JPWO2006080210A1 - イオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキット、並びにその利用 - Google Patents
イオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキット、並びにその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2006080210A1 JPWO2006080210A1 JP2007500466A JP2007500466A JPWO2006080210A1 JP WO2006080210 A1 JPWO2006080210 A1 JP WO2006080210A1 JP 2007500466 A JP2007500466 A JP 2007500466A JP 2007500466 A JP2007500466 A JP 2007500466A JP WO2006080210 A1 JPWO2006080210 A1 JP WO2006080210A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- metal complex
- protein
- present
- metal
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 103
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 103
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 claims abstract description 84
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 92
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 31
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 26
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 claims description 20
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- JFJNVIPVOCESGZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dipyridin-2-ylpyridine Chemical group N1=CC=CC=C1C1=CC=CN=C1C1=CC=CC=N1 JFJNVIPVOCESGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 abstract description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 29
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- CBFCDTFDPHXCNY-UHFFFAOYSA-N icosane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CBFCDTFDPHXCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical group 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DRGAZIDRYFYHIJ-UHFFFAOYSA-N 2,2':6',2''-terpyridine Chemical compound N1=CC=CC=C1C1=CC=CC(C=2N=CC=CC=2)=N1 DRGAZIDRYFYHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWCWJPJYNOBMCC-UHFFFAOYSA-N 3,4-bis(2-aminoethyl)heptane-1,3,4,7-tetramine Chemical compound NCCCC(N)(CCN)C(N)(CCN)CCN FWCWJPJYNOBMCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N Diethylenetriamine Chemical compound NCCNCCN RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 3
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 3
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- -1 triazacycloalkane Chemical compound 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- FLPZQPUGOOVZHK-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichlorocycloocta-1,5-diene platinum Chemical compound [Pt].ClC1=C(Cl)CCC=CCC1 FLPZQPUGOOVZHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYXHVRARDIDEHS-UHFFFAOYSA-N 1,5-cyclooctadiene Chemical compound C1CC=CCCC=C1 VYXHVRARDIDEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004912 1,5-cyclooctadiene Substances 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 0 N*1(*2ccccc2-c2cc(O)c3)*2c3-c2*1cccc2 Chemical compound N*1(*2ccccc2-c2cc(O)c3)*2c3-c2*1cccc2 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- WUGQZFFCHPXWKQ-UHFFFAOYSA-N Propanolamine Chemical compound NCCCO WUGQZFFCHPXWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000965 cold-spray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N nitromethane Chemical compound C[N+]([O-])=O LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000002524 organometallic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000003506 protein modification method Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940096017 silver fluoride Drugs 0.000 description 1
