JPWO2005079835A1

JPWO2005079835A1 - Ｂｌアンジオスタチンを含む制がん剤

Info

Publication number: JPWO2005079835A1
Application number: JP2006510141A
Authority: JP
Inventors: 惠司蓮見; 幸輔清水; 哲郎山本
Original assignee: TTC Co Ltd
Current assignee: TTC Co Ltd
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2007-08-02
Also published as: WO2005079835A1; CA2557154A1; AU2004316095A1; US20110092442A1

Abstract

本発明は、ＢＬアンジオスタチンを有効成分として含む制がん剤及びその製造方法を提供する。

Description

本発明はＢＬアンジオスタチンを含む制がん剤及びその製造方法に関する。

血管の新生を阻害する物質は、癌の増殖、浸潤、転移を抑制することから、抗腫瘍剤としての用途が期待されており、このような物質の一つとしてアンジオスタチンが知られている。アンジオスタチンは、血液中に存在する、線溶因子であるプラスミノーゲンを分解することにより得られる分子量約４０，０００のタンパク質であり、動物実験では、癌に対して劇的な効果を示すことが報告されている（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７９，３１５−３２８（１９９４））。
アンジオスタチンには、（１）プラスミノーゲンをエラスターゼで加水分解したもの（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２，６８９−６９２（１９９６））及び（２）遺伝子組換え技術を用いて酵母に直接生産させたもの（Ｂ．Ｋ．Ｓｉｍｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５７，１３２９−１３３４（１９９７））の２種類が知られていた。
しかし、（１）では、エラスターゼの基質特異性の低さのため、副生成物が多く生じ、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを選択的に生成させることが困難であることから、アンジオスタチンの活性が低いという欠点があった。また、（２）では、アンジオスタチンの精製が困難であり、高コストであり、また、水に対する溶解性が低いという問題があった。
最近、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＡ９５４２株が産生するプロテアーゼであるバシロライシンＭＡを用いて、ヒトプラスミノーゲンを特異的に切断したアンジオスタチン様断片（主にＧｌｕ^１−Ｓｅｒ^４４１、以降、「ＢＬアンジオスタチン」と記載する。）が開発された。（特開２００２−２７２４５３号公報）。ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列は公知であり、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴに受入番号Ｐ００７４７として登録されている。なお、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列は、シグナルペプチド（Ｍｅｔ^１−Ｇｌｙ^１９）を含むものであるため、本出願では、シグナルペプチドを除外した成熟ポリペプチド、すなわち、Ｇｌｕ^１−Ａｓｎ^７９１のアミノ酸配列に基づくアミノ酸番号でアミノ酸位置を示した。
また、組換えアンジオスタチンは、天然型に比べて物理的性質と活性にばらつきがあり、これは異種生物での発現の過程でのタンパク質フォールディングの差に基づく立体構造の変化、糖鎖修飾の差などが原因と考えられる（Ｃａｏ，Ｙ．，ＩｎｔＪＢｉｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ３３，３５７−６９（２００１）、Ｄｅｌｌ’Ｅｖａ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ９，３−１０（２００２））。また、同様の原因により、組換えタンパク質の溶解性が低いことも指摘されている。これらの点で、組換え体と比較して、酵素法により生産される天然型が有利である。
しかし、タンパク質解酵素の基質認識が特異性であることから、プラスミノーゲンから選択的にアンジオスタチンを生成することは、極めて困難であり、多くの副産物を生成するという欠点があった。
また、すべての市販エラスターゼ標品が活性のあるアンジオスタチンを生産することができるわけではなく、切断、その後の処理によってアンジオスタチンを変性させる可能性も示唆されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｄ２，６８９−９２（１９９６））。
バシロライシンＭＡは、プラスミノーゲンを極めて選択的に切断し、ＢＬアンジオスタチン（主生成物としてＧｌｕ^１からＳｅｒ^４４１のアミノ酸配列を有するフラグメント、微量生成物として、Ｐｈｅ^７５からＳｅｒ^４４１、Ｇｌｕ^１からＶａｌ^４４９、およびＰｈｅ^７５からＶａｌ^４４９のアミノ酸からなるフラグメント）を生じせしめる（特開２００２−２７２４５３号公報）。
更に発明者らは、バシロライシンＭＡ固定化リアクター（アフィニティートラップリアクター）を開発し、ヒト血漿から１段階のステップでＧｌｕ^１からＳｅｒ^４４１のアミノ酸配列を有するフラグメントを主成分とするプラスミノーゲンフラグメントの製造技術を開発し（ＰＣＴ／ＪＰ０３／００３３８）、製造時間の短縮とコスト削減を達成した。
組換えアンジオスタチンはＬｅｕ^７４からＬｅｕ^４５１のアミノ酸からなるプラスミノーゲンの内部フラグメントである（Ｓｉｍ，Ｂ．Ｋ．ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５７，１３２９−３４（１９９７））のに対し、ＢＬアンジオスタチンは、上述のようにアンジオスタチンとは異なる構造を有するが、アンジオスタチンと同様の抗血管内皮細胞作用をもつ。
特に、主生成物であるＧｌｕ^１からＳｅｒ^４４１のアミノ酸配列を有するフラグメント、更にＧｌｕ^１からＶａｌ^４４９のアミノ酸配列を有するフラグメントは、プラスミノーゲンのＮ末端側を含むものである。
プラスミノーゲンのＮ末端ペプチド（Ｇｌｕ^１からＧｌｕ^８３）は親水性アミノ酸に富み、Ｎ末端ペプチドの有無の差はＢＬアンジオスタチンとアンジオスタチンとの間に、溶解性などの物理的特性だけではなく、生体内での活性、動態などにも差異をもたらすと考えられる。
しかし、ＢＬアンジオスタチンが、実際に、インビボでの制がん効果を有するとの報告はまだなされておらず、安価で、水に対する溶解性が高く、かつ、優れた制がん性を有する制がん剤及びその製造方法の開発が待たれている。
本発明者は、上記のＢＬアンジオスタチンのがんに対する効果について鋭意研究を行なった結果、驚くべきことに、ＢＬアンジオスタチンが極めて優れた制がん効果を有し、かつ、水に対する溶解性が高いことから、静脈内投与によっても格別の制がん効果を奏することを発見して、本発明を完成するに至った。
また、本発明者は、ＢＬアンジオスタチンの製造の際に、バシロマイシンＭＡによる自己消化の阻害剤であるイソプロピルアルコールを用いないでも、効率よくＢＬアンジオスタチンを得ることができることを発見して、本発明を完成するに至った。

