JP2024051572A

JP2024051572A - 発光酵素活性タンパク質

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Publication number: JP2024051572A
Application number: JP2022157809A
Authority: JP
Inventors: 有紀大室; 忠臣古田
Original assignee: Shimadzu Corp; Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Shimadzu Corp; Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2024-04-11

Abstract

【課題】小さい分子量でありながら、発光値の高い新たな発光酵素を提供すること。【解決手段】本発明として、例えば、次の（Ｉ）に記載のオリゴペプチドが、次の（ＩＩ）に記載のポリペプチドのＣ末端に連結している構造のアミノ酸配列を、分子内に含むことを特徴とする、発光酵素活性タンパク質を挙げることができる。（Ｉ）極性アミノ酸をＣ端に有するオリゴペプチド、（ＩＩ）カイアシ類由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、発光酵素活性を有するポリペプチド。【選択図】図１

Description

本発明は、発光酵素の技術分野に属する。本発明は、発光酵素活性を有するタンパク質に関するものである。

従来、基礎生物学、医療診断、薬剤スクリーニング、食品・衛生管理等の分野において、標的を検出するためのレポータータンパク質として、発光酵素が利用されている。発光酵素は、基礎生物学においては、レポーターアッセイ・イメージングに利用され、標的の発現量・発現場所等が解析されている。医療診断においては、疾病マーカーの検出等に利用され、薬剤スクリーニングにおいては、薬剤の標的、または標的関連因子に融合させることで、薬剤の効果が解析されている。また、食品・衛生管理が必要な場所においては、発光酵素は菌等の検出に利用されている

レポータータンパク質の他の利用例としては蛍光タンパク質等が挙げられるが、蛍光タンパク質を利用して観察等を行うためには励起光が必要であるのに対し、発光酵素は励起光を必要としないという特徴がある。そのため、蛍光タンパク質と比較して発光酵素は、１）生体・細胞に対する励起光照射による光毒性がない、２）励起光照射による細胞の自家蛍光が見られないため、バックグラウンドシグナルが低い、３）励起光がバックグランドシグナルとなることがない、４）測定機械に励起光照射機を搭載する必要がない、といった長所がある。

発光酵素は、そのサイズ（分子量）が大きいと、発光酵素と標的タンパク質との融合タンパク質が細胞内で正常に発現しなかったり、立体障害により標的タンパク質が正常に機能しないことがある。また、サイズが大きい発光酵素は、発光値が低分子化合物の影響を受けやすく、薬剤スクリーニングに適さない。さらに、生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を利用して分子間相互作用の解析を行う場合、シグナルの強度は、発光酵素と蛍光タンパク質との間の距離の６乗に反比例するため、発光酵素のサイズが小さいほどシグナルがより強くなる。

したがって、発光酵素のサイズの小ささは、１）発現が容易であること、２）標的・標的結合因子に対する立体障害が小さいこと、３）低分子化合物の影響を受けにくいこと、４）ＢＲＥＴを利用した分子間相互作用検出等において、シグナルが大きくなることといった長所に繋がる。そのため、より小さいサイズの発光酵素が望まれている。これまでに、本発明者らは、実用レベルの明るさの発光特性を持つ発光酵素の中で、世界最小サイズの発光酵素（ｐｉｃＡＬｕｃ（登録商標、以下同じ。））を開発した（非特許文献１）。

ACS Chem. Biol., 2022, Vol.17, Issue 4, p.864-872

一般に、発光酵素は、蛍光タンパク質と比較して発光値が小さい（暗い）傾向にあるため、非特許文献１に記載の発光酵素をはじめとする小型発光酵素に匹敵するようなサイズ（分子量）を有しながらも、より明るい発光特性を有する発光酵素の開発が望まれている。

本発明は、小さい分子量でありながら、より発光値の高い新たな発光酵素を提供することを主な課題とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、Ｃ末端に極性アミノ酸（好ましくは、電荷を持つアミノ酸）を有するオリゴペプチドを、カイアシ類由来のポリペプチド構造を含有する発光酵素（ｐｉｃＡＬｕｃ等）のＣ末端に付加することで、発光酵素の発光値が上昇することを見出し、本発明を完成するに到った。
本発明として、例えば、以下の態様を挙げることができる。
［１］発光酵素活性を有するタンパク質であって、次の（Ｉ）に記載のオリゴペプチドが、次の（ＩＩ）に記載のポリペプチドのＣ末端に連結している構造のアミノ酸配列を、分子内に含むことを特徴とする、タンパク質；
（Ｉ）極性アミノ酸をＣ末端に有するオリゴペプチド、
（ＩＩ）カイアシ類由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、発光酵素活性を有するポリペプチド。
［２］前記極性アミノ酸が、電荷を有するアミノ酸である、上記［１］に記載のタンパク質。
［３］前記オリゴペプチドを構成するアミノ酸残基数が、４～１５の範囲内である、上記［１］に記載のタンパク質。
［４］前記ポリペプチドが、次の（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、上記［１］に記載のタンパク質；
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸残基が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列。
［５］前記ポリペプチドが、上記（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列を含むポリペプチドである、上記［１］に記載のタンパク質。
［６］前記ポリペプチドが、次の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の配列を含むポリペプチドである、上記［１］に記載のタンパク質；
（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
［７］上記［１］～［６］のいずれか一項に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸。
［８］上記［１］～［６］のいずれか一項に記載のタンパク質を発現させるための遺伝子配列が挿入された発現ベクター。
［９］上記［１］～［６］のいずれか一項に記載のタンパク質を発現させるための遺伝子配列が導入された形質転換細胞。
［１０］上記［１］～［６］のいずれか一項に記載のタンパク質と、標的タンパク質または標的タンパク質に結合するタンパク質とを含む、融合タンパク質。
［１１］上記［１０］に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸。
［１２］上記［１０］に記載の融合タンパク質を発現させるための遺伝子配列が挿入された発現ベクター。
［１３］上記［１０］に記載の融合タンパク質を発現させるための遺伝子配列が導入された形質転換細胞。
［１４］上記［１］～［６］のいずれか一項に記載のタンパク質と、蛍光物質とを備えた、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）プローブ。

［１５］発光酵素のアミノ酸配列の末端に対して、極性アミノ酸を末端に有するオリゴペプチドのアミノ酸配列を連結することを特徴とする、発光酵素の発光値向上方法。

本発明によれば、分子量が小さいながらも発光値が向上された発光酵素を提供することができる。また、本発明によれば、ｐｉｃＡＬｕｃ等の発光酵素に対して、サイズの増加を最小限にしながらも発光値を向上させることができる。

横軸に表記した各基質濃度における各発光酵素の発光値を示すグラフである（実験１）。縦軸は発光値（ｓ^－１）を示す。横軸に表記した各オリゴペプチドをｐｉｃＡＬｕｃ３０のＣ末に付加した構造の各発光酵素ついて、その発光値を示すグラフである（実験２）。縦軸は発光値（１０^８・ｓ^－１）を示す。ｐｉｃＡＬｕｃ３０（ＷＴ）と、横軸に表記した各オリゴペプチドをｐｉｃＡＬｕｃ３０のＣ末に付加した構造の各発光酵素とについて、その発光値を示すグラフである（実験２）。縦軸は発光値（１０^７・ｓ^－１）を示す。ＷＴと、横軸に表記した各アミノ酸をオリゴペプチドのＣ末に付加した構造の各発光酵素とについて、その発光値を示すグラフである（実験３）。縦軸は発光値（１０^７・ｓ^－１）を示す。横軸に表記した各オリゴペプチドをｐｉｃＡＬｕｃ３０のＣ末に付加した構造の各発光酵素ついて、その発光値を示すグラフである（実験４）。縦軸は発光値（１０^８・ｓ^－１）を示す。ＷＴと、横軸に表記した各アミノ酸をオリゴペプチドのＣ末に付加した構造の各発光酵素とについて、その発光値を示すグラフである（実験４）。縦軸は発光値（１０^６・ｓ^－１）を示す。各基質濃度における各発光酵素の発光値を示すグラフである（実験４）。横軸は基質濃度（μＭ）、縦軸は発光値（１０^８・ｓ^－１）を示す。