- REYHXKZHIMGNSE-UHFFFAOYSA-M silver monofluoride Chemical compound [F-].[Ag+] REYHXKZHIMGNSE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
- C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table compounds of the platinum group
- C07F15/0086—Platinum compounds
- C07F15/0093—Platinum compounds without a metal-carbon linkage
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Electron Tubes For Measurement (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明は、温和な条件下でタンパク質を修飾してタンパク質のイオン化効率を向上させる。 特定の官能基を有しかつ三座配位子を有する金属錯体を目的のタンパク質と結合させることによって、タンパク質の性質に依存することなくタンパク質を高感度で検出する。
Description
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキットに関するものであり、具体的には、イオン化する前のタンパク質表面に導入する試薬、該試薬を導入してタンパク質を修飾するための方法、および該試薬を備えるキットに関するものである。
分析化学、特に質量分析の分野においては、多くのイオン化法が開発され、ポストゲノムの研究において利用されている。しかし、不安定な有機化合物、ホスト分子−ゲスト分子、および/または生体分子間の相互作用を質量分析によって測定することは非常に困難である。質量分析では、分子のイオン化の過程において、測定する分子に電圧、熱、レーザーなどによって一定のエネルギーを加える必要がある。その結果、溶液中の分子間に生じる水素結合などの弱い相互作用が切断されたり、分子内結合の開裂によるフラグメント化が生じたりするので、質量分析を用いて溶液中の本来の分子の挙動を観測することが困難であった。
近年、より本来の分子挙動を観測するために、従来のイオン化法を改良した新しいイオン化法に基づく質量分析装置(コールドスプレーイオン化質量分析(cold spray ionization mass spectrometry:CSI−Mass)装置)が開発された(非特許文献1を参照のこと)。この装置は、より安定な有機分子および/または分子間のクラスターなどを観測するために、従来のエレクトロニクススプレーイオン化質量分析(electrospray ionization Mass spectroscopy:ESI−Mass)装置を改良したものである。
CSI−Massは、不安定な分子を分析するために非常に有効であり、特に溶液中での分子動態の解析(非共有結合性相互作用に基づく分子種の溶液動態解析)に現在多用されている。
CSI−Mass装置の特徴は、従来のESI−Massにおいてイオン化に用いられるネブライジングガスを15℃〜−80℃という低温に制御することができ、イオン化を低温で行えることである。本来ESI−Massでは、電圧をかけたニードル先端からネブライジングガスとともに試料溶液をスプレーし、250℃〜室温の脱溶媒室にてスプレーされた液滴の蒸発を行うことによって試料分子のイオン化を促進させる。一方、CSI−Massでは、低温にして分子の分極率を増大させ、イオン化を促進させるという新たな方法を取り入れている。
CSI−Massの最大の利点は、イオン化の際に高温にする必要がない点であり、溶液内の試料分子が有する弱い相互作用を観測することに適している。その証拠に、山口らはCSI−Massを利用して不安定な有機金属錯体および/または生体分子(アミノ酸、DNAなど)、水の溶液構造解析を行い、装置の有する優位性を示している(非特許文献1を参照のこと)。
イオン化効率を向上させるために、質量分析計の改良が試みられている(例えば、特許文献1〜3を参照のこと)。また、特許文献4には、オリゴヌクレオチド試料にトリエチルアミンを加えることによってオリゴヌクレオチドのイオン化効率を向上させて検出効率が20%上昇したことが記載されている。
しかし、CSI−Massは以下のような欠点を有する。第1に、イオン化の際の脱溶媒を促すために必要な加温および脱溶媒ガスを使用しないために、ESI−Massと比べて試料分子の測定感度が低いことである。第2に、試料分子が溶媒分子または他の分子との非特異的な結合をしたままイオン化されるために、試料分子の感度の低下を招くと同時に、特異的に結合している分子の観測を妨げることである。特に、タンパク質などの高分子試料においては、試料の特性(分子量および/またはアミノ酸組成)に依存した影響が顕著に現れる。
