JPWO2008133137A1 - 遺伝子治療のためのベクター - Google Patents
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Abstract
Description
[1]転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖RNA特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる転写ユニットを含有するレトロウイルスベクターであって、前記ユニットからのmRNAの転写方向がレトロウイルスベクターのRNAゲノムの転写方向に対して逆向きとなるように前記ユニットが配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター、
[2]転写調節配列が、がん細胞又はウイルス感染細胞で特異的に発現されている遺伝子の転写を制御する配列である[1]のレトロウイルスベクター、
[3]転写調節配列が、がん細胞又はウイルスに由来するトランス作用因子により転写が誘導される配列である[1]のレトロウイルスベクター、
[4]転写調節配列が免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される配列である[3]のレトロウイルスベクター、
[5]Tatタンパク質及び/又はRevタンパク質により転写が誘導される転写調節配列を含有する[4]のレトロウイルスベクター、
[6]免疫不全ウイルスのLTRの下流に一本鎖RNA特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が配置されている[4]のレトロウイルスベクター、
[7]転写調節配列が、人為的に細胞内に供給されるトランス作用因子により転写が誘導される配列である[1]のレトロウイルスベクター、
[8]一本鎖RNA特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドがMazFタンパク質である[1]〜[7]いずれかのレトロウイルスベクター、
[9][1]〜[8]いずれかのレトロウイルスベクターを細胞に導入することを特徴とする疾病の治療又は予防方法、
[10]疾病ががん又はウイルス感染症である[9]の方法、
[11]疾病が免疫不全ウイルス感染症である[9]の方法、
[12][1]〜[8]いずれかのレトロウイルスベクターを有効成分とする疾病の治療剤又は予防剤、
[13]がん又はウイルス感染症治療剤又は予防剤である[12]の治療剤又は予防剤、及び
[14]免疫不全ウイルス感染症治療剤又は予防剤である[13]の治療剤又は予防剤、
に関する。
本明細書において「免疫不全ウイルス」とは、免疫細胞に感染して免疫細胞を破壊し後天的に免疫不全を発症させるウイルスのことを言い、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、及びネコ免疫不全ウイルス(FIV)が例示される。加えて、異なる免疫不全ウイルスのゲノム同士を組み合わせて作成されたキメラウイルスも、本明細書においては「免疫不全ウイルス」と言う。このようなキメラウイルスとしては、サル/ヒト免疫不全ウイルス(SHIV)が例示される。
(1)MazF発現レトロウイルスベクタープラスミドpMT−HLTR−MazF−PLの構築
プラスミドpQBI−LTRgagGFP(Quantum Biotechnologies Inc.製)に挿入されているgag、sgGFP及びRREをコードする領域を制限酵素SalI、XbaIの二重消化によって除去したうえ、ここにMazFタンパクをコードする、配列表の配列番号2に示す塩基配列の化学的に合成されたDNAを挿入した。こうして構築されたプラスミドをpQBI−LTRMazFcv1と命名した。pQBI−LTRMazFcv1を鋳型とし、配列番号3及び配列番号4に記載のプライマーを用いて、PCR法でHIV−LTRからMazFをコードする領域を増幅し、得られた増幅断片を制限酵素NotI及びEco52Iで消化した。このDNA断片をHIV−LTR−MazFカセットと命名した。
pMT−HLTR−MazF−PLとの比較に使用する目的で、HIV−LTR−MazFカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写と同じ方向に挿入され、遺伝子導入後はレトロウイルスゲノムの転写が抑制される自己不活型レトロウイルスベクターpMTD3−U3TAR−MazF−PLを構築した(図2)。この調製にはpMTベクターの3’LTRのU3領域について、当該領域43〜309番目の塩基にわたる部分を欠損させたプラスミドベクターpMTD3を使用し、そのMluI、BamHI部位に(1)で調製したDNA断片を図2のとおりに挿入して構築した。
pMT−HLTR−MazF−PLとRetrovirus Packaging Kit Eco(タカラバイオ社製)を用いた一過性のウイルス産生を行い、エコトロピックMT−HLTR−MazF−PLウイルスを獲得した。エコトロピックMT−HLTR−MazF−PLウイルスを、GaLVレトロウイルスパッケージング細胞PG13(ATCC CRL−10686)にポリブレン(シグマアルドリッチ社製)8μg/mL存在下に感染させ、遺伝子導入細胞を獲得した。前記の細胞を96穴プレートに限界希釈して播種し、増殖してきたクローンの培養上清を採取して実施例3記載のリアルタイムPCR法によりウイルス力価を測定した。高力価のウイルス産生が見られたクローン1株を選択してレトロウイルスベクター産生細胞株PG13/MT−HLTR−MazF−PLを樹立した。