以下、本発明について詳述する。
１本発明に係るタンパク質
本発明に係るタンパク質（以下、「本発明タンパク質」という。）は、発光酵素活性を有するタンパク質であって、次の（Ｉ）に記載のオリゴペプチドが、次の（ＩＩ）に記載のポリペプチドのＣ末端に連結している構造のアミノ酸配列を、分子内に含むことを特徴とする。
（Ｉ）極性アミノ酸をＣ末端に有するオリゴペプチド。
（ＩＩ）発光酵素活性を有するポリペプチドであって、カイアシ類由来のアミノ酸配列を含むポリペプチド。

本発明タンパク質は、発光酵素活性を有する。
発光酵素（ルシフェラーゼ）とは、発光基質（ルシフェリン）を酸化する酵素であり、その酸化過程において発光を生ずる。本明細書における発光酵素活性とは、発光酵素と基質による酵素反応の活性を表し、基質が発光酵素との酵素反応によって励起状態になった後、基底状態に戻る際に発する光（発光スペクトル）を検出することによって測定される。基底状態に戻る際に発する光は、公知のルミノメーター（例えばＰｒｏｍｅｇａ社製、「ＧｌｏＭａｘ」シリーズ）、または分光光度計（例えばＴＥＣＡＮ社製、「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯ」）を用いて検出することができる。特定の波長での強度を毎分計測することで、発光の経時的変化およびその安定性を検出することができる。発光の長波長へのシフトは、全波長を測定することにより検出することができる。

発光酵素活性のｐＨおよび温度は、公知の発光酵素（例えばカイアシ類の発光酵素または人工発光酵素）と同じであってよい。これらの指標について、本発明タンパク質の発光酵素活性の至適値は、カイアシ類の発光酵素活性の至適値と同じであってもよい。例えば、発光酵素活性のｐＨは５．０～９．５の範囲内が適当であり、至適ｐＨは７．０である。温度は４℃～３０℃の範囲内が適当であり、至適温度は２５℃である。

発光基質は特に限定されず、発光酵素に合わせて適宜選択することができる。発光基質は、セレンテラジン系、ホタルルシフェリン系、ウミホタルルシフェリン系、フリマジン等公知の基質であってよいが、好ましくはセレンテラジン系の基質である。セレンテラジン系の基質としては、例えば、天然型のセレンテラジン、セレンテラジンｉｐ、セレンテラジンｉ、セレンテラジンｈｃｐ、セレンテラジン４００Ａ、セレンテラジン、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｎ等が挙げられる。発光基質は、好ましくはセレンテラジンまたはセレンテラジンｈを含む。

１．１オリゴペプチド
本発明タンパク質は、極性アミノ酸をＣ末端に有するオリゴペプチド（以下、「本発明構成オリゴペプチド」という。）を分子構造上に含む。

本発明構成オリゴペプチドのアミノ酸残基数に特に制限はないが、例えば、４～１５の範囲内であることが適当である。中でも、５～１２の範囲内であることが好ましく、６～１０の範囲内であることがより好ましい。

ここで「極性アミノ酸」とは、極性ないし親水性の側鎖を有するアミノ酸をいい、そのような側鎖を有する限り、電荷（チャージ）を有するアミノ酸および電荷（チャージ）を有しないアミノ酸の何れもが含まれる。

極性アミノ酸の中、電荷を有するアミノ酸とは、中性ｐＨの水溶液中においてイオン化して正電荷または負電荷を有するアミノ酸をいい、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸の何れもが含まれる。塩基性アミノ酸としては、具体的には、例えば、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）を挙げることができる。酸性アミノ酸としては、具体的には、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）を挙げることができる。

電荷を有しない極性アミノ酸（極性無電荷アミノ酸）としては、具体的には、例えば、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）を挙げることができる。

上記の中でも、極性アミノ酸としては、電荷を有するアミノ酸、即ち、塩基性アミノ酸（正電荷を有するアミノ酸）または酸性アミノ酸（負電荷を有するアミノ酸）であることが好ましい。極性の高いアミノ酸をＣ末端に有するオリゴペプチドを含むことにより、その極性の高いアミノ酸と酵素内基質結合部位付近との相互作用により酵素活性を安定化し、基質をより適切にバインディングすることができるようになると考えられ、本発明タンパク質をより高い発光値を示す明るい発光酵素とすることができる。

なお、当該極性アミノ酸は、本発明構成オリゴペプチドのアミノ酸配列のＣ末端に存在するが、本発明タンパク質分子内においては、当該極性アミノ酸のＣ末端にさらに他のアミノ酸またはペプチド（ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド等）が連結した構造となっていてもよい。当該他のアミノ酸またはペプチドの例としては、後掲の表４に例示されるような抗体認識部位や、後掲の表５に例示されるようなシグナルペプチド等の、機能性ペプチドを挙げることができる。また、このような本発明構成オリゴペプチドのＣ末端の極性アミノ酸から突出した部分のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数としては、例えば、１～２０個から１～５個ないし１～３個程度を挙げることができる。このような分子構造のものも、本発明タンパク質に含まれ得る。

１．２ポリペプチド
本発明タンパク質は、カイアシ類由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、発光酵素活性を有するポリペプチド（以下、「本発明構成ポリペプチド」という。）を分子構造上に含む。本発明タンパク質においては、本発明構成ポリペプチドのＣ末端に本発明構成オリゴペプチドが連結している。

ここで「カイアシ類由来のアミノ酸配列」とは、橈脚亜綱（カイアシ亜綱、Ｃｏｐｅｐｏｄａ）に属する生物（カイアシ類）が有するアミノ酸配列の少なくとも一部のことをいう。本発明構成ポリペプチドは、カイアシ類が有する発光酵素におけるアミノ酸配列の少なくとも一部を含んでいることが適当である。カイアシ類由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、発光酵素活性を有するポリペプチドとしては、例えば、ＴｕｒｂｏＬｕｃ、ＧＬｕｃ、ＭＬｕｃ、ＡＬｕｃ（登録商標）、ｐｉｃＡＬｕｃ（登録商標）が挙げられる（特開２０１４－１００１３７号公報、国際公開第２０１７／０５７７５２号パンフレット、Mol.Biol.Evol.29(6):1669-1681.2012、非特許文献１等参照。）。

本発明構成ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列、または当該配列の少なくとも一部が欠損したアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。中でも、本発明構成ポリペプチドは、後述のような、配列番号１で表されるアミノ酸配列の少なくとも一部が欠損したアミノ酸配列を含んでいることがより好ましい。