したがって、CSI−Massを用いたタンパク質の相互作用解析をより汎用性の高いものとするためには、タンパク質の物性に依存することなく効率的にイオン化する方法を開発することが不可欠である。タンパク質を質量分析する際のイオン化効率を向上させる従来法として、タンパク質表面に化学的にアミジンまたはグアニジンを導入する方法が知られているが、このような方法では塩基性条件にすることが必要であり、反応制御も困難であった。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、低温および/または中性などの温和な条件下でのタンパク質修飾を実現することにある。具体的には、CSI−TOF Massにおけるイオン化効率を向上させ得る試薬を提供し、本試薬を用いる低温および中性の温和な条件下でのタンパク質修飾を実現することにある。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法は、目的のタンパク質表面に有機残基誘導体を導入する工程を包含することを特徴としている。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記有機残基誘導体は金属錯体であることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体の配位子は三座配位子であることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体の配位子はテルピリジンであることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体の金属元素はPt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrであることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体は4級アンモニウムを有することが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法において、上記金属錯体は、以下の式
によって示され、
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法は、目的のタンパク質表面に存在するアミノ酸側鎖の非共有電子対と上記金属錯体とを配位させる工程を包含することが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットは、三座配位子を有する金属錯体を備えることを特徴としている。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記配位子はテルピリジンであることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体の金属元素はPt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrであることが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体は4級アンモニウムを有することが好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体は、以下の式
によって示され、
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
本発明に係る金属錯体は、三座配位子を有することを特徴としている。
本発明に係る金属錯体において、上記配位子はテルピリジンであることが好ましい。
本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましい。
本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素はPt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrであることが好ましい。
本発明に係る金属錯体は、4級アンモニウムを有することが好ましい。
本発明に係る金属錯体は、以下の式
によって示され、
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
本発明に係る組成物は、上記金属錯体を含み、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させることを特徴としている。
上記組成物は、質量分析において、検出感度を向上させるために用いられることが好ましい。
本発明に係る人工タンパク質の製造方法は、上記キット、金属錯体、または組成物を用いて、タンパク質の表面に機能性残基を導入することによって、当該タンパク質に前記機能性残基に起因する機能を付与することを特徴としている。
また、本発明に係るタンパク質の分析方法は、上記キット、金属錯体、または組成物を用いて、タンパク質におけるヒスチジン残基、アルギニン残基、および/またはシステイン残基の有無を判定することを特徴としている。
本発明に係る方法を使用すれば、導入する残基の化学構造に制限されることなくタンパク質への機能性残基導入を実現することができる。また、本発明に係る方法を使用すれば、錯体形成反応を利用した温和な条件下でタンパク質表面を修飾することができるので、タンパク質機能を損なうことなく機能分子を導入することができる。さらに、本発明に係る方法を使用すれば、人工タンパク質創成への応用を促進することができる。
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
本発明者らは、タンパク質表面のアミノ酸側鎖の非共有電子対に金属錯体を導入し、錯体導入によってタンパク質機能が損なわれていないことを確認した。また、本発明者らの作製した金属錯体は、官能基を改良することによってイオン化効率を向上させることができた。
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキットを提供する。以下に、これらについて詳述する。
〔1〕イオン化効率を向上させるための試薬
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための金属錯体を提供する。本発明に係る金属錯体の有する配位子は、単座配位子または多座配位子のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、三座配位子が好ましい。三座配位子としては、テルピリジン、ジエチレントリアミン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス(2’−アミノエチル)−1,2−ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ[6.6.6]アイコサンなどが挙げられるが、官能基を導入しやすい配位子として、テルピリジンが好ましい。官能基としては、グアニジン(−NH−C(−NH2)=NH2 +)もしくはアミジン(−C(−NH2)=NH2 +)を有するもの(例えば、アルギニン)、または4級カチオン(−N(CH3)+)を有するものが好ましいが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものであることが好ましく、4級アンモニウムが特に好ましい。本発明に係る金属錯体は、上記官能基を1つまたは複数個有する。
