JP3760183B2 - 新規なアンジオスタチン変換酵素、該酵素の生産菌、該酵素の製造方法、該酵素の利用によるアンジオスタチンおよび活性型セリンプロテアーゼの製造 - Google Patents
新規なアンジオスタチン変換酵素、該酵素の生産菌、該酵素の製造方法、該酵素の利用によるアンジオスタチンおよび活性型セリンプロテアーゼの製造 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3760183B2 JP3760183B2 JP2001085117A JP2001085117A JP3760183B2 JP 3760183 B2 JP3760183 B2 JP 3760183B2 JP 2001085117 A JP2001085117 A JP 2001085117A JP 2001085117 A JP2001085117 A JP 2001085117A JP 3760183 B2 JP3760183 B2 JP 3760183B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- angiostatin
- blma
- plasminogen
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌バチラス メガテリウム Ａ９５４２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６８）、該細菌を起源とする新規なプロテイン（酵素）、該酵素の作用により生成するプラスミノーゲン断片を有効成分とする血管新生阻害剤（以下、血管新生阻害に有効なプラスミノーゲン断片をアンジオスタチン様分子という。）または血栓溶解剤（以下、該血栓溶解に有効なプラスミノーゲン断片をミニプラスミノーゲン様分子という。）、該酵素を有効成分とする血しょうセリンプロテアーゼ群活性化剤、更に該酵素を用いてプラスミノーゲンを基質としてアンジオスタチン様分子およびミニプラスミノーゲン様分子を製造する方法など関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、血管新生抑制剤が新しいガン治療戦略として注目されている。癌における血管新生の研究は最近非常に注目されている。癌細胞が増殖して１〜２ｍｍ3の大きさになると、さらに大きく成長するために多くの酸素と栄養が必要となることが解明されている。癌細胞は血管新生因子とよばれる血管新生を促す因子を放出し、近くの血管から新しい血管の造成を促して腫瘍内に血管を引き込むことにより、血液内の酸素と栄養物を利用し爆発的に増殖速度を増すことができるようになる。また、この腫瘍内微小血管を経由して遠隔転移が可能となる。
【０００３】
前記癌成長における血管新生の役割を見ると、癌の血管新生を阻害することは、癌の増殖、浸潤、転移を抑制することにつながることは容易に理解できる。事実、多くの血管新生を阻害する薬剤が抗腫瘍剤として開発され、提案もされている（特開平４−１７８３２８号公報、特開平６−２３４６４５号公報、特開平１０−８１６３１号公報など）。しかしながら、現在までに血管新生阻害剤として承認された薬剤はない。血管新生を標的とする治療薬の開発は原発腫瘍の増大のみならず転移を阻止する可能性を有する。その一つであるアンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）は血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成を選択的に抑え、酸素や栄養分の供給を断ち、腫瘍の休止状態を引き起こすことが知られるところとなった（米国のフォークマン博士らにより、アンジオスタチンが発見されこのような概念が提唱された。）。
また、アンジオスタチンは血管新生促進物質よりも循環血中での半減期が長いため原発巣から離れた転移巣では阻害物質濃度が優位となり、転移巣の成長を抑制していると考えられている。さらに、内皮細胞のアポトーシスも増加させることも知られている。アンジオスタチンは、線溶因子であるプラスミノーゲンのクリンゲル（ｋｒｉｎｇｌｅ）ｌ−４までを含む分子量約３８ｋＤａのペプチドである。従来、ＡＧはインビトロではプラスミノーゲンのエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）による限定分解や、プラスミノーゲンアクチベータを作用させ、プラスミンへと誘導した後、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）などの還元剤を作用させることにより生産される。また、ｉｎ ｖｉｖｏでは数種のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）によりアンジオスタチン変換は起こると考えられている。
従来のアンジオスタチンを生産する技術は、（１）前記タンパク質を分解するエステラーゼを用いる方法、および（２）組み換えＤＮＡ技術を用いて、大腸菌で生産させる方法に大別することができる。しかしながら、前記従来の生産方法によると、アンジオスタチンへの変換の選択性が低い、得られたアンジオスタチンの活性の再現性が良くない、精製が難しいなどの問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、基本的には前記アンジオスタチンの作用をする物質（アンジオスタチン様分子）、および該物質を生産する方法、特に前記プラスミノーゲンを酵素により分解する方法の問題点、すなわち、基質特異性を改善したアンジオスタチンへの変換酵素を見出すことである。本発明者は、前記改善された酵素を見出すべく、種々の土壌から、微生物の代謝物として放出されるタンパク質の中に前記所望のアンジオスタチンへの変換特性を持ったものはないかと探索した。そして、東京都国分寺市東元町の土壌から、前記基質特異性を持つタンパク質を代謝物として放出する細菌を見出した。そして、本発明者は該細菌をＡ９５４２とし、産業技術総合研究所生命工学研究所の特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６８として、平成１３年３月２１日に受託された。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、（１）配列番号１に記載の塩基配列を持つタンパク質を代謝する細菌バチラス メガテリウム Ａ９５４２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６８）であり、第２の発明は、（２）配列番号１で表される前記細菌の遺伝子の塩基配列であり、本発明の第３は、（３）前記（１）の細菌の培養液をイソプロピルアルコール存在下にＣＭセルロースイオン交換クロマトグラフィーにかける工程を含むことを特徴とする配列番号２に記載のアミノ酸配列を持つ酵素質を製造する方法である。
なお、前記各発明に関連する参考発明として、（４）前記細菌が代謝物として放出する、プラスミノーゲンを基質としてアンジオスタチン様断片を生成させる配列番号１および２に記載のアミノ酸配列を持つ酵素の発明、（５）前記（４）に記載の酵素を有効成分とする血しょうセリンプロテアーゼ群活性化剤の発明、（６）前記（５）に記載の前記酵素が活性化する成分が、プロトロンビン、プロテインＣ、プロウロキナーゼ、または血液凝固因子Ｘである発明、（７）配列番号２に記載のアミノ酸配列を持つ酵素を用いて、プラスミノーゲンからアンジオスタチン様断片またはミニプラスミノーゲン様断片を製造する方法の発明、（８）プラスミノーゲンを請求項３に記載の酵素により限定分解してプラスミノーゲンのＶａｌ ４４２ からＡｓｎ ７９１ のアミノ酸配列を有するフラグメント断片を主たる成分として含む血栓溶解剤有効成分を製造する方法の発明を、本明細書中に記載している。
【０００６】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．本発明の細菌は東京都国分寺市東元町で採取した土壌から分離して得られたものであり、実施例中で記述する培養条件で培養し、培養液からプラスミノーゲンのアンジオスタチン様断片への変換を触媒する酵素を生産する微生物を見出し、以下のように同定された。
Ｂ、菌学的特徴
１，代謝生産物として、配列番号１および２に記載の酵素を産生する。
２，顕微鏡観察から桿菌である。
３，菌の大きさは、約３〜６×０．８〜１．０μｍである。
４，グラム染色により紫色に染まりグラム陽性である。
５，芽胞染色から胞子形成菌である。
６，カタラーゼテストから、カタラーゼ陽性である。
７，嫌気条件で生育できないから、好気性である。
８，寒天培地での糖（Ｄ−（＋）−グルコース、Ｌ−（＋）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース、Ｄ−（−）−マニトール）からの酸性産性する。以上の特性から、Ａ９５４２株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍと一致する。
したがって、本菌を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株とした。
【０００７】
９，本菌の遺伝子はバチラス メガテリウム ｎｐｒＥ遺伝子と９７％の相同性を示した。
本菌は、翻訳産物レベルにおいてバシロライシンに対して１０アミノ酸の相違が見られるアミノ酸配列（配列番号２に示すとおりである）のタンパクを産生する。そこでＡ９５４２株の前記翻訳産物をバシロライシンＭＡとした。
【０００８】
Ｃ，本菌の生育条件
１，培地組成：ブレインハートインフュージョン（ニッスイ ０５５０８）、牛脳エキス末２１％、ペプトン２８．６％、ハートエキス末２３％、グルコース５．７％、ＮａＣｌ １４．３％、リン酸水素−カリウム７．７％
２，培地ｐＨ：７．０、
３，培地の殺菌条件１２１℃、１５分、
４，培養温度：２８℃
