番号４１）、Ａｌｕｃ５０（配列番号４２）、ＡＬｕｃ５１（配列番号４３）、Ａｌｕｃ５２（配列番号４４）、ＡＬｕｃ５３（配列番号４５）、ＡＬｕｃ５５（配列番号４６）、Ａｌｕｃ５６（配列番号４７）、ＡＬｕｃ５７（配列番号４８）等が挙げられる。配列番号１に示されたアミノ酸配列を有する発光酵素は、１位～１９位（分泌シグナル）、２０位～３１位（抗原認識部位等）、２１７位～２２１位（ＧＳリンカー配列）のアミノ酸残基の一部または全部が欠損していてもよい。

配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち１－７１位の領域として、配列番号４９に示すアミノ酸配列を有してもよい。この配列を有する発光酵素の典型例として、ＡＬｕｃ１５，ＡＬｕｃ１６，ＡＬｕｃ１７，ＡＬｕｃ１８，ＡＬｕｃ２４が挙げられる。

配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち１－１５７位の領域として、配列番号５０に示すアミノ酸配列を有してもよい。この配列を有する発光酵素の典型例として、ＡＬｕｃ２２，ＡＬｕｃ２５，ＡＬｕｃ２６，ＡＬｕｃ２７，ＡＬｕｃ２８，ＡＬｕｃ２９が挙げられる。

本発明に係るポリペプチドによれば、発光酵素のサイズを小さくすることができる。小さい発光酵素であれば、発光酵素と、標的タンパク質または抗体等との融合タンパク質を細胞内で発現させた場合、融合タンパク質が正常に発現しやすく、また、標的タンパク質が正常に機能しない可能性を下げることができる。小さい発光酵素は、発光値が低分子化合物の影響を受けにくいため、薬剤またはリガンドスクリーニングのレポータータンパク質に好適に用いることができる。生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を利用して分子間相互作用の解析を行う場合にも、小さい発光酵素を用いれば、強いシグナルを検出することができる。小さい発光酵素は、分泌型の発光酵素に用いられ得る。分泌型の発光酵素によれば、発光値の測定のために細胞を溶解する必要がなく、遺伝子発現の経時的変化を測定することができる。小さい発光酵素は、細胞内で発現しやすいため、大量の発現および精製を行うことができる。小さい発光酵素は、様々な発現系で発現が可能である。また、小さい発光酵素は、構造安定性にも優れる。

本発明に係るポリペプチドは、高い発光値を有することができる。本発明に係るポリペプチドは、発光のピーク値が好ましくは公知の発光酵素、例えばＮａｎｏＬｕｃ、ＡＬｕｃ等と同程度またはそれ以上である。発光値が高い発光酵素は、発光の高感度検出が可能であり、検出限界濃度を低くすることができる。

本発明に係るポリペプチドは、好ましくは熱安定性が高く、例えば温度５０℃、１０分間の熱処理により８０％以上の残存活性を有し、好ましくは温度６０℃、１０分間の熱処理により８０％以上の残存活性を有する。熱安定性が高い発光酵素は、輸送時等の温度上昇に対して失活しにくく、診断および検査等の現場において実用性に優れる。

本発明に係るポリペプチドの酵素活性は、好ましくは発光スペクトルの長波長側の裾野が広く、例えば従来のカイアシ類の発光酵素に比べて発光スペクトルが長波長側にシフトする。長波長は生体透過性に優れるため、長波長側の裾野が広い発光スペクトルを有する発光酵素は、ライブイメージングに適する。本発明に係るポリペプチドは、セレンテラジンを基質としたときに発光の波長ピークが好ましくは４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下であり、より好ましくは約４８２ｎｍである。本発明に係るポリペプチドは、セレンテラジンｈを基質としたときに発光の波長ピークが好ましくは４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下であり、より好ましくは約４８８ｎｍである。

ＡＬｕｃのＣ末端は、基質との結合に必須であると考えられていた。本発明の一態様に係るポリペプチドは、ＡＬｕｃのＣ末端を有さず、発光酵素活性を有する。従って、ＡＬｕｃのＣ末端を有さないポリペプチドの基質結合部位は、ＡＬｕｃとは異なる構造を有すると考えられる。

本発明に係るポリペプチドは、その内部または端部に抗体認識部位を有してもよい。抗体認識部位の例としては、Ｈｉｓ－ｔａｇ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号６７）、ＦＬＡＧ－ｔａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号６８）、Ｍｙｃ－ｔａｇ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号６９）、ＨＡ－ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号７０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明に係るポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端に機能性ペプチドを付加されてもよい。例えばＮ末端またはＣ末端に、細胞膜局在化シグナル（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ；ＭＬＳ）をつけることによって発光酵素を細胞膜に局在させることができる。なお、本明細書において、特に明記していない場合でも、シグナルペプチドを含め２種類以上のペプチドを結合する場合には、適宜周知のリンカーを用いてその長さ、読み枠などを調節してよい。発光酵素が細胞膜に局在することによって、外部からの基質や酸素の供給が円滑になり、発光酵素を基盤とした発光プローブ（例えば、発光カプセル）においては、外部の信号に速やかに反応できる利点がある。

本発明に係るポリペプチドは、（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなってもよい。配列番号５１に記載のアミノ酸配列は、人工発光酵素のひとつであるＡＬｕｃ３０のアミノ酸配列から、Ｎ末端およびＣ末端を除いた配列（図１のｐｉｃＡＬｕｃ３０）である。配列番号５４に記載のアミノ酸配列は、ＡＬｕｃ３０のアミノ酸配列から、Ｎ末端配列および中間の配列を除いた配列（図１のＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１）である。同様に、配列番号５２および５３に記載のアミノ酸配列は人工発光酵素のひとつであるＡＬｕｃ１６およびＡＬｕｃ４８のアミノ酸配列から、それぞれＮ末端およびＣ末端を除いた配列である。配列番号５５および５６に記載のアミノ酸配列は、ＡＬｕｃ１６およびＡＬｕｃ４８のアミノ酸配列から、それぞれＮ末端配列および中間の配列を除いた配列である。

本発明に係るポリペプチドは、（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなってもよい。ポリペプチドは、配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。

本発明に係るポリペプチドは、（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなってもよい。本明細書において数個とは、例えば２～２０個、２～１０個、２～５個、または２～３個であってよい。

本発明に係るポリペプチドは、１位のアミノ酸残基の前に、開始コドンに相当するアミノ酸（多くはメチオニン）を含んでもよい。配列番号５１～５６のアミノ酸配列の１位にメチオニンが付加された配列を配列番号５７～６２に示す。
本発明に係るポリペプチドの一態様は、下記（ａ１）～（ｃ１）を含んでもよく、下記（ａ１）～（ｃ１）からなってもよい。
（ａ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
ポリペプチドは、配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。