ここで、配列番号１中のＸで表されるアミノ酸残基のうち、３、２０－２９、３１、３２、３５、３７、６４－６６、６９、７６－７７、８５－８６、８９－９０、１２９、１４０－１４４、１４８－１５１、１５９、１６１、１８８、１９１、２０２、２０６位のアミノ酸残基はどのようなアミノ酸であってもよい。このうち、２２－２３、３９－４０、７６－７７、１４０、１４８－１５１位のアミノ酸残基は欠失していてもよい。好ましくは、３位のアミノ酸残基がＥまたはＧであり、２０－２９位のアミノ酸残基がＰＴＥＮＫＤＤＩ配列（２残基欠失、配列番号２）、ＡＴＩＮＥＥＤＩ配列（２残基欠失、配列番号３）、ＡＴＩＮＥＮＦＥＤＩ配列（配列番号４）、ＨＨＨＨＨＨＨＨ配列（２残基欠失、配列番号５）、ＥＫＬＩＳＥＥ配列（２残基欠失、配列番号６）、ＭＭＹＰＹＤＶＰ配列（２残基欠失、配列番号７）またはＭＭＤＹＫＤＤＤ配列（２残基欠失、配列番号８）であり、３１位のアミノ酸残基がＩ、Ｌ、ＹまたはＫであり、３２位のアミノ酸残基がＶまたはＡであり、３５位のアミノ酸残基がＥまたはＧであり、３７位のアミノ酸残基がＫまたはＳであり、６４－６６位のアミノ酸残基がＡＮＳ配列またはＤＡＮ配列であり、６９位のアミノ酸残基がＤまたはＧであり、７６－７７位のアミノ酸残基がＧＧ配列若しくはＫ（１残基欠失）であるかまたは欠失していてもよく、８５－８６位のアミノ酸残基がＬＥ、ＫＡまたはＫＥ配列であり、８９－９０位のアミノ酸残基がＫＥ配列、ＩＥ配列、ＬＥ配列またはＫＩ配列であり、１２９位のアミノ酸残基がＥ、ＧまたはＡであり、１４０－１４４位のアミノ酸残基がＴＥＥＥＴ配列（配列番号９）、ＧＥＡＩ配列（１残基欠失、配列番号１０）またはＶＧＡＩ配列（１残基欠失、配列番号１１）であり、１４８－１５１位のアミノ酸残基がＧＶＬＧ配列（配列番号１２）もしくはＩ（３残基欠失）であるかまたはすべて欠失してもよく、１５９位のアミノ酸残基がＤ、Ｅ、Ｎ、Ｆ、ＹまたはＷであり、１６１位のアミノ酸残基がＥ、ＡまたはＬであり、１８８位のアミノ酸残基がＫ、Ｆ、ＹまたはＷであり、１９１位のアミノ酸残基がＤ、Ａ、Ｎ、Ｆ、ＹまたはＷであり、２０２位のアミノ酸残基がＡまたはＫであり、２０６位のアミノ酸残基はＳ、Ｄ、Ｎ、Ｆ、ＹまたはＷである。

配列番号１の１３、１６、１７４、２１８位のアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸（例えば、Ｖ、Ｆ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｇ。）であって、好ましくは、１３位のアミノ酸残基がＶまたはＦであり、１６位のアミノ酸残基がＶまたはＡであり、１７４位のアミノ酸残基がＶまたはＡであり、２１８位のアミノ酸残基がＡまたはＬである。

配列番号１の５、６７、７５、１０１、１１９、２１４位のアミノ酸残基は、親水性アミノ酸（例えばＱ、Ｋ、Ｄ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、Ｔ。）であって、好ましくは、５位のアミノ酸残基がＱまたはＫであり、６７位のアミノ酸残基がＤまたはＲであり、７５位のアミノ酸残基がＫ、Ｈ、ＲまたはＥであり、１０１位のアミノ酸残基がＴまたはＨであり、１１９位のアミノ酸残基がＫ、ＥまたはＱであり、２１１位のアミノ酸残基がＫまたはＴである。

配列番号１の４、６、７、１０、１１、１５、３３、３４、３９－４１、６３、６８、７４、７８、８３、１３７、１６０、２０３位のアミノ酸残基は、脂肪族アミノ酸である。ただし、３９、４０、７０位のアミノ酸残基は、欠失していてもよい。４、６、７、１０、１１、１５、３４、６３、７８、８３、１６０位のアミノ酸残基は、好ましくは高分子量脂肪族アミノ酸（例えば、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｍ。）であるが、低頻度に低分子量脂肪族アミノ酸が入る場合もある。より好ましくは、４位のアミノ酸残基がＩまたはＶであり、６位のアミノ酸残基がＶまたはＬであり、７位のアミノ酸残基がＬまたはＩであり、１０位のアミノ酸残基がＬまたはＶであり、１１位のアミノ酸残基がＩまたはＬであり、１５位のアミノ酸残基がＬまたはＶであり、３４位のアミノ酸残基がＩまたはＶであり、６３位のアミノ酸残基がＬまたはＶであり、７８位のアミノ酸残基がＬまたはＭであり、８３位のアミノ酸残基がＬまたはＭであり、１６０位のアミノ酸残基がＬまたはＭである。３３、３９－４１、６８、７４、１３７、２０３位のアミノ酸残基は、好ましくは低分子量脂肪族アミノ酸（例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ）であるが、低頻度に高分子量脂肪族アミノ酸が入る場合もある。より好ましくは、３３位のアミノ酸残基がＧ、ＬまたはＡであり、３９位のアミノ酸残基がＧもしくはＡであるかまたは欠失していてもよく、ＳまたはＦであり、４０位のアミノ酸残基がＴであるかまたは欠失していてもよく、４１位のアミノ酸残基がＴまたはＡであり、６８位のアミノ酸残基がＡまたはＧであり、７４位のアミノ酸残基がＧであるかまたは欠失していてもよく、１３７位のアミノ酸残基がＧまたはＡであり、２０３位のアミノ酸残基がＴまたはＧである。

配列番号１の７２、７３、９７、１１０位のアミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸。例えば、Ｋ、Ｒ、Ｈ。）である。ただし、７２位および７３位のアミノ酸残基は、欠失していてもよい。好ましくは、７２位および７３位のアミノ酸残基がＲであるかまたは欠失していてもよく、９７位のアミノ酸残基がＫまたはＲであり、１１０位のアミノ酸残基がＨまたはＫである。

配列番号１の６２位および２１１位のアミノ酸残基は、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸。例えば、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ。）であり、好ましくは、６２位のアミノ酸残基がＮまたはＤであり、２１１位のアミノ酸残基がＱまたはＥである。

本発明構成ポリペプチドの一態様は、
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を含むものである。

本発明構成ポリペプチドの一態様は、
（Ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が１４０個以下であってもよい。本発明構成ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸残基からなってもよい。

（Ａ２）本発明構成ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸残基を含み、ポリペプチドの分子量が２０ｋＤａ以下であってもよい。

本発明構成ポリペプチドの一態様は、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸残基が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列を含むものである。

本発明構成ポリペプチドの一態様は、
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０位～２２１位のアミノ酸残基を含み、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列であってよい。本発明構成ポリペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～２２１位のアミノ酸残基からなり、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたポリペプチドであってもよい。

本発明構成ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損していてもよく、７０位～７４位のアミノ酸残基の全てが欠損していてもよい。

本発明構成ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４６位～１５６位のアミノ酸残基が、好ましくは２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上または７個以上欠損している。欠損した部位に１～数塩基のリンカー配列が挿入されていてもよい。本発明構成ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４６位～１５６位の間のアミノ酸残基数が６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下または０個であってもよい。

本発明構成ポリペプチドの分子量は、好ましくは２０ｋＤａ以下であり、より好ましくは１８ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは１５ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは１４ｋＤａ以下であり、特に好ましくは１３ｋＤａ以下である。本発明構成ポリペプチドの分子量は、例えば１０ｋＤａ以上である。

本発明構成ポリペプチドのアミノ酸残基数は、例えば１６０個以下であり、好ましくは１５５個以下、１５０個以下、１４６個以下、１４３個以下、１４０個以下、１３６個以下、１３３個以下、１３０個以下、１２６個以下、１２３個以下、１２２個以下、１２１個以下、１２０個以下、１１９個以下、１１８個以下、１１７個以下である。本発明構成ポリペプチドのアミノ酸残基数は、例えば１００個以上である。

配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する発光酵素の具体例として、例えば、表１（１Ａ～１Ｈ）に示される発光酵素群が挙げられる。配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する発光酵素は、１位～１９位（分泌シグナル）、２０位～３１位（抗原認識部位等）、２１７位～２２１位（ＧＳリンカー配列）のアミノ酸残基の一部または全部が欠損していてもよい。

配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１－７１位の領域として、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を有してもよい。この配列を有する発光酵素の典型例として、ＡＬｕｃ１５、ＡＬｕｃ１６、ＡＬｕｃ１７、ＡＬｕｃ１８、ＡＬｕｃ２４が挙げられる。

配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１－１５７位の領域として、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を有してもよい。この配列を有する発光酵素の典型例として、ＡＬｕｃ２２、ＡＬｕｃ２５、ＡＬｕｃ２６、ＡＬｕｃ２７、ＡＬｕｃ２８、ＡＬｕｃ２９が挙げられる。