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための金属錯体を提供する。本発明に係る金属錯体の有する配位子は、単座配位子または多座配位子のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、三座配位子が好ましい。三座配位子としては、テルピリジン、ジエチレントリアミン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス(2’−アミノエチル)−1,2−ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ[6.6.6]アイコサンなどが挙げられるが、官能基を導入しやすい配位子として、テルピリジンが好ましい。官能基としては、グアニジン(−NH−C(−NH2)=NH2 +)もしくはアミジン(−C(−NH2)=NH2 +)を有するもの(例えば、アルギニン)、または4級カチオン(−N(CH3)+)を有するものが好ましいが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものであることが好ましく、4級アンモニウムが特に好ましい。本発明に係る金属錯体は、上記官能基を1つまたは複数個有する。
本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましく、Pt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrがより好ましい。
本発明に係る金属錯体は、以下の式
によって示され、
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
本発明の上記官能基を有する金属錯体は、まず、上記官能基を有する配位子を調製し、次いで、この配位子を金属に配位させることによって合成することができる。例えば、
に示される化合物(2)を合成する場合、まず、アミンがテルピリジン骨格の4位に導入された化合物(3)
を調製し、次いで、化合物(3)を還元して化合物(4)
を得、化合物(4)を金属塩と反応させて、4級アンモニウムを有するテルビリジン金属錯体を得る。得られた金属錯体は、核磁気共鳴スペクトル、可視紫外吸収スペクトル、質量分析等によって同定することができる。
本発明に係る金属錯体は、タンパク質表面のアミノ酸側鎖の非共有電子対(ヒスチジン、アルギニン、システイン)との配位を利用してタンパク質表面に結合するものであり、本発明に係る金属錯体を使用すれば、タンパク質表面に任意の機能性物質(例えば、糖鎖)を温和な条件で導入することができる。これによって、タンパク質にターゲット能および/または加水分解抵抗性を付与することができる。
なお、本発明には、上記金属錯体の溶液のように、上記金属錯体に加えて、その他の化合物を含み、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させる組成物も含まれる。当該組成物は、質量分析において、検出感度を向上させるために好適に用いることができる。
また、上記金属錯体および組成物は、上述のように、タンパク質表面に任意の機能性残基を温和な条件で導入することができるため、タンパク質に新たな機能を付与した人工タンパク質を創成するために用いることができる。したがって、本発明には、上記金属錯体または組成物を用いて、タンパク質の表面に機能性残基を導入することにより、当該タンパク質に前記機能性残基に起因する機能を付与する人工タンパク質の製造方法も含まれる。上記機能性残基としては、例えば、糖鎖を挙げることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。
さらに、上記金属錯体によれば、タンパク質のヒスチジン残基、アルギニン残基、および/またはシステイン残基が修飾されるので、当該タンパク質における上記アミノ酸残基の有無を判定することができる。したがって、本発明には、上記金属錯体または組成物を用いて、タンパク質におけるヒスチジン残基、アルギニン残基、および/またはシステイン残基の有無を判定するタンパク質の分析方法も含まれる。
上記アミノ酸残基の有無は、上記金属錯体または組成物とタンパク質とを反応させ、反応後のタンパク質をそのまま、もしくは当該タンパク質を適宜プロテアーゼ等で分解することにより得られるペプチドを質量分析することにより判定することができる。
〔2〕イオン化効率を向上させるためのキット
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための試薬を備えたキットを提供する。本発明に係るキットは、金属錯体を試薬として備えることが好ましく、上述したように、該金属錯体の有する配位子は、単座配位子または多座配位子のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、三座配位子が好ましい。三座配位子としては、テルピリジン、ジエチレントリアミン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス(2’−アミノエチル)−1,2−ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ[6.6.6]アイコサンなどが挙げられるが、官能基を導入しやすい配位子として、テルピリジンが好ましい。官能基としては、グアニジン(−NH−C(−NH2)=NH2 +)もしくはアミジン(−C(−NH2)=NH2 +)を有するもの(例えば、アルギニン)、または4級カチオン(−N(CH3)+)を有するものが好ましいが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものであることが好ましく、4級アンモニウムが特に好ましい。本発明に係るキットに備えられる試薬(金属錯体)は、上記官能基を1つまたは複数個有する。
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための試薬を備えたキットを提供する。本発明に係るキットは、金属錯体を試薬として備えることが好ましく、上述したように、該金属錯体の有する配位子は、単座配位子または多座配位子のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、三座配位子が好ましい。三座配位子としては、テルピリジン、ジエチレントリアミン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス(2’−アミノエチル)−1,2−ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ[6.6.6]アイコサンなどが挙げられるが、官能基を導入しやすい配位子として、テルピリジンが好ましい。官能基としては、グアニジン(−NH−C(−NH2)=NH2 +)もしくはアミジン(−C(−NH2)=NH2 +)を有するもの(例えば、アルギニン)、または4級カチオン(−N(CH3)+)を有するものが好ましいが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものであることが好ましく、4級アンモニウムが特に好ましい。本発明に係るキットに備えられる試薬(金属錯体)は、上記官能基を1つまたは複数個有する。