Ｄ，本発明の菌は、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許生物寄託センター受託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６８）として受託されている。
【０００９】
９，本菌の遺伝子はバチラス メガテリウム ｎｐｒＭ遺伝子と９７％の相同性を示した。本菌は、翻訳産物レベルにおいてｎｐｒＭ遺伝子産物（ＮｐｒＭ）に対して１１アミノ酸の相違が見られるアミノ酸配列（配列番号２に示すとおりである）のタンパクを産生する。そこでＡ９５４２株の前記翻訳産物をバシロライシンＭＡとした。
【００１０】
選択対象の菌の分離にはスターチ−カゼイン−寒天培地（コーンスターチ１％、カゼイン０．０３％、ＫＮＯ3 ０．２％、ＮａＣｌ ０．２％、Ｋ2ＨＰＯ4０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００５％、ＣａＣＯ3 ０．００２％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、寒天ｌ．５％、ニスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）０．００５％）を、用いた。希釈液０．１ｍＬをシャーレ中の培地上に塗布し、２８℃で６日間培養した。生じたコロニーを釣菌し、スターチ−カゼイン−寒天培地からなる保存用スラント上において、２８℃で適当な生育状態になるまで培養し、その後４℃で保存した。
【００１１】
２，液体培養
選択対象の菌の液体培養には以下の培地を用いた。
グルコース１％、コーンスターチ ３％、大豆ミール（ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ）１％、ペプトン ０．５％、イースト抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）０．５％、ＣａＣＯ3 ０．２％、ＣＢ４４２ ０．０１％、ｐＨ７．０。
液体培地１０ｍＬの入った試験管（２１×２１０ｍｍ）に保存用スラント上から白金耳を用いて植菌し、２８℃で６日間、振とう培養（２２０ストローク／分）を行った。
【００１２】
実施例２
プラスミノーゲンからアンジオスタチン様断片を生成する代謝産物を生産する微生物の選択
プラスミノーゲンからアンジオスタチン様断片を生成する活性を生産する微生物の探索には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）〔Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０―６８５（１９７９）〕を用いた。
微生物代謝産物の９０％メタノール抽出物を１μＬ乾固して、それに放射ラベルしたプラスミノーゲン（125Ｉ−Ｇｌｕ−Ｐｌｇ）（最終濃度１００ｎＭ、２００００ｃｐｍ）を５μＬ、ｕＰＡ（ウロキナーゼ型 プラスミノーゲン活性剤）（最終濃度２００単位／ｍＬ）を５μＬずつ加えて、ＴＢＳ／Ｔバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１%（ｗ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４）中で３７℃、３０分間インキュベートした。その後サンプルバッファー（３．６％ＳＤＳ，３．６％メルカプトエタノール，０．０８％ブロモ フェノール ブルー，９００ｍｇ／ｍＬ 尿素）を１０μＬ加え、湯浴中で６０℃、３０分間処理、それをＳＤＳ−１０％ ｇｅｌにアプライして泳動後、固定、乾燥を行い、オートラデジオグラフィにかけてバンドのパターンを見た。プラスミノーゲンとｕＰＡのみを反応させたものを対象試料とした。
本方法により、土壌から分離した約１，５００株の放線菌、細菌、真菌の培養液をスクリーニングした結果、バチラス メガテリウム Ａ９５４２株の培養抽出液に強い活性を認めた（図１の２．）。
図１は、１は微生物培養抽出液を含まない反応（対照）で得られた結果であり、２はバチラス メガテリウム Ａ９５４２株の培養抽出液を含むで得られた結果であり、３は本発明の菌株以外のいくつかの菌の培養抽出液を含む反応で得られた結果を示す。
【００１３】
実施例３
バチラス メガテリウム Ａ９５４２株の培養液からの配列番号１および２のアミノ酸配列を持つタンパク質（バシロライシンＭＡ：ＢＬＭＡ）の精製
上記の液体培地１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコでバチラス メガテリウＭ Ａ９５４２株を２８℃、６日間、振とう培養後、培養液３Ｌをセライト（濾液の通過を容易にするための助剤）を用いて濾過し、その濾液１ＬをＨ2Ｏで５Ｌに希釈し、イソプロピルアルコールを最終濃度５％（ｖ／ｖ）と成るように添加した後、２０ｍＭ、ＭＥＳ（２‐［Ｎ‐Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）‐ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコールで平衡化したゲル４００ｍＬのカルボキシルメチルセルロース（ＣＭ‐Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、生化学工業株式会社）カラムに流速１５ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。同じバッファー６００ｍＬで洗浄した後、２０ｍＭ、ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコール／０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出した。その溶出画分を６０ｍＬずつ分画し、活性のあった画分を集めた。その純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認（図２）し、精製品９０ｍｇを得た。なお、ＢＬＭＡは本菌から分泌される際に限定分解を受け、本製造方法で得られる酵素蛋白質は、配列番号１に記載のアミノ酸番号Ｖａｌ1からＧｌｎ317までの配列をもつ分子である。しかし、本発明によるＢＬＭＡは、配列番号１に記載の配列のＰｒｏ-1からＧｌｎ-254のいかなる部分をさらに含む分子であってもよい。
【００１４】
実施例４
ＢＬＭＡによるプラスミノーゲンからのアンジオスタチン様断片とミニプラスミノーゲン様断片の生成（図３）
【００１５】
プラスミノーゲン（Ｇｌｕ‐Ｐｌｇ）を基質とするＢＬＭＡによる限定分解について観察した（測定：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。 ６μＬ の Ｇｌｕ‐Ｐｌｇ (最終濃度２μＭ)、６μＬの ＢＬＭＡ（最終濃度０，３．７，３７ｎＭ）をＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を含むＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６０ 分間インキュベートし、その後、非還元 ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｘ４）を加え、そのうち １５μＬを、ＳＤＳ‐１０ % ｇｅｌ にアプライした。泳動終了後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ‐２５０で染色、乾燥した。
その結果、プラスミノーゲンはＢＬＭＡ濃度依存的に開裂を受けた〔ＢＬＭＡ ３．７ｎＭで５５ %，３７ｎＭで ８６．５%のプラスミノーゲンが開裂した（図３Ａ）〕。
またＢＬＭＡによるプラスミノーゲン切断を、血清５０％、ＢＬ濃度０−１０００ｎＭの条件下で行なった。２μＬの 125Ｉ‐Ｇｌｕ‐Ｐｌｇ 、３μＬの ＢＬＭＡ（最終濃度０，１０，１００，１０００ｎＭ）、５μＬのヒト血清を加え、３７℃、６０分間インキュベートし、それに９０μＬの水 を加えた。そこから５μＬとって、それに５μＬ 還元ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｘ２） を加えた。そのうち５μＬを１２．５ % ｇｅｌ にアプライし、電気泳動した。泳動終了後一晩オートラジオグラフィにかけ、その後フィルムを現像した。
ここでもＢＬ濃度依存的に切断が進みアンジオスタチン様フラグメントが生成することが分かった〔図３Ｂ、ＢＬＭＡ濃度はそれぞれ、１は０ｎＭ、２は１０ｎＭ、３は１００ｎＭ、４は１０００ｎＭ。）〕。
【００１６】
次に図３Ａの切断された断片（フラグメント、１‐５）のＮ末端アミノ酸配列を同定したところ、表１のようになった。この結果から、ＢＬＭＡはＧｌｕ−Ｐ１ｇのＳｅｒ441−Ｖａｌ442（図３Ｃ、矢印３），Ｌｅｕ74−Ｐｈｅ75（図３Ｃ、矢印１），Ｖａ１449−Ｌｅｕ450（図３Ｃ、矢印２）を切断し、プラスミノーゲン分子の断片、Ｇｌｕ1−Ｓｅｒ441、Ｇｌｕ1−Ｖａｌ449、Ｐｈｅ75−Ｓｅｒ441、Ｐｈｅ75−Ｖａｌ449（以上アンジオスタチン様断片）ならびにＶａｌ442−Ａｓｎ791、Ｌｅｕ450−Ａｓｎ791（以上ミニプラスミノーゲン様断片）を生成することがわかった。
【００１７】
【表１】
【００１８】
実施例５
ＢＬＭＡによって生成するプラスミノーゲンのアンジオスタチン様断片およびミニプラスミノーゲン様断片の製造
