JPWO2008047802A1 - D−セリンデヒドラターゼ及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
Lesson, P.D., and Iverson, L.L.(1994) J. Med. Chem. 37, 4053-4067. Hashimoto et al. (2003) Arch. Gen. Psychiatry 60, 572 Hashimoto et al. (2005) Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 29, 767 Hashimoto et al. (2004) Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 28, 385-8. Sensitive Determination of D-Amino Acids in Mammals and the Effect of D-Amino-Acid Oxidase Activity on Their Amounts. Biological & Pharmaceutical Bulletin. (2005), 28, 1578 Characterization of the catalytic pathway for D-serine dehydratase. Evidence for variation of the rate-determining step with substrate structure. J Biol Chem. (1983) 258(9):5379-5385. D-serine dehydratase acting also on L-serine from Klebsiella pneumoniae. J Biochem . 1978 Nov;84(5):1133-1138.
そこで本発明は、現行のD−セリン定量法における様々な問題を解消する新規なD−セリン定量法を提供することを課題とする。また、D−セリン定量法に利用される新規な酵素、それをコードする遺伝子などを提供することも課題とする。
本発明は主として以上の成果・知見に基づくものであり、以下のD−セリンデヒドラターゼ、それをコードする遺伝子等、及びD−セリン定量法を提供する。
[1]以下の(a)又は(b)のタンパク質からなるD−セリンデヒドラターゼ:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質;
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有し、D−セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質。
[2]L−セリンには反応しないことを特徴とする、[1]に記載のD−セリンデヒドラターゼ。
[3]D−セリンに対する反応性を100%としたときのD−スレオニンに対する反応性が5%以下である、[1]又は[2]に記載のD−セリンデヒドラターゼ。
[4]大腸菌を宿主として発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする、[1]〜[3]のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼ。
[5]以下の(A)〜(C)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるD−セリンデヒドラターゼ遺伝子:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号2で示される塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号2で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つD−セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質をコードするDNA。
[6][5]に記載の遺伝子を含有するD−セリンデヒドラターゼ発現用ベクター。
[7][5]に記載の遺伝子が導入されている形質転換体。
[8]以下のステップを含む、D−セリンデヒドラターゼの生産方法:
(1)[7]に記載の形質転換体を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ;及び
(2)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
[9][1]〜[4]のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼを含むD−セリン定量用試薬。
[10][9]に記載のD−セリン定量用試薬と、使用説明書とを含む、D−セリン定量用キット。
[11]以下のステップを含む、D−セリン定量法:
(1)試料を用意するステップ;
(2)[1]〜[4]のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼを前記試料に添加し、反応させるステップ;