Retro−X qRT−PCR Titration Kit(クロンテック社製)を用いてウイルス液1μLを鋳型としてリアルタイムPCR反応を行い、検量線からウイルス液中のRNAコピー数を算出した。実施例2で得たGaLV/MT−HLTR−MazF−PLウイルス液の力価は9.78×109copies/mL、GaLV/MTD3−U3TAR−MazF−PLウイルス液の力価は1.16×109copies/mLであった。HLTR−MazF発現カセットを逆向きに搭載することにより、自己不活型レトロウイルスベクターより高力価の組換えウイルスを獲得することが可能となった。
表面未処理24ウェルプレート(ファルコン社製)に1ウェルあたり500μlの20μg/mLのフィブロネクチンフラグメントであるCH−296(商品名レトロネクチン;タカラバイオ社製)を添加して4℃で一晩放置した後、PBSで洗浄した。このプレートをCH−296コートプレートとして以下の実験に使用した。
実施例2で調製した組換えレトロウイルス液を用いてヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株CCRF−CEM(ATCC CCL−119)及びカニクイザル末梢血より調製したCD4陽性T細胞へ以下の手順で遺伝子導入実験を行い、遺伝子導入効率を測定した。
実施例2で調製した組換えレトロウイルス液を用いて骨髄由来ヒトCD34陽性前駆細胞(Bone Marrow CD34+ Cells、Cambrex社製)へ以下の手順で遺伝子導入実験を行い、遺伝子導入効率を測定した。
本発明のレトロウイルスベクターによる、免疫不全ウイルスの複製の抑制効果について、以下の手順で確認した。
(1)MazF遺伝子を導入したアカゲザルCD4陽性T細胞の調製
アカゲザル(Rhesus macaque)より採取した血液10mLに、PBSを20mL加え希釈した。Ficoll 3mLを添加した15mL遠心管1本あたり10mLの血液を重層し、800×g、30分間室温にて遠心分離した。新しい15mL遠心管にPBS 8mLを予め入れておき、遠心分離した血液から上層を捨てた後、単核球層(白い層)を回収し、PBSの入った遠心管に回収した。800×g、5分間、4℃にて遠心分離後、ペレットを緩衝液ACK Lysing Buffer 8mLで懸濁して37℃、5分間溶血処理を行った。これにPBSを7mL加え、転倒混和し、400×g、5分間、4℃にて遠心分離した。得られた細胞をPBSに懸濁し、MACS サルCD4+ T cell アイソレーションキット(ミルテニーバイオテク社)を用いてCD4陽性T細胞を分離した。
(1)で調製したMazF遺伝子導入CD4陽性T細胞にサル/ヒト免疫不全キメラウイルス株SHIV−KB9[ジャーナル・オブ・ウイロロジー(J.Virol)、第71巻、p4218−4225(1997)]を2種類の力価で感染させた(以下、高力価で感染させたものを[MazF−High KB9]と記載し、低力価で感染させたものを[MazF−Low KB9]と記載する)。対照として、MazF遺伝子を導入していないアカゲザルCD4陽性T細胞についても、SHIV−KB9を2種類の力価で感染させた(以下、高力価で感染させたものを[対照−High KB9]と記載し、低力価で感染させたものを[対照−Low KB9]と記載する)。
SHIV−KB9感染後、培養上清をサンプリングし、リアルタイムPCRでSHIV−KB9のコピー数を算出することによってSHIV−KB9の複製を調べた。結果を表2に示す。対照サンプルではSHIV−KB9が複製したが、MazF遺伝子導入CD4陽性T細胞ではSHIV−KB9の複製が抑制されていることが示された。
実施例4同様の操作により、CH−296コートした24ウェルプレートを作製した。また、表面未処理12ウェルプレート(ファルコン社製)に1ウェルあたり1mLの20μg/mlのCH−296を添加して4℃で一晩放置した後、PBSで2回洗浄した。これらプレートをCH−296コートプレートとして以下の実験に使用した。
ヒト末梢血よりアフェレーシスにより採取し、凍結保存しておいた5人のドナー由来の単核球細胞(PBMC;それぞれTK5、TK14、TK19、TK23、TK29とする)を融解し、RPMI1640培地(シグマアルドリッチ社)に懸濁し、500×g、10分間遠心分離を行い、上清を除去して細胞ペレットを得た。このペレットを1%の自己血漿、0.2%ヒト血清アルブミン(Baxter社製)、600IU/mL rhIL−2(CHIRON社製)、2.5μg/mLファンギゾン(ブリストル・マイヤーズ社製)を含有するGT−T503培地(タカラバイオ社製)である培養用培地10mLに懸濁して細胞数を計数し、同培地で5×106個/mLの細胞濃度に調製した。この懸濁液5mLを25cm2フラスコ(コーニング社製)に移し、抗CD3抗体であるOKT−3(Janssen Pharmaceutica社製)を30ng/mLの濃度で添加して培養を開始した。培養開始から3日目に細胞数をカウントし、新鮮な培養用培地で1〜2×106/mLの細胞濃度の懸濁液とした。
実施例2で調製した組換えレトロウイルス液GALV/MT−HLTR−MazF−PLを実施例8で作製したCH−296コート24ウェルプレートおよび12ウェルプレートにそれぞれ1mL、2mL添加し、32℃、2000×g、2時間の条件で遠心操作を行い、レトロネクチンとレトロウイルスベクターの結合を促した。12ウェルプレートは、ウェルを1mLの1.5%ヒト血清アルブミン含有PBS溶液で2回洗浄し、さらにウェルを1mLの1.5%ヒト血清アルブミン含有PBS溶液で満たして、翌日の遺伝子導入用として4℃で保存した。