２ｍＬのＧｌｕ‐ＰＬＧ（最終濃度２μＭ）に２ｍＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）と４ｍＬのＢＬＭＡ（最終濃度３６．８ｎＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６０分間インキュベートし、２２０μＬのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（最終濃度５ｍＭ）を加えて反応を停止させた。反応液をリジンセファロースカラム（４．６ｘ５０ｍｍ）にアプライ後、１ｍＬ の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで溶出した。ミニプラスミノーゲン様断片はこの画分に回収された。カラムをさらに０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー１ｍＬで洗浄後、１０ｍＬの０．２Ｍイプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）で溶出した。溶出画分は１ｍＬずつ分取した。この画分をＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分析によりアンジオスタチン様断片の確認をし、目的の断片の検出された画分を集め、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で一晩透析後，凍結乾燥を行なった。これにより、７５μｇのアンジオスタチン様断片を得た。なお、上記反応の容量、リジンセファロースカラムのサイズおよび溶出液の容量は適宜変化させることができ、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
実施例６
ＢＬＭＡによって生成するプラスミノーゲンのアンジオスタチン様断片による血管内皮細胞の増殖の阻害（図４）
ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥ細胞）を２４穴組織培養プラスチックプレートに１穴当たり１．２５ｘ１０4／ｍＬの密度で１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸混液および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭＥＭ培地０．５ｍＬを用いて播き込み、ＣＯ2インキュベーターで２４時間培養した。培地を５％ＦＣＳ入りのＭＥＭ培地に交換した後，最終濃度が１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳに溶解したアンジオスタチン様断片を１０μＬ加えた。ＣＯ2インキュベーターで３０分間インキュベート後，６μＬのＰＢＳあるいは１００ｎｇ／ｍｌ塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を加え、ＣＯ2インキュベーターで７２時間培養した。培養後、培地を取り除き０．５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し，１００μＬの０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ入りＰＢＳを加え，３７℃、５分間インキュベート後、１０μＬのＦＣＳを入れてトリプシンの反応を停止した。この細胞懸濁液の細胞数を血球計算盤で数えた。ｂＦＧＦを添加しないとき、細胞数が２６８１に対して、ｂＦＧＦ存在下では３７１２となった。アンジオスタチン様断片を１０μｇ／ｍＬ添加するとｂＦＧＦ存在下でも細胞数は２３３７であった。つまり、アンジオスタチン様断片はｂＦＧＦに依存した血管内皮細胞の増殖を顕著に阻害することが示された（図４）。
【００２０】
実施例７
ＢＬＭＡによって生成するプラスミノーゲンのミニプラスミノーゲン様断片の血栓溶解酵素プラスミンへの効率的変換（図５）
２５μＬのプラスミノーゲン（最終濃度１００ｎＭ）あるいはミニプラスミノーゲン様断片に２５μＬ のｕＰＡ（最終濃度２００単位／ｍＬ）、２５μＬの ＢＬＭＡ（最終濃度０‐３７ｎＭ）および２５μＬ の プラスミン基質Ｓ２２５１（最終濃度１００μＭ）を加え、ＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を含むＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、３ 分ごとに０‐６０分まで４０５ｎｍの吸光度を測定した。この反応で、ミニプラスミノーゲン様断片（●）はプラスミノーゲン（○）の５倍以上の速度でプラスミンを生成した（図５）。この結果から、ミニプラスミノーゲン様断片はプラスミノーゲンよりも優れた血栓溶解性を示すことがわかる。
【００２１】
実施例８
ＢＬＭＡによるプロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ｕＰＡ）の活性化（図６）
ＢＬＭＡによるｐｒｏ−ｕＰＡの限定分解とそれに伴う活性化を以下のように観察した。まず、ＢＬＭＡによってｐｒｏ−ｕＰＡがどのような分子に開裂されているかを調べるために、開裂パターンと、生じる断片の同定を行なった。
６μＬ の ｐｒｏ−ｕＰＡ（最終濃度２μＭ）、６μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０，３．７，１１０ｎＭ）をＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を含むＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６０分間インキュベートし、その後、非還元ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｘ４）を加え、そのうち１５μＬをＳＤＳ−１０ % ｇｅｌにアプライした。泳動終了後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色、乾燥した。さらに、ここで生じたフラグメントのＮ末端アミノ酸配列を同定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画後、ＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬＢＩＯＳＵＰＰＯＲＴ ＧＲＯＵＰ ＦＬＵＯＲＯＴＲＡＮＳ）へ転写した。 膜をＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色、メタノールで脱色した後、目的のバンドを切り出し、４７６Ａプロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。
ＢＬＭＡ３．７ｎＭでｐｒｏ−ｕＰＡの活性化開裂部位であるＬｙｓ158−Ｉｌｅ159間の切断が起り（図６Ｃ中の矢印１）、Ａ鎖（Ｓｅｒ1-Ｌｙｓ158）とＢ鎖（Ｉｌｅ159−Ｌｅｕ411）が生じた。ＢＬＭＡ１１０ｎＭではｐｒｏ‐ｕＰＡのすべてが開裂され、さらにＡ鎖のがＴｙｒ24−Ｐｈｅ25間で切断され（図６Ｃ中の矢印２）、新たなフラグメントＳｅｒ1-Ｔｙｒ24およびＰｈｅ25−Ｌｙｓ158が生じた（図６Ａ、Ｃおよび表２）。なお、これらの開裂により生ずる分子は互いにジスルフィド結合で連結されている。
【００２２】
【表２】
【００２３】
また、同様の実験を５０％血清存在下で行なった。２μＬの125Ｉ‐ｐｒｏ‐ｕＰＡ（１００，０００ｃｐｍ）、３μＬのＢＬＭＡ（図６Ｂ、１は ０ｎＭ，２は１０ｎＭ，３は１００ｎＭ，４は１０００ｎＭ、以上すべて最終濃度）、５μＬのヒト血清を加え、３７℃、６０分間インキュベートし、それに９０μＬのＨ2Ｏを加えた。そこから５μＬをとって、それに５μＬ還元ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｘ２）を加えた。そのうち５μＬを１２．５ % ｇｅｌにアプライし、泳動した。泳動終了後一晩オートラジオグラフィにかけ、その後フィルムを現像した。その結果、血清非存在下と同様の結果を得た（図６Ｂ）。
【００２４】
ＢＬＭＡによるプロウロキナーゼ（ｐｒｏ‐ｕＰＡ）の活性化
１０μＬのｐｒｏ‐ｕＰＡ（最終濃度２０ｎＭ）、１０μＬのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＵＫ（活性型ウロキナーゼの特異的基質）（最終濃度１００μＭ）、１０μＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）、２０μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０‐１９０ｎＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、３分ごとに０‐６０分まで４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて測定した。その結果、図６Ｄに示すように、ＢＬＭＡはｐｒｏ−ｕＰＡの活性化をもたらすことが示された。
【００２５】
実施例９
ＢＬＭＡによる血液凝固第Ｘ因子の活性化（図７）
ＢＬＭＡによる血液凝固第Ｘ因子の開裂（図７のＢ）を以下のように調べた。
５μＬの血液凝固第Ｘ因子（最終濃度２μＭ）、５μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０，３０，１００，３００ｎＭ）を加え、ＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を含むＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、１２０分間インキュベートした。その後３．３μＬの還元ＳＤＳ‐ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｘ４）を加え、そのうち１２μＬを、１２．５ % ｇｅｌにアプライした。泳動終了後、染色、乾燥を行なった（図７Ａ）。さらに、生成したフラグメントのＮ末端アミノ酸配列を実施例７と同様の方法で同定した（表３）。