(3)(2)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(4)(3)で得た定量値より、前記試料中のD−セリン量を算出するステップ。
[12]以下のステップを更に含む、[11]に記載のD−セリン定量法:
(5)アミノ酸ラセマーゼをステップ(2)後の反応液に添加し、前記D−セリンデヒドラターゼの共存下で反応させるステップ;
(6)(5)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(7)(6)で得た定量値と、(4)で算出したD−セリン量より、前記試料中の全セリン量を算出するステップ。
[13]以下のステップを含む、D−セリン定量法:
(1)試料を用意するステップ;
(2)[1]〜[4]のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼを前記試料の一部に添加し、反応させるステップ;
(3)(2)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(4)(3)で得た定量値より、前記試料中のD−セリン量を算出するステップ;
(5)[1]〜[4]のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼとアミノ酸ラセマーゼとを、前記試料の他の一部に添加し、反応させるステップ;
(6)(5)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(7)(6)で得た定量値より、前記試料中の全セリン量を算出するステップ。
本発明において「タンパク質をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるDNA、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。
本明細書において用語「疾患」は、疾病、病気、又は病態など、正常でない状態を表す言葉と交換可能に用いられる。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本発明のD−セリンデヒドラターゼに関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実質的に含まない(特に夾雑タンパク質を実質的に含まない)状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。一方、本発明の酵素が遺伝子工学的手法によって調製されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「D−セリンデヒドラターゼ」と記載した場合は「単離された状態のD−セリンデヒドラターゼ」を意味する。D−セリンデヒドラターゼの代わりに使用される用語「酵素」についても同様である。
DNAについて使用する場合の「単離された」とは、もともと天然に存在しているDNAの場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列(例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など)など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のDNA成分を実質的に含まない。一方、cDNA分子など遺伝子工学的手法によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、dDNTPなどの前駆体(原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「DNA」と記載した場合には単離された状態のDNAを意味する。
本明細書において用語「〜を含む」又「〜含んでなる」は、「〜からなる」の意味をも含む表現として使用される。
本発明の第1の局面は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の機能未知遺伝子がD−セリンデヒドラターゼをコードすることを発見したことに基づき、新規なD−セリンデヒドラターゼを提供する。以下、説明の便宜上、本発明のD−セリンデヒドラターゼのことを「本発明の酵素」ともいう。
一態様では、本発明の酵素は配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。尚、当該アミノ酸配列は、機能未知タンパク質をコードするものとしてGenebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)に登録されている(Accession: P53095、DEFINITION: Uncharacterized protein YGL196W.)。
本発明となる酵素は、細菌由来の既知のD−セリンデヒドラターゼ(D−セリンデアミナーゼ、D−セリンアンモニアリアーゼ)(EC4.3.1.18)と同様、D−セリンをピルビン酸とアンモニアに分解するが、既知のD−セリンデアミナーゼとは一次構造上の相同性を有していない。
後述の実施例に示すように、当該酵素はD−セリンに対する基質特異性が非常に高い。即ち、当該酵素にはL−セリンに対する反応性は認められず、D−スレオニンに対する反応性も非常に低い(D−セリンに対する反応性を100%としたときのD−スレオニンに対する反応性が5%以下であった)。このように本発明の酵素は、既知の同種の酵素に比較して基質特異性に優れる。