＜ポリペプチドをコードする核酸＞
本発明の一実施形態に係る核酸は、上述のポリペプチドをコードする。上述のポリペプチドをコードする核酸からは、上述のポリペプチドを製造できる。核酸は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。ポリペプチドをコードする核酸は、上述のポリペプチドに対応する塩基配列の５’末端側に開始コドンを、３’末端に終止コドンを含んでいてもよい。核酸はイントロン配列を含んでもよい。本発明の一実施形態に係る核酸は、化学合成またはＰＣＲ等によって得ることができる。

一実施形態に係る核酸は、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他のコドンに置換した塩基配列を含む核酸が含まれる。ポリペプチドの発現を向上させる観点から、本発明に係る核酸は、宿主生物または形質転換細胞種に適するようにコドン出現頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更した塩基配列を含む核酸であってもよい。

＜ベクター＞
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述の核酸を含む。ベクターは、ＤＮＡを増幅または維持できる核酸分子であり、例えば発現ベクターおよびクローニングベクターが挙げられる。一例において、上述の核酸は、発現ベクターに挿入された形で宿主細胞等に導入され、発光酵素活性を有するポリペプチドを発現する。発現ベクターは、組み込まれた遺伝子を発現するためのプロモーター配列およびターミネーター配列を有してもよい。本発明の一実施形態に係るベクターは，上述の核酸を適当なベクターに挿入して得ることができる。

ベクターは、例えば細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、人工染色体ベクター等であってよい。ベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＥＴ系プラスミドベクター等が挙げられる。具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ３２等を挙げることができる。哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えばｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等を挙げることができる。

＜形質転換細胞＞
本発明の一実施形態に係る形質転換細胞は、上述の核酸が導入された細胞である。核酸は、ベクターに含まれた形態で細胞に導入されてもよい。形質転換細胞は、発光酵素を発現できる。発光酵素は上清中に分泌されてもよい。細胞に核酸を導入する方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオニックリポソーム法などの化学的手法；アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＨＶＪリポソームなどの生物学的手法；エレクトロポレーション、ＤＮＡ直接注射、遺伝子銃などの物理的手法などが例示される。導入する細胞に応じて、適切な導入方法を選択することができる。

核酸が導入される細胞としては、真核生物または原核生物の細胞を用いることができ、細菌、真菌、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞が挙げられる。細胞は、酵母、大腸菌または哺乳動物の細胞であってよい。哺乳動物には、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ等が含まれる。

＜レポータータンパク質およびレポーター分析法＞
本発明に係るポリペプチドをレポータータンパク質として用いて、レポーター分析を行うことができる。本発明に係るポリペプチドは、従来の発光酵素または各種蛍光タンパク質を用いたレポーター分析法において、発光または蛍光物質の代替として用いることができる。

本明細書において、レポータータンパク質とは、細胞内での標的タンパク質、標的核酸または標的遺伝子の挙動を調べるために用いる発光標識である。本明細書においてレポーター分析法とは、本発明に係るポリペプチドをレポータータンパク質として用いて、外部刺激に応じた細胞内における標的タンパク質または標的遺伝子の挙動を、発光の有無もしくは発光量、発光時期またはその発光位置等に置き換えて観察する分析法である。具体的には、レポーター分析法は、標的遺伝子の発現位置、発現時期または発現量を、レポータータンパク質の発光位置、発光時期または発光量として定性的または定量的に測定する方法であるといえる。レポーターアッセイは、異なる波長の光を発する複数の酵素またはタンパク質と多重化して使用してもよい。

レポーター分析は、哺乳動物等の生体内、培養細胞内または試験管内で行い得る。生体内等のｉｎ ｖｉｖｏ条件で用いる場合には、例えば上述のポリペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする核酸からなるレポーター遺伝子と標的遺伝子とを繋いでベクターに組み込み、ターゲットとなる細胞内に導入する。培養細胞としては、一般的な遺伝子組換えに用いられる哺乳動物細胞のＣＯＳ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、酵母、大腸菌等の細菌、昆虫細胞が挙げられる。

以下、本発明に係るレポーター分析法を、Ｎｉｕら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２、２０１２、４１３．において示された３つの分類である“ｂａｓｉｃ”、“ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ”および“ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ”の３種類に分けて、本発明に係るポリペプチドのそれぞれの分析法への適用について説明する。

（１）ｂａｓｉｃ法
ｂａｓｉｃ法とは、もっとも単純なレポーター分析系であって、挙動を調べたい標的タンパク質に発光酵素を繋いで標識するレポーター分析系である。本発明に係るポリペプチドをレポータータンパク質としてｂａｓｉｃ法に適用する場合、本発明に係るポリペプチドと標的タンパク質または標的タンパク質に結合するタンパク質とを含む融合タンパク質を作製すればよい。融合タンパク質が非制御型プロモーターで発現する点が他のレポーター分析法とは異なる。融合タンパク質は、標的タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏイメージングにも使用できる。

融合タンパク質は、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末端にレポータータンパク質を融合して作製される場合が典型的であるが、Ｎ末端とＣ末端に２分割したレポータータンパク質と標的タンパク質とが直接または他のペプチド配列を介して融合される場合もある。

融合タンパク質は、（ｉ）本発明に係るポリペプチドと、標的タンパク質または標的タンパク質を認識するタンパク質（ペプチドを含む。）とを含む融合タンパク質をコードする核酸から一体として発現させたもの、（ｉｉ）本発明に係るポリペプチドと、標的タンパク質または標的タンパク質を認識するタンパク質とを別々に発現させ、これらを化学反応により連結させたものを包含する。別々に発現させたタンパク質等を化学反応により連結させる手段としては、例えばクロスリンカーによる連結、アビジン－ビオチンの結合能を利用した連結、アミノ酸残基の化学反応性を利用した結合などが例示される。

融合タンパク質としては、発光酵素を抗体に繋げた発光酵素標識抗体が挙げられる。この融合タンパク質においては、例えば抗体の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）のｃＤＮＡの上流または下流にレポーター遺伝子を繋げたキメラＤＮＡを作成する。ＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、細胞に導入し、発現させて融合タンパク質を得ることができる。

（２）ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法は、ｂａｓｉｃ法と比較して、レポーターの発現がプロモーターによって制御されている点が異なる。発光酵素をレポータータンパク質としてｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法に適用することは、組換えＤＮＡ技術によって組換えタンパク質が作製される際の遺伝子発現の時期および発現量の解析のために従来から用いられており、特に外部刺激に応答した発現時期および発現量変化を示す指標として広く用いられている。ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法に含まれる分析システムとしては、レポータージーンアッセイ、酵母ツーハイブリットアッセイ、哺乳類ツーハイブリットアッセイ、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）、タンパク質スプライシングアッセイ（ＰＳＡ）、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）、ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ等が挙げられる。これらの分析法に用いられるレポーター遺伝子として、本発明のポリペプチドを用いることで、アッセイの計測性能を飛躍的に向上できる。