ＢＬＭＡは濃度依存的に血液凝固第Ｘ因子のＢ鎖のＡｓｐ34‐Ｌｅｕ35間（図７Ｂ中の矢印１）、および活性化開裂部位であるＢ鎖のＬｙｓ52‐Ｉｌｅ53間（図７Ｂ中の矢印２）の開裂をもたらした（図７Ａ、Ｂおよび表３）。その結果、Ｂ鎖のＳｅｒ1−Ａｓｐ34断片と、Ａ鎖とＢ鎖のＬｅｕ35−Ｌｙｓ254断片がジスルフィド結合で連結された分子を生成した。
【００２６】
【表３】
【００２７】
ＢＬＭＡによる血液凝固第Ｘ因子の活性化
１０μＬ血液凝固第Ｘ因子（最終濃度２０ｎＭ）、１０μＬのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ Ｘａ（活性型血液凝固第Ｘ因子の特異的基質）（最終濃度１００μＭ）、１０μＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）、２０μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０‐１００ｎＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６分ごとに０‐１２０分まで４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＢＬＭＡは図７Ｃに示すように血液凝固第Ｘ因子の活性化をもたらした。
【００２８】
実施例１０
ＢＬＭＡによるプロトロンビンの活性化（図８）
ＢＬＭＡによるプロトロンビンの活性化は、以下の方法で測定した。１２．５μＬのプロトロンビン（最終濃度２０ｎＭ）、１２．５μＬのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＴＨ（最終濃度１００μＭ）、１２．５μＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）、１２．５μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０‐４００ｎＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６分ごとに0‐１２０分まで４０５ｎｍの吸光度を測定した。図８に示すようにＢＬＭＡは濃度依存的にプロトロンビンを活性化した。
【００２９】
実施例１１
ＢＬＭＡによるプロテインＣの活性化（図９）
１２．５μＬの ヒトプロテインＣ（最終濃度２０ｎＭ）、１２．５μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０‐４０ｎＭ）、１２．５μＬのＳ２３３６（活性型プロテインＣに特異的な基質）（最終濃度１００μＭ）、１２．５μＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６分ごとに０‐１２０分まで４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図９に示すように、ＢＬＭＡは濃度依存的にプロテインＣの活性化をもたらした。
【００３０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の菌の生産する酵素ＢＬＭＡは、プラスミノーゲンを基質として限定分解して、新生血管抑制効果を有するアンジオスタチン様断片、および優れた血栓溶解作用を示すミニプラスミノーゲン様断片を産生する。またＢＬＭＡは血漿セリンプロテアーゼ群の活性化をもたらし、活性型血液凝固第Ｘ因子、活性型プロテインＣなどの活性型血漿セリンプロテアーゼの製造に優れた効果をもたらす。
【配列番号】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる微生物代謝物の探索による微生物の選択
【図２】 バシロライシンＭＡのカルボキシルメチルセルロースクロマトグラフィーによる精製
【図３】 バシロライシンＭＡによるプラスミノーゲンからのアンジオスタチン様断片とミニプラスミノーゲン様断片の生成
【図４】 プラスミノーゲンのアンジオスタチン様断片による血管内皮細胞の増殖の阻害
【図５】 プラスミノーゲンのミニプラスミノーゲン様断片の血栓溶解酵素プラスミンへの変換効率
【図６】 バシロライシンＭＡによるプロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ｕＰＡ）活性化
【図７】 バシロライシンＭＡによる血液凝固第Ｘ因子の開裂と活性化
【図８】 バシロライシンＭＡによるプロトロンビンの活性化
【図９】 バシロライシンＭＡによるプロテインＣの活性化
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌バチラス メガテリウム Ａ９５４２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６８）、該細菌を起源とする新規なプロテイン（酵素）、該酵素の作用により生成するプラスミノーゲン断片を有効成分とする血管新生阻害剤（以下、血管新生阻害に有効なプラスミノーゲン断片をアンジオスタチン様分子という。）または血栓溶解剤（以下、該血栓溶解に有効なプラスミノーゲン断片をミニプラスミノーゲン様分子という。）、該酵素を有効成分とする血しょうセリンプロテアーゼ群活性化剤、更に該酵素を用いてプラスミノーゲンを基質としてアンジオスタチン様分子およびミニプラスミノーゲン様分子を製造する方法など関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、血管新生抑制剤が新しいガン治療戦略として注目されている。癌における血管新生の研究は最近非常に注目されている。癌細胞が増殖して１〜２ｍｍ3の大きさになると、さらに大きく成長するために多くの酸素と栄養が必要となることが解明されている。癌細胞は血管新生因子とよばれる血管新生を促す因子を放出し、近くの血管から新しい血管の造成を促して腫瘍内に血管を引き込むことにより、血液内の酸素と栄養物を利用し爆発的に増殖速度を増すことができるようになる。また、この腫瘍内微小血管を経由して遠隔転移が可能となる。
【０００３】
前記癌成長における血管新生の役割を見ると、癌の血管新生を阻害することは、癌の増殖、浸潤、転移を抑制することにつながることは容易に理解できる。事実、多くの血管新生を阻害する薬剤が抗腫瘍剤として開発され、提案もされている（特開平４−１７８３２８号公報、特開平６−２３４６４５号公報、特開平１０−８１６３１号公報など）。しかしながら、現在までに血管新生阻害剤として承認された薬剤はない。血管新生を標的とする治療薬の開発は原発腫瘍の増大のみならず転移を阻止する可能性を有する。その一つであるアンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）は血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成を選択的に抑え、酸素や栄養分の供給を断ち、腫瘍の休止状態を引き起こすことが知られるところとなった（米国のフォークマン博士らにより、アンジオスタチンが発見されこのような概念が提唱された。）。
また、アンジオスタチンは血管新生促進物質よりも循環血中での半減期が長いため原発巣から離れた転移巣では阻害物質濃度が優位となり、転移巣の成長を抑制していると考えられている。さらに、内皮細胞のアポトーシスも増加させることも知られている。アンジオスタチンは、線溶因子であるプラスミノーゲンのクリンゲル（ｋｒｉｎｇｌｅ）ｌ−４までを含む分子量約３８ｋＤａのペプチドである。従来、ＡＧはインビトロではプラスミノーゲンのエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）による限定分解や、プラスミノーゲンアクチベータを作用させ、プラスミンへと誘導した後、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）などの還元剤を作用させることにより生産される。また、ｉｎ ｖｉｖｏでは数種のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）によりアンジオスタチン変換は起こると考えられている。
従来のアンジオスタチンを生産する技術は、（１）前記タンパク質を分解するエステラーゼを用いる方法、および（２）組み換えＤＮＡ技術を用いて、大腸菌で生産させる方法に大別することができる。しかしながら、前記従来の生産方法によると、アンジオスタチンへの変換の選択性が低い、得られたアンジオスタチンの活性の再現性が良くない、精製が難しいなどの問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、基本的には前記アンジオスタチンの作用をする物質（アンジオスタチン様分子）、および該物質を生産する方法、特に前記プラスミノーゲンを酵素により分解する方法の問題点、すなわち、基質特異性を改善したアンジオスタチンへの変換酵素を見出すことである。本発明者は、前記改善された酵素を見出すべく、種々の土壌から、微生物の代謝物として放出されるタンパク質の中に前記所望のアンジオスタチンへの変換特性を持ったものはないかと探索した。そして、東京都国分寺市東元町の土壌から、前記基質特異性を持つタンパク質を代謝物として放出する細菌を見出した。そして、本発明者は該細菌をＡ９５４２とし、産業技術総合研究所生命工学研究所の特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６８として、平成１３年３月２１日に受託された。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、（１）配列番号１に記載の塩基配列を持つタンパク質を代謝する細菌バチラス メガテリウム Ａ９５４２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６８）であり、第２の発明は、（２）配列番号１で表される前記細菌の遺伝子の塩基配列であり、本発明の第３は、（３）前記（１）の細菌の培養液をイソプロピルアルコール存在下にＣＭセルロースイオン交換クロマトグラフィーにかける工程を含むことを特徴とする配列番号２に記載のアミノ酸配列を持つ酵素質を製造する方法である。