「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する1〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは1〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異(変化)が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違はD−セリンデヒドラターゼ活性が保持される限り許容される(活性の多少の変動があってもよい)。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約30%未満に相当する数であり、好ましくは約20%未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10%未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5%未満に相当する数であり、最も好ましくは約1%未満に相当する数である。即ち相同タンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列と例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有する。
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。本発明のポリペプチド分子に相同的なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム(例えばXBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー(IGH Montpellier、フランス)またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ=12、ギャップペナルティ=4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重=12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重=2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重=50、ギャップ長加重=3として決定することができる。
尚、本発明の酵素の調製法は遺伝子工学的手法によるものに限られない。例えば天然に存在するものであれば、天然材料から標準的な手法(破砕、抽出、精製など)によって本発明の酵素を調製することもできる。尚、本発明の酵素は、通常、単離された状態に調製される。
本発明の第2の局面は本発明の酵素をコードする遺伝子、即ち新規なD−セリンデヒドラターゼ遺伝子を提供する。
一態様において本発明の遺伝子は、配列番号1のアミノ酸配列をコードするDNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号2で示される塩基配列からなるDNA、配列番号3で示される塩基配列からなるDNAである。配列番号2で示される塩基配列はタンパク質YGL196Wの全長cDNAである。尚、イントロンは存在せず、cDNAの配列はゲノムDNAの配列に一致する。
相同DNAの更に他の例として、SNPに代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるDNAを挙げることができる。
例えば、配列番号2で示される塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応(例えばPCR)を利用して増幅及び単離することができる。
本発明のさらなる局面は本発明の遺伝子を含有するベクターに関する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター(アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等)の形態をとり得る。
使用目的(クローニング、タンパク質の発現)に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とするベクター(M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体(pB325、pAT153、pUC8など)など)、酵母を宿主とするベクター(pYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター(pAc、pVLなど)、哺乳類細胞を宿主とするベクター(pCDM8、pMT2PCなど)等である。
本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入(必要な場合)、プロモーターの挿入(必要な場合)等は標準的な組換えDNA技術(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法)を用いて行うことができる。