本発明構成ポリペプチドは、（ａ）配列番号５１～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むことが好ましく、表２（配列番号５１～５６）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなってもよい。配列番号５１で表されるアミノ酸配列は、人工発光酵素のひとつであるＡＬｕｃ３０のアミノ酸配列から、Ｎ末端およびＣ末端を除いた配列である。配列番号５４で表されるアミノ酸配列は、ＡＬｕｃ３０のアミノ酸配列から、Ｎ末端配列および中間の配列を除いた配列である。同様に、配列番号５２および５３で表されるアミノ酸配列は人工発光酵素の一つであるＡＬｕｃ１６およびＡＬｕｃ４８のアミノ酸配列から、それぞれＮ末端およびＣ末端を除いた配列である。配列番号５５および５６で表されるアミノ酸配列は、ＡＬｕｃ１６およびＡＬｕｃ４８のアミノ酸配列から、それぞれＮ末端配列および中間の配列を除いた配列である。

本発明構成ポリペプチドは、（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号５１～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなってもよい。本発明構成ポリペプチドは、配列番号５１～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。

本発明構成ポリペプチドは、（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号５１～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなってもよい。本明細書において数個とは、例えば２～２０個、２～１０個、２～５個、または２～３個であってよい。

上記（ａ）～（ｃ）のいずれかの配列を含む本発明構成ポリペプチドによれば、発光活性が高い本発明タンパク質を得ることができる。

本発明タンパク質または本発明構成ポリペプチドは、１位のアミノ酸残基の前に、開始コドンに相当するアミノ酸（多くはメチオニン）を含んでもよい。配列番号５１～５６のアミノ酸配列の１位にメチオニンが付加された配列を表３（配列番号５７～６２）に示す。

本発明構成ポリペプチドの一態様は、下記（ａ１）～（ｃ１）を含んでもよく、下記（ａ１）～（ｃ１）からなってもよい。
（ａ１）配列番号５７～６２のいずれかで表されるアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号５７～６２のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ１）配列番号５７～６２のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
ポリペプチドは、配列番号５７～６２のいずれかにで表されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。

１．３本発明タンパク質の諸物性
本発明によれば、発光酵素（本発明構成ポリペプチド）の小さいサイズを可及的に維持したまま、発光値を向上させることができる。小さい発光酵素であれば、発光酵素と、標的タンパク質または抗体等との融合タンパク質を細胞内で発現させた場合、融合タンパク質が正常に発現しやすく、また、標的タンパク質が正常に機能しない可能性を下げることができる。小さい発光酵素は、発光値が低分子化合物の影響を受けにくいため、薬剤またはリガンドスクリーニングのレポータータンパク質に好適に用いることができる。生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を利用して分子間相互作用の解析を行う場合にも、小さい発光酵素を用いれば、強いシグナルを検出することができる。小さい発光酵素は、分泌型の発光酵素に用いられ得る。分泌型の発光酵素によれば、発光値の測定のために細胞を溶解する必要がなく、遺伝子発現の経時的変化を測定することができる。小さい発光酵素は、細胞内で発現しやすいため、大量の発現および精製を行うことができる。小さい発光酵素は、様々な発現系で発現が可能である。また、小さい発光酵素は、構造安定性にも優れる。

本発明タンパク質は、高い発光値を有することができる。本発明タンパク質は、発光のピーク値が好ましくは公知の発光酵素、例えばＮａｎｏＬｕｃ、ＡＬｕｃ等と同程度以上である。発光値が高い発光酵素は、発光の高感度検出が可能であり、検出限界濃度を低くすることができる。

本発明タンパク質は、好ましくは熱安定性が高く、例えば温度５０℃、１０分間の熱処理により８０％以上の残存活性を有し、好ましくは温度６０℃、１０分間の熱処理により８０％以上の残存活性を有する。熱安定性が高い発光酵素は、輸送時等の温度上昇に対して失活しにくく、診断および検査等の現場において実用性に優れる。

本発明タンパク質の酵素活性は、好ましくは発光スペクトルの長波長側の裾野が広く、例えば従来のカイアシ類の発光酵素に比べて発光スペクトルが長波長側にシフトする。長波長は生体透過性に優れるため、検出感度に優れる。長波長側の裾野が広い発光スペクトルを有する発光酵素は、ライブイメージングに適する。本発明タンパク質は、セレンテラジンを基質としたときに発光の波長ピークが好ましくは４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下であり、より好ましくは約４８２ｎｍである。本発明タンパク質は、セレンテラジンｈを基質としたときに発光の波長ピークが好ましくは４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下であり、より好ましくは約４８８ｎｍである。

本発明タンパク質は、その内部または端部に抗体認識部位を有してもよい。抗体認識部位の例としては、表４に示したものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端に機能性ペプチドを付加していてもよい。例えばＮ末端またはＣ末端に、細胞膜局在化シグナル（ｍｅｍｂｒａｎｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ；ＭＬＳ）をつけることによって発光酵素を細胞膜に局在させることができる。なお、本明細書において、特に明記していない場合でも、シグナルペプチドを含め２種類以上のペプチドを結合する場合には、適宜周知のリンカーを用いてその長さ、読み枠などを調節してもよい。発光酵素が細胞膜に局在することによって、外部からの基質や酸素の供給が円滑になり、発光酵素を基盤とした発光プローブ（例えば、発光カプセル）においては、外部の信号に速やかに反応できる利点がある。

２本発明タンパク質をコードする核酸
本発明の一実施形態に係る核酸は、上述の本発明タンパク質をコードする。上述の本発明タンパク質をコードする核酸からは、上述の本発明タンパク質を製造することができる。当該核酸は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。本発明タンパク質をコードする核酸は、上述の本発明タンパク質に対応する塩基配列の５’末端に開始コドンを、３’末端に終止コドンを含んでいてもよい。当該核酸はイントロン配列を含んでもよい。本発明の一実施形態に係る核酸は、化学合成またはＰＣＲ等によって得ることができる。

一実施形態に係る核酸は、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他のコドンに置換した塩基配列を含む核酸が含まれる。ポリペプチドの発現を向上させる観点から、本発明に係る核酸は、宿主生物または形質転換細胞種に適するようにコドン出現頻度（ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ）を変更した塩基配列を含む核酸であってもよい。

３ベクター
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述の核酸を含む。ベクターは、ＤＮＡを増幅または維持できる核酸分子であり、例えば発現ベクターおよびクローニングベクターが挙げられる。一例において、上述の核酸は、発現ベクターに挿入された形で宿主細胞等に導入され、発光酵素活性を有するポリペプチドを発現する。発現ベクターは、組み込まれた遺伝子を発現するためのプロモーター配列およびターミネーター配列を有してもよい。本発明の一実施形態に係るベクターは、上述の核酸を適当なベクターに挿入して得ることができる。

ベクターは、例えば細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、人工染色体ベクター等であってよい。ベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＥＴ系プラスミドベクター等が挙げられる。具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ３２等を挙げることができる。哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えばｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等を挙げることができる。

当該ベクターによれば、上述の核酸を容易に増幅および維持することができる。また、当該ベクターを用いて、本発明タンパク質を製造することもできる。

４形質転換細胞
本発明の一実施形態に係る形質転換細胞は、上述の核酸が導入された細胞である。当該核酸は、ベクターに含まれた形態で細胞に導入されていてもよい。形質転換細胞は、発光酵素を発現することができる。発光酵素は上清中に分泌されてもよい。細胞に核酸を導入する方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオニックリポソーム法などの化学的手法；アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＨＶＪリポソームなどの生物学的手法；エレクトロポレーション、ＤＮＡ直接注射、遺伝子銃などの物理的手法などが例示される。導入する細胞に応じて、適切な導入方法を選択することができる。

核酸が導入される細胞としては、真核生物または原核生物の細胞を挙げることができ、具体的には、細菌、真菌、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞が挙げられる。当該細胞は、酵母、大腸菌または哺乳動物の細胞であってもよい。哺乳動物には、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ等が含まれる。