本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましく、Pt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrがより好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体は、以下の式
によって示され、
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
本発明に係るキットは、タンパク質表面のアミノ酸側鎖の非共有電子対(ヒスチジン、アルギニン、システイン)と配位する金属錯体を試薬として利用してタンパク質表面に任意の機能性物質(例えば、糖鎖)を温和な条件で導入するためのものである。これによって、タンパク質にターゲット能および/または加水分解抵抗性を付与することができる。
すなわち、本発明に係るキットによれば、タンパク質に新たな機能を付与した人工タンパク質を創成するために用いることができる。したがって、本発明には、上記キットを用いて、タンパク質表面に機能性残基を導入することにより、人工タンパク質を創成する方法も含まれる。上記機能性残基としては、例えば、糖鎖を挙げることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。
また、発明に係る金属錯体は、タンパク質のヒスチジン残基、アルギニン残基、および/またはシステイン残基を修飾するので、当該タンパク質における上記アミノ酸残基の有無を判定することができる。したがって、本発明には、上記キットを用いて、タンパク質におけるヒスチジン残基、アルギニン残基、および/またはシステイン残基の有無を判定するタンパク質の分析方法も含まれる。
〔3〕イオン化効率を向上させるための方法
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための方法を提供する。本発明に係る方法は、目的のタンパク質表面に有機残基誘導体を導入する工程を包含することが好ましく、該有機残基誘導体は、金属錯体であることが好ましい。すなわち、本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法は、目的のタンパク質表面に存在するアミノ酸側鎖の非共有電子対と上記金属錯体とを配位させる工程を包含することが好ましい。
本発明は、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させるための方法を提供する。本発明に係る方法は、目的のタンパク質表面に有機残基誘導体を導入する工程を包含することが好ましく、該有機残基誘導体は、金属錯体であることが好ましい。すなわち、本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるための方法は、目的のタンパク質表面に存在するアミノ酸側鎖の非共有電子対と上記金属錯体とを配位させる工程を包含することが好ましい。
上述したように、該金属錯体の有する配位子は、単座配位子または多座配位子のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、三座配位子が好ましい。三座配位子としては、テルピリジン、ジエチレントリアミン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス(2’−アミノエチル)−1,2−ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ[6.6.6]アイコサンなどが挙げられるが、官能基を導入しやすい配位子として、テルピリジンが好ましい。官能基としては、グアニジン(−NH−C(−NH2)=NH2 +)もしくはアミジン(−C(−NH2)=NH2 +)を有するもの(例えば、アルギニン)、または4級カチオン(−N(CH3)+)を有するものが好ましいが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものであることが好ましく、4級アンモニウムが特に好ましい。本発明に係るイオン化効率を向上させるための方法に用いる金属錯体は、上記官能基を1つまたは複数個有する。
本発明に係る金属錯体において、上記金属錯体の金属元素は遷移元素または典型元素であることが好ましく、Pt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrがより好ましい。
本発明に係るタンパク質イオン化効率を向上させるためのキットにおいて、上記金属錯体は、以下の式
によって示され、
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
ここで、Rは、Hまたは4級アンモニウムであり、Xは、PtまたはCuであることが好ましい。
本発明に係る方法は、タンパク質表面のアミノ酸側鎖の非共有電子対(ヒスチジン、アルギニン、システイン)と金属(Pt、Cuなど)の錯体との配位を利用するものであり、本発明に係る方法を使用すれば、タンパク質表面に任意の機能性物質(例えば、糖鎖)を温和な条件で導入することができる。これによって、タンパク質にターゲット能および/または加水分解抵抗性を付与することができる。
以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
〔実施例〕
(実施例1:タンパク質修飾用金属錯体の合成)
(実施例1:タンパク質修飾用金属錯体の合成)
テトラクロロ白金(II)酸カリウム100mgを、蒸留水1.6mlに溶解した後に酢酸2.4mlを添加して、室温にて攪拌した。この溶液に、1,5−シクロオクタジエンを0.1ml加えた後に加熱して、90℃で30分間攪拌した。その結果、白色結晶が析出した。この溶液を、減圧下で約1mlになるまで濃縮した後、減圧濾過によって結晶を得た。この結晶を、蒸留水、エタノール、およびジエチルエーテルを用いて洗浄した後、減圧下にて乾燥して、白金ジクロロ(1,5−シクロオクタジエン)の結晶59mgを得た。白金ジクロロ(1,5−シクロオクタジン)50mgを、フラスコ中にてN,N’−ジメチルホルムアミド4mlに溶解した。この溶液を50℃に加熱した後、2,2’:6’,2’’−テルピリジン31.1mlを加え、15分間攪拌した、この溶液を室温に戻した後、減圧濾過によって固体物質を除去した。得られた濾液を、減圧下にて濃縮した後に乾燥させて、化合物(1)(白金クロロ(2,2’:6’,2’’−テルピリジン))の結晶42.5mgを得た。この結晶をESI−Massによって確認した。