実施例10で調製した5ドナー由来のMazF遺伝子導入細胞および非遺伝子導入細胞を培養用培地でそれぞれ5×105/mLに希釈し、その10mLを一晩培養した。翌日、細胞懸濁液を二等分してそれぞれを遠心管に移し、一方にHIV IIIB株をMOI=0.01で添加して感染した。もう一方はMock感染としてHIVを含まない培地を添加した。37℃にて2時間インキュベーションしてHIV IIIBを細胞に吸着させた後、細胞をGT−T503培地で3回洗浄し、次いで3.5mLの培養用培地に懸濁した。上記細胞懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルに1mLずつ添加し、さらに培養用培地を1mL添加して培養を行った。この培養は1検体あたり3ウェル(3群)で実施した。感染から3日後、培養液上清1mLをサンプリングし、各ウェルに培養用培地を1mL添加し、引き続き培養を行った。感染から6日後、上清1mLをサンプリングした。サンプリングした上清中に存在するHIVのp24抗原をELISA法で定量することによって、上清中のHIVを定量した。また、感染から6日後の細胞をMTTアッセイに供し、生細胞数を測定した。
実施例10と同様の操作でTK19由来のPBMCからMazF遺伝子導入細胞および非遺伝子導入細胞を調製した。調製した遺伝子導入細胞における遺伝子導入効率は61.1%であった。これら細胞のそれぞれに、実施例11と同様の方法で、HIV IIIB株およびHE株をMOI=0.01で添加して感染させた。対照として、HIVを含まない培地を添加し、Mock感染とした。感染から3日後および6日後の上清中に存在するHIVのp24抗原をELISA法で定量することによって、上清中のHIVを定量した。3日後、6日後のp24抗原定量結果を表5に示す。
SEQ ID NO:3 ; Primer to amplify HIV-LTR-MazF cassette.
SEQ ID NO:4 ; Primer to amplify HIV-LTR-MazF cassette.
SEQ ID NO:5 ; Primer to amplify pA fragment.
SEQ ID NO:6 ; Primer to amplify pA fragment.
SEQ ID NO:7 ; Primer to amplify pPGK fragment.
SEQ ID NO:8 ; Primer to amplify pPGK fragment.
SEQ ID NO:9 ; Primer to amplify LNGFR fragment.
SEQ ID NO:10 ; Primer to amplify LNGFR fragment.
Claims (14)
- 転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖RNA特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる転写ユニットを含有するレトロウイルスベクターであって、前記ユニットからのmRNAの転写方向がレトロウイルスベクターのRNAゲノムの転写方向に対して逆向きとなるように前記ユニットが配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター。
- 転写調節配列が、がん細胞又はウイルス感染細胞で特異的に発現されている遺伝子の転写を制御する配列である請求項1記載のレトロウイルスベクター。
- 転写調節配列が、がん細胞又はウイルスに由来するトランス作用因子により転写が誘導される配列である請求項1記載のレトロウイルスベクター。
- 転写調節配列が免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される配列である請求項3記載のレトロウイルスベクター。
- Tatタンパク質及び/又はRevタンパク質により転写が誘導される転写調節配列を含有する請求項4記載のレトロウイルスベクター。
- 免疫不全ウイルスのLTRの下流に一本鎖RNA特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が配置されている請求項4記載のレトロウイルスベクター。
- 転写調節配列が、人為的に細胞内に供給されるトランス作用因子により転写が誘導される配列である請求項1記載のレトロウイルスベクター。
- 一本鎖RNA特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドがMazFタンパク質である請求項1〜7いずれか記載のレトロウイルスベクター。
- 請求項1〜8いずれか記載のレトロウイルスベクターを細胞に導入することを特徴とする疾病の治療又は予防方法。
- 疾病ががん又はウイルス感染症である請求項9記載の方法。
- 疾病が免疫不全ウイルス感染症である請求項9記載の方法。
- 請求項1〜8いずれか記載のレトロウイルスベクターを有効成分とする疾病の治療剤又は予防剤。
- がん又はウイルス感染症治療剤又は予防剤である請求項12記載の治療剤又は予防剤。
- 免疫不全ウイルス感染症治療剤又は予防剤である請求項13記載の治療剤又は予防剤。
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