本発明は更に、本発明の遺伝子が導入された形質転換体に関する。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション等はリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann,M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))等によって実施することができる。
宿主細胞としては大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris等)等を例示することができる。
上記の形質転換体を用いてD−セリンデヒドラターゼを生産することができる。そこで本発明の更に他の局面は、上記の形質転換体を用いたD−セリンデヒドラターゼの生産方法を提供する。本発明の生産方法では上記の形質転換体を、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で培養するステップが行われる。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり(例えば大島泰郎 他 編 (2002) ポストシークエンスタンパク質実験法2 試料調製法、東京化学同人が参考になる)、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。
培養ステップに続き、産生されたタンパク質(即ち、D−セリンデヒドラターゼ)を回収するステップが行われる。培養後の培養液又は菌体より目的のタンパク質を回収することができる。菌体外に産生された場合には培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを組み合わせて分離、精製を行うことにより目的のタンパク質を取得することができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的のタンパク質を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程(菌体の破砕、分離、精製)を行ってもよい。
本発明は更に本発明の酵素の用途を提供する。いくつかのD−セリンデヒドラターゼ(非特許文献6に記載されたEscherichia coliの酵素、非特許文献7に記載されたKlebsiella pneumoniaeの酵素など)が見出されているものの、D−セリンデヒドラターゼを用いてD−セリンを定量したとの報告はない。その理由は既知の酵素の基質特異性の低さにあると予想される。本発明の酵素は、既知の同種の酵素に比較して基質特異性に優れ、L−セリンに対する反応性が実質的にない。この特性を備える本発明の酵素によれば、試料中のD−セリンを選択的に定量することが可能である。このように本発明の酵素はD−セリンの定量に適したものである。即ち、本発明の酵素はD−セリンの定量用試薬として有用である。そこで本発明は、本発明の酵素を含むD−セリンの定量用試薬を提供する。
本発明の定量法では以下のステップ、即ち(1)試料を用意するステップ;(2)本発明のD−セリンデヒドラターゼを前記試料に添加し、反応させるステップ;(3)(2)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;及び(4)(3)で得た定量値より、前記試料中のD−セリン量を算出するステップ、がこの順で実施される。以下、各ステップの詳細を説明する。
このステップでは試料を用意する。試料の種類は特に限定されず、生体(ヒト又は非ヒト動物・植物、微生物)由来の試料(例えば血液、血清、リンパ液、脊髄液、骨髄液、組織抽出液、植物抽出液、細胞抽出液等)又は非生体由来の試料(例えば、食品、薬品、飼料、土壌、河川および海洋水等)が用いられる。これらの試料は常法で調製すればよい。
このステップでは、本発明のD−セリンデヒドラターゼを試料に添加し、反応させる。D−セリンデヒドラターゼの添加量は、これに限定されるものではないが、例えば1μg/ml〜50μg/mlとする。反応温度は例えば20℃〜40℃とし、好ましくは30℃〜37℃とする。反応溶液のpHは例えば約7.5〜約9.0の範囲内で設定し、好ましくはpH8付近とする。pH調整にはTris系緩衝液やHEPES系緩衝液を用いることができる。反応時間は例えば5分〜3時間とする。経時的な測定を行うことにしてもよい。
以上の反応条件はあくまでも一例であって、一部又は全部の条件を適宜修正することができる。当業者であれば予備実験を通して反応条件の修正、最適化が可能である。
このステップでは、ステップ(2)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量する。アンモニアの定量にはネスラー法(例えばJohn,Cら (1976) Biochemical J. 159:803-806を参照)、インドフェノール法(例えばJ. Berthelot:Report chem Appt 1, 284, 1859、特公昭58−11024号公報、特開昭61−38463号公報、特開昭61−44351号公報を参照)、血漿中のアンモニアにグルタミン酸脱水素酵素、NADPH及びα−ケトグルタレートを反応させNADPHの減少に伴う吸光度の変化量を測定する酵素法(例えば特開昭50−23699号公報を参照)等を利用できる。この中でもネスラー法及びインドフェノール法は簡便な手順で行え、しかも特別な器具・装置も必要とせず、好ましい方法である。