なお、前記各発明に関連する参考発明として、（４）前記細菌が代謝物として放出する、プラスミノーゲンを基質としてアンジオスタチン様断片を生成させる配列番号１および２に記載のアミノ酸配列を持つ酵素の発明、（５）前記（４）に記載の酵素を有効成分とする血しょうセリンプロテアーゼ群活性化剤の発明、（６）前記（５）に記載の前記酵素が活性化する成分が、プロトロンビン、プロテインＣ、プロウロキナーゼ、または血液凝固因子Ｘである発明、（７）配列番号２に記載のアミノ酸配列を持つ酵素を用いて、プラスミノーゲンからアンジオスタチン様断片またはミニプラスミノーゲン様断片を製造する方法の発明、（８）プラスミノーゲンを請求項３に記載の酵素により限定分解してプラスミノーゲンのＶａｌ ４４２ からＡｓｎ ７９１ のアミノ酸配列を有するフラグメント断片を主たる成分として含む血栓溶解剤有効成分を製造する方法の発明を、本明細書中に記載している。
【０００６】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．本発明の細菌は東京都国分寺市東元町で採取した土壌から分離して得られたものであり、実施例中で記述する培養条件で培養し、培養液からプラスミノーゲンのアンジオスタチン様断片への変換を触媒する酵素を生産する微生物を見出し、以下のように同定された。
Ｂ、菌学的特徴
１，代謝生産物として、配列番号１および２に記載の酵素を産生する。
２，顕微鏡観察から桿菌である。
３，菌の大きさは、約３〜６×０．８〜１．０μｍである。
４，グラム染色により紫色に染まりグラム陽性である。
５，芽胞染色から胞子形成菌である。
６，カタラーゼテストから、カタラーゼ陽性である。
７，嫌気条件で生育できないから、好気性である。
８，寒天培地での糖（Ｄ−（＋）−グルコース、Ｌ−（＋）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース、Ｄ−（−）−マニトール）からの酸性産性する。以上の特性から、Ａ９５４２株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍと一致する。
したがって、本菌を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ａ９５４２株とした。
【０００７】
９，本菌の遺伝子はバチラス メガテリウム ｎｐｒＥ遺伝子と９７％の相同性を示した。
本菌は、翻訳産物レベルにおいてバシロライシンに対して１０アミノ酸の相違が見られるアミノ酸配列（配列番号２に示すとおりである）のタンパクを産生する。そこでＡ９５４２株の前記翻訳産物をバシロライシンＭＡとした。
【０００８】
Ｃ，本菌の生育条件
１，培地組成：ブレインハートインフュージョン（ニッスイ ０５５０８）、牛脳エキス末２１％、ペプトン２８．６％、ハートエキス末２３％、グルコース５．７％、ＮａＣｌ １４．３％、リン酸水素−カリウム７．７％
２，培地ｐＨ：７．０、
３，培地の殺菌条件１２１℃、１５分、
４，培養温度：２８℃
Ｄ，本発明の菌は、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許生物寄託センター受託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６８）として受託されている。
【０００９】
９，本菌の遺伝子はバチラス メガテリウム ｎｐｒＭ遺伝子と９７％の相同性を示した。本菌は、翻訳産物レベルにおいてｎｐｒＭ遺伝子産物（ＮｐｒＭ）に対して１１アミノ酸の相違が見られるアミノ酸配列（配列番号２に示すとおりである）のタンパクを産生する。そこでＡ９５４２株の前記翻訳産物をバシロライシンＭＡとした。
【００１０】
選択対象の菌の分離にはスターチ−カゼイン−寒天培地（コーンスターチ１％、カゼイン０．０３％、ＫＮＯ3 ０．２％、ＮａＣｌ ０．２％、Ｋ2ＨＰＯ4０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００５％、ＣａＣＯ3 ０．００２％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、寒天ｌ．５％、ニスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）０．００５％）を、用いた。希釈液０．１ｍＬをシャーレ中の培地上に塗布し、２８℃で６日間培養した。生じたコロニーを釣菌し、スターチ−カゼイン−寒天培地からなる保存用スラント上において、２８℃で適当な生育状態になるまで培養し、その後４℃で保存した。
【００１１】
２，液体培養
選択対象の菌の液体培養には以下の培地を用いた。
グルコース１％、コーンスターチ ３％、大豆ミール（ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ）１％、ペプトン ０．５％、イースト抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）０．５％、ＣａＣＯ3 ０．２％、ＣＢ４４２ ０．０１％、ｐＨ７．０。
液体培地１０ｍＬの入った試験管（２１×２１０ｍｍ）に保存用スラント上から白金耳を用いて植菌し、２８℃で６日間、振とう培養（２２０ストローク／分）を行った。
【００１２】
実施例２
プラスミノーゲンからアンジオスタチン様断片を生成する代謝産物を生産する微生物の選択
プラスミノーゲンからアンジオスタチン様断片を生成する活性を生産する微生物の探索には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）〔Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０―６８５（１９７９）〕を用いた。
微生物代謝産物の９０％メタノール抽出物を１μＬ乾固して、それに放射ラベルしたプラスミノーゲン（125Ｉ−Ｇｌｕ−Ｐｌｇ）（最終濃度１００ｎＭ、２００００ｃｐｍ）を５μＬ、ｕＰＡ（ウロキナーゼ型 プラスミノーゲン活性剤）（最終濃度２００単位／ｍＬ）を５μＬずつ加えて、ＴＢＳ／Ｔバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１%（ｗ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４）中で３７℃、３０分間インキュベートした。その後サンプルバッファー（３．６％ＳＤＳ，３．６％メルカプトエタノール，０．０８％ブロモ フェノール ブルー，９００ｍｇ／ｍＬ 尿素）を１０μＬ加え、湯浴中で６０℃、３０分間処理、それをＳＤＳ−１０％ ｇｅｌにアプライして泳動後、固定、乾燥を行い、オートラデジオグラフィにかけてバンドのパターンを見た。プラスミノーゲンとｕＰＡのみを反応させたものを対象試料とした。
本方法により、土壌から分離した約１，５００株の放線菌、細菌、真菌の培養液をスクリーニングした結果、バチラス メガテリウム Ａ９５４２株の培養抽出液に強い活性を認めた（図１の２．）。
図１は、１は微生物培養抽出液を含まない反応（対照）で得られた結果であり、２はバチラス メガテリウム Ａ９５４２株の培養抽出液を含むで得られた結果であり、３は本発明の菌株以外のいくつかの菌の培養抽出液を含む反応で得られた結果を示す。
【００１３】
実施例３
バチラス メガテリウム Ａ９５４２株の培養液からの配列番号１および２のアミノ酸配列を持つタンパク質（バシロライシンＭＡ：ＢＬＭＡ）の精製
上記の液体培地１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコでバチラス メガテリウＭ Ａ９５４２株を２８℃、６日間、振とう培養後、培養液３Ｌをセライト（濾液の通過を容易にするための助剤）を用いて濾過し、その濾液１ＬをＨ2Ｏで５Ｌに希釈し、イソプロピルアルコールを最終濃度５％（ｖ／ｖ）と成るように添加した後、２０ｍＭ、ＭＥＳ（２‐［Ｎ‐Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）‐ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコールで平衡化したゲル４００ｍＬのカルボキシルメチルセルロース（ＣＭ‐Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、生化学工業株式会社）カラムに流速１５ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。同じバッファー６００ｍＬで洗浄した後、２０ｍＭ、ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコール／０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出した。その溶出画分を６０ｍＬずつ分画し、活性のあった画分を集めた。その純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認（図２）し、精製品９０ｍｇを得た。なお、ＢＬＭＡは本菌から分泌される際に限定分解を受け、本製造方法で得られる酵素蛋白質は、配列番号１に記載のアミノ酸番号Ｖａｌ1からＧｌｎ317までの配列をもつ分子である。しかし、本発明によるＢＬＭＡは、配列番号１に記載の配列のＰｒｏ-1からＧｌｎ-254のいかなる部分をさらに含む分子であってもよい。
【００１４】
実施例４
ＢＬＭＡによるプラスミノーゲンからのアンジオスタチン様断片とミニプラスミノーゲン様断片の生成（図３）
【００１５】