当該形質転換細胞は、本発明タンパク質（発光酵素）を発現することができる。発光酵素は上清中に分泌されてもよい。

５レポータータンパク質およびレポーター分析法
本発明タンパク質をレポータータンパク質として用いて、レポーター分析を行うことができる。本発明タンパク質は、従来の発光酵素または各種蛍光タンパク質を用いたレポーター分析法において、発光または蛍光物質の代替として用いることができる。

本明細書において、レポータータンパク質とは、細胞内での標的タンパク質、標的核酸または標的遺伝子の挙動を調べるために用いる発光標識である。本明細書においてレポーター分析法とは、本タンパク質をレポータータンパク質として用いて、外部刺激に応じた細胞内における標的タンパク質または標的遺伝子の挙動を、発光の有無もしくは発光量、発光時期またはその発光位置等に置き換えて観察する分析法である。具体的には、レポーター分析法は、標的遺伝子の発現位置、発現時期または発現量を、レポータータンパク質の発光位置、発光時期または発光量として定性的または定量的に測定する方法であるといえる。レポーターアッセイは、異なる波長の光を発する複数の酵素またはタンパク質と多重化して使用してもよい。

レポーター分析は、哺乳動物等の生体内、培養細胞内または試験管内で行い得る。生体内等のｉｎｖｉｖｏ条件で用いる場合には、例えば上述のタンパク質を構成するアミノ酸配列をコードする核酸からなるレポーター遺伝子と標的遺伝子とを繋いでベクターに組み込み、ターゲットとなる細胞内に導入する。培養細胞としては、一般的な遺伝子組換えに用いられる哺乳動物細胞のＣＯＳ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、酵母、大腸菌等の細菌、昆虫細胞が挙げられる。

以下、本発明に係るレポーター分析法を、Ｎｉｕら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２，２０１２，４１３．において示された３つの分類である“ｂａｓｉｃ”、“ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ”および“ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ”の３種類に分けて、本発明タンパク質のそれぞれの分析法への適用について説明する。

５．１ｂａｓｉｃ法
ｂａｓｉｃ法とは、もっとも単純なレポーター分析系であって、挙動を調べたい標的タンパク質に発光酵素を繋いで標識するレポーター分析系である。本発明タンパク質をレポータータンパク質としてｂａｓｉｃ法に適用する場合、本発明タンパク質と標的タンパク質または標的タンパク質に結合するタンパク質とを含む融合タンパク質を作製すればよい。融合タンパク質が非制御型プロモーターで発現する点が他のレポーター分析法とは異なる。融合タンパク質は、標的タンパク質のｉｎｖｉｖｏイメージングにも使用できる。

融合タンパク質は、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末端にレポータータンパク質を融合して作製される場合が典型的であるが、Ｎ末端とＣ末端に２分割したレポータータンパク質と標的タンパク質とが直接または他のペプチド配列を介して融合される場合もある。

融合タンパク質は、（ｉ）本発明タンパク質と、標的タンパク質または標的タンパク質を認識するタンパク質（ペプチドを含む。）とを含む融合タンパク質をコードする核酸から一体として発現させたもの、（ｉｉ）本発明タンパク質と、標的タンパク質または標的タンパク質を認識するタンパク質とを別々に発現させ、これらを化学反応により連結させたものを包含する。別々に発現させたタンパク質等を化学反応により連結させる手段としては、例えばクロスリンカーによる連結、アビジン－ビオチンの結合能を利用した連結、アミノ酸残基の化学反応性を利用した結合などが例示される。

融合タンパク質としては、発光酵素を抗体に繋げた発光酵素標識抗体が挙げられる。この融合タンパク質においては、例えば抗体の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）のｃＤＮＡの上流または下流にレポーター遺伝子を繋げたキメラＤＮＡを作成する。ＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、細胞に導入し、発現させて融合タンパク質を得ることができる。

５．２ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法は、ｂａｓｉｃ法と比較して、レポーターの発現がプロモーターによって制御されている点が異なる。発光酵素をレポータータンパク質としてｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法に適用することは、組換えＤＮＡ技術によって組換えタンパク質が作製される際の遺伝子発現の時期および発現量の解析のために従来から用いられており、特に外部刺激に応答した発現時期および発現量変化を示す指標として広く用いられている。ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法に含まれる分析システムとしては、レポータージーンアッセイ、酵母ツーハイブリットアッセイ、哺乳類ツーハイブリットアッセイ、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）、タンパク質スプライシングアッセイ（ＰＳＡ）、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）、ｃｉｒｃｕｌａｒｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｓｓａｙ等が挙げられる。これらの分析法に用いられるレポーター遺伝子として、本発明のポリペプチドを用いることで、アッセイの計測性能を飛躍的に向上することができる。

５．２．１レポータージーンアッセイ
レポータージーンアッセイ法は、外部刺激による転写因子の活性化および遺伝子の発現調節の解析手段として汎用されている。一例としては核内受容体を介したシグナル伝達を攪乱する内分泌攪乱物質（環境ホルモン）の検出に用いられている。核内受容体を介したシグナル伝達に関連した標的遺伝子（例えば、ホルモン応答性遺伝子）の発現は、リガンドと受容体との複合体が当該遺伝子の転写調節するシス領域（ホルモン応答配列；ｈｏｒｍｏｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ）に結合することで引き起こされる。この各種ホルモン応答性遺伝子のシス領域の下流にレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを細胞内に導入し、リガンドとなり得るホルモン分子または内分泌攪乱物質の量を発光値として検出する。

レポータージーンアッセイ法において、従来から広く用いられていたホタルルシフェラーゼの場合、［１］分子量が大きくて発現までに時間がかかるので、宿主細胞に大きな負担をかけることになり、［２］発光強度が低いため、十分ルシフェラーゼ（レポーター）量が蓄積するまでに、通常刺激後１～２日の時間を待つ必要がある、という欠点があったが、本発明タンパク質をレポータータンパク質として選択することでこれらの問題点が解消される。

本発明タンパク質をレポータータンパク質として使用すれば、レポーターの発光強度が極めて高いため、刺激後にごく短時間で測定ができる利点がある。そのため、従来のレポータータンパク質より大幅に計測時間を短縮でき、かつ経時的な発光の安定性も高いことから、遺伝子導入効率の悪い細胞株においても発光測定を行うことができる。また、発光が長波長側にシフトしているので、細胞膜、皮膚を通しての透過性が高まる。バックグラウンド値が下がるため、測定精度も高い。

例えば、本発明タンパク質をレポータージーンアッセイに適用するためには、上流に特殊なプロモーターを搭載している既知の真核細胞発現ベクターに当該発光酵素を繋いで、真核細胞に導入し、一定時間が過ぎた後、信号（刺激）有り無しの条件で発光値を測定すればよい。本発明タンパク質を搭載することができる、レポータージーンアッセイ用の発現ベクターとしては、公知のｐＴｒａｎｓＬｕｃｅｎｔベクターを利用し、既知の方法を使って簡単に搭載させることができる。

５．２．２ツーハイブリッド法
ツーハイブリッド法（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法）はタンパク質間の相互作用を調べる手法の１つであり、１９８９年に酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いたｙｅａｓｔｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ（Ｙ２Ｈ）システムがまず構築された。転写活性化因子であるＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢＤ）と転写活性化ドメインが分離可能であることを利用して、ＧＡＬ４ＤＢＤと任意のタンパク質Ａ（ｂａｉｔ）を融合タンパク質として発現させ、同時に細胞内で発現させた転写活性化ドメイン（ＴＡ）と融合タンパク質としたタンパク質Ｂ（ｐｒｅｙ）と相互作用をするかどうかを判定することができる。タンパク質Ａとタンパク質Ｂとが結合する場合にはＤＢＤとＴＡが近接してＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、「ＵＡＳＧ」塩基配列に結合するのでその下流に連結したレポーター遺伝子発現を促すことになる。レポーター遺伝子が発光酵素であれば、その特異的な基質存在下で生物発光をモニターすれば、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの両タンパク質の親和性が測定でき、タンパク質Ａ（ｂａｉｔ）と相互作用をするタンパク質またはペプチドのスクリーニングを行うことができる。その際のタンパク質Ｂ（ｐｒｅｙ）は発現ライブラリーによって提供させることもできる。