この中でも乳酸脱水素酵素を用いる方法及びピルビン酸オキシダーゼを用いる方法は簡便な手順で行え、しかも特別な器具・装置も必要とせず、好ましい方法である。
尚、二種類以上の測定法によってアンモニア(又はピルビン酸)を定量することにしてもよい。このようにすれば各測定法による定量値を検証することができ、定量結果の信頼性向上が図られる。同様の目的でアンモニアとピルビン酸の両者を定量することにしてもよい。
このステップでは、ステップ(3)で得たアンモニア又はピルビン酸の定量値より、試料中のD−セリン量を算出する。通常は、D−セリン含量の判明している複数の試料を用い、アンモニア量又はピルビン酸量とD−セリン量との関係を表す検量線を予め作成しておき、アンモニア又はピルビン酸の定量値を当該検量線に照らし合わせることによって試料中のD−セリン量を算出する。
この態様の定量法は、試料中のD−セリン量を定量する一方、アミノ酸ラセマーゼを利用して試料中のL−セリンをD−セリンへ転換することで試料中の全セリン量を定量する。即ちこの態様の定量法によれば、試料中のD−セリン量に加えて全セリン量(即ちD−セリン量とL−セリン量を合算したもの)が求められることになり、全セリン量に対するD−セリン量の比率を明らかにすることが可能となる。
最近の報告によれば、統合失調症患者の脳脊髄液や血清、アルツハイマー病患者の血清では、全セリン含量に占めるD−セリン含量の割合(D−セリン含量/全セリン含量)が有意に低下している(非特許文献2〜4)。このことから、この態様の定量法は、統合失調症やアルツハイマー症の診断に有用な情報(データ)を提供するといえる。また、統合失調症やアルツハイマー病に限らず、全セリン含量に対するD−セリン含量の比率と、その発症や進行状態或いは病態等との間に関連性を認める様々な疾患の診断において、この態様の定量法が利用されることを期待できる。
以下、この態様に特徴的な各ステップの詳細を説明する。
このステップではアミノ酸ラセマーゼをステップ(2)後の反応液に添加し、反応させる。ステップ(2)後の反応液中には先に添加したD−セリンデヒドラターゼ及びピリドキサール5’−リン酸が共存することから、アミノ酸ラセマーゼによる酵素反応とD−セリンデヒドラターゼによる酵素反応が同時に進行することになる。尚、この態様の定量法では、ステップ(2)の後に一部の反応液をサンプリングし、これを用いてステップ(3)を実施することにするとともに、残りの反応液(又はその一部)を当該ステップ(5)に使用する。
アミノ酸ラセマーゼの添加量は、これに限定されるものではないが、例えば1μg/ml〜50μg/mlとする。このステップの反応条件(反応温度、反応pH、反応時間)は、原則、上記ステップ(2)の反応条件に準ずる。
但し、一部又は全部の条件を適宜修正してもよい。また、当業者であれば予備実験を通して反応条件の修正、最適化が可能である。
尚、例えばD−セリンデヒドラターゼが失活したおそれのある場合やアミノ酸ラセマーゼの作用によって生ずるD−セリンの量が過大な場合など、先に添加したD−セリンデヒドラターゼの十分な作用が期待できない場合には、アミノ酸ラセマーゼとともにD−セリンデヒドラターゼを追加で添加するとよい。また、このステップをピリドキサール5’−リン酸の存在下で実施することが好ましく、この段階においてピリドキサール5’−リン酸を追加することにしてもよい。
このステップでは、ステップ(5)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量する。即ち、アミノ酸ラセマーゼの作用で生成したD−セリンがD−セリンデヒドラターゼで分解されることによって生じたアンモニア又はピルビン酸が定量される。このステップは上記ステップ(3)と同様に実施される。
このステップでは、ステップ(6)で得たアンモニア又はピルビン酸の定量値と、ステップ(4)で算出したD−セリン量より、試料中の全セリン量を算出する。まず、ステップ(6)で得た定量値を用い、試料中に当初存在していたL−セリン量を算出する。得られたL−セリン量に、ステップ(4)で算出したD−セリン量(試料中に当初存在していたD−セリン量)を合算することによって試料中の全セリン量とする。尚、L−セリン量は、ステップ(4)におけるD−セリンの算出方法と同様の方法、即ちアンモニア量又はピルビン酸量とL−セリン量との関係を表す検量線を用いた方法によって算出することができる。
ステップ(6)で得た定量値は、試料中に当初存在していたL−セリン量及びD−セリン量を反映したものとなる。従って、ステップ(6)で得た定量値より、試料中の全セリン量を算出することができる(ステップ(7))。尚、この態様における各ステップは上記の対応するステップと同様の方法、条件で実施することができる。
以下の方法で新規D−セリンデヒドラターゼを検索した。BLAST検索により、サッカロマイセス・セレビシエのゲノム上に細菌アラニンラセマーゼのN-末端ドメインと相同な立体構造を有するタンパク質をコードすると考えられる遺伝子、YGL196Wを見いだした。そこで、後述した方法でYGL196W遺伝子がコードするタンパク質を調製した。調製したタンパク質を用い、D-セリン、L-セリン、D-トレオニン、L-トレオニンを基質として後述の方法でアンモニアの生成を測定した。その結果、サッカロマイセス・セレビシエの機能未知タンパク質YGL196W(図1、配列番号1)がD−セリンデヒドラターゼ活性を有することが判明した。尚、当該タンパク質をコードするcDNAの配列を配列番号2に示す。