本発明は、ＢＬアンジオスタチンを有効成分として含む制がん剤及びその製造方法に関する。

図１は、アフィニティートラップリアクターにより精製したＢＬアンジオスタチンを示す。レーン１は、得られたＢＬアンジオスタチンである。レーン２は、バシロライジンＭＡ（５ｎＭ）、プラスミノーゲン（３μＭ）を１００ｍＭＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、１ｍＭＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）１０μｌ中で３７℃、６０分間インキュベートした後、１０μｌのサンプル緩衝液（４％ＳＤＳ、１０％２−メルカプトエタノール、２０％スクロース、０．００４％ブロモフェノールブルーを含む１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８）を加えレーン１と同様に分析した。
図２は、皮下移植ルイス肺がんの増殖に対するＢＬアンジオスタチンの効果（腫瘍体積の推移）を表す。Ｘ軸はルイス肺がんを移植してからの日数（日）であり、Ｙ軸は腫瘍体積（ｍｍ^３）である。●は、対照群を、▲、■、×及び◆は、それぞれ、ＢＬアンジオスタチン０．３、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ処理群を表し、それぞれの値は、各群８例の平均値±標準偏差を表す。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、対照群と比較して統計的に有意な差は＊印を付してある。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）
図３は、皮下移植ルイス肺がんの増殖に対するＢＬアンジオスタチンの効果（腫瘍湿重量）を表す。Ｘ軸はＢＬアンジオスタチンの用量（ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）であり、Ｙ軸は腫瘍湿重量（ｍｇ）である。それぞれの値は、各群８例の平均値±標準誤差を表す。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、対照群と比較して統計的に有意な差は＊印を付してある。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）
図４は、ルイス肺がん皮下移植動物の体重に対するＢＬアンジオスタチンの影響を表す。Ｘ軸はルイス肺がんを移植してからの日数（日）であり、Ｙ軸は体重（ｇ）である。●は対照（生理食塩水）処理群であり、▲は、アンジオスタチン０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ処理群であり、■は、アンジオスタチン１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ処理群であり、×は、アンジオスタチン３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ処理群であり、◆は、アンジオスタチン１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ処理群である。それぞれの値は、各群８例の平均値±標準誤差を表す。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で、対照群と比較して統計的に有意な差は＊印を付してある。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）
図５は、腫瘍の病理組織像及びｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子免疫染色像を表す。対照群（腫瘍長径８．２ｍｍ、短径７．８ｍｍ）（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、３ｍｇ／ｋｇ投与群（腫瘍長径７．０ｍｍ、短径５．６ｍｍ）（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）および１０ｍｇ／ｋｇ投与群（腫瘍長径４．４ｍｍ、短径２．８ｍｍ）（Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）の代表例を示す。Ｄ、ＨおよびＬはｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子免疫染色、それ以外はヘマトキシリン・エオシン染色。倍率は、５倍（Ａ、Ｅ、Ｉ）、２５倍（Ｂ、Ｆ、Ｊ）、１００倍（Ｃ、Ｇ、Ｋ）、および５０倍（Ｄ、Ｈ、Ｌ）。

本発明のＢＬアンジオスタチン
本発明のＢＬアンジオスタチンは、プロテアーゼ、特に、バチラスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）Ａ９５４２が産生する酵素であるバシロライシンＭＡ（ＢＬＭＡ）を用いてプラスミノーゲンを処理することによって得ることができる。バチラスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）Ａ９５４２は、産業技術総合研究所生命工学研究所の特許生物寄託センターに平成１３年３月２１日に受託番号ＦＥＲＭＰ−１８２６８として寄託されている。ＢＬＭＡのアミノ酸配列は、特開２００２−２７２４５３に開示されている。
ＢＬＭＡは、ヒトプラスミノーゲンのＳｅｒ^４４１−Ｖａｌ^４４２、Ｌｅｕ^７４−Ｐｈｅ^７５及びＶａｌ^４４９−Ｌｅｕ^４５０の間を切断し、Ｇｌｕ^１−Ｓｅｒ^４４１、Ｇｌｕ^１−Ｖａｌ^４４９、Ｐｈｅ^７５−Ｓｅｒ^４４１、Ｐｈｅ^７５−Ｖａｌ^４４９の４種類のアンジオスタチン様活性を有する断片を生成することが知られている。
本発明の制がん剤としては、上記の４つのアンジオスタチン様断片の１種類以上を単独でか又は組み合わせて用いることができるが、特に、Ｇｌｕ^１−Ｓｅｒ^４４１が好ましく用いられる。
プラスミノーゲンは、哺乳動物、特にヒトやウシにおいて、そのアミノ酸配列が高度に保存されていることが知られている。したがって、本発明のＢＬアンジオスタチンの製造のための原料としてのプラスミノーゲンは、哺乳動物に由来するものであればあらゆるものを用いることができ、特に、ヒトやウシ由来のプラスミノーゲンが好ましい。
また、本発明のＢＬアンジオスタチンは、化学合成又は遺伝子組み換え技術によっても製造することができる。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、遺伝子組み換え技術による製造が好ましい。本発明のＢＬアンジオスタチンを製造するには、該タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを作製し、これを好適な発現系に導入することにより目的タンパク質を製造することができる。
本発明のＢＬアンジオスタチンの塩基配列を有するＤＮＡは、ヒト由来（例えば、ＨｅｐＧ２細胞由来など）のｃＤＮＡライブラリーを、ＢＬアンジオスタチンのアミノ酸配列をコードする塩基配列の情報に基づいて設計した好適なプライマー又はプローブを用いてスクリーニングすることにより入手できる。スクリーニングはプラークハイブリダイゼーション等で行うことができる。あるいは、ヒト由来（例えば、ＨｅｐＧ２細胞由来など）のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、上記塩基配列の情報に基づいて設計した好適なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子を直接クローニングすることもできる。
組み換えタンパク質を発現させるための発現系（遺伝子を含む発現ベクターとその宿主）は当業者に公知である。ＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、該ＤＮＡを発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いでこの組み換え発現ベクターを、当該発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
細菌用の発現ベクターとしては、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられ、動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）や、組換えウイルス作成用発現ベクター、例えば、ｐＭＦＧ（Ｔａｋａｒａ）が挙げられる。
細菌用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等を挙げることができる。酵母用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーターを挙げることができる。動物細胞用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、アデノウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、目的タンパク質を発現できるものであれば特に制限されず、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。
組換えベクターの宿主への導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法などが挙げられ、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
形質転換体の培養物から、目的の組み換えタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。例えば、組み換えタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、イオン交換グロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法を単独でか又は組み合わせて用い、精製することができる。
また、本発明は、下記工程：
アガロースゲル上にバシロライシンＭＡ及びリシンを固定したアフィニティトラップリアクターを緩衝液で平衡化する工程、
クエン酸処理した血清を添加する工程、
塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄する工程、及び
６−アミノヘキサン酸で溶出する工程からなる、ＢＬアンジオスタチンの製造方法であって、上記緩衝液が、イソプロピルアルコールを含まないことを特徴とする、製造方法にも関する。好ましくは、全ての操作を４℃で行う。これによって、ＢＬアンジオスタチンを高収率で得ることができる。
本発明の制がん剤は、一般的には、有効成分としてのＢＬアンジオスタチンと担体、賦形剤などの製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で提供される。
本発明の制がん剤は、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。
本発明の薬剤の投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
ＢＬアンジオスタチンは、先行技術のアンジオスタチンとは異なり、水に対する溶解度が高い（２０ｍｇ／ｍｌ以上）ことから、本発明の制がん剤は、静脈内投与によって投与することができるという特徴を有する。
本発明の制がん剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。本発明の薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択することができる。
本発明の薬剤の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
本発明の制がん剤は、乳がん、肺がん、咽頭がん、胃がん、膵がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん、等の治療に用いることができる。