宿主細胞としては、酵母細胞に限らず、大腸菌など細菌類や、哺乳動物細胞、昆虫細胞も用いられる。その際、酵母由来の転写活性化因子であるＧＡＬ４ＤＢＤ以外に、大腸菌由来のリプレッサータンパク質の「ＬｅｘＡ」等を用いることもできる。これらをコードするＤＮＡと、リガンド応答性転写調節因子のリガンド結合領域などｂａｉｔタンパク質（即ち、前記の任意のタンパク質Ａ）をコードするＤＮＡとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。一方、「転写活性化因子の転写活性化領域」としては、例えば、ＧＡＬ４の転写活性化領域、大腸菌由来のＢ４２酸性転写活性化領域、ヘルペス単純ウイルスＶＰ１６の転写活性化領域等を用いることができる。これら転写活性化領域をコードするＤＮＡと、ｐｒｅｙタンパク質（即ち、前記の任意のタンパク質Ｂ）をコードするＤＮＡとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。

転写調節因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、出芽酵母を宿主細胞において利用可能なベクターとして、プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。ＧＡＬ４の転写活性化領域をコードするＤＮＡを有し、出芽酵母において利用可能なベクターとして、プラスミドｐＧＡＤ４２４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。また、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＢＩＮＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を挙げることができ、単純ヘルペスウィルスＶＰ１６の転写活性化領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＶＰ１６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＡＣＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を挙げることができる。また、ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＬｅｘＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができ、Ｂ４２をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＢ４２ＡＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。

例えば本発明タンパク質を、ＧＡＬ４が結合する領域（「ＵＡＳＧ」）などの下流にレポーター遺伝子として挿入したベクターを構築すればよく、哺乳動物宿主の場合であれば、市販のｐＧ５Ｌｕｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）やｐＦＲ－Ｌｕｃベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を利用し、当該ベクターに搭載されているホタルルシフェラーゼの代わりに周知の方法で簡単に本発明タンパク質を搭載して使用することができる。また、市販のｐＧ５ＣＡＴベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＣｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）の代わりに用いることもできる。

５．３ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ法
ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ法は、レポーター自体がリガンド刺激に能動的に反応して発光することを利用するレポーター分析法である。典型的には、一分子型生物発光プローブ、発光カプセルがあげられ、他にｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｎｔａｔｉｏｎａｓｓａｙ（ＰＣＡ）、ｐｒｏｔｅｉｎｓｐｌｉｃｉｎｇａｓｓａｙ（ＰＳＡ）などに適用することができる。

５．３．１発光性融合タンパク質（発光カプセル）の製造
本発明タンパク質のＣ末端に膜局在シグナル（ＭＬＳ）を結合することで、発光酵素本体を細胞膜に局在させることができる。発光酵素を細胞膜に局在する分子設計を行うことによって、基質と酸素の供給が円滑になるため、極めて高輝度で安定的な生物発光可視化が可能になる。その際、発光酵素本体とシグナルペプチドをコードする核酸の間に任意のポリペプチドやタンパク質の遺伝子をカーゴ（貨物という）として挿入することが可能である。これによりカーゴとなるタンパク質を細胞膜表面に効率的に運ぶことができ、しかも運ばれた場所が光るようになる。一例としては、各タンパク質の繋ぎ目に細胞死に応答するＤＥＶＤ配列やＩＥＴＤ配列をカーゴとして入れ込んだ場合、細胞死の際のｃａｓｐａｓｅ－３やｃａｓｐａｓｅ－８の活性を信号として能動的に応答し、可視化するシステムとして働く。この構造の発光性融合タンパク質を「発光カプセル」ともいう。発光カプセルは、化学物質の毒性評価にも使用することができる。

発光カプセルは、従来の発光プローブと比較し、極めて高輝度で安定な発光特質を示し、細胞膜を透過できない検体に対しても応答する利点を持つ。この発光カプセルは「発光酵素本体のＣ末端」に「膜局在シグナル（ＭＬＳ）」をつけた構造を基本骨格とする。酵素は本発明タンパク質をタンデムに繋いで発光量を増強してもよい。発光カプセルは、細胞死等の細胞表面の形態変化を引き起こす化合物の作用を、細胞膜表面の形態変化として可視化できるため、観察が容易になる。好ましくは、発光酵素本体のＣ末端とＭＬＳとの間に、細胞膜表面の形態変化を引き起こすポリペプチドもしくはその一部認識配列、具体的には、Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）やｃ－Ｓｒｃなどの全長もしくは一部認識配列を挿入することが可能である。発光酵素本体のＣ末端とＭＬＳとの間に細胞死を誘発するポリペプチド、もしくはその認識配列を貨物として挿入することで、細胞死の可視化が可能である。より具体的には、各種ｃａｓｐａｓｅやプロテアーゼ（セリンプロティアーゼ、システインプロティアーゼなど）、消化酵素（トリプシン、アミラーゼなど）によって認識されるペプチド配列（通常２０アミノ酸残基以下、好ましくは１０アミノ酸残基以下）またはＤＥＶＤ配列もしくはＩＥＴＤ配列を含むアミノ酸配列をカーゴとして挿入した場合、ｃａｓｐａｓｅ－３活性による細胞死の可視化が可能である。更に発光酵素本体とＭＬＳとの間に蛍光タンパク質もしくは他の発光酵素をカーゴとしてつなげることによって、細胞膜表面での光発生量が強力となるため、より細胞膜の形態観察が容易となる。発光カプセルは、細胞膜を透過できないリガンドに対しても応答するため、幅広い刺激物に対するスクリーニングが可能である。

発光カプセルは、本発明タンパク質のＣ末端と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、細胞膜表面で発現させたい任意のタンパク質またはポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質であり、典型的には、
（ａ）本発明タンパク質のＣ末端と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、蛍光タンパク質または発光酵素（本発明タンパク質以外の酵素であってよい。）が挿入された発光性融合タンパク質、または
（ｂ）本発明タンパク質のＣ末端と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチドまたは当該ポリペプチドが認識する２０アミノ酸残基以下の、好ましくは１０アミノ酸残基以下のポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質であってもよい。細胞膜の形態を変化させるポリペプチドとして、細胞死を誘発するポリペプチドが好ましく、ｃａｓｐａｓｅおよびその認識配列である「ＤＥＶＤ」または「ＩＥＴＤ」を含む２０アミノ酸残基以下のポリペプチドが特に好ましい。

５．３．２発光プローブへの応用
本発明タンパク質を一分子型発光プローブ、または二分子型発光プローブに組み込むことによって、リガンドの有無およびリガンドの活性強度を高輝度で観測することができる。当該プローブの構成要素として、［１］２つに分割された発光酵素（ＮとＣ末側断片）の近傍に、［２］標的リガンドに応答するリガンド結合タンパク質と、［３］リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質を繋げた形態で高性能の発光プローブを構成することができる。この発光プローブ中、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された酵素断片が相補して酵素活性を変化させることができる。この時、当該分割酵素の高輝度と安定性のため、検出限界の向上と信頼性の高い計測が可能となる。

一分子型発光プローブは、可視化イメージングするために用いられる全構成要素を単一融合分子内に集積したことを特徴とする、公知の生物発光プローブの一つである。例えば、本発明タンパク質を２分割したＮとＣ末側断片を、リガンド結合タンパク質およびリガンド結合タンパク質の認識タンパク質を基本構成要素として含む融合タンパク質である。二分子型発光プローブは、本発明タンパク質のＮ末側断片とＣ末側断片を、リガンド結合タンパク質を含む融合タンパク質、および認識タンパク質を含む融合タンパク質内にそれぞれ存在させたタイプの生物発光プローブを指す。

生物発光プローブにおいて本発明タンパク質を用いる場合には、Ｎ末側断片とＣ末側断片とに２分割する必要があるが、その分割位置は、ＡＬｕｃ１６の１２５／１２６、１２９／１３０、１３３／１３４、１３７／１３８、１４１／１４２、１４６／１４７に相当する切断位置が適用されてもよい。

