JPWO2006033435A1 - 生体硬組織または軟組織誘導性スカフォールド材料 - Google Patents
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Abstract
【課題】 骨芽細胞との機械的結合が比較的高く、強度が高いインプラント材料を提供する。【解決手段】 胴部21と橋げた22を有するロッド11と、そのロッドの胴部の外周に形成された結合層13と、その結合層の外周に形成された金属繊維層14とからなり、さらに金属繊維層14の外周には補強層15が形成されている生体硬組織誘導性スカフォールド材料10。この結合層13は平均ポアサイズが100μmより小さく、金属繊維層14は、平均ポアサイズが100〜400μmである。【選択図】 図1
Description
本発明は人工歯根インプラント、人工関節インプラント、骨プレートなどの骨固定具、代替骨または人工臓器およびその保持装置に用いられる生体硬組織または軟組織誘導性スカフォールド材料(以下、スカフォールド材料という)に関する。さらに、本発明は細胞・微生物の培養方法、それを用いた生物由来物質(とくに医療用のコラーゲン)の産生方法、ならびにそれらの方法に用いる装置に関する。
従来、生体内植え込み用インプラント材料として、人工歯根、人工関節などの硬組織誘導性のインプラント材料または人工臓器およびその保持装置、皮膚端子など軟組織誘導性のインプラント材料が知られている。ここで人工歯根、人工関節などの骨固定具は、生体内の硬組織である骨組織(骨芽細胞、骨細胞)の誘導および成長が重要となり、人工臓器またはその保持装置あるいは皮膚端子などは、生体内の軟組織(線維芽細胞等)の誘導および成長が重要となる。このようなインプラント材料の金属材料としてチタンおよびチタン合金が、他の金属に比べて生体内での異物反応が少ない特異な親和性を有するとして好ましく用いられている。
しかし、たとえ生体内での異物反応が少ない場合でも、これらのインプラント材料が生体内に植え込まれたとき、インプラント材料表面には結合組織系の線維芽細胞などが膠原繊維と共に集まって被包組織を形成するため、インプラント材料と骨組織とは直接接することができず、骨組織を誘導するのに時間がかかり実用的でなかった。また、材料の表面がたとえ粗造な平面でも2次元構造のため、前記被包組織等を含む軟組織とは結合することができない。そのためインプラント材料が生体内に強固に固定されるためには、インプラント材料と生体硬組織または軟組織とが短時間でそして、より多くの機械的結合を備えることが必要になる。このような趣旨から生体硬組織または軟組織と機械的結合する部位を備えた様々な幾何学的構造を有するインプラント材料が開発されている。
しかし、たとえ生体内での異物反応が少ない場合でも、これらのインプラント材料が生体内に植え込まれたとき、インプラント材料表面には結合組織系の線維芽細胞などが膠原繊維と共に集まって被包組織を形成するため、インプラント材料と骨組織とは直接接することができず、骨組織を誘導するのに時間がかかり実用的でなかった。また、材料の表面がたとえ粗造な平面でも2次元構造のため、前記被包組織等を含む軟組織とは結合することができない。そのためインプラント材料が生体内に強固に固定されるためには、インプラント材料と生体硬組織または軟組織とが短時間でそして、より多くの機械的結合を備えることが必要になる。このような趣旨から生体硬組織または軟組織と機械的結合する部位を備えた様々な幾何学的構造を有するインプラント材料が開発されている。
特許文献1には、外部表面が複数の開口セルを有する金属製の泡構造薄層で被覆されたインプラント材料が開示されている。そして、この泡構造薄層の被覆部に強化された骨セメントを含侵させることにより、インプラント材料と骨との中間的な機械的性質を示すものである。
また特許文献2には、金属線材をインプラント材料の下部外周に多重に圧縮して巻きつけて形成される埋入部を備えたインプラント材料が開示されている。このインプラント材料も骨芽細胞との金属的結合部位を増やすことを目的としており、さらに、埋入部が緩衝機能に優れているため、咬合等の外力にたいしても破断が起こりにくい。
しかし、上述する幾何学的構造を有するインプラント材料には骨芽細胞のインプラント材料への侵入は見られるが、細胞との一体となったオステオインテグレーション状態を満足するものではなかった。
また特許文献2には、金属線材をインプラント材料の下部外周に多重に圧縮して巻きつけて形成される埋入部を備えたインプラント材料が開示されている。このインプラント材料も骨芽細胞との金属的結合部位を増やすことを目的としており、さらに、埋入部が緩衝機能に優れているため、咬合等の外力にたいしても破断が起こりにくい。
しかし、上述する幾何学的構造を有するインプラント材料には骨芽細胞のインプラント材料への侵入は見られるが、細胞との一体となったオステオインテグレーション状態を満足するものではなかった。
本発明者は、特許文献3において「骨芽細胞は細い繊維が構成する幾何学的空間に好んで成育し、100μm未満の太さのチタン繊維集団が構成する幾何学的空間構造で、その広がりが100〜400μmであるような構造に対して極めて高い親和性を示し、積極的に付着する特性がある」と記載している。そして、この知見を元にチタン金属製のロッドと、直径が100ミクロン未満、アスペクト比20以上(短軸:長軸比=1:20以上)のチタン繊維又はチタン基合金繊維を絡合して層状に形成したものを前記ロッドの外周に巻きつけた生体組織着床空間とからなる生体硬組織誘導性スカフォールド材料を開示している。この特許文献3のスカフォールド材料を生体に用いることにより、材料と骨芽細胞との間で3次元的な物理的結合が形成され、極めて良好なオステオインテグレーション組織となる。
しかし、特許文献3の多孔質の生体組織着床層を備えたインプラント材は、骨芽細胞との機械的結合は好ましくなるが、外力に対する耐久性、特にロッドと硬組織形成誘導層との間の接合面に加わる力、ねじりまたはせん断等に対する強度についてのさらなる改善が求められている。
本発明は、硬組織(骨芽細胞)が好んで育成する幾何学的空間を維持したまま、ロッドと硬組織形成誘導層との間の接合面に加わる力、特にねじりまたはせん断等に対する強度を向上させることを目的としている。
また、現在人工心臓を初めとする人工臓器を生体内に埋め込む場合、その人工臓器を保持するために、生体内組織と結合しやすい別の人工物を人工臓器と共に埋め込んでいる。本発明は軟組織が誘導され易いポアサイズで、かつ幾何学的空間を持ち、骨芽細胞以外の各種(足場依存性)細胞や軟組織である皮膚や筋肉にも用いることができるスカフォールド材料およびそのインプラント材料を提供することも目的としている。
本発明は、硬組織(骨芽細胞)が好んで育成する幾何学的空間を維持したまま、ロッドと硬組織形成誘導層との間の接合面に加わる力、特にねじりまたはせん断等に対する強度を向上させることを目的としている。
また、現在人工心臓を初めとする人工臓器を生体内に埋め込む場合、その人工臓器を保持するために、生体内組織と結合しやすい別の人工物を人工臓器と共に埋め込んでいる。本発明は軟組織が誘導され易いポアサイズで、かつ幾何学的空間を持ち、骨芽細胞以外の各種(足場依存性)細胞や軟組織である皮膚や筋肉にも用いることができるスカフォールド材料およびそのインプラント材料を提供することも目的としている。
本発明の生体組織誘導性スカフォールド材料(請求項1)は、金属基材と、その金属基材の外周に設けられている金属線からなる金属繊維層とを備え、前記金属繊維層の平均ポアサイズが100〜400μmであることを特徴としている。このようなスカフォールド材料であって金属繊維層の内側に金属線からなる平均ポアサイズが100μmより小さい結合層を備えているものが好ましい(請求項2)。また、金属繊維層の平均ポアサイズが、最内から最外にかけて傾斜的または段階的に大きくなっているものが好ましい(請求項3)。
上述のスカフォールド材料の金属繊維層として、径5〜400μmの金属線を絡合することによって形成されている金属不織布を固定したものが挙げられる(請求項4)。また、金属繊維層が径5〜400μmの金属線からなり、その金属線の絡合度の差または金属線径の差により、ポアサイズを傾斜的または段階的に大きくなるように変化させているものであってもよい(請求項5、6)。
さらに、前記結合層が、径5〜400μmの金属線を絡合させることにより形成され、その絡合された金属線間に金属粉または金属粒子を密に埋め込むことにより、平均ポアサイズが100μmより小さい結合層を形成してもよい(請求項7)。このような金属粉または金属粒子の径は100μm以下であることが好ましい(請求項8)。
また、金属繊維層の外周に、径100〜2000μmの金属線を用い、平均ポアサイズを100〜2000μmとした補強層を形成してもよい(請求項9)。
さらに、前記結合層が、径5〜400μmの金属線を絡合させることにより形成され、その絡合された金属線間に金属粉または金属粒子を密に埋め込むことにより、平均ポアサイズが100μmより小さい結合層を形成してもよい(請求項7)。このような金属粉または金属粒子の径は100μm以下であることが好ましい(請求項8)。
また、金属繊維層の外周に、径100〜2000μmの金属線を用い、平均ポアサイズを100〜2000μmとした補強層を形成してもよい(請求項9)。
このようなスカフォールド材料の金属基材は用途に応じてその形状をロッドとし、そのロッド表面にロッドの半径方向に対して外側に突出している橋げたまたは突起物を形成してもよい(請求項10)。また、金属基材の形状をプレートとし、そのプレート表面外側に突出している突起物を形成してもよい(請求項11)。
さらに、スカフォールド材料は金属基材と金属繊維層および/または結合層とを共に焼結することにより形成するのが好ましい(請求項12)。そのような焼結は金属基材の融点(Tm・℃)の0.3〜0.9倍の温度により行うのが好ましい(請求項13)。しかし、金属基材と金属繊維層または結合層を接着剤でもって接着してもよい(請求項14)。
スカフォールド材料の材質は、金属基材および金属繊維層および/または結合層の材質がチタン、チタン合金、金、金合金からなる群より選ばれた一種または二種の金属であるものが好ましく(請求項15)、金属繊維層および/または結合層がアパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含む、ヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物によってコートされているものが好ましい(請求項16)。
スカフォールド材料の材質は、金属基材および金属繊維層および/または結合層の材質がチタン、チタン合金、金、金合金からなる群より選ばれた一種または二種の金属であるものが好ましく(請求項15)、金属繊維層および/または結合層がアパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含む、ヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物によってコートされているものが好ましい(請求項16)。
本発明の生体硬組織または軟組織誘導性スカフォールド材料の第2の態様は、基材と、その基材の外周に設けられている平均ポアサイズが100〜400μmの多孔質構造体からなる細胞誘導層とを備えており、前記基材が、2mm以下のミクロな孔を持つポーラス構造体で、中心方向に向かって延びる少なくとも一本の導入孔を備えており、この導入孔と基材の外部とがミクロな孔によって複雑に連通していることを特徴としている(請求項17)。
本発明の生体硬組織または軟組織誘導性スカフォールド材料の第3の態様は、基材と、その基材の外周に設けられている平均ポアサイズが100〜400μmの多孔質構造体からなる細胞誘導層とを備えており、前記基材は、中空部を備えた基材本体と、その中空部に充填される多孔質三次元構造体とを有しており、前記基材本体は、中空部に連通するように外面に形成された少なくとも1つ以上の外径2mm以下の穿孔と、中空部に連通するように外面に形成された穿孔より大きい導入孔とを備えていることを特徴としている(請求項18)。また、前記中空部に、支柱が配置されているものが好ましい(請求項19)。
さらに、本発明の第2または第3の態様のスカフォールド材料において、前記細胞誘導層は、金属線を絡合することによって形成されているものが好ましい(請求項20)。また、前記のようにリン酸カルシウム化合物をコートしたものおよび未コートのものに骨形成たんぱく質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質からなる群から選ばれた一種または二種以上がコートされているものが好ましい(請求項21)。
さらに、本発明の第2または第3の態様のスカフォールド材料において、前記細胞誘導層は、金属線を絡合することによって形成されているものが好ましい(請求項20)。また、前記のようにリン酸カルシウム化合物をコートしたものおよび未コートのものに骨形成たんぱく質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質からなる群から選ばれた一種または二種以上がコートされているものが好ましい(請求項21)。
本発明の生体インプラント材料は、生体内に埋設させ、生体の周囲表面に一体に固定する上述したいずれかの生体組織誘導性スカフォールド材料を備えたことを特徴としている(請求項22)。また、このインプラント材料は、人工歯根、人工関節、骨プレートなどの骨固定具、代替骨、人工臓器またはその保持装置または皮膚端子に用いられるのが好ましい(請求項23)。
本発明のスカフォールド材料(請求項1)は、平均ポアサイズが100〜400μmの金属繊維層を備えているため、生体硬組織の誘導および着床性に優れており、骨芽細胞が好んで定着し、成長しやすい。そのため、金属繊維層において、骨芽細胞とスカフォールド材料は一体化し、いわゆるコラボレーション・ゾーンを形成する。
このようなスカフォールド材料であって、金属繊維層の内側に平均ポアサイズが100μmより小さい結合層を備えているため(請求項2)、金属基材と結合層との密着性が優れており、強固に固着される。そして、金属繊維層と金属基材との接合強度も結合層を挟んでより強固になる。
また、金属繊維層の平均ポアサイズが最内から最外にかけて傾斜的または段階的に大きくなるように形成されているため(請求項3)、骨芽細胞が成長した後、両層の境界面がなくなるため、スカフォールド材料に力が加わっても、せん断しにくい。そして、最外部位の平均ポアサイズが一番大きいため、細胞が侵入しやすい。
このようなスカフォールド材料であって、金属繊維層の内側に平均ポアサイズが100μmより小さい結合層を備えているため(請求項2)、金属基材と結合層との密着性が優れており、強固に固着される。そして、金属繊維層と金属基材との接合強度も結合層を挟んでより強固になる。
また、金属繊維層の平均ポアサイズが最内から最外にかけて傾斜的または段階的に大きくなるように形成されているため(請求項3)、骨芽細胞が成長した後、両層の境界面がなくなるため、スカフォールド材料に力が加わっても、せん断しにくい。そして、最外部位の平均ポアサイズが一番大きいため、細胞が侵入しやすい。
前記金属繊維層が径5〜400μmの金属線を絡合することによって形成された金属不織布を巻きつけたもの(請求項4)、また、前記金属繊維層が径5〜400μmの金属線からなり、その金属線の絡合度の差または金属線径の差により、平均ポアサイズを傾斜的または段階的に大きくなるように変化させたもの(請求項5、6)は、製造が容易である。たとえば、同径の金属線からなる金属不織布または同径の金属線を徐々に巻きつけ力を弱めながら絡合して形成する、または、平均ポアサイズの異なる複数の金属不織布を連続して巻きつける、または、金属線または金属不織布を巻きつけ、または、金型に入れて外部より異なる圧力をかけることにより絡合度に差を設ける、さらには、異なる径の金属線または異なる径の金属線からなる金属不織布を一定の巻きつけ力で絡合していく等が挙げられる。もちろんこれらを組合せても構わない。しかし、これらに限定するものではない。
また、前記結合層が、径5〜400μmの金属線を絡合させることにより形成されており、その絡合された金属線間に金属粉または金属粒子が密に埋め込まれている場合(請求項7)、金属繊維層の平均ポアサイズを、金属線を金属基材に設ける前にも設けた後にも自由に調整できるため、その製造が容易である。また、金属粉または金属粒子を埋め込むことにより金属繊維層の平均ポアサイズを調整してもよく、その金属繊維層の平均ポアサイズは一律にしても、段階的または傾斜的にしてもよい。
本発明のスカフォールド材料であって、金属繊維層の外周に、径100〜2000μmの金属線を用い、平均ポアサイズを100〜2000μmとした補強層が形成されている場合(請求項9)、この補強層がスカフォールド材料全体の骨組みとなり、ねじり等の外力に対してさらに強固になる。
前記基材の形状をロッドとすることにより、人工歯根、人工関節、代替骨として使用することができ、また、基材の形状をプレートにすることにより、骨プレートなどの骨固定具、人工臓器または保持装置として使用することができる。さらに、そのロッド表面にロッドの半径方向に対して外側に突出している橋げたまたは突起物が形成されている場合(請求項10、11)、外力特にねじり、せん断に対するロッドと金属繊維層との接合強度を向上させることができる。
上述したスカフォールド材料の金属基材と金属繊維層および/または結合層とを共に焼結することによって形成する場合(請求項12)、金属基材と金属線との接合部位および金属線同士の絡合部位が焼結によって固着されるため、一層強固になる。このような場合、金属基材と金属線が同種の金属であることが好ましい。
本発明のスカフォールド材料の金属基材、金属繊維層および/または結合層の材料がチタン、チタン合金、金、金合金である場合(請求項15)、生体親和性が高く好ましい。また、金属繊維層および/または結合層がアパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物および骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質によってコートされている場合(請求項16、17)、短期間で骨芽細胞を金属繊維層内に誘導することができ、着床させることができる。
本発明のスカフォールド材料の金属基材、金属繊維層および/または結合層の材料がチタン、チタン合金、金、金合金である場合(請求項15)、生体親和性が高く好ましい。また、金属繊維層および/または結合層がアパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物および骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質によってコートされている場合(請求項16、17)、短期間で骨芽細胞を金属繊維層内に誘導することができ、着床させることができる。
本発明のインプラント材料は、生体内に埋設させ、生体の周囲表面に一体に固定する上述したいずれか記載のスカフォールド材料を備えているため(請求項18)、生体と強固に固着させることができ、金属基材に加わるねじりまたはせん断等の外力による金属基材と金属繊維層との間との間の境界面の破断を防止する。
一方、医療用コラーゲンは皮膚、骨、軟骨など、あらゆる組織と臓器の再建・再生医療にとって最良の基本素材である。このような医療用コラーゲンは、ウシの皮膚、骨などから供給されており、現在、その特性をもつ人工の代替品は開発されていない。しかし近年、ウシ海綿脳炎(BSE、狂牛病)の出現の影響により、最大の医療用コラーゲン供給源であったウシの皮膚、骨などが利用困難になりつつある。また、ウシ以外の哺乳動物、たとえばブタでも類似疾患の可能性が否定できない。また、魚類のコラーゲンは特性が著しく劣るため、使用できない場合が多い。
そこでヒト・コラーゲンの遺伝子工学的手法による製造が試みられたが、従来のウシ・コラーゲンと比較して、非常にコスト高になり、一般の医療用として実用的でない。コスト高の原因の一つは、コラーゲン遺伝子を導入した哺乳類細胞を大量培養する場合の細胞支持体が平面(プラスチックの皿)であるため、コラーゲン生産力に限界があるためである。
特許文献4には、人工関節インプラント、骨補綴用インプラント、人工歯根インプラントなどの各種のインプラントと共に使用される生体硬組織誘導スカフォールド材料として、直径100ミクロン未満、アスペクト比20以上のチタンまたはチタン基合金繊維を絡合して層状に形成したものが開示されている。さらに特許文献1には、前記繊維表面をアパタイト生成液により処理され、ヒドロキシアパタイトまたは炭酸アパタイトを含むリン酸カルシウム化合物によりコートしたものも開示されている。
それらの繊維層からなるスカフォールド材料は、チタンまたはチタン基合金材料よりなるインプラント材料の周囲に巻き掛けた上で生体骨に埋設すると、繊維層内部に骨組織を誘導させ、チタンと骨組織との立体的なハイブリッド状態を形成することができ、骨組織との親和性がきわめて高くなる。また、従来のポリマーなどの繊維では、目詰まりと変形が生ずるので採用が難しく、セラミック製では破損が生じやすい。
本発明は前述の2次元平板の細胞培養法を改良し、特許文献1に示す3次元スカフォールド材料と同様な3次元構造を利用して、コラーゲン産生細胞(ヒト線維芽細胞、ヒト骨芽細胞など)などの細胞、あるいは抗生物質や各種医学上、産業上有用な物質を産生する微生物を効率的に培養する方法および生物由来物質(細胞由来物質、微生物由来物質)を効率的かつ大量に産生する方法、ならびにそれらの方法に用いる装置を提供することを技術課題としている。
本発明の細胞・微生物の培養方法は、細繊維を絡合したウエブからなる培養基盤に足場依存性の細胞または微生物を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記細胞または微生物を培養することを特徴としている(請求項24)。このような培養方法においては、前記培養基盤の底部に、あるいは底部と側面に不透過層を設けて複合層とした状態で、細胞または微生物を培養するのが好ましい(請求項25)。
また、前記培養基盤を多数枚、複数段の着脱可能な積層状態で筒状の容器内に収容し、その容器内に培養液を環流させるのが好ましい(請求項26)。その場合、培養基盤を容器に収容する前に、旋回培養により細胞または微生物を培養するのが好ましい(請求項27)。
本発明の生物由来物質の産生方法は、所定の生物由来物質を産生する細胞または微生物を前述のいずれかの培養方法で培養し、ついで培養した細胞または微生物から得られた生物由来物質を分離・回収することを特徴としている(請求項28)。前記生物由来物質としては、コラーゲンなどのマトリックスタンパク質、骨形成タンパク質(BMP)などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質など、医学上・産業上有用なリコンビナントタンパク質などがあげられ、用いられる細胞、微生物についても、医療と産業に有益なリコンビナントタンパク質をつくるほとんど全ての細胞ならびに微生物があげられる(請求項29)。前記産生方法においては、前記環流させる培養液の一部を回収し、その培養液中に分泌された生物由来物質を回収するのが好ましい(請求項30)。さらに前記培養基盤に沈着された生物由来物質を溶媒またはペプシンなどの酵素処理によって可溶化し、溶媒中に溶けている生物由来物質を抽出することもできる(請求項31)。
本発明の培養装置は、筒状の容器と、その内部に積層状態で着脱自在に収容される細繊維を絡合したウエブからなる複数枚の培養基盤と、前記容器内に培養液を環流させる手段とを備えていることを特徴としている(請求項32)。このような培養装置では、前記細繊維が、太さ1〜1000μm、望ましくは100μm以下の、チタン、チタン合金、金、金合金などの生体親和性がある金属製の細繊維であり、前記ウエブが厚さ0.5〜10mm、望ましくは1〜3mmのシート状を呈するものが好ましい(請求項33)。さらに前記ウエブに炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物をコートするのが好ましい(請求項34)。さらにリン酸カルシウム化合物をコートした上に、コラーゲンなどのマトリックスタンパクをコートしたものが好ましい(請求項35)。
また、前記積層される培養基盤が、培養基盤同士の間に隙間をあけるようにそれぞれホルダーに載置された状態で積層されているものが好ましい(請求項36)。その場合、前記ホルダーが、培養基盤を載置する薄板リング状の底板と、その底板の周囲から立ち上がる周囲壁とからなり、周囲壁の内面の高さが培養基盤と同程度ないしそれよりいくらか高いものが好ましい(請求項37)。
本発明の生物由来物質の産生装置は、前述のいずれかの培養装置と、前記培養基盤または培養液から生物由来物質を取り出す手段とを備えていることを特徴としている(請求項38)。
本発明の三次元人工モデルの製造方法は、前記培養基盤に第1細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記第1細胞を培養し、その後、その第1細胞を培養した培養基盤の上に第2細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて第1および第2細胞を培養することによって製造されることを特徴としている(請求項39)。
また、この三次元人工モデルの製造方法により、三次元皮膚モデルを製造することができる(請求項40)。特に、この製造方法において、前記第1細胞が線維芽細胞であり、前記第2細胞が上皮細胞である、好ましい三次元皮膚モデルを製造することができる(請求項41)。
また、この三次元人工モデルの製造方法により、三次元皮膚モデルを製造することができる(請求項40)。特に、この製造方法において、前記第1細胞が線維芽細胞であり、前記第2細胞が上皮細胞である、好ましい三次元皮膚モデルを製造することができる(請求項41)。
本発明の培養方法(請求項24)では、細繊維を絡合したウエブからなる三次元的な培養基盤に細胞や微生物を播種し、その前記培養基盤で培養する。そのため、細胞や微生物を支持する面積が広く、多数の細胞あるいは微生物を一度に培養することができる。このような培養方法において、前記培養基盤の底部に不透過層を設けて複合層とした状態で細胞または微生物を培養する場合は、細胞および微生物が培養基盤から落ちにくい。そのため、通常の振とう培養をしなくてもよく、培養皿での培養が可能である。また、前記培養基盤を、底面および側面を有する不透過層の内部に載置した状態で、細胞または微生物を培養する場合は、細胞または微生物が産生(分泌)した、活性物質が培養基盤から散らばらず、不透過層の上に留まりやすい。それにより細胞または微生物が活性化される(請求項25、26)。
前記培養基盤を多数枚、複数段の着脱可能な積層状態で筒状の容器内に収容し、その容器内に培養液を環流させる場合は、多量の細胞や微生物を効率的に培養することができる(請求項27)。このような培養方法において、前記培養基盤を容器に収容する前に、旋回培養により細胞や微生物を培養する場合は、容器内で培養する前に、それぞれの培養基盤に高密度に細胞や微生物を培養することができる。そのため、一層多量の細胞や微生物を培養することができる。
本発明の生物由来物質の産生方法(請求項28)は、前述の効率的な方法で多量の細胞や微生物を培養し、培養した細胞や微生物に生物由来物質を産生させるので、多量の生物由来物質を効率的に分離・回収することができる。前記生物由来物質がコラーゲンなどのマトリックスタンパク質、骨形成タンパク質(MBP)などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質、その他、医療と産業に有益なリコンビナントタンパク質の場合は、多量の物質を効率的に産生することができ、医療と産業に有益である(請求項29)。このような産生方法において、前記環流させる培養液の一部を回収し、その培養液中に分泌された生物由来物質を回収する場合は、培養液の循環と産生された物質の回収を一度に行うことができるので、効率的である(請求項30)。また、前記培養基盤に沈着された生物由来物質を溶媒またはペプシンなどの酵素処理によって可溶化し、溶媒中に溶けている生物由来物質を抽出する場合は、一度に多量の物質を回収することができる(請求項31)。
本発明の培養装置は、培養基盤として細繊維を絡合したウエブからなる三次元的な培養基盤を用いる(請求項32)。そのため細胞や微生物を支持する面積が広く、多数の細胞や微生物を一度に培養することができる。さらに培養基盤を容器内に複数段に積層した状態で収容して培養するので、狭いスペースでも多量の細胞や微生物を効率的に培養することができる。
前記細繊維が、太さ1〜1000μmの生物親和性が高い金属製の細繊維である場合は、ウエブを構成する細繊維の生物適合性が高い(請求項33)。そのため、細胞や微生物が培養基盤から脱落しにくい。金属がチタン、チタン合金、金、金合金のばあいは、とくに生物適合性が高い。また、細繊維の径が100μm以下の場合は、一層細胞や微生物との接触が密になり、培養効率が高くなる。さらに前記ウエブを厚さ 0.5〜10mmのシート状とする場合は、各ウエブの取り扱いが容易であり、積層したときの細胞や微生物の密度を高くすることができる。とくに厚さ1〜3mmとする場合は、生体の支持が確実で、しかも培養液の透過性が高い。さらに前記ウエブに炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物がコートされている場合は、細繊維の生体適合性が一層高くなる(請求項34)。前記リン酸化合物のコートの上に、さらに産生目的の生物由来物質のマトリックスタンパクをコートしている場合は、細胞や微生物同士の接着性を増大させることができる(請求項35)。
前記積層される培養基盤が、培養基盤同士の間に隙間をあけるようにそれぞれホルダーに載置された状態で積層されている場合は、培養基盤の表面に新鮮な培養液が供給されやすくなる(請求項36)。そのため、細胞や微生物の活性が高くなり、効率的に培養することができる。
前記ホルダーが、培養基盤を載置する薄板リング状の底板と、その底板の周囲から立ち上がる周囲壁とからなり、周囲壁の内面の高さが培養基盤と同程度ないしそれよりいくらか高い場合は、それぞれの培養基盤をホルダーごと容器内に収容したり、取り出したりすることができる(請求項37)。そのため、新しい培養基盤を容器内に収容する作業および培養基盤の交換作業において培養基盤の取り扱いが容易である。さらにホルダーにより各培養基盤の間に隙間ができるので、新鮮な培養液が培養基盤の表面の細胞や微生物に供給される。
本発明の生物由来物質の産生方法は、前記いずれかの培養装置と、生物由来物質を取り出す手段とを備えているので、前述のように効率的に細胞や微生物を多量に培養することができ、それらの細胞や微生物から多量の生物由来物質を分離・回収することができる(請求項38)。
本発明の三次元人工モデルの製造方法は、前記培養基盤に第1細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記第1細胞を培養し、その後、その第1細胞を培養した培養基盤の上に第2細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて第1および第2細胞を培養することによって製造されることにより、第1細胞および第2細胞を培養基盤内において層構造となるような三次元人工モデルを製造することができる(請求項39)。そのため、薬剤スクリーニング用として三次元人工モデルの生産が可能である。
特にこの製造方法において、前記第1細胞として線維芽細胞を用い、前記第2細胞として上皮細胞を用いることで、三次元皮膚モデルを容易に製造することができる(請求項40)。また、この製造方法を用いることにより、三次元皮膚モデルの生産もできる(請求項41)。
特にこの製造方法において、前記第1細胞として線維芽細胞を用い、前記第2細胞として上皮細胞を用いることで、三次元皮膚モデルを容易に製造することができる(請求項40)。また、この製造方法を用いることにより、三次元皮膚モデルの生産もできる(請求項41)。
図1は本発明のスカフォールド材料の一実施形態を示す断面図、図2は本発明のスカフォールド材料の他の実施形態を示す斜視図、図3は本発明のスカフォールド材料のさらに他の実施形態を示す斜視図、図4は本発明のスカフォールド材料の金属繊維層で細胞を培養した後の顕微鏡写真である。なお、これらの実施例は、本発明を容易にするための一助としての具体例を開示するものであり、これによって、本発明を限定するものではない。
本発明の人工歯根10は、金属基材であるロッド11と、そのロッドの外周に形成された結合層13と、その結合層の外周に設けられた金属繊維層14と、さらにその金属繊維層の外周に設けられ、全体を支える骨組みとして働く補強層15とからなる。
本発明の人工歯根10は、金属基材であるロッド11と、そのロッドの外周に形成された結合層13と、その結合層の外周に設けられた金属繊維層14と、さらにその金属繊維層の外周に設けられ、全体を支える骨組みとして働く補強層15とからなる。
ロッド11は、径が3〜5mmである胴部21と、その胴部の上中下部に設けられた橋げた22a、22b、22cと、胴部の上下端に設けられたフランジ部23a、23bとからなる。上端フランジ部23aの上面には歯の支台部(図示せず)を嵌入する嵌入孔24が形成されている。また、下端フランジ部23bの下部は骨組織に埋入させやすいようにねじ切り用タップとなっている。ロッドの11の全体の長さは7〜20mmであり、橋げた22の高さは0.2〜2mmであるものが好ましい。このようなロッド11としてチタン、チタン合金、金、金合金製のものが好ましい。しかし、ステンレス鋼またはコバルト−クロム合金などの生体親和性の高いものであれば特に限定されるものではない。
結合層13は、平均ポアサイズが100μmより小さく、径が5〜400μmの金属線をロッド11の外周の橋げた22の間に厚さが0.1〜2mmとなるようにきつく巻きつけることにより形成される。また、また金属繊維層14は、平均ポアサイズが100〜400μmであり、径が5〜400μmの金属線を絡合した網状のウエブ(金属不織布)を結合層13の外周に厚さが0.3〜10mmとなるようにきつく巻きつけることにより形成される。この後、ロッドと共に真空焼結することにより各金属線の交点および結合層とロッドの接点を融着する。この金属線および金属不織布の金属基材への固定方法は、鋳型法を用いる。すなわち、あらかじめこれらの金属線および金属不織布が入る体積を計算して、空隙率と線径から使用する金属線および金属不織布の材料の体積並びに重量などを計算して、その必要量を基材と鋳型との間に押し込み、厚さを計算して圧力下にて真空焼結する。金属繊維層と結合層の全体の厚さを0.4〜12mmとすることにより金属線からなるウエブの真空焼結を容易にすることができる。この焼結温度は金属線の融点(Tm・℃)により異なり、金属または金属合金の融点(Tm・℃)の0.3〜0.9倍が好ましい。たとえば、基材および金属線としてチタンを用いるとき、チタンの融点は1668℃であるため、焼結温度は約500〜1500℃が好ましい。
補強層15は、径が100〜2000μmの金属線を平均ポアサイズが100〜2000μmになるように絡合した網状のウエブを厚みが0.1〜5mmとなるように金属繊維層14に巻きつけたものである。
このように補強層15は、比較的太い金属線から形成されているため、スカフォールド材料全体を支える骨組みとして働き、ねじれまたはせん断等の外力による生体と最外層および中間層からなる金属繊維層との間の境界面の破断を防止する。
このように補強層15は、比較的太い金属線から形成されているため、スカフォールド材料全体を支える骨組みとして働き、ねじれまたはせん断等の外力による生体と最外層および中間層からなる金属繊維層との間の境界面の破断を防止する。
各層には、生体細胞を誘導する誘導剤がコートされている。このような誘導剤として炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物などが挙げられる。これにより、骨芽細胞が作り出す骨組織と金属繊維層14とが一体化したコラボレーション・ゾーンを一層短期間で達成することができる。また、このとき補強層のポアサイズは金属繊維層の平均ポアサイズより大きいため、骨芽細胞の金属繊維層までの成育を阻害することはない。
このように構成されている人工歯根10は、掘削して形成した顎骨の埋入部に埋入される。これにより生体細胞は比較的平均ポアサイズの大きい補強層15を介して、金属繊維層14そして結合層13に至る。また、金属繊維層14は骨芽細胞が好んで成育する幾何学的構造を備えているため、骨芽細胞が短期間で成育する。この金属繊維層14と骨芽細胞とが一体となったオステオインテグレーションの状態となるまでの期間は、個人差は見られるが約1〜2ヶ月である。
このように骨芽細胞は各層に定着して骨を作り、しかも代謝を営んでいるため常に骨とこの人工歯根10との結合強度に大きく寄与する。またロッドに対して咬合外力等による外力(圧迫、ねじり、せん断等)が働いても、結合層13の存在により金属繊維層14と基材との間の境界面の破断を防止する。つまり、一度骨芽細胞が成長すると生体と金属繊維層14との各境界面での破断が起こりにくい。
このように骨芽細胞は各層に定着して骨を作り、しかも代謝を営んでいるため常に骨とこの人工歯根10との結合強度に大きく寄与する。またロッドに対して咬合外力等による外力(圧迫、ねじり、せん断等)が働いても、結合層13の存在により金属繊維層14と基材との間の境界面の破断を防止する。つまり、一度骨芽細胞が成長すると生体と金属繊維層14との各境界面での破断が起こりにくい。
図1の人工歯根10の各層は、絡合した金属線を真空焼結することにより形成されているが、ロッドの胴部外周に径が100μmより小さく金属不織布と同質の金属粉末または金属粒子を鋳型を使って、真空焼結してもよい。また、ロッドの外周にエポキシ接着剤、紫外線硬化型接着剤などを塗布し、5〜500μmの金属線からなるウエブを巻きつけてもよい。このように各層が形成されているため、ロッドは結合層13を介して金属繊維層14と強固に固定する。しかし、すべての各層をロッドと同種の金属または合金の金属線を用いてロッドと共に焼結してロッドに固定する場合、ロッドと金属繊維層とを融着によって一体化させることができるので最も好ましい。
図2のスカフォールド材料30は、チタン板31と、その上面に設けられる金属繊維層32とからなるものである。この金属繊維層32は平均ポアサイズが100〜400μmである金属不織布をチタン板31に固着したものである。このスカフォールド材料を人工臓器に取りつけ、生体に埋設する。これにより、金属繊維層内で軟組織が約1〜2ヶ月で成長し、人工臓器をしっかり保持する。
図3のスカフォールド材料35は、円筒状のチタンロッド36と、その内外面に設けられた平均ポアサイズが100〜400μmの金属繊維層37a、bとからなるものである。このようなスカフォールド材料35は、主として人工血管、その他、食道、気管、神経、脊椎の再菅として生体に埋設し、使用することができる。
図4に示す写真は、細胞MC3T3−E1を平均ポアサイズが100〜300μmのチタン不織布上で4週間ならびに6週間培養した後の金属繊維と前記細胞が合成したコラーゲン繊維との結合を表すものである。この図2で表されるように、わずか1ヶ月足らずで金属繊維とコラーゲン繊維が密接に結合しているのがわかり、軟組織が誘導され、成長しているのがわかる。
図5aに示すスカフォールド材料は、生体硬組織誘導性である人工歯根に用いられるものであり、この人工歯根40は、円柱状の基材41と、その基材の外周に設けられている細胞誘導層42とからなる。
基材41は、上端に形成されたフランジ部43と、上面中心にその柱の軸に沿って中心に向かって形成された導入孔44と、軸方向に延びるように側面から突出して形成された突起45とを備えている。また、基材41は、2mm以下のミクロな孔45aを持つポーラス構造体であり、導入孔44と基材外部とはこのミクロな孔によって複雑に連通している。また、導入孔44の内面には、人工歯を取り付ける上部構造体あるいはアパットメント(図示せず)と螺合できるように雌ネジ46が形成されている。
このような基材は、その材料として金属を用いる場合は、例えば、金型に金属繊維を充填し、固め、真空焼結することによって成形したり、金型に溶融した金属を流し込み、凝固時における過飽和ガス原子の析出に伴い気泡を生成させたり、または、凝固後に外形を整えてからドリルなどによって穿孔することにより成形したりすることができる。また、基材の材料として合成樹脂を用いる場合は、発泡剤を加えた溶融した合成樹脂を金型に流し込んで成形することができる。
細胞誘導層42は、平均ポアサイズが100〜400μmの多孔質構造体であり、基材のフランジ部43および突起45と当接するように設けられている。これにより、外力を加えられても細胞誘導層が基材から容易にはずれないように構成されている。また、このような細胞誘導層42は、アパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物および骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質によってコートされている。これによって生体硬組織の誘導を促進させることができる。
このような細胞誘導層42は、たとえば、径5〜400μmの金属線を絡合させることによって形成される金属不織布をポアサイズが100〜400μmとなるように巻きつけて形成される。また、合成樹脂材料を使用する場合、金型で形成し、その後、基材41に嵌合させてもよい。
このような細胞誘導層42は、たとえば、径5〜400μmの金属線を絡合させることによって形成される金属不織布をポアサイズが100〜400μmとなるように巻きつけて形成される。また、合成樹脂材料を使用する場合、金型で形成し、その後、基材41に嵌合させてもよい。
このような人工歯根40は、次のようにして口内に取り付けられる。始めに人工歯根の導入孔44(アパットメント取り付け部)に骨髄液などを注入し、その後注射器等で導入孔44内を陽圧にして骨髄液を基材41の内部に送り込む。その後、人工歯根40を口内に埋植し、導入孔44に雄ネジを有するカバーあるいは導入孔44を閉じるカバーを取り付け、人工歯根40が生体と一体化するまで一定期間放置する。このとき、基材内部の骨髄液は、ミクロの孔を通って細胞誘導層42に到達する。そのため、人工歯根の外部から開始される骨の再生が促進される。その後、カバーを取り外し、導入孔を清浄したのち、雄ネジを有するアパットメントを導入孔44に装着する。
このようにこの人工歯根40を用いた治療は、従来の治療操作とほとんど変わらない。しかし、平均ポアサイズが100〜400μmの多孔質構造体からなる細胞誘導層42を備えており、かつ、導入孔44に骨髄を注入し、基材全体に骨髄を分布させているため、その骨髄効果により骨の再生速度は格段に向上する。
図6に示すスカフォールド材料は、生体硬組織誘導性である人工歯根に用いられるものであり、この人工歯根50は、円柱状の基材50aと、その基材の外周に設けられている細胞誘導層51とからなる。
基材50aは、筒状の基材本体51aと、内部に充填される多孔質三次元構造体52と、内部に配置される支柱53とから構成されている。
筒状の基材本体51aは、その側面に外径2mm以下の小孔55が形成されている。この基材本体51aは、筒状金属体の側面穿孔によって基材本体51aを生成し、その基材本体内へ支柱53を焼結による設置し、そして基材本体の内部へ金属繊維を充填した後、焼結の操作によって多孔質三次元構造52を形成して製造される。
多孔質三次元構造体52は、特に限定されるものではなく、基材本体51aを通して細胞誘導層51に後述して充填される骨髄などの栄養を供給するものである。また、三次元構造体52の内部に血管や神経なども導入、形成されるため、いわば、人工歯髄を形成することができる。このような多孔質三次元構造体52は、生体親和性のある合成樹脂あるいは金属の繊維を基材本体の内部に充填することにより形成される。
また、支柱53は人工歯根全体の強度を保つために配置されるものである。このような支柱も生体親和性のある材料が用いられる。
筒状の基材本体51aは、その側面に外径2mm以下の小孔55が形成されている。この基材本体51aは、筒状金属体の側面穿孔によって基材本体51aを生成し、その基材本体内へ支柱53を焼結による設置し、そして基材本体の内部へ金属繊維を充填した後、焼結の操作によって多孔質三次元構造52を形成して製造される。
多孔質三次元構造体52は、特に限定されるものではなく、基材本体51aを通して細胞誘導層51に後述して充填される骨髄などの栄養を供給するものである。また、三次元構造体52の内部に血管や神経なども導入、形成されるため、いわば、人工歯髄を形成することができる。このような多孔質三次元構造体52は、生体親和性のある合成樹脂あるいは金属の繊維を基材本体の内部に充填することにより形成される。
また、支柱53は人工歯根全体の強度を保つために配置されるものである。このような支柱も生体親和性のある材料が用いられる。
細胞誘導層51は、図5の細胞誘導層42と実質的に同じものであり、たとえば、径5〜400μmの金属線を絡合させることによって形成される金属不織布をポアサイズが100〜400μmとなるように巻きつけた形成される。
このように人工歯根50は構成されているため、図5の人工歯根40と同様に、始めに人工歯根の基材本体内部の多孔質三次元構造体52に骨髄液などを注入し、その後注射器等で基材本体の内部を陽圧にして多孔質三次元構造体52内に平均して分布するようにする。その後、人工歯根50を口内に埋植し、基材の開口にカバー(図示せず)を取り付け、人工歯根50が生体と一体化するまで一定期間放置する。このとき、図5の人工歯根40と同様に基材内部に充填された骨髄液等は、基材本体の穿孔55を介して細胞誘導層51にまで到達する。これにより、内部から開始される骨の再生が一層促進される。その後、カバーを取り外し、導入孔を清浄した後、アパットメント55aを装着する。
このように基材の内部に多孔質三次元構造体52を備えているため、その多孔質三次元構造体52に貯蓄された栄養を供給するための最短の栄養供給ルート(人工歯髄)が形成される。また、この人工歯髄により、象牙質の再生や細菌に対する免疫反応が高まり、人工歯根の長期安定性が向上する。
図7に示す人工歯根59は、基材の内部に支柱が設けられていないものであり、他の構成は図6の人工歯根50と実質的に同じものである。これにより、人工歯根59は、人工歯根50より強度は弱くなるが、その取り付けは容易になる。
図8に示すスカフォールド材料は、生体硬組織誘導性の人工関節に用いられるものであり、この人工関節60は、円柱状の基材61と、その基材の外周に設けられている細胞誘導層62とからなる。
また、基材61は、側面に外径2mm以下の小孔63aを有する円筒状の基材本体63と、その基材本体の内部に充填される多孔質三次元構造体64と、その基材本体63の内部に沿って配置される支柱65とからなる。この支柱65の上端には人工骨節65aが形成されており、また、この支柱65の中部には、基材内において半径方向に突出するようにリブ65aが形成されている。また、この人工関節65aには、想像線で示すように小孔63aが設けられていてもよい。さらに、この想像線で示す小孔63aはより微細な孔であってもよい。
多孔質三次元構造体64は、図6の多孔質三次元構造体と実質的に同じものであり、例えば、チタン金属の繊維を基材本体63の内部に充填することにより形成される。
支柱65の材料として強度が高く、生体親和性の高いチタンやチタン合金が用いられる。
また、基材61は、側面に外径2mm以下の小孔63aを有する円筒状の基材本体63と、その基材本体の内部に充填される多孔質三次元構造体64と、その基材本体63の内部に沿って配置される支柱65とからなる。この支柱65の上端には人工骨節65aが形成されており、また、この支柱65の中部には、基材内において半径方向に突出するようにリブ65aが形成されている。また、この人工関節65aには、想像線で示すように小孔63aが設けられていてもよい。さらに、この想像線で示す小孔63aはより微細な孔であってもよい。
多孔質三次元構造体64は、図6の多孔質三次元構造体と実質的に同じものであり、例えば、チタン金属の繊維を基材本体63の内部に充填することにより形成される。
支柱65の材料として強度が高く、生体親和性の高いチタンやチタン合金が用いられる。
このように構成された人工関節60は、図9aに示すよう配置する。ここで図9bは正常な状態の関節の概略図である。ここで符号66bは軟骨、符号66cは緻密骨、符号66dは海綿骨と骨髄とが混合している部位、符号66eは、骨髄を表わす。また、図9aの符号66は、人工関節の受け皿である。この受け皿66は、扇状の金属基材67と、その内面に設けられた合成樹脂層68と、金属基材の外面に設けられたチタンウェブからなる金属繊維層69とからなる。図9aに示すように生体の骨髄Aは人工関節60を配置した近辺に存在するため、この骨髄Aは、基材の下端開口61bから基材の三次元構造体64内に誘導される。そして、誘導された骨髄Aは、次に基材本体の小孔63aを通じて細胞誘導層62の全域に送られる。これにより、人工関節60の治癒期間の短縮化が図れる。このように、人工関節のように骨再生域が広いものは外部から骨侵入のみでは治癒時間がかかるため、内部からの再生が重要であり、本発明の人工関節60は内部からの再生プロセスが可能となる。また、周囲の骨と一体になった際には、三次元構造体内に血管や神経が導入、形成されているため、従来の生体内に似た構造体で復元される。そのため、再生された細胞誘導層62に誘導された骨は骨髄から栄養を受けることができ、長期経過後も骨がやせることはない。そのため従来の人工関節で問題となる人工関節と骨との隙間(ルーズニング)が発生しなく、人工関節の取り替えが必要ない。
[実施例1]
図5の人工歯根40を作成した。ここで導入孔44の内面に形成された雌ネジは形成していない。基材41は、そのフランジ部43の径が4mm、導入孔44の径が2mm、長さが3mm、そして、平均ポアサイズが80μmとなるように径が80μmのチタン金属線を金型に詰め込み、焼結して成形した。
また、細胞誘導層42は、径が80μmのチタン金属線を絡合させることによって形成される金属不識布を平均ポアサイズが200μmとなるようにまきつけた。
そして、チタンロッドを導入孔44に取り付けて真空焼結によりそれらを結合して人工歯根を作成した。このように形成された人工歯根40は、基材41が特許請求の範囲における結合層に該当し、細胞誘導層42が金属繊維層に該当する。
[比較例1]
チタンロッドに径が80μmのチタン金属線を絡合させて平均ポアサイズが200μmとなるように巻きつけた。これを真空焼結して人工歯根を作成した。これを比較例1とする。
[比較例2]
チタンロッドに径が80μmのチタン金属線を絡合させて平均ポアサイズが80μmとなるように巻きつけた。これを真空焼結して人工歯根を作成した。これを比較例2とする。
図5の人工歯根40を作成した。ここで導入孔44の内面に形成された雌ネジは形成していない。基材41は、そのフランジ部43の径が4mm、導入孔44の径が2mm、長さが3mm、そして、平均ポアサイズが80μmとなるように径が80μmのチタン金属線を金型に詰め込み、焼結して成形した。
また、細胞誘導層42は、径が80μmのチタン金属線を絡合させることによって形成される金属不識布を平均ポアサイズが200μmとなるようにまきつけた。
そして、チタンロッドを導入孔44に取り付けて真空焼結によりそれらを結合して人工歯根を作成した。このように形成された人工歯根40は、基材41が特許請求の範囲における結合層に該当し、細胞誘導層42が金属繊維層に該当する。
[比較例1]
チタンロッドに径が80μmのチタン金属線を絡合させて平均ポアサイズが200μmとなるように巻きつけた。これを真空焼結して人工歯根を作成した。これを比較例1とする。
[比較例2]
チタンロッドに径が80μmのチタン金属線を絡合させて平均ポアサイズが80μmとなるように巻きつけた。これを真空焼結して人工歯根を作成した。これを比較例2とする。
これらの実施例1および比較例1および2の人工歯根のねじれ破壊試験を行った。その破壊トルクおよび破壊ねじれ角の結果を図10および図11に示す。この結果からわかるように、本発明の人工歯根である実施例1は破壊トルクで約4倍の力を加えても破壊しなかった。また、実施例1は、比較例の人工歯根の約10倍のねじれに対してもロッドと結合層および金属繊維層との間に破壊が見られず。その柔軟性が著しく高くなったことがわかる。
図12に示す産生装置70は、カラム71と、そのカラムの内部に積層状態で収容される皿状のホルダー72と、それぞれのホルダー内に収容される培養基盤73と、カラム71内に培養液を環流させる閉ループ状の管路74とを備えている。その管路74には、空気や新鮮な培地(培養液)を混合して供給する混合槽75および気泡除去槽76が介在されている。
前記カラム71としては、たとえばジャケット付きファルマシア・クロマト・カラムなどが用いられる。カラム本体71aの外周をジャケット81が囲んでおり、そのジャケットの下部に設けられる入口および上部に設けられる出口には、たとえば37℃の水を循環させる管路82が連結されている。それによりカラム71内に充填する培地を生体内の温度に維持することができる。本体71aは円筒状の外周壁83と、その上端を塞ぐ上蓋84と、下端を塞ぐ下蓋85とを備えており、全体が液密状態で結合されている。外周壁83は通常はガラス製であるが、ステンレスなどの金属製であってもよい。培地としては、通常用いられる培地をいずれも採用することができ、たとえばイーグルの最小必要培地、ならびにその改良組成を持つ培地をいずれも用いることができる。
カラム71の上蓋84にはパイプ状の出口部材86が貫通しており、その出口部材は円板上の固定部材87によって上蓋84に固定されている。出口部材86の下端には、積層された多段のホルダー72の上端を保持する上押さえ部材88が固定されている。他方、下蓋85にはパイプ状の入口部材89が貫通すると共に、固定部材90によって下蓋85に固定されている。入口部材89の上端には、積層したホルダー72の下端を支持する下押さえ部材91が固定されている。
前記上押さえ部材88にはカラム71から使用後の培地を流出するための送り出しチューブ92の一端が連結され、出口部材86内を通って外部に出ていき、他端は混合槽75内の上部空洞(気体部)75aに開口している。出口部材86の上端には、送り出しチューブ92の一端が連結され、その混合槽75の培地(液体)75bには中間チューブ93の一端が漬けられ、その中間チューブの他端は気泡除去槽76の上部空洞76aに開口している。気泡除去槽76内の培地76bには、戻りチューブ94の一端が漬けられており、ペリスタポンプ(チュービングポンプ)95、圧力計96および予備加熱槽97を経由して、カラム71の入口部材89を通って下押さえ部材91に連結されている。
前記送り出しチューブ92、中間チューブ93および戻りチューブ94などは全体として前述のカラム71に培地を環流させる管路74を構成しており、ペリスタポンプ95は管路74内の培地を循環させるものである。ペリスタポンプ95はいわば生体の心臓の役割を果たす。予備加熱槽97はカラム71内に送り込む培地をあらかじめ生体内の温度(たとえば37℃)近辺まで加熱するための装置である。
前記混合槽75の培地75bには、空気と炭酸ガスとの混合ガスを供給するチューブ98の端部が漬けられている。そのチューブはフィルタ99を介して空気と炭酸ガスとを混合するためのミキサー100に連結されている。ミキサー100には、空気を供給するコンプレッサ102と炭酸ガスを供給するためのガスボンベ103がホースないしチューブを介して連結されている。なお、符号104はフィルタである。
さらに混合槽75の上部空洞75aには、新鮮な培地を供給するチューブ105の端部が開口しており、そのチューブ105の他端は新鮮な培地106bを充填した新鮮培地槽106の培地106b内に漬けられている。新鮮培地槽106は蓋によって密閉されており、上部空洞106aにフィルタ107を介して外気を導入するチューブ108が開口している。
さらに本実施形態では、送り出しチューブ92の途中に切り替え弁(コック)110が介在されており、そのコック110にチューブ111を介して回収・モニタ槽112が連結されている。回収・モニタ槽112は、産生装置70を作動させた後、カラム71内で細胞が目的としてい物質、たとえばコラーゲンを産生していることを確認したり、産生された物質を回収するための槽である。
図13および図14はそれぞれ図12のカラム71に収容されるホルダー72と、その内部に収容する培養基盤73とを拡大して示している。ホルダー72は略皿状の部材であり、リング状を呈し、内部に培養基盤73を載置する段部114が設けられている。ホルダー72の上端から段部114までの深さDは、培養基盤73の厚さよりも深い。培養基盤73は細胞を播種して培養する基盤であり、チタンあるいはチタン合金製の細繊維を絡合してマット状に構成したウエブによって形成している。
培養基盤73を構成する細繊維の太さは適切な空隙を構成するため、200μm以下、とくに100μm以下が好ましい。また、通常は20μm以上、好ましくは50μm以上のものが用いられる。細繊維の長さおよび本数はとくに制限はない。なお、1枚の培養基盤73を1本の細繊維で構成してもよい。細繊維を絡合するには、たとえば各細繊維を直角に交差させて金網とするなどの方法を用いることができる。また、不織布ないし織布状のシートにして、所定の形状に打ち抜いて構成することもできる。培養基盤73の厚さは1〜2mm程度であり、径は使用するカラム(図12の符号71)の大きさによって異なるが、通常は10〜200mm程度である。培養基盤73の重量は1〜100g程度である。チタン以外には、たとえばチタン合金、ステンレス、金、金合金などの細繊維を用いることもできる。細繊維の状態で、あるいは培養基盤73を形成した後、細繊維にヒドロキシアパタイト、炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム化合物をコートすると、生物適合性が高くなり、細胞(および微生物)が付着しやすいので好ましい。さらにその上にコラーゲンをはじめ、フィブリロネクチンなどの細胞接着物質をあらかじめコートして、いわば「二重コート」にすることもきわめて好ましい。
ホルダー72はたとえばポリアクリルアミドなどのプラスチックで形成される。ポリアクリルアミドを用いる場合は、加工性が高いという利点がある。ただしポリプロピレン、ポリエチレン、スチレンなど、他のプラスチックも使用することができる。なお、薄い環状板からなるディバイダ72aの上に、外径が同じで厚いリング状のサポータ72bを重ねて接着するなどにより、構成することもできる。このようなホルダー72に培養基盤73を入れて重ねると、培養基盤73同士の間に隙間をあけた状態で多数の培養基盤73を積層することができる。そのため、この状態で図12のカラム71に収容すると、それぞれの培養基盤73に培地が接触し、培養基盤73上で培養されている細胞を長期間培養し続けることができる。
培養基盤73で培養する細胞としては、培養基盤73を足場として培養できる足場依存性のもの、たとえば線維芽細胞、骨芽細胞などのコラーゲンを産生する細胞、血管内皮細胞、副腎皮質細胞などの副腎皮質(ホルモン)を産生する細胞、すい臓細胞などのインシュリンを産生する細胞、血管系のサイトカインを産生する分化過程にある骨髄由来血液細胞、肝細胞などの有用な血液タンパクを産生する細胞など、種々の細胞由来物質を産生する細胞を使用することができる。ただし図12の産生装置70は、細胞由来物質を産生させる場合に限らず、単に細胞を培養、増殖させるためだけにも用いることができる。その場合は回収・モニタ槽52は不要である。このような細胞の培養・増殖など、細胞由来物質の産生を目的としない場合は、産生装置というよりも、単なる細胞培養装置である。コラーゲンを産生させる場合は、培地としてビタミンCを含むものなどが好ましい。牛海綿状胞症(BSE)を避けるために合成培地を用いてもよい。
このように細胞(第1細胞)を培養した培養基盤73に、上から異なる種類の第2細胞を播種して、さらに培養してもよい。それにより、2層の細胞を培養した培養基盤自体を薬剤スクリーニング用の三次元人工モデルとして使用することができる。特に、第1細胞として培養基盤上でファイブロブラスト(線維芽細胞)を播種し、第2細胞として上皮細胞を播種して培養することにより、三次元皮膚モデルを製造することができる。
この実施形態では、円板状の培養基盤73を用いているが、この三次元人工モデルを製造するとき、その形状は特に限定されるものではない。
この実施形態では、円板状の培養基盤73を用いているが、この三次元人工モデルを製造するとき、その形状は特に限定されるものではない。
つぎに図12の産生装置70を用いて線維芽細胞、骨芽細胞などのコラーゲン産生細胞からコラーゲンを産生させる方法を説明する。線維芽細胞は、たとえば骨、軟骨、歯周組織、神経、筋、靱帯の一部を欠損した患者の口腔粘膜などを数mmオーダーで採取して、そこに含まれる線維芽細胞を公知の方法で増殖させて用いる。なお、患者以外に、提供者の承諾を得た上で、特定の新生児の臍帯、若い成人の皮下組織などから線維芽細胞を分離して増殖したものを用いることもできる。骨芽細胞は骨髄由来の間葉系幹細胞などにより得ることができる。
つぎに図15に示すように、増殖させた線維芽細胞や骨芽細胞の細胞片115を、シャーレ116内に収容した培養基盤73に播種する。シャーレ116の培養基盤73は適切な培地に浸しておく。ついでシャーレ116を旋回培養器に設置し、往復旋回させて細胞に刺激を与える旋回培養を行う。細胞片115が培養基盤73上で培養されたことを確認した後、図13のように培養基盤73をホルダー72に収容し、多数のホルダー72を重ねて図12のカラム71内に入れる。重ねるホルダー72の個数は産生するコラーゲンの量によって異なるが、20〜50段程度である。
上記のようにして図12のカラム71内に培養基盤73を収容した多数のホルダー72を設置した後、ペリスタポンプ95を作動させて管路74内に培地を循環させ、培養基盤73の細胞を培養する。カラム71のジャケットには前述のように37℃の温水を循環させてカラム71内を生体内と類似の環境にする。混合槽75に前述のコンプレッサ102から空気を供給し、ガスボンベ103から炭酸ガスを供給する。両者の比率は、たとえば炭酸ガス95%(重量%)、空気5%(重量%)の比率であり、供給量は0.1〜1リットル/分程度である。炭酸ガスおよび空気の混合ガスは供給用のチューブ98の端部からバブリングにより培地内に混入される。この混合槽75はいわば生体の肺の働きをする。
新鮮培地槽106から混合槽75へは、混合槽75の液面が低下したときにサイホンの原理で新鮮な培地を供給する。ただしポンプを用いて強制的に供給することもできる。混合槽75に供給する新鮮な環流液の量は、0.1〜1mリットル/分程度である。ここで供給される培地は細胞に栄養を供給する働きがあるので、いわば消化器官としても作用する。
前記気泡除去槽76では、混合槽75から送られてくる培地を静かにためておき、それにより培地混合槽75でバブリングにより培地内に混合された炭酸ガスと空気との混合ガスのうち、培地内に溶けずに気泡として残っているものを上部空洞内に浮かび上がらせて除去する。
上記のように産生装置70を作動させることにより、カラム71内に収容した培養基盤73がコラーゲンを分泌する。分泌されたコラーゲンのうち、一部は培地中に分泌され、他は培養基盤73内に不溶性コラーゲンとして沈着する。培地中には不溶性コラーゲンと可溶性コラーゲンの両方が含まれるが、それらのコラーゲンは、適宜コック110を切り替えて、回収・モニタ槽112に連続的に回収することができる。すなわち回収・モニタ槽112に回収された培地から、塩析法、イオン交換法などにより、コラーゲンを精製分離することができる。
他方、培養基盤73内に沈着した不溶性コラーゲンは、カラム71から取り外し、個々の培養基盤73をコラーゲン可溶化溶媒、たとえば1M食塩を含む中性緩衝液、あるいは0.5M酢酸、あるいはペプシンを含む0.5M酢酸で抽出することにより、ほぼ完全に回収することができる。
上記のように、産生装置70を用いることにより、患者の口腔粘膜などから得た線維芽細胞を培養してコラーゲンを連続的に産生することができ、可溶性コラーゲンおよび不溶性コラーゲンの両方を効率よく回収することができる。回収したコラーゲンは、患者の必要部位、すなわち骨、軟骨、歯周組織、神経、筋、靱帯などの修復治療に還元することができる。また、患者以外の組織提供者(ドナー)から得た組織から産生したコラーゲンについても、患者の再生医療一般に利用することができる。
上記のようにこの産生方法では、3次元のチタン細繊維を絡合したウエブからなる培養基盤73を、それぞれ分離を図りつつ、数十枚重ねて産生させるので、産生量を従来の平板法に比して10倍以上に増大させることができる。これによって、コラーゲン産制遺伝子を導入した細胞はもちろん、遺伝子操作をすることなく、正常のヒト細胞から、大量のコラーゲンを製造し、安全な再生医療の素材を提供することができる。
前記実施の形態ではコラーゲンを産生する場合について説明したが、骨形成タンパク質(BMP)などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質、その他、医療と産業に有益なリコンビナントタンパク質などを産生する場合も、実質的に同様の方法で産生することができる。また、ヒト細胞を用いる場合について説明したが、ヒト以外の動物の細胞を用いてコラーゲン、その他の細胞由来物質を産生することができる。その場合は、安全性が確認されればヒトの患者の再生医療や、獣医分野で使用することができる。さらに細胞以外に、有用な生物由来物質を産生する足場依存性の微生物を培養したり、その微生物に有用物質を産生させたりする場合も、本発明の方法や装置を採用することができ、同様の作用効果を得ることができる。
前記実施形態では、培養基盤73として、チタンあるいはチタン合金製の細繊維を絡合してマット状に構成したウエブをそのまま用いているが、図16aに示すように、培養基盤73の下面側に、培養液、細胞や微生物またはこれら細胞や微生物が産生した活性物質を透過させない不透過層117を設けて複合層としてもよい。このような不透過層117は合成樹脂シートやフィルム、金属箔、金属プレートなどによって形成することができる。また、培養基盤73と別個に設けるほか、培養基盤73の下面側に粉末、微小ビーズなどを充填して、いわゆる目詰まりを生じる層を設けることによっても形成することができる。
前述のように培養基盤73の下面側に不透過層117を設ける場合は、細胞および微生物が培養基盤73から落ちにくくなる。そのため、通常の振とう培養をしなくてもよく、培養皿での培養が可能である。
さらに図16bに示すように、培養基盤73の底部に加えて側面にも不透過層118を設けてもよい。この側面の不透過層118も前述の底部の不透過層117と同様のものを用いることができる。底部および側面に不透過層117、118を設ける場合は、細胞または微生物が産生(分泌)した、活性物質が培養基盤から散らばらず、不透過層117の上に留まりやすい。それにより細胞または微生物が活性化される。
図15のように培養基盤73をシャーレ116に入れる場合、あるいは図13、図14のようにホルダー72に入れる場合も、培養基盤73に不透過層117、118を設けたまま一緒に入れることができる。それにより、細胞や微生物が落下しにくいなどの効果を奏する。ただし不透過層117、118を培養基盤73に対して着脱自在に構成し、ホルダー72に入れる場合など、特定の状態で取り外すようにすることもできる。
[実施例1]
本発明の培養方法に用いられる培養基盤に該当する径が50μmのチタン金属線を空隙率87%となるように絡合したチタンウェブを製造した。これを実施例1とする。
[実施例2]
実施例1のチタンウェブを有底筒状のチタン製のホルダーに挿入した培養基盤を製造した。これを実施例2とする。
[比較例1]
従来公知で平面のプラスチックの皿からなるプラスチックセルを比較例1とする。
本発明の培養方法に用いられる培養基盤に該当する径が50μmのチタン金属線を空隙率87%となるように絡合したチタンウェブを製造した。これを実施例1とする。
[実施例2]
実施例1のチタンウェブを有底筒状のチタン製のホルダーに挿入した培養基盤を製造した。これを実施例2とする。
[比較例1]
従来公知で平面のプラスチックの皿からなるプラスチックセルを比較例1とする。
これらの実施例1、2および比較例1に線維芽細胞を播種し、培養液に浸して2週間培養した。図17にこのときに線維芽細胞によって生産されたコラーゲンの産生量を示す。この図面からもわかるように本発明の培養方法に用いられる培養基盤(実施例1)を用いて培養した場合、コラーゲンの産生が通常のプラスチックセルより1.4倍向上した。さらに、ホルダーをつけた培養基盤(実施例2)で培養した場合は、通常のプラスチックセルよりコラーゲンの産生が1.8倍も向上した。
Claims (41)
- 金属基材と、その金属基材の外周に設けられている金属線からなる金属繊維層とを備え、前記金属繊維層の平均ポアサイズが100〜400μmである生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。
- 前記金属繊維層の内側に金属線からなる平均ポアサイズが100μmより小さい結合層を備えている請求項1記載のスカフォールド材料。
- 前記金属繊維層の平均ポアサイズが、最内から最外にかけて傾斜的にまたは段階的に大きくなっている請求項1記載のスカフォールド材料。
- 前記金属繊維層が径5〜400μmの金属線を絡合することによって形成されている金属不織布を固定したものである請求項1記載のスカフォールド材料。
- 前記金属繊維層が径5〜400μmの金属線からなり、その金属線の絡合度の差により、平均ポアサイズを傾斜的または段階的に大きくなるように変化させている請求項3記載のスカフォールド材料。
- 前記金属繊維層が径5〜400μmの金属線からなり、その金属線径の差により、平均ポアサイズを傾斜的または段階的に大きくなるように変化させている請求項3記載のスカフォールド材料。
- 前記結合層が、径5〜400μmの金属線を絡合させることにより形成されており、その絡合された金属線間に金属粉または金属粒子が密に埋め込まれている請求項2記載のスカフォールド。
- 前記金属粉または金属粒子の径が100μm以下である請求項7記載のスカフォールド。
- 前記金属繊維層の外周に、径100〜2000μmの金属線を用い、平均ポアサイズを100〜2000μmとした補強層が形成されている請求項1から8いずれか記載のスカフォールド材料。
- 前記金属基材の形状がロッドであり、そのロッド表面にロッドの半径方向に対して外側に突出している橋げたまたは突起物が形成されている請求項1から9いずれか記載のスカフォールド材料。
- 前記金属基材の形状がプレートであり、そのプレート表面外側に突出している突起物が形成されている請求項1から9いずれか記載のスカフォールド材料。
- 前記金属基材と前記金属繊維層および/または結合層とを共に焼結することにより形成している請求項1から11いずれか記載のスカフォールド材料。
- 前記焼結が、金属基材の融点(Tm・℃)の0.3〜0.9倍の温度により行われる請求項12記載のスカフォールド材料。
- 前記金属基材と金属繊維層または結合層を接着剤でもって接着している請求項2記載のスカフォールド材料。
- 前記金属基材および金属繊維層および/または結合層の材質がチタン、チタン合金、金、金合金からなる群より選ばれた一種または二種の金属である請求項1から14いずれか記載のスカフォールド材料。
- 前記金属繊維層および/または結合層がアパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含む、ヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物によってコートされている請求項1から15いずれか記載のスカフォールド材料。
- 基材と、その基材の外周に設けられている平均ポアサイズが100〜400μmの多孔質構造体からなる細胞誘導層とを備えており、
前記基材が、2mm以下のミクロな孔を持つポーラス構造体で、中心方向に向かって延びる少なくとも一本の導入孔を備えており、この導入孔と基材の外部とがミクロな孔によって複雑に連通している、生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。 - 基材と、その基材の外周に設けられている平均ポアサイズが100〜400μmの多孔質構造体からなる細胞誘導層とを備えており、
前記基材は、中空部を備えた基材本体と、その中空部に充填される多孔質三次元構造体とを有しており、
前記基材本体は、中空部に連通するように外面に形成された少なくとも1つ以上の外径2mm以下の穿孔と、中空部に連通するように外面に形成された穿孔より大きい導入孔とを備えている、生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。 - 前記中空部に、支柱が配置されている請求項18記載の生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。
- 前記細胞誘導層は、金属線を絡合することによって形成されている請求項17または18記載の生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。
- 前記金属繊維層および/または結合層に骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質からなる群から選ばれた一種または二種以上コートされている請求項1から20いずれか記載のスカフォールド材料。
- 生体内に埋設させ、生体の周囲表面に一体に固定する請求項1から21いずれか記載の生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料を備えた生体インプラント材料。
- 人工歯根、人工関節、骨プレートなどの骨固定具、代替骨、人工臓器またはその保持装置、皮膚端子からなる群より選ばれた一種に用いられる請求項22記載の生体インプラント材料。
- 細繊維を絡合したウエブからなる培養基盤に足場依存性の細胞または微生物を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記細胞または微生物を培養する、細胞・微生物の培養方法。
- 前記培養基盤の底部に不透過層を設けて複合層とした状態で、細胞または微生物を培養する請求項24記載の細胞・微生物の培養方法。
- 前記培養基盤の側面にも不透過層を設けて、細胞または微生物を培養する請求項25記載の細胞・微生物の培養方法。
- 前記培養基盤を多数枚、複数段の着脱可能な積層状態で筒状の容器内に収容し、その容器内に培養液を環流させる請求項24記載の細胞・微生物の培養方法。
- 所定の生物由来物質を産生する細胞または微生物を請求項24−27のいずれかに記載の培養方法で培養し、ついで培養した細胞または微生物から得られた生物由来物質を分離・回収する生物由来物質の産生方法。
- 前記生物由来物質がコラーゲンなどのマトリックスタンパク質、骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質、医学上・産業上有用なリコンビナントタンパク質からなる群から選ばれた1種または2種以上である請求項28記載の産生方法。
- 前記環流させる培養液の一部を回収し、その培養液中に分泌された生物由来物質を回収する請求項29記載の産生方法。
- 前記培養基盤に沈着された生物由来物質を溶媒または酵素処理によって可溶化し、溶媒中に溶けている生物由来物質を抽出する請求項28記載の産生方法。
- 筒状の容器と、その内部に積層状態で着脱自在に収容される細繊維を絡合したウエブからなる複数枚の培養基盤と、前記容器内に培養液を環流させる手段とを備えている培養装置。
- 前記細繊維が、太さ1〜1000μmの生体親和性が高い金属製の細繊維であり、前記ウエブが厚さ0.5〜10mmのシート状を呈する請求32記載の培養装置。
- 前記ウエブにリン酸カルシウム化合物がコートされている請求項32記載の培養装置。
- 前記リン酸カルシウム化合物のコートの上に、さらに産生目的の生物由来物質のマトリックスタンパクをコートしている請求項34記載の培養装置。
- 前記積層される培養基盤が、培養基盤同士の間に隙間をあけるようにそれぞれホルダーに載置された状態で積層されている請求項32記載の培養装置。
- 前記ホルダーが、培養基盤を載置する薄板リング状の底板と、その底板の周囲から立ち上がる周囲壁とからなり、周囲壁の内面の高さが培養基盤と同程度ないしそれよりいくらか高い請求項36記載の培養装置。
- 請求項32−37のいずれかに記載の培養装置と、前記培養基盤または培養液から生物由来物質を取り出す手段とを備えている生物由来物質の産生装置。
- 前記培養基盤に第1細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記第1細胞を培養し、その後、その第1細胞を培養した培養基盤の上に第2細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて第1および第2細胞を培養することによって製造される三次元人工モデルの製造方法。
- 前記三次元人工モデルが三次元皮膚モデルである請求項39記載の三次元皮膚モデルの製造方法。
- 前記第1細胞が線維芽細胞であり、前記第2細胞が上皮細胞である、請求項40記載の三次元皮膚モデル製造方法。
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