（ｉ）レポータージーンアッセイ
レポータージーンアッセイ法は、外部刺激による転写因子の活性化および遺伝子の発現調節の解析手段として汎用されている。一例としては核内受容体を介したシグナル伝達を攪乱する内分泌攪乱物質（環境ホルモン）の検出に用いられている。核内受容体を介したシグナル伝達に関連した標的遺伝子（例えば、ホルモン応答性遺伝子）の発現は、リガンドと受容体との複合体が当該遺伝子の転写調節するシス領域（ホルモン応答配列；ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合することで引き起こされる。この各種ホルモン応答性遺伝子のシス領域の下流にレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを細胞内に導入し、リガンドとなり得るホルモン分子または内分泌攪乱物質の量を発光値として検出する。

レポータージーンアッセイ法において、従来から広く用いられていたホタルルシフェラーゼの場合、［１］分子量が大きくて発現までに時間がかかるので、宿主細胞に大きな負担をかけることになり、［２］発光強度が低いため、十分ルシフェラーゼ（レポーター）量が蓄積するまでに、通常刺激後１～２日の時間を待つ必要がある、という欠点があったが、本発明に係るポリペプチドをレポータータンパク質として選択することでこれらの問題点が解消される。

本発明に係るポリペプチドをレポータータンパク質として使用すれば、レポーターの発光強度が極めて高いため、刺激後にごく短時間で測定ができる利点がある。そのため、従来のレポータータンパク質より大幅に計測時間を短縮でき、かつ経時的な発光の安定性も高いことから、遺伝子導入効率の悪い細胞株においても発光測定ができる。また、発光が長波長側にシフトしているので、細胞膜、皮膚を通しての透過性が高まる。バックグラウンド値が下がるため、測定精度も高い。

例えば、本発明に係るポリペプチドをレポータージーンアッセイに適用するためには、上流に特殊なプロモーターを搭載している既知の真核細胞発現ベクターに当該発光酵素を繋いで、真核細胞に導入し、一定時間が過ぎた後、信号（刺激）有り無しの条件で発光値を測定すればよい。本発明に係るポリペプチドを搭載できる、レポータージーンアッセイ用の発現ベクターとしては、公知のｐＴｒａｎｓＬｕｃｅｎｔベクターを利用し、既知の方法を使って簡単に搭載させることができる。

（ｉｉ）ツーハイブリッド法
ツーハイブリッド法（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法）はタンパク質間の相互作用を調べる手法の１つであり、１９８９年に酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いたｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ（Ｙ２Ｈ）システムがまず構築された。転写活性化因子であるＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）と転写活性化ドメインが分離可能であることを利用して、ＧＡＬ４ ＤＢＤと任意のタンパク質Ａ（ｂａｉｔ）を融合タンパク質として発現させ、同時に細胞内で発現させた転写活性化ドメイン（ＴＡ）と融合タンパク質としたタンパク質Ｂ（ｐｒｅｙ）と相互作用をするかどうかを判定できる。タンパク質Ａとタンパク質Ｂとが結合する場合にはＤＢＤとＴＡが近接してＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、「ＵＡＳＧ」塩基配列に結合するのでその下流に連結したレポーター遺伝子発現を促すことになる。レポーター遺伝子が発光酵素であれば、その特異的な基質存在下で生物発光をモニターすれば、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの両タンパク質の親和性が測定でき、タンパク質Ａ（ｂａｉｔ）と相互作用をするタンパク質またはペプチドのスクリーニングができる。その際のタンパク質Ｂ（ｐｒｅｙ）は発現ライブラリーによって提供させることもできる。

宿主細胞としては、酵母細胞に限らず、大腸菌など細菌類や、哺乳動物細胞、昆虫細胞も用いられる。その際、酵母由来の転写活性化因子であるＧＡＬ４ ＤＢＤ以外に、大腸菌由来のリプレッサータンパク質の「ＬｅｘＡ」等を用いることもできる。これらをコードするＤＮＡと、リガンド応答性転写調節因子のリガンド結合領域などｂａｉｔタンパク質（即ち、前記の任意のタンパク質Ａ）をコードするＤＮＡとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。一方、「転写活性化因子の転写活性化領域」としては、例えば、ＧＡＬ４の転写活性化領域、大腸菌由来のＢ４２酸性転写活性化領域、ヘルペス単純ウイルスＶＰ１６の転写活性化領域等を用いることができる。これら転写活性化領域をコードするＤＮＡと、ｐｒｅｙタンパク質（即ち、前記の任意のタンパク質Ｂ）をコードするＤＮＡとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。

転写調節因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、出芽酵母を宿主細胞において利用可能なベクターとして、プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。ＧＡＬ４の転写活性化領域をコードするＤＮＡを有し、出芽酵母において利用可能なベクターとして、プラスミドｐＧＡＤ４２４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。また、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＢＩＮＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等をあげることができ、単純ヘルペスウィルスＶＰ１６の転写活性化領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＶＰ１６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＡＣＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等をあげることができる。また、ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＬｅｘＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等をあげることができ、Ｂ４２をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＢ４２ＡＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等をあげることができる。

例えば本発明に係るポリペプチドを、ＧＡＬ４が結合する領域（「ＵＡＳＧ」）などの下流にレポーター遺伝子として挿入したベクターを構築すればよく、哺乳動物宿主の場合であれば、市販のｐＧ５Ｌｕｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）やｐＦＲ－Ｌｕｃベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を利用し、当該ベクターに搭載されているホタルルシフェラーゼの代わりに周知の方法で簡単に本発明に係るポリペプチドを搭載して使用することができる。また、市販のｐＧ５ＣＡＴベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＣｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）の代わりに用いることもできる。

（３）ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ法
ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ法は、レポーター自体がリガンド刺激に能動的に反応して発光することを利用するレポーター分析法である。典型的には、一分子型生物発光プローブ、発光カプセルがあげられ、他にｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（ＰＣＡ），ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＰＳＡ）などに適用できる。