(実施例2:4級アンモニウムを有する白金錯体の合成)
4’−クロロ−2,2’:6’,2’’−テルピリジン1g、水酸化カリウム280mgおよび1−アミノ−3−プロパノール0.32mlを、フラスコ内にてジメチルスルホキシド約5mlに溶解した。この溶液を90分間室温にて攪拌した後に加熱して、55℃で40時間攪拌した。この溶液を室温に戻し、0℃の蒸留水5mlを加えた。この溶液を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて化合物(3)
を精製した。NMRおよびMALDI−TOF Massによって同定した。化合物(3)422mgおよび炭酸カリウム300mgをフラスコ中で乾燥させた後にクロロホルム15mlに溶解させた。フラスコ内の気体を窒素に置換し、過剰量のヨウ化メチルを少量ずつ添加しながら室温で約6時間攪拌した。セライトを用いてこの溶液を減圧濾過することによって、炭酸カリウムを除去した。得られた濾液を濃縮し、減圧下にて乾燥させて、化合物(4)
を381mg得た。化合物(4)を、ニトロメタン20mlに溶解した後、テトラクロロ白金(II)酸カリウム218mgおよびフッ化銀244mgを添加した。この溶液を110℃に加熱した後21時間攪拌し、次いで減圧濾過して溶液中の固体物質を除去した。濾液を濃縮した後、ジエチルエーテルを少量ずつ添加することによって生成物を析出させた後、再度減圧濾過を行って化合物(2)208mgを得た。
(実施例3:化合物(1)および(2)のタンパク質への導入、ならびにCSI−TOF Massによるイオン化効率の比較)
ガラクトース転位酵素(TOYOBO)(以下、GalTと称する)を、20mM酢酸アンモニウム緩衝液(pH7)に置換して、13μMのタンパク質溶液を調整した。このタンパク質溶液100μlに、タンパク質に対して1等量の化合物(1)または2等量の化合物(2)を添加した後、室温で4時間攪拌した。これらの溶液を、Microcon YM−10(Millipore)を用いて限外濾過し、未反応の化合物(1)または(2)を除去した。MS−T100CS(日本分光)を用いて、これらのタンパク質溶液の質量分析を行った。測定条件を以下に示す:加速電圧−7kV、ニードル電圧2kV、オレフィス電圧80V、分解能6000(半値全幅)、ガス流速3l/分、脱溶媒室温度200℃、100℃、80℃、50℃、10℃。
ガラクトース転位酵素(TOYOBO)(以下、GalTと称する)を、20mM酢酸アンモニウム緩衝液(pH7)に置換して、13μMのタンパク質溶液を調整した。このタンパク質溶液100μlに、タンパク質に対して1等量の化合物(1)または2等量の化合物(2)を添加した後、室温で4時間攪拌した。これらの溶液を、Microcon YM−10(Millipore)を用いて限外濾過し、未反応の化合物(1)または(2)を除去した。MS−T100CS(日本分光)を用いて、これらのタンパク質溶液の質量分析を行った。測定条件を以下に示す:加速電圧−7kV、ニードル電圧2kV、オレフィス電圧80V、分解能6000(半値全幅)、ガス流速3l/分、脱溶媒室温度200℃、100℃、80℃、50℃、10℃。
化合物(1)で修飾されたGalTについて、脱溶媒室温度200℃、80℃、10℃の条件下で質量分析を行った(図1)。得られたスペクトルのデコンボリューション処理を行い、タンパク質の一部が化合物(1)によって修飾されていることを確認した(図2)。得られたデータからGalTおよび修飾されたGalTのそれぞれのピーク面積を求めた。200℃にて測定した値を1とした場合のグラフを図3に示す。さらに、各温度条件下でのGalTおよび修飾されたGalTの面積比のグラフを図4に示す。
化合物(2)で修飾されたGalTについて、脱溶媒室温度200℃、100℃、50℃、10℃の条件下で質量分析を行った(図5)。得られたスペクトルのデコンボリューション処理を行い、タンパク質の一部が化合物(2)で修飾されていることを確認した(図6)。得られたデータに基づいて、GalTおよび修飾されたGalTのそれぞれのピーク面積を求めた。200℃にて測定した値を1とした場合のグラフを図7に示す。さらに、各温度条件下でのGalTおよび修飾されたGalTの面積比のグラフを図8に示す。
図2および図6より、GalTおよびそれぞれ1つの化合物(1)または化合物(2)で修飾されたGalTのピークを確認した。この結果より、白金錯体またはテルピリジンを用いることによって、タンパク質を中性条件下で修飾することができることがわかった。すなわち、テルピリジンを有する種々の分子を用いれば、温和な条件下でのタンパク質修飾法を提供することができる。
図3および図7より、脱溶媒室温度の変化によってタンパク質のピーク面積が変化していること、温度低下に伴ってピーク面積が低下すること、およびGalTでの修飾の有無によって温度低下に伴うピーク面積低下の割合が異なることが確認された。
図4および図8より、温度低下に伴って修飾タンパク質のピーク面積比が増大することがわかった。この理由としては、修飾に用いた白金錯体または4級アミンの有するカチオンが分子イオン化を促進していることが考えられる。
図10および図12より、修飾の有無にかかわらず、GalTがUDPまたはUDP−Galと複合体を形成していることが確認された。この結果より、修飾されたGalTもまた、タンパク質の酵素活性部位を保存していることがわかった。
これらの結果より、白金錯体を利用した化合物(1)および(2)は、温和な条件下においてタンパク質の活性を保持したまま修飾することができることがわかった。さらに、修飾したGalTは、未修飾のものと比較してCSI−Massでのイオン化効率の低下が軽減された。これらの化合物の修飾を利用すれば、CSI−Mass状態でのタンパク質−リガンド分子複合体の測定またはスクリーニングを高感度で行うことができる。
発明を実施するための最良の形態の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求事項の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
タンパク質の質量分析におけるイオン化効率は、個々のタンパク質に固有の性質(例えば、タンパク質の分子量および/または等電点など)に依存することが多い。イオン化効率を向上させ得る構造を有する化合物を本発明に係る方法によって導入することによって、タンパク質の性質に依存することなくタンパク質を高感度で検出することができる。これによって、タンパク質相互作用を高速かつ高感度で解析することができる。また、タンパク質表面に糖鎖などの機能性残基を導入することによって、タンパク質の機能改変および/または多機能化が可能となり、人工糖タンパク質の新規創成を実現することができる。