(1)遺伝子クローニング
サッカロマイセス・セレビシエBY4742株(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC))の染色体DNAを鋳型に、下記プライマーを用いてPCRを行った。
5'-atgctcgaggttctatctcaatataaagggtgctcag-3'(配列番号3)
5'-accaagcttaccatttctgaaaaggtaaccaaacatcg-3'(配列番号4)
常法に従い、プラスミドpDsdSCを大腸菌BL21(DE3)(Novagen社)に導入した。導入操作後のBL21(DE3)細胞を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地5 mlに植菌し、37℃で一晩培養した。これを200 mlの同培地に植菌し37℃で培養、610 nmで測定した培養液の濁度が0.5になった時点で、IPTG(終濃度、0.5 mM)を加え30℃で3時間培養した。細胞を集菌、洗浄後、結合用バッファー(500 mM NaCl、5 mMイミダゾールを含む20 mM Tris HCl(pH 7.9))に懸濁し、超音波破砕した。20,000 X gで30分遠心して得られた上清を、結合用バッファーで平衡化したNi-キレーティングカラム(Novagen His-Bind Resin)にアプライした。カラムの10倍量の洗浄用バッファー(500 mM NaCl、80 mM を含む20 mM TrisHCl (pH 7.9) )で洗浄後、溶出用バッファー(500 mM NaCl、1 M イミダゾールを含む20 mM TrisHCl (pH 7.9) )で溶出した。活性画分を500倍量のA buffer (140 mM NaClを含む20 mM TrisHCl (pH 7.5) )で透析後、2 x 10-5 M ピリドキサール5'-リン酸を含むAバッファーで平衡化したDEAE-TOYOPEARLカラム(10 ml)に供した。同バッファーで溶出させた酵素の純度(purity)をSDS-PAGEで確認した(図2)。
(3)活性測定
D−セリンデヒドラターゼは以下の反応式で示される反応を触媒する。
(a)ネスラー法
50 mMのHEPES-NaOH buffer (pH 8.0)、20μmolのピリドキサール5’−リン酸、10 mMのD−セリンを含む反応液(最終容量200μl)に、適当量のD−セリンデヒドラターゼを加え、30℃でインキュベート後、終濃度5%のトリクロロ酢酸を加えて反応を停止、遠心上清中のアンモニアをネスラー試薬を用いて定量した。
(b)乳酸脱水素酵素を用いる方法
50 mMのHEPES-NaOH buffer (pH 8.0)、20μmolのピリドキサール5’−リン酸、10 mMのD−セリン、0.3 mMのNADH、20 unitsの乳酸脱水素酵素を含む反応液(最終容量1ml)に、適当量のD−セリンデヒドラターゼを加え、30℃で反応させた。NADHからNADへの転換に伴う340 nmの吸収の減少を測定した。
次に、新規酵素の構造的特徴を明らかにするために、そのアミノ酸配列と相同な配列を持つタンパク質をデータベース上に検索した。その結果、図3に示す通り、新規酵素と相同なアミノ酸配列を有するタンパク質はいずれも機能未知のタンパク質であり、新規酵素は既知のD−セリンデヒドラターゼと一次構造上の相同性を有していないことが判明した。
新規酵素の基質特異性を以下の方法で検討した。即ち、基質としてD−セリンの他、L−セリン及びD−スレオニンを用意し、ネスラー法によって各基質に対する反応性を調べた。尚、L−セリン又はD−スレオニンに対する反応性を調べる場合には、基質としてL−セリン(和光純薬工業株式会社)又はD−スレオニン(和光純薬工業株式会社)を使用する以外、D−セリンの場合と同一の条件下でネスラー法を実施した。
結果を図4に示す。図4から明らかなように、新規酵素(左)にはL−セリンに対する反応性が全く認められなかった。また、D−スレオニンに対する反応も非常に低い。このように新規酵素はD−セリンに対する基質特異性に極めて優れることが明らかとなった。
新規酵素の活性に対する金属イオンの影響・効果を以下の方法で検討した。図5に示した化合物を未処理の新規酵素、および2mMのEDTAとインキュベートした後トリス緩衝液で透析した新規酵素を、それぞれ0.05 mM,または0.5 mMのKCl、NaCl, MnCl2,MgCl2,CaCl2,NiSO4,CuSO4,ZnCl2のいずれかの存在下、ネスラー法によってD-セリンデヒドラターゼ活性を測定した。
結果を図5に示す。図5から明らかなように、新規酵素はEDTA処理により活性の大部分を失うこと、また亜鉛の添加によって活性化されることが明らかとなった。また亜鉛の濃度を変えて同様の実験を行った結果、0.005 mMが酵素活性を最も増大させる亜鉛濃度であることが判明した。