（ｉ）発光性融合タンパク質（発光カプセル）の製造
本発明に係るポリペプチドのＣ末端側に膜局在シグナル（ＭＬＳ）を結合することで、発光酵素本体を細胞膜に局在させることができる。発光酵素を細胞膜に局在する分子設計を行うことによって、基質と酸素の供給が円滑になるため、極めて高輝度で安定的な生物発光可視化が可能になる。その際、発光酵素本体とシグナルペプチドをコードする核酸の間に任意のポリペプチドやタンパク質の遺伝子をカーゴ（貨物という）として挿入することが可能である。これによりカーゴとなるタンパク質を細胞膜表面に効率的に運ぶことができ、しかも運ばれた場所が光るようになる。一例としては、各タンパク質の繋ぎ目に細胞死に応答するＤＥＶＤ配列やＩＥＴＤ配列をカーゴとして入れ込んだ場合、細胞死の際のｃａｓｐａｓｅ－３やｃａｓｐａｓｅ－８の活性を信号として能動的に応答し、可視化するシステムとして働く。この構造の発光性融合タンパク質を「発光カプセル」ともいう。発光カプセルは、化学物質の毒性評価にも使用できる。

発光カプセルは、従来の発光プローブと比較し、極めて高輝度で安定な発光特質を示し、細胞膜を透過できない検体に対しても応答する利点を持つ。この発光カプセルは「発光酵素本体のＣ末端」に「膜局在シグナル（ＭＬＳ）」をつけた構造を基本骨格とする。酵素は本発明に係るポリペプチドをタンデムに繋いで発光量を増強してもよい。発光カプセルは、細胞死等の細胞表面の形態変化を引き起こす化合物の作用を、細胞膜表面の形態変化として可視化できるため、観察が容易になる。好ましくは、発光酵素本体のＣ末端とＭＬＳとの間に、細胞膜表面の形態変化を引き起こすポリペプチドもしくはその一部認識配列、具体的には、Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）やｃ－Ｓｒｃなどの全長もしくは一部認識配列を挿入することが可能である。発光酵素本体のＣ末端とＭＬＳとの間に細胞死を誘発するポリペプチド、もしくはその認識配列を貨物として挿入することで、細胞死の可視化が可能である。より具体的には、各種ｃａｓｐａｓｅやプロテアーゼ（セリンプロティアーゼ、システインプロティアーゼなど）、消化酵素（トリプシン、アミラーゼなど）によって認識されるペプチド配列（通常２０アミノ酸残基以下、好ましくは１０アミノ酸残基以下）またはＤＥＶＤ配列もしくはＩＥＴＤ配列を含むアミノ酸配列をカーゴとして挿入した場合、ｃａｓｐａｓｅ－３活性による細胞死の可視化が可能である。更に発光酵素本体とＭＬＳとの間に蛍光タンパク質もしくは他の発光酵素をカーゴとしてつなげることによって、細胞膜表面での光発生量が強力となるため、より細胞膜の形態観察が容易となる。発光カプセルは、細胞膜を透過できないリガンドに対しても応答するため、幅広い刺激物に対するスクリーニングが可能である。

発光カプセルは、本発明に係るポリペプチドのＣ末端側と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、細胞膜表面で発現させたい任意のタンパク質またはポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質であり、典型的には、
（ａ）本発明に係るポリペプチドのＣ末端側と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、蛍光タンパク質または発光酵素（本発明に係るポリペプチド以外の酵素であってよい。）が挿入された発光性融合タンパク質、または
（ｂ）本発明に係るポリペプチドのＣ末端側と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチドまたは当該ポリペプチドが認識する２０アミノ酸残基以下の、好ましくは１０アミノ酸残基以下のポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質であってよい。細胞膜の形態を変化させるポリペプチドとして、細胞死を誘発するポリペプチドが好ましく、ｃａｓｐａｓｅおよびその認識配列である「ＤＥＶＤ」または「ＩＥＴＤ」を含む２０アミノ酸残基以下のポリペプチドが特に好ましい。

（ｉｉ）発光プローブへの応用
本発明に係るポリペプチドを一分子型発光プローブ、または二分子型発光プローブに組み込むことによって、リガンドの有無およびリガンドの活性強度を高輝度で観測できる。当該プローブの構成要素として、［１］２つに分割された発光酵素（ＮとＣ末側断片）の近傍に、［２］標的リガンドに応答するリガンド結合タンパク質と、［３］リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質を繋げた形態で高性能の発光プローブを構成できる。この発光プローブ中、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された酵素断片が相補して酵素活性を変化させることができる。この時、当該分割酵素の高輝度と安定性のため、検出限界の向上と信頼性の高い計測が可能となる。

一分子型発光プローブは、可視化イメージングするために用いられる全構成要素を単一融合分子内に集積したことを特徴とする、公知の生物発光プローブの一つである。例えば、本発明に係るポリペプチドを２分割したＮとＣ末側断片を、リガンド結合タンパク質およびリガンド結合タンパク質の認識タンパク質を基本構成要素として含む融合タンパク質である。二分子型発光プローブは、本発明に係るポリペプチドのＮ末側断片とＣ末側断片を、リガンド結合タンパク質を含む融合タンパク質、および認識タンパク質を含む融合タンパク質内にそれぞれ存在させたタイプの生物発光プローブを指す。

生物発光プローブにおいて本発明に係るポリペプチドを用いる場合には、Ｎ末側断片とＣ末側断片とに２分割する必要があるが、その分割位置は、ＡＬｕｃ１６の１２５／１２６、１２９／１３０、１３３／１３４、１３７／１３８、１４１／１４２、１４６／１４７に相当する切断位置が適用されてよい。

本発明に係るポリペプチドを一分子型発光プローブとして用いる際の具体的な手法は、公知の手法に従う。具体的には、本発明に係るポリペプチドを２分割し、リガンド結合性のタンパク質および当該タンパク質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するペプチド配列とを直線上に結合させた発光プローブをコードするキメラＤＮＡを設計する。一般には、そのキメラＤＮＡを発現させたい細胞に適したベクター内にサブクローンし、当該ベクターを細胞内に導入して、細胞内で発現させるが、キメラＤＮＡの上流に制御配列を繋いで細胞内に直接導入することもできる。ここで、対象の細胞としては、ヒトを含めた哺乳動物由来の細胞が好ましく、生体内に存在する状態の細胞であっても、細胞本来の機能を維持した状態の培養細胞であってもよい。酵母細胞、昆虫細胞の他、大腸菌などの原核細胞であってもよい。ベクターの具体的な種類も特に限定されず、発現に用いる宿主中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。細胞内への導入法としては、マイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の公知のトランスフェクション法を用いることができる。あるいは脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）等）を採用することもできる。

本発明に係るポリペプチドを用いた生物発光プローブは、キメラＤＮＡとして細胞内に導入された後に細胞内で融合タンパク質として発現されるため、当該形質転換細胞に対してリガンド刺激を行った後、当該細胞からの発光量の変化を測定することによって、リガンドの性質、活性の程度等を評価することができる。