Claims (25)
- タンパク質イオン化効率を向上させるための方法であって、目的のタンパク質表面に有機残基誘導体を導入する工程を包含することを特徴とする、方法。
- 前記有機残基誘導体が金属錯体であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記金属錯体の配位子が三座配位子であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記金属錯体の配位子がテルピリジンであることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記金属錯体の金属元素が遷移元素または典型元素であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記金属錯体の金属元素がPt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrであることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記金属錯体が4級アンモニウムを有することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 目的のタンパク質表面に存在するアミノ酸側鎖の非共有電子対と前記金属錯体とを配位させる工程を包含することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 三座配位子を有する金属錯体を備えることを特徴とする、タンパク質イオン化効率を向上させるためのキット。
- 前記配位子がテルピリジンであることを特徴とする、請求項10に記載のキット。
- 前記金属錯体の金属元素が遷移元素または典型元素であることを特徴とする、請求項10に記載のキット。
- 前記金属錯体の金属元素がPt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrであることを特徴とする、請求項10に記載のキット。
- 前記金属錯体が4級アンモニウムを有することを特徴とする、請求項10に記載のキット。
- 三座配位子を有することを特徴とする、金属錯体。
- 前記配位子がテルピリジンであることを特徴とする、請求項16に記載の金属錯体。
- 前記金属錯体の金属元素が遷移元素または典型元素であることを特徴とする、請求項16に記載の金属錯体。
- 前記金属錯体の金属元素がPt、Pd、Fe、Co、Ni、Cu、Cr、Ru、Rh、Ag、Au、OsまたはIrであることを特徴とする、請求項16に記載の金属錯体。
- 4級アンモニウムを有することを特徴とする、請求項16に記載の金属錯体。
- 請求項16〜21のいずれか1項に記載の金属錯体を含み、タンパク質の質量分析におけるイオン化効率を向上させることを特徴とする組成物。
- 質量分析において、検出感度を向上させるために用いられることを特徴とする請求項22に記載の組成物。
- 請求項10〜15のいずれか1項に記載のキット、請求項16〜21のいずれか1項に記載の金属錯体、または請求項22に記載の組成物を用いて、
タンパク質の表面に機能性残基を導入することによって、当該タンパク質に前記機能性残基に起因する機能を付与することを特徴とする人工タンパク質の製造方法。 - 請求項10〜15のいずれか1項に記載のキット、請求項16〜21のいずれか1項に記載の金属錯体、または請求項22に記載の組成物を用いて、タンパク質におけるヒスチジン残基、アルギニン残基、および/またはシステイン残基の有無を判定することを特徴とするタンパク質の分析方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005019516 | 2005-01-27 | ||
JP2005019516 | 2005-01-27 | ||
PCT/JP2006/300554 WO2006080210A1 (ja) | 2005-01-27 | 2006-01-17 | イオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキット、並びにその利用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2006080210A1 true JPWO2006080210A1 (ja) | 2008-06-19 |
Family
ID=36740244
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007500466A Pending JPWO2006080210A1 (ja) | 2005-01-27 | 2006-01-17 | イオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキット、並びにその利用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2006080210A1 (ja) |
WO (1) | WO2006080210A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020533579A (ja) * | 2017-09-08 | 2020-11-19 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 質量分析のためのスルホキシドベースの試薬 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2852678B1 (en) | 2012-05-22 | 2017-08-23 | Biogen MA Inc. | Trapping reagents for reactive metabolites screening |
CN103044462B (zh) * | 2012-11-20 | 2015-12-02 | 复旦大学 | 钳型Cu(II)金属有机络合物小分子水凝胶及其应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3035559B1 (ja) * | 1999-02-05 | 2000-04-24 | 工業技術院長 | アルキル置換フェノ―ル重合体の製造方法 |
JP4186532B2 (ja) * | 2002-07-12 | 2008-11-26 | 株式会社島津製作所 | 新規な金属錯体、及びそれを用いるタンパク質のアミノ酸配列決定方法 |
JP2004075633A (ja) * | 2002-08-21 | 2004-03-11 | Asahi Kasei Chemicals Corp | ヘテロポリ酸塩の製造方法 |