プラスミノーゲン（Ｇｌｕ‐Ｐｌｇ）を基質とするＢＬＭＡによる限定分解について観察した（測定：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。 ６μＬ の Ｇｌｕ‐Ｐｌｇ (最終濃度２μＭ)、６μＬの ＢＬＭＡ（最終濃度０，３．７，３７ｎＭ）をＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を含むＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６０ 分間インキュベートし、その後、非還元 ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｘ４）を加え、そのうち １５μＬを、ＳＤＳ‐１０ % ｇｅｌ にアプライした。泳動終了後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ‐２５０で染色、乾燥した。
その結果、プラスミノーゲンはＢＬＭＡ濃度依存的に開裂を受けた〔ＢＬＭＡ ３．７ｎＭで５５ %，３７ｎＭで ８６．５%のプラスミノーゲンが開裂した（図３Ａ）〕。
またＢＬＭＡによるプラスミノーゲン切断を、血清５０％、ＢＬ濃度０−１０００ｎＭの条件下で行なった。２μＬの 125Ｉ‐Ｇｌｕ‐Ｐｌｇ 、３μＬの ＢＬＭＡ（最終濃度０，１０，１００，１０００ｎＭ）、５μＬのヒト血清を加え、３７℃、６０分間インキュベートし、それに９０μＬの水 を加えた。そこから５μＬとって、それに５μＬ 還元ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｘ２） を加えた。そのうち５μＬを１２．５ % ｇｅｌ にアプライし、電気泳動した。泳動終了後一晩オートラジオグラフィにかけ、その後フィルムを現像した。
ここでもＢＬ濃度依存的に切断が進みアンジオスタチン様フラグメントが生成することが分かった〔図３Ｂ、ＢＬＭＡ濃度はそれぞれ、１は０ｎＭ、２は１０ｎＭ、３は１００ｎＭ、４は１０００ｎＭ。）〕。
【００１６】
次に図３Ａの切断された断片（フラグメント、１‐５）のＮ末端アミノ酸配列を同定したところ、表１のようになった。この結果から、ＢＬＭＡはＧｌｕ−Ｐ１ｇのＳｅｒ441−Ｖａｌ442（図３Ｃ、矢印３），Ｌｅｕ74−Ｐｈｅ75（図３Ｃ、矢印１），Ｖａ１449−Ｌｅｕ450（図３Ｃ、矢印２）を切断し、プラスミノーゲン分子の断片、Ｇｌｕ1−Ｓｅｒ441、Ｇｌｕ1−Ｖａｌ449、Ｐｈｅ75−Ｓｅｒ441、Ｐｈｅ75−Ｖａｌ449（以上アンジオスタチン様断片）ならびにＶａｌ442−Ａｓｎ791、Ｌｅｕ450−Ａｓｎ791（以上ミニプラスミノーゲン様断片）を生成することがわかった。
【００１７】
【表１】
実施例５
ＢＬＭＡによって生成するプラスミノーゲンのアンジオスタチン様断片およびミニプラスミノーゲン様断片の製造
２ｍＬのＧｌｕ‐ＰＬＧ（最終濃度２μＭ）に２ｍＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）と４ｍＬのＢＬＭＡ（最終濃度３６．８ｎＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６０分間インキュベートし、２２０μＬのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（最終濃度５ｍＭ）を加えて反応を停止させた。反応液をリジンセファロースカラム（４．６ｘ５０ｍｍ）にアプライ後、１ｍＬ の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで溶出した。ミニプラスミノーゲン様断片はこの画分に回収された。カラムをさらに０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー１ｍＬで洗浄後、１０ｍＬの０．２Ｍイプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）で溶出した。溶出画分は１ｍＬずつ分取した。この画分をＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分析によりアンジオスタチン様断片の確認をし、目的の断片の検出された画分を集め、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で一晩透析後，凍結乾燥を行なった。これにより、７５μｇのアンジオスタチン様断片を得た。なお、上記反応の容量、リジンセファロースカラムのサイズおよび溶出液の容量は適宜変化させることができ、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
実施例６
ＢＬＭＡによって生成するプラスミノーゲンのアンジオスタチン様断片による血管内皮細胞の増殖の阻害（図４）
ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥ細胞）を２４穴組織培養プラスチックプレートに１穴当たり１．２５ｘ１０4／ｍＬの密度で１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸混液および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭＥＭ培地０．５ｍＬを用いて播き込み、ＣＯ2インキュベーターで２４時間培養した。培地を５％ＦＣＳ入りのＭＥＭ培地に交換した後，最終濃度が１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳに溶解したアンジオスタチン様断片を１０μＬ加えた。ＣＯ2インキュベーターで３０分間インキュベート後，６μＬのＰＢＳあるいは１００ｎｇ／ｍｌ塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を加え、ＣＯ2インキュベーターで７２時間培養した。培養後、培地を取り除き０．５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し，１００μＬの０．０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ入りＰＢＳを加え，３７℃、５分間インキュベート後、１０μＬのＦＣＳを入れてトリプシンの反応を停止した。この細胞懸濁液の細胞数を血球計算盤で数えた。ｂＦＧＦを添加しないとき、細胞数が２６８１に対して、ｂＦＧＦ存在下では３７１２となった。アンジオスタチン様断片を１０μｇ／ｍＬ添加するとｂＦＧＦ存在下でも細胞数は２３３７であった。つまり、アンジオスタチン様断片はｂＦＧＦに依存した血管内皮細胞の増殖を顕著に阻害することが示された（図４）。
【００２０】
実施例７
ＢＬＭＡによって生成するプラスミノーゲンのミニプラスミノーゲン様断片の血栓溶解酵素プラスミンへの効率的変換（図５）
２５μＬのプラスミノーゲン（最終濃度１００ｎＭ）あるいはミニプラスミノーゲン様断片に２５μＬ のｕＰＡ（最終濃度２００単位／ｍＬ）、２５μＬの ＢＬＭＡ（最終濃度０‐３７ｎＭ）および２５μＬ の プラスミン基質Ｓ２２５１（最終濃度１００μＭ）を加え、ＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を含むＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、３ 分ごとに０‐６０分まで４０５ｎｍの吸光度を測定した。この反応で、ミニプラスミノーゲン様断片（●）はプラスミノーゲン（○）の５倍以上の速度でプラスミンを生成した（図５）。この結果から、ミニプラスミノーゲン様断片はプラスミノーゲンよりも優れた血栓溶解性を示すことがわかる。
【００２１】
実施例８
ＢＬＭＡによるプロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ｕＰＡ）の活性化（図６）
ＢＬＭＡによるｐｒｏ−ｕＰＡの限定分解とそれに伴う活性化を以下のように観察した。まず、ＢＬＭＡによってｐｒｏ−ｕＰＡがどのような分子に開裂されているかを調べるために、開裂パターンと、生じる断片の同定を行なった。
６μＬ の ｐｒｏ−ｕＰＡ（最終濃度２μＭ）、６μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０，３．７，１１０ｎＭ）をＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を含むＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６０分間インキュベートし、その後、非還元ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｘ４）を加え、そのうち１５μＬをＳＤＳ−１０ % ｇｅｌにアプライした。泳動終了後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色、乾燥した。さらに、ここで生じたフラグメントのＮ末端アミノ酸配列を同定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画後、ＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬＢＩＯＳＵＰＰＯＲＴ ＧＲＯＵＰ ＦＬＵＯＲＯＴＲＡＮＳ）へ転写した。 膜をＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色、メタノールで脱色した後、目的のバンドを切り出し、４７６Ａプロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。
ＢＬＭＡ３．７ｎＭでｐｒｏ−ｕＰＡの活性化開裂部位であるＬｙｓ158−Ｉｌｅ159間の切断が起り（図６Ｃ中の矢印１）、Ａ鎖（Ｓｅｒ1-Ｌｙｓ158）とＢ鎖（Ｉｌｅ159−Ｌｅｕ411）が生じた。ＢＬＭＡ１１０ｎＭではｐｒｏ‐ｕＰＡのすべてが開裂され、さらにＡ鎖のがＴｙｒ24−Ｐｈｅ25間で切断され（図６Ｃ中の矢印２）、新たなフラグメントＳｅｒ1-Ｔｙｒ24およびＰｈｅ25−Ｌｙｓ158が生じた（図６Ａ、Ｃおよび表２）。なお、これらの開裂により生ずる分子は互いにジスルフィド結合で連結されている。