本発明に係るポリペプチドを生物発光プローブ内に構成する際、当該ポリペプチドと共に搭載できる「リガンド結合タンパク質」としては、そのリガンド結合部位にリガンドが結合するタンパク質が意図される。リガンド結合タンパク質は、例えば、リガンドが結合することによって立体構造が変化するか、リン酸化を起こすか、タンパク質間相互作用を促すものであり得る。このようなリガンド結合タンパク質としては、例えば、ホルモン、化学物質または信号伝達タンパク質をリガンドとする核内受容体（ＮＲ）、サイトカイン受容体、あるいは各種タンパク質キナーゼが用いられる。リガンド結合タンパク質は、対象とするリガンドによって適宜選択される。リガンド結合タンパク質に結合するリガンドとしては、リガンド結合タンパク質に結合するものであれば特に限定されず、細胞外から細胞内に取り込まれる細胞外リガンドであってもよく、細胞外からの刺激により細胞内で産生される細胞内リガンドであってもよい。細胞外リガンドは、例えば、受容体タンパク質（例えば核内受容体、Ｇタンパク質結合型受容体等）に対するアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。細胞内の情報伝達に関与するタンパク質に特異的に結合するサイトカイン、ケモカイン、インシュリン等の信号伝達タンパク質、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー、リン酸化アミノ酸残基、Ｇタンパク質結合型受容体リガンド等であり得る。

例えば、リガンドとして細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー等を対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、各セカンドメッセンジャーの結合ドメインを使用することができる。セカンドメッセンジャーとは、ホルモン、神経伝達物質等の細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質を意図している。このセカンドメッセンジャーとして、例えば、ｃＧＭＰ、ＡＭＰ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、イノシトール３リン酸（ＩＰ３：ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＩＰ４、Ｃａ^２＋、ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｈｉｄ等が挙げられる。例えば、セカンドメッセンジャーのＣａ^２＋に対しては、リガンド結合タンパク質としてカルモジュリン（ＣａＭ）を用いることができる。

（ｉｉｉ）生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）分子プローブ
本発明に係るポリペプチドは、分子同士の相互作用、例えばリガンド－タンパク質相互作用またはタンパク質－タンパク質相互作用を検出するための任意の方法において使用され得る。一実施形態に係るＢＲＥＴ分子プローブは、本発明に係るポリペプチドと蛍光物質とを備える。発光ドナーから蛍光受容体へのエネルギー移動は、光の放出のスペクトル分布のシフトをもたらす。このエネルギー移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの分子間相互作用のリアルタイムモニタリングを可能にし得る。一例として、本発明に係るポリペプチドと標的分子（標的タンパク質、リガンド、核酸、脂質等）とを接続した融合タンパク質、および標的分子に結合する分子（タンパク質、リガンド、核酸、脂質等）と蛍光物質とを接続した融合タンパク質を作製する。本発明に係るポリペプチドと標的分子とは適切なリンカー（例えばペプチド、核酸、ポリマー、エステル結合、ＰＥＧリンカー、炭素鎖等）によって接続されていてよい。標的分子と、標的分子に結合する分子とが近接したときに、本発明に係るポリペプチドと蛍光物質とが近接し、ＢＲＥＴシグナルが検出される。ＢＲＥＴ分子プローブを含むアッセイシステムは、発光基質を含んでもよい。標的分子の結合に競合する分子（例えば、標的分子に結合する分子であって蛍光物質と接続されていない分子）を添加することで、ＢＲＥＴシグナルが減少する。ＢＲＥＴシグナルの減少により分子間の相互作用を検出することもできる（競合バインディングアッセイ）。

蛍光物質の吸収スペクトルは、通常、本発明に係るポリペプチドの発光スペクトルと重なる。発光酵素の波長ピークは、通常、蛍光物質の波長ピークと隔てられており、例えば８０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１４０ｎｍ程度隔てられていてよい。蛍光物質は蛍光タンパク質、蛍光色素または発色団であってもよい。蛍光物質は、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド等）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン等）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル及びプロダン誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンズオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール等）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０等）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー等）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン等）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン等）、ＣＦ ｄｙｅ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロゲン）、ＡＬＥＸＡ ＦＬｕｏＲ（インビトロゲン）、ＤＹＬＩＧＨＴ ＦＬＵＯＲ（サーモサイエンティフィック、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（シグマアルドリッチ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯ ＣＹ ｄｙｅ（ＣＹＡＮＤＹＥ、ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ及びＳＱＵＡＲＥ ＤＹＥＳ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬ ＦＬＵＯＲ ｄｙｅｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴ ＤＹＥＳ（ＡＰＣ、ＲＰＥ、ＰｅｒＣＰ、フィコビリソーム）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自動蛍光タンパク（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ）、量子ドットナノクリスタル等が挙げられる。蛍光物質は、ローダミン類似体（例えばカルボキシローダミン類似体）であってもよい。

ＢＲＥＴ分子プローブの他の例として、本発明に係るポリペプチドと蛍光物質とを、特定のプロテアーゼで消化されるタンパク質をリンカーとして結合された融合タンパク質が挙げられる。特定のプロテアーゼの非存在下では、発光酵素と蛍光物質とが近接するため、ＢＲＥＴの蛍光シグナルが生じる。特定のプロテアーゼの存在下では、タンパク質が消化されて発光酵素と蛍光物質とが離れるため、消光する。この方法によれば、特定のプロテアーゼの存在を検出できる。

（ｉｖ）タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）
本発明に係るポリペプチドは、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）または酵素断片化アッセイなどのリガンド－タンパク質相互作用またはタンパク質－タンパク質相互作用あるいは近接を検出するための方法において使用されてよい。ＰＣＡは、２つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。例えば本発明に係るポリペプチドを２つに断片化し、近接を検証したい分子にそれぞれ融合させる。標的の分子が相互作用する場合、２つに分断されていたポリペプチドは相互作用して完全な発光酵素となり、発光が検出される。

（ｖ）細胞内イメージング
本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子は、様々な細胞株に安定的に導入され得る。発光酵素を用いた細胞内イメージングは、公知の方法により行えばよい。一例として、胚内未分化細胞、ＥＳ細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に当該ポリペプチドを安定的に導入できる。