以下に、本発明について具体的に説明するが、本発明は実施例に記載されたものに限定されるものではない。
例１．バシロライシンＭＡの生産及び精製
バシロライシンＭＡは、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＡ９５４２株（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１８２６８で経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許生物寄託センターに寄託されている）から、以下の方法により分離精製した。
グルコース１％、コーンスターチ３％、大豆ミール１％、ペプトン０．５％、イースト抽出物０．５％、ＣａＣＯ_３０．２％、ＣＢ４４２０．０１％の成分を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコで、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＡ９５４２株を２８℃で６日間振とう培養後、培養液３リットルをセライトを用いてろ過し、そのろ液１リットルをＨ_２Ｏで５リットルに希釈し、イソプロピルアルコールを最終濃度５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。その後、２０ｍＭＭＥＳ（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコールで平衡化した４００ｍｌのカルボキシメチルセルロース（生化学工業株式会社）カラムに流速１５ｍｌ／分で注入した。同じ緩衝液６００ｍｌで洗浄した後、２０ｍＭＭＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコール／０．２ＭＮａＣｌで溶出した。その溶出画分を６０ｍｌずつ分画し、活性の認められた画分を集めた。その純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、精製物９０ｍｇを得た。
例２．バシロライシンＭＡ及びリシンを固定した本発明のアフィニティートラップリアクターの作成（リアクター１０ｍｌを作成）
臭化シアンであらかじめ活性化しておいたアガロースゲル（セファロース４Ｂ、ファルマシア社）２．８６ｇを１ｍＭＨＣｌ溶液１００ｍｌに懸濁し、室温で１５分間撹拌した。これをカラムに移し、吸引してＨＣｌ溶液を除去し、１ｍＭＨＣｌ溶液１００ｍｌで３回、次に０．５ＭＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールを含む緩衝液Ａ（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３）７５ｍｌで１回ゲルを洗浄した。２．８４ｍｇ／ｍｌのバシロライシンＭＡ溶液を同じ緩衝液Ａで作成し、その１７．６ｍｌをカラムに添加し、室温で２時間撹拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、吸引により溶液を除去し、０．２ＭＬ−リシン塩酸塩を含む５％イソプロピルアルコール水溶液（ｐＨ８．０）２０ｍｌを加えて、室温で２時間撹拌することによりリシンの固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を吸引により除去し、５％イソプロピルアルコールを含む、緩衝液Ｂ（２０ｍＭＭＥＳ（２−〔モルホリノ〕エタンスルホン酸）−ＮａＯＨ）５００ｍｌでゲルを洗浄し、最後に０．０２％アジ化ナトリウムを含む、上記組成の緩衝液Ｂ中、４℃で保存した。
例３．バシロライシンＭＡ／リシンリアクターを用いた、ヒト血漿からのＢＬアンジオスタチンの一段階精製プロセス
クエン酸処理したヒト血漿９５ｍｌにイソプロピルアルコール５ｍｌを氷上で添加し、３０分間放置した後、遠心分離（２２，０００ｘｇ、４℃、１時間）により上清を得、ろ過した。以降の操作はすべて４℃で行なった。例２で作成した本発明のバシロライシンＭＡ／リシンリアクター１０ｍｌを、５％イソプロピルアルコールを含む緩衝液Ｃ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。平衡化したリアクターに、上記の上清を流速１．５ｍｌ／分で添加した。その後、０．５ＭＮａＣｌを含む上記組成の緩衝液Ｃ２００ｍｌでリアクターを洗浄した（３ｍｌ／分）。生成したＢＬアンジオスタチンの溶出は、２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む５％イソプロピルアルコール溶液５０ｍｌで行なった。その結果、ほとんどのＢＬアンジオスタチンは、１０〜３０ｍｌの溶出液で溶出された。ＢＬアンジオスタチンの収量は、４．２ｍｇであり、純度は９５％であった。
なお、使用後のリアクターは、１ＭのＮａＣｌと２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸を含む上記組成の緩衝液Ｃ５０ｍｌを用いて４℃で洗浄した。その後、０．０２％アジ化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ中、４℃で保存した。この状態で洗浄、保存したリアクターは、２ヶ月以上繰り返して使用可能であった。
例４．バシロライシンＭＡ／リシンリアクターを用いた、ヒト血漿からのＢＬアンジオスタチンの一段階精製プロセス（イソプロピルアルコールを用いない方法）
クエン酸処理したヒト血漿を１５，０００ｒｐｍ、２０分間遠心して、上清を得た。以下の操作は、すべて４℃で行った。例２で作製した本発明のバシロライシンＭＡ／リシンリアクター０．５ｍｌを、緩衝液Ｃで平衡化した。これに、上記の上清２．５ｍｌを流速０．１ｍｌ／分で添加した。その後、１５ｍｌの０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃで洗浄（０．１５ｍｌ／分）後、２．５ｍｌの２００ｍＭ６−アミノヘキサン酸で溶出した。大部分のＢＬアンジオスタチンは、０から１．５ｍｌの溶出液で溶出された。ＢＬアンジオスタチンの収量は６３μｇで純度は９４％であった（図１）。