-
2006
- 2006-01-17 JP JP2007500466A patent/JPWO2006080210A1/ja active Pending
- 2006-01-17 WO PCT/JP2006/300554 patent/WO2006080210A1/ja not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020533579A (ja) * | 2017-09-08 | 2020-11-19 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 質量分析のためのスルホキシドベースの試薬 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006080210A1 (ja) | 2006-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6582916B1 (en) | Metal ion-binding mass markers for nucleic acids | |
DE69904478T2 (de) | Arylsulfon-linker zur massenspektrometrischen analyse | |
US8299225B2 (en) | Amidite for synthesizing modified nucleic acid and method for synthesizing modified nucleic acid | |
JP2001501449A (ja) | 核酸分子の配列を決定するための方法および組成物 | |
NZ331042A (en) | Methods and compositions for detecting binding of ligand pair using non-fluorescent label | |
Wang et al. | Visible-light-mediated catalyst-free synthesis of unnatural α-amino acids and peptide macrocycles | |
CZ228598A3 (cs) | Způsoby a kompozice pro analyzování molekul nukleových kyselin za použití postupu třídění | |
US20210356473A1 (en) | Solid-phase n-terminal peptide capture and release | |
DE60110127T2 (de) | Ligationsverfahren und reagenzien zur bildung einer amid-bindung | |
US8940879B2 (en) | Functional molecule, functional molecule synthesizing amidite and target substance analysis method | |
JPWO2006080210A1 (ja) | イオン化効率を向上させるための試薬、方法およびキット、並びにその利用 | |
CN107129519B (zh) | 基于金属铱配合物的多肽荧光环化方法及环化多肽 | |
Bergeron et al. | Ligand dissociation and core fission from diphosphine-protected gold clusters | |
Bognár et al. | Novel functional monomer for the electrochemical synthesis of highly affine epitope‐imprinted polymers | |
AU2005312404A1 (en) | Labeled transition metal complexes | |
Strømgaard et al. | A versatile method for solid-phase synthesis of polyamines: neuroactive polyamine toxins as example | |
Kimutai et al. | Amino acid-linked platinum (II) compounds: non-canonical nucleoside preferences and influence on glycosidic bond stabilities | |
Rudolf et al. | Metallocarbonyl complexes of bromo‐and dibromomaleimide: synthesis and biochemical application | |
US7476738B2 (en) | Method for identifying molecular weight of a phosphoric acid monoester compound and an additive for mass spectrometry | |
WO2007018315A1 (ja) | タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ | |
Zhao et al. | Detection of GSH with a dual-mode biosensor based on carbon quantum dots prepared from dragon fruit peel and the T-Hg (ii)-T mismatch | |
EP3966203B1 (en) | A method for functionalization of an aromatic amino acid or a nucleobase | |
JP4163821B2 (ja) | オリゴヌクレオチドの修飾方法 | |
Piper et al. | Direct aminoalkylation of α-branched aldehydes with in situ generated glycine cation equivalents | |
McChesney-Harris et al. | Mechanism based design of amine fluorogenic derivatization reagents: proof of concept, physical–chemical characterization and initial analytical derivatization protocols |