本発明に係るポリペプチドに適当なシグナルペプチドを繋げることによって、各細胞小器官の高輝度イメージングに使用できる。例えば、ＧＡＰ－４３由来の「ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶ配列」（配列番号６３）をポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加すると、細胞膜に局在化できる。「ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列」（配列番号６４）を付加すると細胞質に局在できる。「ＫＤＥＬ」（配列番号６５）の付加により小胞体（ＥＲ）に、「ＤＰＫＫＫＲＫＶ配列」（配列番号６６）の付加により細胞核に局在化させることができる。ＨＩＳ－ｔａｇ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号６７）、ＦＬＡＧ－ｔａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号６８）、Ｍｙｃ－ｔａｇ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号６９）、ＨＡ－ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号７０）、Ｖ５－ｔａｇ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号７１）、Ｔ７－ｔａｇ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）（配列番号７２）などの抗原サイトをつけることによって、非細胞系における免疫染色、分離精製に利用できる。その際には、周知の免疫染色法、ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ等の手法が適用できる。

本明細書におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１ ｔｏ ４，（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｂ） ＆ １０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｅ） ＆ １５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするＤＮＡについては、既存のデータベース（URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等から入手することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実験１：ｐｉｃＡＬｕｃプラスミドの作製＞
配列番号１の２０位～２２１位に相当するアミノ酸配列を有する発光酵素のひとつであり、ＡＬｕｃ３０（配列番号２８）からシグナル配列を除いた２０位～２１２位のアミノ酸配列を有する発光酵素をＡＬｕｃ３０ｗｔとした。ＡＬｕｃ３０ｗｔの配列を図１に示す。ＡＬｕｃ３０ｗｔの分子量は約２１ｋＤａである。ＡＬｕｃは、Ｎ末端から順にヘリックス構造２つ、ループ構造、ヘリックス構造、ヘリックス構造・ループ構造・ヘリックス構造、小さなヘリックス構造２つ、ヘリックス構造、小さなヘリックス構造からなる。図１に示すように、ＡＬｕｃ３０ｗｔのＮ末端とＣ末端を除いた、ＡＬｕｃ３０ｗｔの５４位～１７５位のアミノ酸までを含むｐｉｃＡＬｕｃ３０（配列番号５１）を作製した。ｐｉｃＡＬｕｃ３０はｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に挿入した。同じ方法で、ＡＬｕｃ３０の代わりにＡＬｕｃ１６（配列番号１５）およびＡＬｕｃ４８（配列番号４０）を用いて、ｐｉｃＡＬｕｃ３０に相当するアミノ酸配列を有するｐｉｃＡＬｕｃ１６（配列番号５２）およびｐｉｃＡＬｕｃ４８（配列番号５３）の発現プラスミドを作製した。ｐｉｃＡＬｕｃ３０の大きさは、１３ｋＤａであった。各変異体のＮ末端にはＨｉｓ－ｔａｇを、Ｃ末端にはＦｌａｇ－ｔａｇを付加した。

ｐｉｃＡＬｕｃ３０とｐｉｃＡＬｕｃ１６とのアミノ酸配列同一性は９６％（図２）、ｐｉｃＡＬｕｃ３０とｐｉｃＡＬｕｃ４８とのアミノ酸配列同一性は８５％（図３）、ｐｉｃＡＬｕｃ４８とｐｉｃＡＬｕｃ１６とのアミノ酸配列同一性は９０％（図４）であった。

＜実験２：ｐｉｃＡＬｕｃの発光値の測定＞
（１）アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ－７細胞を２４ウェルディッシュに播種し、次の日にサブコンフルエントとした。
（２）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２５μＬとプラスミド４００ｎｇ（２μＬ）とＰ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬとを混合した。
（３）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ２５μＬとｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬとを混合した。
（４）（２）と（３）とを混合し、室温で５分間インキュベーションした。
（５）混合物を（１）の培地に加えた。
（６）５００μＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ培地を添加して、１日間３７℃で細胞を培養した後、培地を回収した。培地には分泌発現された発光酵素が含まれる。
（７）発光酵素を含む培地１００μＬに基質であるセレンテラジンを終濃度５μＭとなるように添加し、Ｅｎｓｐｉｒｅ ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、発光値を測定した。

ｐｉｃＡＬｕｃ３０は、ＡＬｕｃ３０ｗｔと同等以上の発光値を示した（図５）。ｐｉｃＡＬｕｃ１６およびｐｉｃＡＬｕｃ４８についても、十分に高い発光値が測定された。

＜実験３：Δｌｏｏｐプラスミドの作製＞
予想されるｐｉｃＡＬｕｃ３０の立体構造を図６に示す。ｐｉｃＡＬｕｃ３０は、複数のループ構造を有していた。このうち３つのループ（ループ１、ループ２およびループ３）を構成するアミノ酸配列を欠損させた変異体を作製した。ＡＬｕｃ３０ｗｔからループ１（ＡＬｕｃ３０ｗｔの９６位～１００位）、ループ２（ＡＬｕｃ３０ｗｔの１２２位～１２８位）またはループ３（ＡＬｕｃ３０ｗｔの１５６位～１６１位）のアミノ酸残基を削除し、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを挿入した。さらに、ＡＬｕｃ３０ｗｔのＮ末端（１位～４９位）を除いた。これにより、Ｎ末端とループが欠損したＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ１Ｎ１、ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１（配列番号５４）およびＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ３Ｎ１の発現プラスミドを作製した。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１の大きさは、１４ｋＤａであった。

＜実験４：ＡＬｕｃΔｌｏｏｐの発光値の測定＞
実験２と同じ方法により、発光値を測定した。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１は、Ｎ末端を除いただけのＡＬｕｃ３０ΔＮ１と比較して、半分程度の発光値を維持していた（図７）。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ１Ｎ１およびＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ３Ｎ１の発光値は著しく低かった。

＜実験５：公知の発光酵素との比較＞
公知のＮａｎｏＬｕｃ、ＴｕｒｂｏＬｕｃおよびＧＬｕｃと、実験１で作製したｐｉｃＡＬｕｃとを比較した。ＮａｎｏＬｕｃは、サイズが約１９ｋＤａと小さく、発光値が非常に高く、熱安定性も高いことが知られている。ＴｕｒｂｏＬｕｃは、サイズが約１６ｋＤａと小さく、発光値も比較的高く、熱安定性が高いことが知られている。ＧＬｕｃは、サイズが２０ｋＤａと小さく、細胞から分泌発現させた場合、発光値はＡＬｕｃと比較して低く、熱安定性が高いことが知られている。ＮａｎｏＬｕｃ、ＴｕｒｂｏＬｕｃおよびＧＬｕｃの作製には、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５に記載の配列がそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入されたプラスミドを用いた。