なお、使用後のリアクターは、１ＭのＮａＣｌと２００ｍＭの６−アミノヘキサ酸を含む緩衝液Ｃ２．５ｍｌを用いて洗浄した。その後、０．０２％アジ化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ中、４℃で保存した。この状態で、保存したリアクターは２ヶ月以上繰り返して使用可能であった。
得られたＢＬアンジオスタチンのうち４μｇを精製水に溶解して１０μｌとし、これに１０μｌのサンプル緩衝液（４％ＳＤＳ、１０％２−メルカプトエタノール、２０％スクロース、０．００４％のブロモフェノールブルーを含む１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８）を加え、そのうち１０μｌを、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分画した後、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した（図１）。
例５．ＢＬアンジオスタチンのルイス肺がんに対する効果
・がん種及びがんの移植方法、試験動物
ルイス肺がん細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植して継代維持した。１０−１４日目の腫瘍を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水にがん細胞を懸濁した。５週齢で購入し、その後１週間ＳＰＦ環境下で予備飼育したＢＤＦ_１マウスの腹側部皮下に、１匹当たり１×１０^５個の細胞を含む０．０５ｍｌの細胞懸濁液を移植した。以後の実験もすべてＳＰＦ環境で行った。
・薬剤調製方法、投与方法、投与条件
例３の方法で調製したＢＬアンジオスタチンを凍結乾燥し、これを精製水に対して、２時間、３回透析した。得られた溶液を凍結乾燥して、２０ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩水に溶解した。この溶液を孔径０．２２μｍのフィルターを用いてろ過滅菌した。この溶液をさらに滅菌生理食塩水で希釈して、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ及び２ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。ルイス肺がん細胞の移植の翌日から、上記のＢＬアンジオスタチン溶液を、５ｍｌ／ｋｇの割合で毎日１回１４日間静脈内投与した。これにより、それぞれの投与量は、０．３、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇとなった。対照群には、生理食塩水を同容量静脈内投与した。各群の動物数は１０匹とした。
・観察項目
投与期間中は、腫瘍の大きさ（短径及び長径から腫瘍体積を以下のように算出：短径の２乗×長径×０．５２）及び体重を毎日測定した。投与終了翌日、エーテル麻酔下にマウスを致死させ、腫瘍を摘出してその湿重量を測定した。各群の最大及び最小値を除外して、計８匹の動物のデータを統計処理した。有意差の検定にはＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用い、危険率０．０５％以下を有意差とした。更に、対照群、３ｍｇ／ｋｇ投与群および１０ｍｇ／ｋｇ投与群の代表例各３個体から得られた腫瘍について、長径および短径の測定、細胞増殖、出血、壊死、分裂細胞の組織学的観察、および抗ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体を用いた血管内皮細胞の免疫染色を行った。
・観察結果、考察
対照群と比較して、ルイス肺がん移植後１０日目移行、３及び１０ｍｇ／ｋｇＢＬアンジオスタチン投与群において、腫瘍体積が有意に低下した（図２）。１０ｍｇ／ｋｇ投与群においてはすべての観察期間で、腫瘍体積は対照群の１／２以下であった。０．３及び１ｍｇ／ｋｇ投与群においても腫瘍成長の抑制が観察されたが統計的に有意な差となったのは、０．３ｍｇ／ｋｇ投与群で１４及び１５日目、１ｍｇ／ｋｇ投与群で１４日目であった（図２）。また、移植後１５日目に腫瘍を摘出して、その湿重量を測定したが、ＢＬアンジオスタチン投与群では対照群と比較して、５０−７０％の値となった（図３）。０．３、３及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群における差は統計的に有意な差であった。一方、飼育期間を通して各群の体重に有意な差は見られなかった（図４）。また、動物の一般状態も、試験群間の差は見られなかった。
摘出した腫瘍の病理組織学的検査の結果を表１にまとめた。対照群では、細胞増殖が高度に（図５Ａ）、出血が軽度に（図５Ｂ）、壊死が軽微に（図５Ｂ）、分裂細胞が中等度に（図５Ｃ）認められた。また、抗ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体による血管内皮細胞の免疫染色では、陽性細胞の割合が軽度から中等度に認められた（図５Ｄ）。ＢＬアンジオスタチン３ｍｇ／ｋｇ投与群では、細胞増殖が中等度に（図５Ｅ）、出血が軽度に（図５Ｆ）、壊死が軽度に（図５Ｆ）、分裂細胞が中等度に（図５Ｇ）、ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子陽性細胞の割合が軽微から中等度に（図５Ｈ）認められた。更に、ＢＬアンジオスタチン１０ｍｇ／ｋｇ投与群では、細胞増殖が軽微から中等度に（図５Ｉ）、出血が軽微から中等度に（図５Ｊ）、壊死が軽度から高度に（図５Ｊ）、分裂細胞が軽微から軽度に（図５Ｋ）、ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子陽性細胞の割合が軽微から軽度に（図５Ｌ）認められた。

以上のことから、１日当たり０．３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇのＢＬアンジオスタチンの静脈内投与は、皮下移植ルイス肺がんの成長の抑制に有効であることが示された。また、腫瘍の病理組織学的検査の結果から、ＢＬアンジオスタチンの投与により、腫瘍細胞の分裂増殖の低下、壊死の増加がおこることが示された。さらに、抗ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体による血管内皮細胞の免疫染色により、ＢＬアンジオスタチンが、がんの新生血管を抑えていることが確認され、この血管新生阻害作用が、上述の腫瘍細胞の分裂増殖の低下、壊死の増加をもたらすものと考えられる。また、試験動物の体重や一般状態に影響しないことから、ＢＬアンジオスタチンは重篤な副作用を持たないものと推測される。臨床予測性に優れたルイス肺がんの成長を抑制したことから、他の多くのがん（乳がん、肺がん、咽頭がん、膵がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん等）に対して、抑制効果を示すと考えられる。

本発明の制がん剤は、乳がん、肺がん、咽頭がん、胃がん、膵がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん等の治療に用いることができる。

Claims

ＢＬアンジオスタチンを有効成分として含む制がん剤。
ＢＬアンジオスタチンが、哺乳動物に由来する、請求の範囲第１項に記載の制がん剤。
ＢＬアンジオスタチンが、ヒトプラスミノーゲンのＧｌｕ^１−Ｓｅｒ^４４１、Ｇｌｕ^１−Ｖａｌ^４４９、Ｐｈｅ^７５−Ｓｅｒ^４４１及びＰｈｅ^７５−Ｖａｌ^４４９断片からなる群より選択される、請求の範囲第１又は２項に記載の制がん剤。
下記工程：
アガロースゲル上にバシロライシンＭＡ及びリシンを固定したアフィニティトラップリアクターを緩衝液で平衡化する工程、
クエン酸処理した血清を添加する工程、
塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄する工程、及び
６−アミノヘキサン酸で溶出する工程からなる、請求の範囲第１項に記載のＢＬアンジオスタチンの製造方法であって、上記緩衝液が、イソプロピルアルコールを含まないことを特徴とする、製造方法。