新規酵素の活性と反応時のpHとの関係を以下の方法で検討した。ネスラー法においてそれぞれ緩衝液をMOPS(pH 6.5-8.0)、MES(pH 6.0-6.5)、HEPES(pH 7.0-8.5)、Tris(pH 7.5-9.0)に変更した反応液を用いて、新規酵素のD−セリンデヒドラターゼ活性を測定した。
結果を図6に示す。図6から明らかなように、新規酵素の至適pHは8付近にあり、約7.5〜約9.0のpH域で良好な反応性が認められる。
新規酵素の動力学的特性を以下の方法で検討した。ネスラー法において、D−セリン濃度を変化させ、それぞれのD−セリン濃度下における新規酵素のD−セリンデヒドラターゼ活性を測定した。得られた速度の逆数をD−セリン濃度の逆数に対してプロットし、y切片の逆数から最大速度を、x軸切片の逆数からKm値を算出した。
結果を図7に示す。図7から明らかなように最大速度は4.2 μmol/min/mg、Km値は0.46 mMと算出された。
(1)D−セリンの定量
被検者の末梢血より血清(50μl)を調製する(血清サンプル)。血清サンプルを10 mMのHEPES-NaOH buffer (pH 8.0)で10倍希釈した後、2μMのピリドキサール5’−リン酸溶液10μlと、1 nmolのD−セリンデヒドラターゼを加え、30℃で10分間インキュベートする。その後、終濃度5%のトリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。遠心処理(10,000 rpm、5分間)の後、上清中に含まれるアンモニアをネスラー試薬を用いて定量する。
血清サンプルの代わりに所定量のD−セリンを含む標準試薬(1mM、10mM、50mM、100mM)を用いて上記の定量法を実施し、アンモニアの定量値とD−セリン含量との関係を示す検量線を作成する。この検量線に基づき、血清サンプルについて得られたアンモニアの定量値より血清サンプル中のD−セリン量を算出する。
(2)全セリン量に対するD−セリン量の比率の測定
(2−1)D−セリン量の定量
被検者の末梢血より血清(50μl×2)を調製する(血清サンプル1及び2)。血清サンプル1中のD−セリンを(1)と同様の手順で定量する。
一方、血清サンプル2中の全セリンを以下の方法で定量する。血清サンプル2を10 mMのHEPES-NaOH buffer (pH 8.0)で10倍希釈した後、2μMのピリドキサール5’−リン酸溶液 10μl、1 nmolのセリンラセマーゼ、及び1 nmolのD−セリンデヒドラターゼを加え、30℃で10分間インキュベートする。その後、終濃度5%のトリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。遠心処理(10,000rpm、5分間)の後、上清中に含まれるアンモニアをネスラー試薬を用いて定量する。(1)の方法と同様に作成した検量線に基づき、アンモニアの定量値より血清サンプル2中のD−セリン量を算出する。尚、ここでの定量法の原理は次の通りである。セリンラセマーゼの作用によって血清サンプル中のL−セリンがD−セリンに変換される。このようにして生じたD−セリンと最初から存在していたD−セリンがD−セリンデヒドラターゼで定量される。
尚、活性や安定性から本測定法に最も適すると考えられる細胞性粘菌(Dictyostelium discoideum)のセリンラセマーゼは以下の方法で調製することができる。D. discoideumのセリンラセマーゼ遺伝子(DDB0230209)をDicty cDBクローンを鋳型とし、C末端に6個のHis残基を配するように設計したプライマーを用いてPCRによって増幅する。得られたDNA断片をpET16b(Novagen)へ挿入して構築した発現ベクターを用いてEscherichia coli Rosetta株を形質転換し、IPTG添加によってセリンラセマーゼを発現させる。セリンラセマーゼの精製はNi-NTA・Bind Resins(Novagen)を用いて行う。細胞性粘菌由来の酵素以外にも、本測定用いるセリンラセマーゼとしては、細菌由来のもの(調製法は、Arias C.A.ら(2000)Microbiology 146, 1727-1734を参照)、および副反応としてセリンのラセミ化を触媒する細菌由来のアラニンラセマーゼ(調製法は、Tanizawa K. ら(1988), Biochemistry. 27, 1311-1316.)、低基質特異性アミノ酸ラセマーゼ(調製法は、Lim YH,ら (1993) J Bacteriol. 175, 4213-4217.)も使用可能である。
(1)方法
種々の量のヒト尿(-20℃に保存)と50 mM HEPES-NaOH 緩衝液 (pH 8.0), 20 μM PLP、0.3 mM NADH, 2ユニットのウサギ筋肉由来乳酸脱水素酵素、および2 μg のD−セリンデヒドラターゼ(2.で調製された新規酵素)を含む反応液(200 μl)を37℃で30分間インキュベートし、NADHに由来する340 nmの吸収の減少を測定した。
またコントロールとして、蛍光ジアステレオマー化したD−セリンをHPLCにより分離定量する従来法により、同一標品のD−セリン定量を行った。
本酵素法により定量した尿中D−セリン濃度は、243±7.0 μM (平均値±標準偏差)(n=6、CV 2.9%)であった(図8)。一方、HPLC法により定量したD−セリン濃度は、239±9.8 μM (平均値±標準偏差)(n=6)で良い一致を示した。
測定の際の尿濃度に対する340 nmでの吸収の減少をプロットしたところ、r2 = 0.996 のよい直線性が得られた(図9)。このことから、D−セリン以外の尿成分は本酵素定量法に影響を与えないことが示唆された。
一方、本発明の定量法は、極めて一般的なマイクロプレートリーダーや分光光度計を利用して実施することが可能である。煩雑な前処理も必須でなく、キット化が容易である点も本発明の定量法の大きな利点である。また、本発明の定量法は簡便な操作で実施することができ、データの解析にも熟練を要しない。さらに、マイクロプレート等の使い捨て可能な器具を用いて実施することが可能であることから、生体試料を扱う場合の作業者への感染リスクの軽減にも貢献する。加えて、本発明の定量法によれば、従来のD−セリンの定量法で問題視される経済的、時間的コストを大幅に削減可能であり、集団検診などへの適用も期待される。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (13)
- 以下の(a)又は(b)のタンパク質からなるD−セリンデヒドラターゼ:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質;
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有し、D−セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質。 - L−セリンには反応しないことを特徴とする、請求項1に記載のD−セリンデヒドラターゼ。
- D−セリンに対する反応性を100%としたときのD−スレオニンに対する反応性が5%以下である、請求項1又は2に記載のD−セリンデヒドラターゼ。
- 大腸菌を宿主として発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼ。
- 以下の(A)〜(C)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるD−セリンデヒドラターゼ遺伝子:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号2で示される塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号2で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つD−セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質をコードするDNA。 - 請求項5に記載の遺伝子を含有するD−セリンデヒドラターゼ発現用ベクター。
- 請求項5に記載の遺伝子が導入されている形質転換体。
- 以下のステップを含む、D−セリンデヒドラターゼの生産方法:
(1)請求項7に記載の形質転換体を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ;及び
(2)産生された前記タンパク質を回収するステップ。 - 請求項1〜4のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼを含むD−セリン定量用試薬。
- 請求項9に記載のD−セリン定量用試薬と、使用説明書とを含む、D−セリン定量用キット。
- 以下のステップを含む、D−セリン定量法:
(1)試料を用意するステップ;
(2)請求項1〜4のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼを前記試料に添加し、反応させるステップ;
(3)(2)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(4)(3)で得た定量値より、前記試料中のD−セリン量を算出するステップ。 - 以下のステップを更に含む、請求項11に記載のD−セリン定量法:
(5)アミノ酸ラセマーゼをステップ(2)後の反応液に添加し、前記D−セリンデヒドラターゼの共存下で反応させるステップ;
(6)(5)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(7)(6)で得た定量値と、(4)で算出したD−セリン量より、前記試料中の全セリン量を算出するステップ。 - 以下のステップを含む、D−セリン定量法:
(1)試料を用意するステップ;
(2)請求項1〜4のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼを前記試料の一部に添加し、反応させるステップ;
(3)(2)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(4)(3)で得た定量値より、前記試料中のD−セリン量を算出するステップ;
(5)請求項1〜4のいずれかに記載のD−セリンデヒドラターゼとアミノ酸ラセマーゼとを、前記試料の他の一部に添加し、反応させるステップ;
(6)(5)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(7)(6)で得た定量値より、前記試料中の全セリン量を算出するステップ。
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