セレンテラジンを終濃度０．５μＭとした以外は、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。発光値はＮａｎｏＬｕｃ＞＞ｐｉｃＡＬｕｃ３０＞ＴｕｒｂｏＬｕｃ＞ＡＬｕｃ３０ｗｔ＞ＧＬｕｃの順に高かった（図８）。セレンテラジンを終濃度５μＭとして、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。発光値は、ＡＬｕｃ３０ｗｔ＝ｐｉｃＡＬｕｃ３０＞ＮａｎｏＬｕｃ＞ＴｕｒｂｏＬｕｃ＞ＧＬｕｃの順に高かった（図９）。

基質としてセレンテラジンｈ終濃度５μＭを使用した以外は、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。発光値はＴｕｒｂｏＬｕｃ＝ＡＬｕｃ３０ｗｔ＞＞ＮａｎｏＬｕｃ＞ｐｉｃＡＬｕｃ３０＞ＧＬｕｃの順に高かった（図１０）。基質としてセレンテラジンｈ終濃度２５μＭを使用した以外は、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。発光値はｐｉｃＡＬｕｃ３０＞＞ＮａｎｏＬｕｃ＝ＴｕｒｂｏＬｕｃ＝ＡＬｕｃ３０ｗｔ＞＞ＧＬｕｃの順に高かった（図１１）。

基質としてＰｒｏｍｅｇａ社からＮａｎｏＬｕｃ用基質として販売されているフリマジンをメーカー推奨濃度で使用した以外は、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。ＧＬｕｃ、ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｐｉｃＡＬｕｃ３０は発光が検出されたが、ＮａｎｏＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃと比較して低かった（図１２および図１３）。ＮａｎｏＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃは高い発光値を示し、ＮａｎｏＬｕｃの発光値はセレンテラジンまたはセレンテラジンｈ使用時と同程度であった（図１３）。

以上の結果から、ｐｉｃＡＬｕｃ３０の基質として、フリマジンよりセレンテラジンおよびセレンテラジンｈが適すること、および分泌発現されたｐｉｃＡＬｕｃ３０は、高濃度のセレンテラジンまたはセレンテラジンｈを基質として反応させたとき、ＮａｎｏＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃ以上の発光値を示すことが明らかになった。

＜実験６：タンパク質の末端の安定性＞
実験２と同じ方法で、ＣＯＳ－７細胞にプラスミドをトランスフェクションし、培養上清を回収した。分泌発現させた各発光酵素のＮ末端に付加してあるＦｌａｇ－ｔａｇおよびＣ末端に付加してあるＨｉｓ－ｔａｇをウエスタンブロット（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ミニプロティアンＴＧＸゲル ＳｔａｉｎＦｒｅｅ ４－１５％ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ））で検出した（図１４）。抗体はそれぞれＡｎｔｉ ６×Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （９Ｃ１１）， Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（富士フイルム和光純薬製、１：１０００）およびＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（Ｒ） Ｍ２－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ （ＨＲＰ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ， ｃｌｏｎｅ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、１／１０００）を用いて、検出にはＡｍｅｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０ （Ｃｙｔｉｖａ）を使用した。ＧＬｕｃのＦｌａｇ－ｔａｇおよびＨｉｓ－ｔａｇは検出限界以下であった。ＧＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃについて、Ｆｌａｇ－ｔａｇとＨｉｓ－ｔａｇのシグナル強度を比較すると、ＴｕｒｂｏＬｕｃのＦｌａｇ－ｔａｇは検出値が低く、Ｎ末端が削れていることが示された。一方、ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｐｉｃＡＬｕｃ３０の両末端は削れておらず、ＧＬｕｃやＴｕｒｂｏＬｕｃに比べて安定性が高いことが示された。

＜実験７：比活性の測定＞
実験６のウエスタンブロットのシグナル強度から各酵素濃度を合わせ、ＮａｎｏＬｕｃ、ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｐｉｃＡＬｕｃ３０の比活性を測定した。セレンテラジンまたはセレンテラジンｈをそれぞれ基質として反応させたとき、ＡＬｕｃの比活性とｐｉｃＡＬｕｃの比活性は同程度であることが示された（図１５および図１６）。ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｐｉｃＡＬｕｃ３０の最大発光値はＮａｎｏＬｕｃと同程度であり、高い発光活性を有していることが示された。

＜実験８：発光スペクトルの測定＞
ｐｉｃＡＬｕｃ３０の波長ピークは、セレンテラジンと反応させたときは４８２ｎｍであり（図１７）、セレンテラジンｈと反応させたときは４８８ｍであり（図１８）であった。ｐｉｃＡＬｕｃ３０の波長ピークは、ＡＬｕｃ３０ｗｔとほぼ同じであった。発光スペクトルは、長波長側の裾野が短波長側の裾野よりも広い特徴を有していた。

＜実験９：熱安定性の検証＞
実験２と同じ方法で、ＣＯＳ－７細胞にプラスミドをトランスフェクションし、培地を回収した。ｐｉｃＡＬｕｃ３０を含む培養上清を室温（２５℃）、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃または９０℃で１０分間インキュベーション後、発光値を測定した。その結果、５０℃１０分間または６０℃１０分間インキュベーションで８０％以上、７０℃１０分間インキュベーションで５０％以上の活性が残存しており（図１９）、十分に実用性を有することが確認された。

＜実験１０：大腸菌での発光酵素の発現＞
（１）ｐｉｃＡＬｕｃ３０をコードしたＤＮＡ配列をｐＥＴ３２ベクターに挿入したプラスミドを作製した。大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ ｅｘｐｒｅｓｓ ｌｙｓＹ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）に形質転換した。
（２）ＬＢプレート（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）に（１）の大腸菌を播種した。
（３）次の日、１コロニーをピックアップし、２ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）を入れた試験管内において、３０℃で一晩振盪培養した。
（４）１００ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）に（３）を１ｍＬ加えて、５００ｍＬのフラスコを用いて吸光度ＯＤ_６００が約０．４になるまで、３０℃で振盪培養した。
（５）吸光度ＯＤ_６００が約０．４に達したとき、１Ｍイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを４０μＬ添加し、１６℃で一晩培養した。
（６）菌体を回収し、ＨｉｓＴＡＬＯＮ Ｂｕｆｆｅｒ ＳｅｔおよびＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ともにタカラバイオ株式会社）を用いて、タンパク質を精製した。１００ｍＬの培地からは１．７ｍｇのｐｉｃＡＬｕｃ３０が得られた。

ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで濃度を合わせて比活性を測定した結果、ＣＯＳ－７細胞から分泌発現させたｐｉｃＡＬｕｃ３０との比活性と、大腸菌で作製したｐｉｃＡＬｕｃ３０の比活性は、ほぼ同じであった（図２０）。ｐｉｃＡＬｕｃ３０は、哺乳動物細胞からの分泌発現だけでなく、大腸菌においても発現可能であり、さらに大量に製造が可能であることがわかった。

大腸菌から精製したｐｉｃＡＬｕｃ３０を、室温（２５℃）、６０℃、７０℃、８０℃または９０℃で１０分間インキュベーション後、発光値を測定した（図２１）。大腸菌で発現したｐｉｃＡＬｕｃ３０は、６０℃で１０分間インキュベーションしてもほとんど活性を失わず、７０℃１０分間インキュベーションで９０％以上、８０℃１０分間インキュベーションで８０％以上の活性が残存しており、熱安定性に優れていることがわかった。

＜実験１１：ＢＲＥＴ分子プローブ＞
ｐＥＴ３２ベクターに発光酵素（ＮａｎｏＬｕｃまたはｐｉｃＡＬｕｃ３０）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ）－Ｓｅｒ－ＹＦＰを挿入した（図２２）。このプラスミドを用いて、実験１０と同じ方法でタンパク質を発現および精製した。融合タンパク質を、ＴＥＶプロテアーゼ（コスモ・バイオ株式会社）によって３０℃で一晩反応させた。プロテアーゼを添加しない溶液をコントロールとした。プロテアーゼ処理後のタンパク質をＰＢＳで４０ｎＭに希釈し、基質としてセレンテラジンｈ（５００ｎＭ）と反応させた。発光酵素の波長ピークは４８８ｎｍ程度、ＹＦＰの波長ピークは５２７ｎｍ程度に検出される。発光酵素としてＮａｎｏＬｕｃを使用したときのスペクトルを図２３に、発光酵素としてｐｉｃＡＬｕｃ３０を使用したときのスペクトルを図２４に示す。

ＮａｎｏＬｕｃの発光の最大値を１００％とし、ＢＲＥＴ ｒａｔｉｏを算出した。その結果、ＮａｎｏＬｕｃ含むプローブのＢＲＥＴ ｒａｔｉｏは２６％であり（図２５）、ｐｉｃＡＬｕｃ３０を含むプローブのＢＲＥＴ ｒａｔｉｏは４４％であった（図２６）。ＢＲＥＴ効率は発光酵素と蛍光タンパク質の距離の６乗に反比例する。ｐｉｃＡＬｕｃのサイズがＮａｎｏＬｕｃと比較して小さいため、ＡＬｕｃ３０はＮａｎｏＬｕｃと比べて高いＢＲＥＴ ｒａｔｉｏが得られたと考えられる。本発明に係るポリペプチドが、ＢＲＥＴ分子プローブとして有用であることが示唆された。

［態様］
上述した複数の例示的な実施形態および実施例は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

（第１項）
発光酵素活性を有する、（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸残基が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列。

第１項のポリペプチドによれば、発光活性を維持しながら、サイズが小さい発光酵素を得ることができる。

（第２項）
第１項に記載のポリペプチドにおいて、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列を含む。

第２項のポリペプチドによれば、発光活性を維持しながら、よりサイズが小さい発光酵素を得ることができる。

（第３項）
第１項または第２項のポリペプチドにおいて、（ａ）～（ｃ）のいずれかの配列を含む；
（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。

第３項に記載のポリペプチドによれは、発光活性が高い発光酵素を得ることができる。

（第４項）
第１項～第３項に記載のポリペプチドにおいて、温度５０℃、１０分間の熱処理により８０％以上の残存活性を有する。

第４項に記載のポリペプチドによれは、熱安定性が高い発光酵素を得ることができる。

（第５項）
第１項～第４項のポリペプチドにおいて、発光酵素活性は、セレンテラジンを基質としたときに発光の波長ピークが４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下である、または
セレンテラジンｈを基質としたときに発光の波長ピークが４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下である。

第５項に記載のポリペプチドによれば、発光スペクトルが長波長側にシフトしているため、発光の生体透過性がよく、検出感度に優れる。また、第５項に記載のポリペプチドはライブイメージングに好適である。

（第６項）
第１項～第５項のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。

第６項に記載の核酸によれば、第１項～第５項に記載のポリペプチドを製造することができる。

（第７項）
第６項に記載の核酸を含むベクター。

第７項に記載のベクターによれば、第６項に記載の核酸を容易に増幅および維持することができる。また、第７項に記載のベクターを用いて、第１項～第５項のポリペプチドを製造することもできる。

（第８項）
第６項に記載の核酸が導入された形質転換細胞。

第８項に記載の形質転換細胞は、発光酵素を発現できる。発光酵素は上清中に分泌されてもよい。

（第９項）
第１項～第５項のいずれかに記載のポリペプチドからなる、レポータータンパク質。

第１項～第５項のいずれかに記載のポリペプチドは、レポータータンパク質として使用することができる。

（第１０項）
第９項に記載のレポータータンパク質を用いたレポーター分析法。

第１０項に記載のレポーター分析法によれば、標的タンパク質や標的遺伝子の挙動を効率的に検出することができる。第１０項に記載のレポーター分析法において、公知のレポーター分析法に使用される発光酵素の代わりに、第１項～第５項のいずれかに記載のポリペプチドを発光酵素として用いることができる。

（第１１項）
第１項～第５項のいずれかに記載のポリペプチドと、標的タンパク質または標的タンパク質に結合するタンパク質と、を含む融合タンパク質。

第１１項に記載の融合タンパク質によれば、標的タンパク質の挙動を発光により検出することができる。

（第１２項）
第１１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。

第１２項に記載のベクターによれば、第１１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を容易に増幅および維持することができる。第１２項に記載のベクターを用いて、第１１項に記載の融合タンパク質を容易に製造することができる。

（第１３項）
第１項～第５項のいずれかに記載のポリペプチドと、蛍光物質とを備えた、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）分子プローブ。

第１３項に記載の分子プローブによれば、プロテアーゼなどを高感度に検出することができる。

Claims (13)

1. 発光酵素活性を有する、（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
   （Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
   （Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸残基が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列。
2. 配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. （ａ）～（ｃ）のいずれかの配列を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド；
   （ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列、
   （ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
4. 前記発光酵素活性は、温度５０℃、１０分間の熱処理により８０％以上の残存活性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
5. 前記発光酵素活性は、セレンテラジンを基質としたときに発光の波長ピークが４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下である、または
   セレンテラジンｈを基質としたときに発光の波長ピークが４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下である、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
6. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
7. 請求項６に記載の核酸を含むベクター。
8. 請求項６に記載の核酸が導入された形質転換細胞。
9. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドからなる、レポータータンパク質。
10. 請求項９に記載のレポータータンパク質を用いたレポーター分析法。
11. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドと、標的タンパク質または標的タンパク質に結合するタンパク質と、を含む融合タンパク質。
12. 請求項１１に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。
13. 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドと、蛍光物質とを備えた、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）分子プローブ。
    

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