【００２２】
【表２】
また、同様の実験を５０％血清存在下で行なった。２μＬの125Ｉ‐ｐｒｏ‐ｕＰＡ（１００，０００ｃｐｍ）、３μＬのＢＬＭＡ（図６Ｂ、１は ０ｎＭ，２は１０ｎＭ，３は１００ｎＭ，４は１０００ｎＭ、以上すべて最終濃度）、５μＬのヒト血清を加え、３７℃、６０分間インキュベートし、それに９０μＬのＨ2Ｏを加えた。そこから５μＬをとって、それに５μＬ還元ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｘ２）を加えた。そのうち５μＬを１２．５ % ｇｅｌにアプライし、泳動した。泳動終了後一晩オートラジオグラフィにかけ、その後フィルムを現像した。その結果、血清非存在下と同様の結果を得た（図６Ｂ）。
【００２４】
ＢＬＭＡによるプロウロキナーゼ（ｐｒｏ‐ｕＰＡ）の活性化
１０μＬのｐｒｏ‐ｕＰＡ（最終濃度２０ｎＭ）、１０μＬのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＵＫ（活性型ウロキナーゼの特異的基質）（最終濃度１００μＭ）、１０μＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）、２０μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０‐１９０ｎＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、３分ごとに０‐６０分まで４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて測定した。その結果、図６Ｄに示すように、ＢＬＭＡはｐｒｏ−ｕＰＡの活性化をもたらすことが示された。
【００２５】
実施例９
ＢＬＭＡによる血液凝固第Ｘ因子の活性化（図７）
ＢＬＭＡによる血液凝固第Ｘ因子の開裂（図７のＢ）を以下のように調べた。
５μＬの血液凝固第Ｘ因子（最終濃度２μＭ）、５μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０，３０，１００，３００ｎＭ）を加え、ＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を含むＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、１２０分間インキュベートした。その後３．３μＬの還元ＳＤＳ‐ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｘ４）を加え、そのうち１２μＬを、１２．５ % ｇｅｌにアプライした。泳動終了後、染色、乾燥を行なった（図７Ａ）。さらに、生成したフラグメントのＮ末端アミノ酸配列を実施例７と同様の方法で同定した（表３）。
ＢＬＭＡは濃度依存的に血液凝固第Ｘ因子のＢ鎖のＡｓｐ34‐Ｌｅｕ35間（図７Ｂ中の矢印１）、および活性化開裂部位であるＢ鎖のＬｙｓ52‐Ｉｌｅ53間（図７Ｂ中の矢印２）の開裂をもたらした（図７Ａ、Ｂおよび表３）。その結果、Ｂ鎖のＳｅｒ1−Ａｓｐ34断片と、Ａ鎖とＢ鎖のＬｅｕ35−Ｌｙｓ254断片がジスルフィド結合で連結された分子を生成した。
【００２６】
【表３】
ＢＬＭＡによる血液凝固第Ｘ因子の活性化
１０μＬ血液凝固第Ｘ因子（最終濃度２０ｎＭ）、１０μＬのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ Ｘａ（活性型血液凝固第Ｘ因子の特異的基質）（最終濃度１００μＭ）、１０μＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）、２０μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０‐１００ｎＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６分ごとに０‐１２０分まで４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＢＬＭＡは図７Ｃに示すように血液凝固第Ｘ因子の活性化をもたらした。
【００２８】
実施例１０
ＢＬＭＡによるプロトロンビンの活性化（図８）
ＢＬＭＡによるプロトロンビンの活性化は、以下の方法で測定した。１２．５μＬのプロトロンビン（最終濃度２０ｎＭ）、１２．５μＬのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＴＨ（最終濃度１００μＭ）、１２．５μＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）、１２．５μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０‐４００ｎＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６分ごとに0‐１２０分まで４０５ｎｍの吸光度を測定した。図８に示すようにＢＬＭＡは濃度依存的にプロトロンビンを活性化した。
【００２９】
実施例１１
ＢＬＭＡによるプロテインＣの活性化（図９）
１２．５μＬの ヒトプロテインＣ（最終濃度２０ｎＭ）、１２．５μＬのＢＬＭＡ（最終濃度０‐４０ｎＭ）、１２．５μＬのＳ２３３６（活性型プロテインＣに特異的な基質）（最終濃度１００μＭ）、１２．５μＬのＣａＣｌ2（最終濃度１ｍＭ）を加え、ＴＢＳ／Ｔバッファー中で３７℃、６分ごとに０‐１２０分まで４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図９に示すように、ＢＬＭＡは濃度依存的にプロテインＣの活性化をもたらした。
【００３０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の菌の生産する酵素ＢＬＭＡは、プラスミノーゲンを基質として限定分解して、新生血管抑制効果を有するアンジオスタチン様断片、および優れた血栓溶解作用を示すミニプラスミノーゲン様断片を産生する。またＢＬＭＡは血漿セリンプロテアーゼ群の活性化をもたらし、活性型血液凝固第Ｘ因子、活性型プロテインＣなどの活性型血漿セリンプロテアーゼの製造に優れた効果をもたらす。
【配列番号】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる微生物代謝物の探索による微生物の選択
【図２】 バシロライシンＭＡのカルボキシルメチルセルロースクロマトグラフィーによる精製
【図３】 バシロライシンＭＡによるプラスミノーゲンからのアンジオスタチン様断片とミニプラスミノーゲン様断片の生成
【図４】 プラスミノーゲンのアンジオスタチン様断片による血管内皮細胞の増殖の阻害
【図５】 プラスミノーゲンのミニプラスミノーゲン様断片の血栓溶解酵素プラスミンへの変換効率
【図６】 バシロライシンＭＡによるプロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ｕＰＡ）活性化
【図７】 バシロライシンＭＡによる血液凝固第Ｘ因子の開裂と活性化
【図８】 バシロライシンＭＡによるプロトロンビンの活性化
【図９】 バシロライシンＭＡによるプロテインＣの活性化
Claims (3)
- バチラス メガテリウム Ａ９５４２株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ‐１８２６８）。
- 配列番号１に記載の細菌バチラス メガテリウム Ａ９５４２のバシロライシンＭＡ遺伝子。
- バチラス メガテリウム Ａ９５４２株の培養液を、イソプロピルアルコール存在下にＣＭセルロースイオン交換クロマトグラフィーにかける工程を含むことを特徴とする配列番号１および２に記載のアミノ酸配列を持つ、プラスミノーゲンを基質としてアンジオスタチン様プラスミノーゲン断片を生成させる新規な酵素を製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001085117A JP3760183B2 (ja) | 2001-03-23 | 2001-03-23 | 新規なアンジオスタチン変換酵素、該酵素の生産菌、該酵素の製造方法、該酵素の利用によるアンジオスタチンおよび活性型セリンプロテアーゼの製造 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001085117A JP3760183B2 (ja) | 2001-03-23 | 2001-03-23 | 新規なアンジオスタチン変換酵素、該酵素の生産菌、該酵素の製造方法、該酵素の利用によるアンジオスタチンおよび活性型セリンプロテアーゼの製造 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005181685A Division JP4220985B2 (ja) | 2005-06-22 | 2005-06-22 | 新規な変換選択性を有するアンジオスタチン変換酵素の利用により得られたアミノ酸配列断片を有効成分とする血管新生阻害剤 |
| JP2005181693A Division JP3783034B2 (ja) | 2005-06-22 | 2005-06-22 | 新規な変換選択性を有するアンジオスタチン変換酵素、及び前記酵素の利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002272453A JP2002272453A (ja) | 2002-09-24 |
| JP3760183B2 true JP3760183B2 (ja) | 2006-03-29 |
Family