本発明タンパク質を一分子型発光プローブとして用いる際の具体的な手法は、公知の手法に従う。具体的には、本発明タンパク質を２分割し、リガンド結合性のタンパク質と当該タンパク質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するペプチド配列とを直線上に結合させた発光プローブをコードするキメラＤＮＡを設計する。一般には、そのキメラＤＮＡを発現させたい細胞に適したベクター内にサブクローンし、当該ベクターを細胞内に導入して、細胞内で発現させるが、キメラＤＮＡの上流に制御配列を繋いで細胞内に直接導入することもできる。ここで、対象の細胞としては、ヒトを含めた哺乳動物由来の細胞が好ましく、生体内に存在する状態の細胞であっても、細胞本来の機能を維持した状態の培養細胞であってもよい。酵母細胞、昆虫細胞の他、大腸菌などの原核細胞であってもよい。ベクターの具体的な種類も特に限定されず、発現に用いる宿主中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。細胞内への導入法としては、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等の公知のトランスフェクション法を用いることができる。あるいは脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＳｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｈａｒｉｏｔ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ社）等）を採用することもできる。

本発明タンパク質を用いた生物発光プローブは、キメラＤＮＡとして細胞内に導入された後に細胞内で融合タンパク質として発現されるため、当該形質転換細胞に対してリガンド刺激を行った後、当該細胞からの発光量の変化を測定することによって、リガンドの性質、活性の程度等を評価することができる。

本発明タンパク質を生物発光プローブ内に構成する際、当該ポリペプチドと共に搭載できる「リガンド結合タンパク質」としては、そのリガンド結合部位にリガンドが結合するタンパク質が意図される。リガンド結合タンパク質は、例えば、リガンドが結合することによって立体構造が変化するか、リン酸化を起こすか、タンパク質間相互作用を促すものであり得る。このようなリガンド結合タンパク質としては、例えば、ホルモン、化学物質または信号伝達タンパク質をリガンドとする核内受容体（ＮＲ）、サイトカイン受容体、あるいは各種タンパク質キナーゼが用いられる。リガンド結合タンパク質は、対象とするリガンドによって適宜選択される。リガンド結合タンパク質に結合するリガンドとしては、リガンド結合タンパク質に結合するものであれば特に限定されず、細胞外から細胞内に取り込まれる細胞外リガンドであってもよく、細胞外からの刺激により細胞内で産生される細胞内リガンドであってもよい。細胞外リガンドは、例えば、受容体タンパク質（例えば核内受容体、Ｇタンパク質結合型受容体等）に対するアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。細胞内の情報伝達に関与するタンパク質に特異的に結合するサイトカイン、ケモカイン、インシュリン等の信号伝達タンパク質、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー、リン酸化アミノ酸残基、Ｇタンパク質結合型受容体リガンド等であり得る。

例えば、リガンドとして細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー等を対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、各セカンドメッセンジャーの結合ドメインを使用することができる。セカンドメッセンジャーとは、ホルモン、神経伝達物質等の細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質を意図している。このセカンドメッセンジャーとして、例えば、ｃＧＭＰ、ＡＭＰ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、イノシトール３リン酸（ＩＰ３：ｉｎｏｓｉｔｏｌｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＩＰ４、Ｃａ^２＋、ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｈｉｄ等が挙げられる。例えば、セカンドメッセンジャーのＣａ^２＋に対しては、リガンド結合タンパク質としてカルモジュリン（ＣａＭ）を用いることができる。

５．３．３生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）分子プローブ
本発明タンパク質は、分子同士の相互作用、例えばリガンド－タンパク質相互作用またはタンパク質－タンパク質相互作用を検出するための任意の方法において使用され得る。一実施形態に係るＢＲＥＴ分子プローブは、本発明タンパク質と蛍光物質とを備える。発光ドナーから蛍光受容体へのエネルギー移動は、光の放出のスペクトル分布のシフトをもたらす。このエネルギー移動は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでの分子間相互作用のリアルタイムモニタリングを可能にし得る。一例として、本発明タンパク質と標的分子（標的タンパク質、リガンド、核酸、脂質等）とを接続した融合タンパク質、および標的分子に結合する分子（タンパク質、リガンド、核酸、脂質等）と蛍光物質とを接続した融合タンパク質を作製する。本発明タンパク質と標的分子とは適切なリンカー（例えばペプチド、核酸、ポリマー、エステル結合、ＰＥＧリンカー、炭素鎖等）によって接続されていてよい。標的分子と、標的分子に結合する分子とが近接したときに、本発明タンパク質と蛍光物質とが近接し、ＢＲＥＴシグナルが検出される。ＢＲＥＴ分子プローブを含むアッセイシステムは、発光基質を含んでもよい。標的分子の結合に競合する分子（例えば、標的分子に結合する分子であって蛍光物質と接続されていない分子）を添加することで、ＢＲＥＴシグナルが減少する。ＢＲＥＴシグナルの減少により分子間の相互作用を検出することもできる（競合バインディングアッセイ）。

蛍光物質の吸収スペクトルは、通常、本発明タンパク質の発光スペクトルと重なる。発光酵素の波長ピークは、通常、蛍光物質の波長ピークと隔てられており、例えば８０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１４０ｎｍ程度隔てられていてよい。蛍光物質は蛍光タンパク質、蛍光色素または発色団であってもよい。蛍光物質は、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド等）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン等）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル及びプロダン誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンズオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール等）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０等）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー等）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン等）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン等）、ＣＦｄｙｅ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロゲン）、ＡＬＥＸＡＦＬｕｏＲ（インビトロゲン）、ＤＹＬＩＧＨＴＦＬＵＯＲ（サーモサイエンティフィック、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（シグマアルドリッチ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯＣＹｄｙｅ（ＣＹＡＮＤＹＥ、ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ及びＳＱＵＡＲＥＤＹＥＳ（ＳＥＴＡＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬＦＬＵＯＲｄｙｅｓ（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴＤＹＥＳ（ＡＰＣ、ＲＰＥ、ＰｅｒＣＰ、フィコビリソーム）（ＣｏｌｕｍｂｉａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自動蛍光タンパク（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ）、量子ドットナノクリスタル等が挙げられる。蛍光物質は、ローダミン類似体（例えばカルボキシローダミン類似体）であってもよい。

ＢＲＥＴ分子プローブの他の例として、本発明タンパク質と蛍光物質とを、特定のプロテアーゼで消化されるタンパク質をリンカーとして結合された融合タンパク質が挙げられる。特定のプロテアーゼの非存在下では、発光酵素と蛍光物質とが近接するため、ＢＲＥＴの蛍光シグナルが生じる。特定のプロテアーゼの存在下では、タンパク質が消化されて発光酵素と蛍光物質とが離れるため、消光する。この方法によれば、特定のプロテアーゼの存在を高感度に検出することができる。

５．３．４タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）
本発明タンパク質は、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）または酵素断片化アッセイなどのリガンド－タンパク質相互作用またはタンパク質－タンパク質相互作用あるいは近接を検出するための方法において使用してもよい。ＰＣＡは、２つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。例えば本発明タンパク質を２つに断片化し、近接を検証したい分子にそれぞれ融合させる。標的の分子が相互作用する場合、２つに分断されていたタンパク質は相互作用して完全な発光酵素となり、発光が検出される。

５．３．５細胞内イメージング
本発明タンパク質をコードする遺伝子は、様々な細胞株に安定的に導入され得る。発光酵素を用いた細胞内イメージングは、公知の方法により行えばよい。一例として、胚内未分化細胞、ＥＳ細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に当該ポリペプチドを安定的に導入することができる。

本発明タンパク質に、表５に例示されるような適当なシグナルペプチドを繋げることによって、各細胞小器官の高輝度イメージングに使用することができる。例えば、ＧＡＰ－４３由来の「ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶ配列」（配列番号６３）を本発明タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加すると、細胞膜に局在化できる。「ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列」（配列番号６４）を付加すると細胞質に局在できる。「ＫＤＥＬ」（配列番号６５）の付加により小胞体（ＥＲ）に、「ＤＰＫＫＫＲＫＶ配列」（配列番号６６）の付加により細胞核に局在化させることができる。ＨＩＳ－ｔａｇ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号６７）、ＦＬＡＧ－ｔａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号６８）、Ｍｙｃ－ｔａｇ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号６９）、ＨＡ－ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号７０）、Ｖ５－ｔａｇ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号７１）、Ｔ７－ｔａｇ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）（配列番号７２）などの抗原サイトをつけることによって、非細胞系における免疫染色、分離精製に利用できる。その際には、周知の免疫染色法、ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ等の手法を適用することができる。

本明細書におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ）”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒｅｔａｌ．ｅｄ．，”ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄｅｄ．，Ｖｏｌ．１ｔｏ４，（ＴｈｅＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈＳｅｒｉｅｓ），ＩＲＬＰｒｅｓｓ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕｅｄ．，”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕｅｔａｌ．ｅｄ．，”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，ＰａｒｔＢ）＆１０１（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，ＰａｒｔＣ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕｅｔａｌ．ｅｄ．，”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，ＰａｒｔＤ），１５４（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，ＰａｒｔＥ）＆１５５（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，ＰａｒｔＦ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするＤＮＡについては、既存のデータベース（URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等から入手することができる。

以下、実施例を掲げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実験１＞
ｐｉｃＡＬｕｃ３０（配列番号５１）をコードするＤＮＡ配列の３’末端に、ＥＮＬＹＦＱＳＫ（配列番号７３）、ＥＮＬＹＦＱＳＤ（配列番号７４）をコードするＤＮＡ配列を付加した配列を、ｐＥＴ３２ｖｅｃｔｏｒに挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｅｘｐｒｅｓｓｌｙｓＹ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ）をそのプラスミドで形質転換し、細胞内発現をさせ、ＴＡＬＯＮｍｅｔａｌａｆｆｉｎｉｔｙｒｅｓｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）とＨｉｓＴＡＬＯＮｂｕｆｆｅｒｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）とを使用して、タンパク質精製を行った。付加配列のないｐｉｃＡＬｕｃ（ＷＴ）、ｐｉｃＡＬｕｃ－ＥＮＬＹＦＱＳＫ、ｐｉｃＡＬｕｃ－ＥＮＬＹＦＱＳＤを各々３２０ｎＭ、基質ＣＴＺｈを０．０１２５－１２５ｎＭをＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｔｓ，ＴＡＫＡＲＡ）で希釈して混合し、ルミノメーターＧｌｏＭａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、基質添加直後の発光値を測定した。その結果、付加配列により発光値の上昇が見られた（図１）。

＜実験２＞
表６に記載した付加配列について検討した。各付加配列を付けたｐｉｃＡＬｕｃを発現させたＥ．ｃｏｌｉＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｅｘｐｒｅｓｓｌｙｓＹの培養液５ｍＬに含まれる大腸菌をペレットにし、２００μＬのＢ－ＰＥＲＲｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）に懸濁し、室温で１５分間、ｒｏｔａｔｉｏｎをして大腸菌を溶解後、２００００ｇ、５分間遠心を行い、上清をｌｙｓａｔｅとして回収した。各ｌｙｓａｔｅを電気泳動し、各タンパク質の発現量を確認した。そしてすべてのタンパク質量が同じようになるように、各ｌｙｓａｔｅを希釈し、１２５ｎＭＣＴＺｈと反応直後の発光値を測定した。その結果、付加配列によって、発光値が異なることが明らかになった（図２）。

次に、図２の右４つの付加配列（配列番号１０１～１０４）とＷＴの発光値を同様の方法で比較した結果、ＷＴは、ＧＳＧＤとＧＳＧＳＧＳＧＤの間の発光値を示したことから（図３）、図２で示したほとんどの付加配列によって発光値を向上できることが示された。

＜実験３＞
Ｃ末端にチャージを持つアミノ酸を付けることが発光値上昇に必要であることを確認するために、表７に示すような、ＥＮＬＹＦＱＳＫ（＋チャージ）・ＥＮＬＹＦＱＳＲ（＋チャージ）・ＥＮＬＹＦＱＳＤ（－チャージ）・ＥＮＬＹＦＱＳＥ（－チャージ）とＥＮＬＹＦＱＳＡ（チャージなし）の各付加配列について、発光値を比較した。実験１と同様な方法で精製した各酵素５０ｎＭとＣＴＺｈ１．２５μＭを混合した結果、チャージのある方がチャージのない場合よりも発光値が高いことが確認された（図４）。

＜実験４＞
図２において、比較的高い発光値を示した配列（Ｋ、Ｄを除いた部分）、ＡＮＬＹＦＱＳ・ＥＡＬＹＦＱＳ・ＥＮＡＹＦＱＳ・ＥＮＬＡＦＱＳ・ＥＮＬＹＡＱＳ・ＥＮＬＹＦＡＳ・ＥＮＬＹＦＱＡについて、ＥをＣ末に付けて（表８）、実験２と同様な方法で作製したライセートを使用して検討を行った。

その結果、図２の結果も合わせると、Ｃ末端のチャージを持つアミノ酸がＫ、Ｄ、Ｅのいずれにおいても、ＥＮＬＹＦＱＡを使用した場合に発光値が高いことが示された（図５）。そこで、ＥＮＬＹＦＱＡＫ・ＥＮＬＹＦＱＡＲ・ＥＮＬＹＦＱＡＤ・ＥＮＬＹＦＱＡＥ・ＷＴの発光値を比較した。実験１と同様な方法で精製した各酵素５００ｐＭとＣＴＺｈを５０～２５０μＭの各濃度で混合した結果、ＥＮＬＹＦＱＡＫがもっとも高い発光値を示し、ＷＴと比較して、ＣＴＺｈ２５μＭ使用時は約５０倍（図６）、ＣＴＺｈ６２．５μＭ使用時は約２８倍、ＣＴＺｈ１２５μＭ使用時は約２５倍の発光値を示した（図７）。

本発明によれば、分子量が小さいながらも発光値が向上された発光酵素を提供することができる。また、本発明によれば、ｐｉｃＡＬｕｃ等の発光酵素に対して、サイズの増大を最小限にしながらも発光値を向上させることができる。したがって、分析産業、医薬産業、食品産業、衛生管理に関する産業等において有用である。

Claims

発光酵素活性を有するタンパク質であって、次の（Ｉ）に記載のオリゴペプチドが、次の（ＩＩ）に記載のポリペプチドのＣ末端に連結している構造のアミノ酸配列を、分子内に含むことを特徴とする、タンパク質；
（Ｉ）極性アミノ酸をＣ末端に有するオリゴペプチド、
（ＩＩ）カイアシ類由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、発光酵素活性を有するポリペプチド。
前記極性アミノ酸が、電荷を有するアミノ酸である、請求項１に記載のタンパク質。
前記オリゴペプチドを構成するアミノ酸残基数が、４～１５の範囲内である、請求項１に記載のタンパク質。
前記ポリペプチドが、次の（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸残基が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列。
前記ポリペプチドが、前記（Ａ）または（Ｂ）に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質。
前記ポリペプチドが、次の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載のタンパク質；
（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸。
請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質を発現させるための遺伝子配列が挿入された発現ベクター。
請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質を発現させるための遺伝子配列が導入された形質転換細胞。
請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質と、標的タンパク質または標的タンパク質に結合するタンパク質とを含む、融合タンパク質。
請求項１０に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸。
請求項１０に記載の融合タンパク質を発現させるための遺伝子配列が挿入された発現ベクター。
請求項１０に記載の融合タンパク質を発現させるための遺伝子配列が導入された形質転換細胞。
請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質と、蛍光物質とを備えた、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）プローブ。
発光酵素のアミノ酸配列の末端に対して、極性アミノ酸を末端に有するオリゴペプチドのアミノ酸配列を連結することを特徴とする、発光酵素の発光値向上方法。