ID=18940682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001085117A Expired - Fee Related JP3760183B2 (ja) | 2001-03-23 | 2001-03-23 | 新規なアンジオスタチン変換酵素、該酵素の生産菌、該酵素の製造方法、該酵素の利用によるアンジオスタチンおよび活性型セリンプロテアーゼの製造 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3760183B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2512894A1 (en) | 2003-01-17 | 2004-08-05 | Ttc Co., Ltd. | Affinity trap reactor and single-step process for purifying angiostatin-like fragment from human plasma using the same |
| AU2004316095A1 (en) * | 2004-02-24 | 2005-09-01 | Ttc Co., Ltd. | Anticancer agent containing BL angiostatin |
| JP2012050386A (ja) * | 2010-09-01 | 2012-03-15 | Kaneka Corp | ２種類以上の多孔質充填剤を充填するカラム |
-
2001
- 2001-03-23 JP JP2001085117A patent/JP3760183B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002272453A (ja) | 2002-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dubey et al. | Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources | |
| Jeong et al. | Purification and biochemical characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis BK-17 | |
| Kim et al. | Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang | |
| Ko et al. | Identification of two novel fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis QK02 | |
| Kim et al. | Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish | |
| JP2534020B2 (ja) | 血清不含培地による組織プラスミノ―ゲン活性化物質の製造方法 | |
| Lu et al. | Purification and characterization of a novel anticoagulant and fibrinolytic enzyme produced by endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3 | |
| Lee et al. | Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme form Bacillus sp. KDO-13 isolated from soybean paste | |
| Chitte et al. | Production, purification, and biochemical characterization of a fibrinolytic enzyme from thermophilic Streptomyces sp. MCMB-379 | |
| Park et al. | Purification and biochemical characterization of a 17 kDa fibrinolytic enzyme from Schizophyllum commune | |
| JP3760183B2 (ja) | 新規なアンジオスタチン変換酵素、該酵素の生産菌、該酵素の製造方法、該酵素の利用によるアンジオスタチンおよび活性型セリンプロテアーゼの製造 | |
| Tsushima et al. | Characterization of a cathepsin‐H‐like enzyme from a human melanoma cell line | |
| EP0398859A2 (en) | Novel 92-kDa type IV collagenase | |
| Park et al. | Identification of fibrinogen-induced nattokinase WRL101 from Bacillus subtilis WRL101 isolated from Doenjang | |
| JP4220985B2 (ja) | 新規な変換選択性を有するアンジオスタチン変換酵素の利用により得られたアミノ酸配列断片を有効成分とする血管新生阻害剤 | |
| JP3783034B2 (ja) | 新規な変換選択性を有するアンジオスタチン変換酵素、及び前記酵素の利用 | |
| Eldeen et al. | Optimization of culture conditions to enhance nattokinase production using RSM | |
| Abdelghani et al. | Isolation and mutagenesis of streptokinase producing bacteria | |
| Obeid et al. | Isolation and characterization of bacillus subtillus with potential production of nattokinase | |
| KR100670499B1 (ko) | 혈전용해효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 비비-1 | |
| Majumdar et al. | Statistical optimization for improved production of fibrin (Ogen) olytic enzyme by Bacillus cereus strain FF01 and assessment of in vitro thrombolytic potential of protease enzyme | |
| KR0180103B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스 속 균주 유래의 혈전용해효소 | |
| US20040147009A1 (en) | Tissue type plasminogen activator (t-PA) variants: compositions and methods of use | |
| JPH06153977A (ja) | 線溶活性を持つ蛋白質の製造法 | |
| Ghaffar et al. | Production and characterization of streptokinase enzyme by using Streptococcus mutans strain in liquid state fermentation through corn steep liquor (CSL) substrate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20050105 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20050225 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050426 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050502 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050622 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050622 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051108 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051122 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090120 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100120 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100120 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110120 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110120 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120120 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |