KR20070023672A - Ｂｌ 앤지오스태틴을 함유하는 제암제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 BL 앤지오스태틴을 유효 성분으로 하여 함유하는 제암제 및 그 제조 방법을 제공한다.

BL 앤지오스태틴, 제암제

Description

ＢＬ 앤지오스태틴을 함유하는 제암제{ANTICANCER AGENT CONTAINING BL ANGIOSTATIN}

본 발명은 BL 앤지오스태틴을 함유하는 제암제 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

혈관의 신생을 저해하는 물질은 암의 증식, 침윤, 전이를 억제한다는 점에서 항종양제로서의 용도가 기대되고 있고, 이와 같은 물질의 하나로서 앤지오스태틴이 알려져 있다. 앤지오스태틴은 혈액 중에 존재하는 선용인자(線溶因子)인 플라스미노겐을 분해함으로써 얻게 되는 분자량 약 40,000의 단백질이며, 동물 실험에서는 암에 대하여 극적인 효과를 나타내는 것이 보고되어 있다 (M. S. O'Reilly et al., Cell, 79, 315-328 (1994)).

앤지오스태틴에는 (1) 플라스미노겐을 엘라스타제로 가수 분해한 것 (M. S. O'Reilly et al., Nature Medicine, 2, 689-692 (1996)) 및 (2) 유전자 재조합 기술을 사용하여 효모에 직접 생산한 것 (B. K. Sim et al., Cancer Research 57, 1329-1334 (1997))의 2 종류가 알려져 있었다.

그러나, (1)에서는 엘라스타제의 기질 특이성이 낮기 때문에 부생성물이 많이 발생하고, 플라스미노겐으로부터 앤지오스태틴을 선택적으로 생성시키는 것이 곤란하기 때문에, 앤지오스태틴의 활성이 낮다고 하는 결점이 있었다. 또한, (2)에서는 앤지오스태틴의 정제가 곤란하고 고비용이며, 또한 물에 대한 용해성이 낮다고 하는 문제가 있었다.

최근, 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) A9542주가 산생하는 프로테아제인 바실로라이신 MA를 사용하여, 사람 플라스미노겐을 특이적으로 절단한 앤지오스태틴상 단편 (주로 Glu¹-Ser⁴⁴¹, 이하에서는「BL 앤지오스태틴」라고 기재한다.)이 개발되었다 (일본 공개 특허 공보 2002-272453호). 사람 플라스미노겐의 아미노산 배열은 공지이며, 스위스-프롯 (SWISS-PROT)에 입수 번호 P00747로서 등록되어 있다. 또한, 사람 플라스미노겐의 아미노산 배열은 시그널 펩티드 (Met¹-Gly¹⁹)를 포함하는 것이기 때문에, 본 출원에서는 시그널 펩티드를 제외한 성숙 폴리펩티드, 즉 Glu¹-Asn⁷⁹¹의 아미노산 배열에 기초하는 아미노산 번호로 아미노산 위치를 나타내었다.

또한, 재조합 앤지오스태틴은 천연형에 비하여 물리적 성질과 활성이 불균일한데, 이것은 이종 생물에의 발현 과정에서의 단백질 폴딩의 차이에 기인한 입체 구조의 변화, 당사슬 수식의 차이 등이 원인이라고 생각된다 (Cao, Y., Int J Biochem Cell Biol 33, 357-69 (2001), Dell'Eva, R., et al., Endothelium 9, 310 (2002)). 또한, 동일한 원인에 의하여, 재조합 단백질의 용해성이 낮은 것도 지적되고 있다. 이러한 점에서 재조합체에 비하여 효소법에 의하여 생산되는 천연형이 유리하다.

그러나, 단백질 분해 효소의 기질 인식이 특이성이므로, 플라스미노겐으로부터 선택적으로 앤지오스태틴을 생성하는 것은 극히 곤란하고, 많은 부산물을 생성한다고 하는 결점이 있었다.

또한, 모든 시판되는 엘라스타제 표품(標品)이 활성이 있는 앤지오스태틴을 생산하는 것은 아니며, 절단, 그 후의 처리에 의하여 앤지오스태틴을 변성시킬 가능성도 시사되어 있다 (O'Reilly et al., Nat Med 2, 689-692 (1996)).

바실로라이신 MA는 플라스미노겐을 극히 선택적으로 절단하고, BL 앤지오스태틴 (주생성물로서 Glu¹으로부터 Ser⁴⁴¹의 아미노산 배열을 가지는 프래그먼트, 미량 생성물로서 pHe⁷⁵로부터 Ser⁴⁴¹, Glu¹으로부터 Val⁴⁴⁹ 및 pHe⁷⁵로부터 Val⁴⁴⁹의 아미노산으로 이루어지는 프래그먼트)를 생성시킨다 (일본 공개 특허 공보 2002-272453호).

또한, 본 발명자들은 바실로라이신 MA 고정화 리액터 (어피니티 트랩 리액터)를 개발하고, 사람 혈장으로부터 1 단계의 스텝으로 Glu¹로부터 Ser⁴⁴¹까지의 아미노산 배열을 가지는 프래그먼트를 주성분으로 하는 플라스미노겐 프래그먼트의 제조 기술을 개발하고 (PCT/JP03/00338), 제조 시간의 단축과 비용 삭감을 달성하였다.

재조합 앤지오스태틴은 Leu⁷⁴로부터 Leu⁴⁵¹의 아미노산으로 이루어지는 플라스 미노겐의 내부 프래그먼트인 (Sim, B. K. et al. Cancer Res 57, 1329-34 (1997))것에 대하여, BL 앤지오스태틴은 전술한 바와 같이 앤지오스태틴과는 다른 구조로 되어 있지만, 앤지오스태틴과 유사한 항혈관 내피 세포 작용을 한다.

특히, 주생성물인 Glu¹로부터 Ser⁴⁴¹의 아미노산 배열을 가지는 프래그먼트, 더욱 Glu¹로부터 Val⁴⁴⁹의 아미노산 배열을 가지는 프래그먼트는 플라스미노겐의 N 말단측을 포함하는 것이다.

플라스미노겐의 N 말단 펩티드 (Glu¹로부터 Glu⁸³)는 친수성 아미노산이 풍부하고, N 말단 펩티드의 유무의 차이는 BL 앤지오스태틴과 앤지오스태틴과의 사이에 용해성 등의 물리적 특성뿐만이 아니라, 생체 내에서의 활성, 동태 등에도 차이를 나타내게 하는 것으로 생각된다.

그러나, BL 앤지오스태틴이 실제로 생체 내에서의 제암 효과가 있다는 보고는 아직 없었지만, 염가로 물에 대한 용해성이 높고, 또한 우수한 제암성을 가지는 제암제 및 그 제조 방법의 개발이 기대되고 있다.

본 발명자는, 상기 BL 앤지오스태틴의 암에 대한 효과에 대하여 예의 연구를 한 결과, 놀랍게도 BL 앤지오스태틴이 극히 우수한 제암 효과가 있으며, 한편으로물에 대한 용해성이 높기 때문에, 정맥내 투여에 의하여도 각별한 제암 효과가 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

또한, 본 발명자는, BL 앤지오스태틴의 제조시에, 바실로마이신 MA에 의한 자기 소화의 저해제인 이소프로필 알코올을 사용하지 않고도 높은 효율로 BL 앤지 오스태틴을 얻을 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 BL 앤지오스태틴을 유효 성분으로서 포함하는 제암제 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

도 1은 어피니티 트랩 리액터에 의하여 정제한 BL 앤지오스태틴을 나타낸다. 레인 1은 얻게 된 BL 앤지오스태틴이다. 레인 2는 바실로라이신 MA (5nM), 플라스미노겐 (3μM)을 100 mM NaCl, 0.O1% Tween 8O, 1 mM CaCl₂를 포함하는 5O mM 트리스 염산 (pH 7.4) 10 ㎕ 중에서 37℃로, 60분간 인큐베이트한 후, 10 ㎕의 샘플 완충액 (4% SDS, 10% 2-메르캅토에탄올, 20% 수크로스, 0.004% 브롬페놀 블루를 포함하는 125 mM 트리스 염산 완충액, pH 6.8)을 가하고 레인 1과 동일하게 분석하였다.

도 2는 피하 이식 루이스 폐암의 증식에 대한 BL 앤지오스태틴의 효과 (종양 체적의 추이)를 나타낸다. X축은 루이스 폐암을 이식하고 난 후의 일수(일)이며, Y축은 종양 체적 (mm³)이다. ●는 대조군을, ▲, ■, × 및 ◆은 각각 BL 앤지오스태틴 0.3, 1, 3 및 10 ㎎/㎏/day 처리군을 나타내고, 각각의 값은 각군의 8개의 예의 평균치±표준 편차를 나타낸다. 던넷 (Dunnett)의 다중 비교 검정으로, 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이에는 *표를 붙였다. * (p<0.05), ** (p<0.01)

도 3은 피하 이식 루이스 폐암의 증식에 대한 BL 앤지오스태틴의 효과 (종양 습중량(濕重量)을 나타낸다. X축은 BL 앤지오스태틴의 용량 (㎎/㎏/day)이며, Y축은 종양 습중량 (㎎)이다. 각각의 값은 각군의 8개의 예의 평균치±표준 오차를 나타낸다. 던넷의 다중 비교 검정으로, 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이에는 *표를 붙였다. * (p<0.05), ** (p<0.01)

도 4는 루이스 폐암 피하 이식 동물의 체중에 대한 BL 앤지오스태틴의 영향을 나타낸다. X축은 루이스 폐암을 이식한 때로부터의 일수(일)이며, Y축은 체중 (g)이다. ●는 대조 (생리 식염수) 처리군이며, ▲은 앤지오스태틴 0.3 ㎎/㎏/day 처리군이며, ■는 앤지오스태틴 1 ㎎/㎏/day 처리군이며, ×는 앤지오스태틴 3 ㎎/㎏/day 처리군이며, ◆는 앤지오스태틴 10 ㎎/㎏/day 처리군이다. 각각의 값은 각 군 8개의 예의 평균치±표준 오차를 나타낸다. 던넷의 다중 비교 검정으로, 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이에는 *표를 붙였다. * (p<0.05), ** (p<0.01)

도 5는 종양의 병리 조직상 및 폰 빌리브란트 인자 (von Willebrand factor) 면역 염색상을 나타낸다. 대조군 (종양의 장경 8.2 mm, 단경 7.8mm) (A, B, C, D), 3 ㎎/㎏ 투여군 (종양의 장경 7.0 mm, 단경 5.6 mm) (E, F, G, H) 및 10 ㎎/㎏ 투여군 (종양의 장경 4.4 mm, 단경 2.8 mm) (I, J, K, L)의 대표예를 나타낸다. D, H 및 L은 폰 빌리브란트 인자 면역 염색, 그 이외에는 헤마톡시린·에오신 염색. 배율은 5배 (A, E, I), 25배 (B, F, J), 100배 (C, G, K) 및 50배 (D, H, L).

발명을 실시하기 위한 최선의 상태

본 발명의 BL 앤지오스태틴

본 발명의 BL 앤지오스태틴은 프로테아제, 특히, 바실러스 메가테리움 A9542 가 생산하는 효소인 바실로라이신 MA (BLMA)를 사용하여 플라스미노겐을 처리함으로써 얻을 수 있다. 바실러스 메가테리움 A9542는 산업기술 종합 연구소 생명공학 연구소의 특허 생물 기탁 센터에 2001년 3월 21일에 수탁 번호 FERM P-18268로서 기탁되어 있다. BLMA의 아미노산 배열은 일본 공개 특허 공보 2002-272453에 개시되어 있다. BLMA는 사람 플라스미노겐의 Ser⁴⁴¹-Val⁴⁴², Leu⁷⁴-pH e⁷⁵ 및 Val⁴⁴⁹-Leu⁴⁵⁰의 사이를 절단하고, Glu¹-Ser⁴⁴¹, Glu¹-Val⁴⁴⁹, pH e⁷⁵-Ser⁴⁴¹, pH e⁷⁵-Val⁴⁴⁹의 4 종류의 앤지오스태틴과 유사한 활성을 가지는 단편을 생성하는 것이 알려져 있다.

본 발명의 제암제로서는, 전술한 4개의 앤지오스태틴과 유사한 단편의 1종 이상을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으나, 특히 Glu¹-Ser⁴⁴¹가 바람직하게 사용된다.

플라스미노겐은 포유 동물, 특히 사람이나 소에 있어서, 그 아미노산 배열이 고도로 보존되어 있는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 BL 앤지오스태틴의 제조를 위한 원료로서의 플라스미노겐은 포유 동물에 유래하는 것이면 어떠한 것이든 사할 수 있고, 특히 사람이나 소에서 유래된 플라스미노겐이 좋다.

또한, 본 발명의 BL 앤지오스태틴은 화학 합성 또는 유전자 조작 기술에 의하여도 제조할 수 있다. 비교적 용이한 조작으로 그리고 대량으로 제조할 수 있다는 점에서는 유전자 조작 기술에 의한 제조가 좋다. 본 발명의 BL 앤지오스태틴을 제조하려면, 상기 단백질을 코드하는 염기 배열을 가지는 DNA를 제작하고, 이것을 매우 적합한 발현계에 도입함으로써 목적으로 하는 단백질을 제조할 수 있다.

본 발명의 BL 앤지오스태틴의 염기 배열을 가지는 DNA는 사람 유래 (예를 들면, HepG2 세포 유래 등)의 cDNA 라이브러리를 BL 앤지오스태틴의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열의 정보에 기초하여 설계한 매우 적합한 프라이머 또는 프로브를 사용하여 스크리닝함으로써 입수할 수 있다. 스크리닝은 플라크 하이브리다이제이션 등으로 실시할 수 있다. 또는, 사람 유래 (예를 들면, HepG2 세포 유래 등)의 cDNA 라이브러리를 주형(鑄型)으로서 사용하고, 상기 염기 배열의 정보에 기초하여 설계한 매우 적합한 프라이머를 사용하여 PCR를 실시함으로써, 목적으로 하는 유전자를 직접 클로닝할 수도 있다.

재조합 단백질을 발현시키기 위한 발현계 (유전자를 포함하는 발현 벡터와 그 숙주)는 당업자에게 공지이다. DNA를 숙주 세포 중에서 발현시키기 위하여는, 먼저 상기 DNA를 발현 벡터 중의 프로모터의 하류에 삽입하고, 그 후에 이 재조합 발현 벡터를, 해당 발현 벡터에 적합한 숙주 세포 중에 도입한다.

세균용의 발현 벡터로서는, pGEMEX-1 (Promega), pQE-9 (QIAGEN), pQE-3O (QIAGEN), pRSET (Invitrogen), pLEX (Invitrogen) 등을 들 수 있고, 동물 세포용의 발현 벡터로서는, 예를 들면 pcDNAI, pcDM8 (Funakoshi), pcDNAI/AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen)나, 재조합 바이러스 작성용 발현 벡터, 예를 들면 PMFG (Takara)를 들 수 있다.

세균용의 발현 벡터에 사용할 수 있는 프로모터로서는, 예를 들면 trp 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터 등의 대장균이나 파지(phages) 등에서 유래하는 프로모터 등을 들 수 있다. 효모용의 발현 벡터에 사용할 수 있는 프로모터로서는, 예를 들면 pHO5 프로모터, GAP 프로모터를 들 수 있다. 동물 세포용의 발현 벡터에 사용할 수 있는 프로모터로서는, 예를 들면 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 아데노바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터를 들 수 있다.

숙주 세포로서는, 목적 단백질을 발현할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않으며, 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터를 숙주에 도입하는 방법은, 예를 들면 인산칼슘법, 프로토플라스트법, 일렉트로포레이션법, 스페로블라스트법, 초산리튬법, 리포펙션법 등을 들 수 있고, 숙주 세포의 종류에 따라 적당히 선택할 수 있다.

형질 전환체의 배양물로부터, 목적으로 하는 재조합 단백질을 단리 정제하려면, 통상의 단백질의 단리, 정제법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 재조합 단백질이, 세포 내에 용해 상태로 발현되는 경우에는 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의하여 회수하여 수계 완충액에 현탁한 후, 세포를 파쇄하고, 무세포 추출액을 얻는다. 상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻은 상정으로부터 통상의 단백질의 단리 정제법, 즉 용매 유출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 이온 교환 크로마토그래피법, 겔 여과법, 어피니티 크로마토그래피법을 단독으로 또는 조합하여 사용하여 정제할 수 있다.

또한, 본 발명은 아래의 공정, 즉

아가로스 겔 상에 바실로라이신 MA 및 라이신을 고정한 어피니티 트랩 리액 터를 완충액으로 평형화하는 공정과,

구연산 처리한 혈청을 첨가하는 공정과,

염화나트륨을 포함하는 완충액으로 세정하는 공정 및

6-아미노헥산산으로 용출하는 공정

으로 이루어지는 BL 앤지오스태틴의 제조 방법으로서, 상기 완충액이 이소프로필 알코올을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 제조 방법에도 관한 것이다. 좋기로는, 모든 조작을 4℃에서 실시한다. 이것에 의하여, BL 앤지오스태틴을 고수율로 얻을 수 있다.

본 발명의 제암제는 일반적으로는 유효 성분으로서의 BL 앤지오스태틴과 담체, 부형제 등의 제제용 첨가물을 포함하는 의약 조성물의 형태로 제공된다.

본 발명의 제암제는 사람을 비롯한 포유동물에 의약으로서 투여할 수 있다.

본 발명의 약제의 투여 경로는 특히 한정되지 않고, 경구 투여 또는 비경구 투여 (예를 들면, 근육내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 비강의 점막 투여, 또는 흡입 투여 등)의 어느 것이라도 좋다.

BL 앤지오스태틴은 선행 기술의 앤지오스태틴과는 달리, 물에 대한 용해도가 높으므로 (20 ㎎/ml 이상), 본 발명의 제암제는 정맥내 투여에 의하여 투여할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 제암제의 형태는 특히 한정되지 않고, 경구 투여를 위한 제제로서는, 예를 들면 정제, 캅셀제, 세립제, 분말제, 과립제, 물약, 시럽제 등을 들 수 있어 비경구 투여를 위한 제제로서는, 예를 들면 주사제, 링거제, 좌제, 흡입제, 경점막 흡수제, 경피 흡수제, 점비제, 점이제 등을 들 수 있다. 본 발명의 약제의 형태, 사용하여야할 제제용 첨가물, 제제의 제조 방법 등은 모두 당업자가 적당히선택할 수 있다.

본 발명의 약제의 투여량은 환자의 성별, 연령 또는 체중, 증상의 중증도, 예방 또는 치료 등의 투여 목적, 또는 다른 합병증의 유무 등을 종합적으로 고려하여 적당히 선택할 수 있다. 투여량은 일반적으로는 0.1 ㎎/㎏ 체중/일 내지 10O ㎎/㎏ 체중/일, 좋기로는 1 ㎎/ ㎏ 체중/일 내지 10 ㎎/㎏체중/일이다.

본 발명의 제암제는 유방암, 폐암, 인두암, 위암, 췌장암, 간암, 결장암, 자궁암, 난소암 등의 치료에 사용할 수 있다.

이하에, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 기재된 것에 한정되는 것은 아니다.

예1. 바실로라이신 MA의 생산 및 정제

바실로라이신 MA는 바실러스 메가테리움 A9542주 (기탁 번호 FERM P-18268으로 일본 경제 산업성 산업기술 종합 연구소 생명공학 공업 기술 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다)로부터, 이하의 방법에 의하여 분리 정제하였다.

글루코스 1%, 옥수수 전분 3%, 대두밀 1%, 펩톤 0.5%, 이스트 추출물 0.5%, CaCO₃ 0.2%, CB442 0.01%의 성분을 포함하는 액체 배양지 (pH 7.0) 100 ㎖를 포함하는 500 ㎖용 삼각 플라스코에서, 바실러스 메가테리움 A9542주를 28℃로 6일간 진 동 배양한 후, 배양액 3 리터를 셀라이트를 사용하여 여과하고, 그 여과액 1 리터를 H₂O로 5 리터로 희석하고, 이소프로필 알코올을 최종 농도 5% (v/v)가 되도록 첨가하였다. 그 후, 20 mM MES (2-N-몰포리노〕에탄술폰산)-NaOH 완충액 (pH 6.5)/5% 이소프로필 알코올로 평형화한 400 ㎖의 카르복시메틸셀룰로오스 (생화학공업 주식회사) 컬럼에 유속 15 ㎖/분으로 주입하였다. 동일한 완충액 600 ㎖로 세정한 후, 20 mM MES/NaOH (pH 6.5)/5% 이소프로필 알코올/0.2M NaCl로 용출하였다. 그 용출 획분을 60 ㎖씩 분획하고, 활성이 인정된 획분을 모았다. 그 순도를 SDS-PAGE로 확인하고, 정제물 90 ㎎를 얻었다.

예 2. 바실로라이신 MA 및 라이신을 고정한 본 발명의 어피니티 트라프리 어댑터 1의 작성 (리액터 10㎖를 작성)

브롬화시안으로 미리 활성화시켜 둔 아가로스 겔 (세파로스 4B, 팔마시아사) 2.86 g을 1 mM HCl 용액 100 ㎖에 현탁하여, 실온에서 15분간 교반하였다. 이것을 컬럼으로 옮겨, 흡인하여 HCl 용액을 제거하고, 1mM HCl 용액 100 ㎖로 3회, 다음에 0.5M NaCl, 5% 이소프로필 알코올을 함유하는 완충액 A (0.1 M 탄산수소나트륨, pH 8.3) 75 ㎖로 1회 겔의 세정을 실시하였다. 2.84 ㎎/㎖의 바실로라이신 MA 용액을 동일한 완충액 A로 작성하고, 그것의 17.6 ㎖를 컬럼에 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반함으로써 고정화 반응을 실시하였다. 반응 종료 후, 흡인에 의하여 용액을 제거하고, 0.2M L-라이신 염산염을 포함하는 5% 이소프로필 알코올 수용액 (pH 8.0) 20㎖ 를 가하고, 실온에서 2 시간 교반함으로써 라이신의 고정화 반응을 실시 하였다. 반응 종료 후, 용액을 흡인에 의하여 제거하고, 5% 이소프로필알코올을 포함하는, 완충액 B (20 mM MES (2-[몰포리노]에탄술폰산)-NaOH) 500 ㎖로 겔을 세정하고, 마지막으로 0.02% 아지화나트륨을 포함하는 상기 조성의 완충액 B 중에서 4℃로 보존하였다.

예 3. 바실로라이신 MA/리신 리액터를 이용한, 사람 혈장으로부터의 BL 앤지오스태틴의 1단계 정제 프로세스

구연산 처리한 사람 혈장 95 ㎖에 이소프로필 알코올 5 ㎖를 얼음 위에서 첨가하고, 30분간 방치한 후, 원심 분리 (22,000xg, 4℃, 1시간)에 의하여 상청을 얻고 여과하였다. 이후의 조작은 모두 4℃에서 행하였다. 예 2에서 작성한 본 발명의 바실로라이신 MA/리신 리액터 10 ㎖를, 5% 이소프로필 알코올을 포함하는 완충액 C (25 mM 인산나트륨, pH 7.4)로 평형화하였다. 평형화한 리액터에 상기 상청을 유속 1.5 ㎖/분으로 첨가하였다. 그 후, 0.5M NaCl를 포함하는 상기 조성의 완충액 C 200 ㎖로 리액터를 세정하였다(3 ㎖/분). 생성한 BL 앤지오스태틴의 용출은 200 mM의 6-아미노헥산산을 포함하는 5% 이소프로필 알코올 용액 50 ㎖로 실시하였다. 그 결과, 대부분의 BL 앤지오스태틴은 10 내지 30 ㎖의 용출액으로 용출되었다. BL 앤지오스태틴의 수량(收量)은 4.2 ㎎이며, 순도는 95%이었다.

또한, 사용 후의 리액터는 1 M의 NaCl과 200 mM의 6-아미노헥산산을 포함하는 상기 조성의 완충액 C 50㎖를 사용하여 4℃에서 세정하였다. 그 후, 0.02% 아지화나트륨을 포함하는 완충액 C 중에서, 4℃로 보존하였다. 이 상태로 세정, 보존한 리액터는 2개월 이상 반복하여 사용 가능하였다.

예 4. 바실로라이신 MA/리신 리액터를 사용한 사람 혈장으로부터의 BL 앤지오스태틴의 1단계 정제 프로세스 (이소프로필 알코올을 사용하지 않는 방법)

구연산 처리한 사람 혈장을 15,000rpm으로, 20분간 원심기로 분리하고, 상청을 얻었다. 이하의 조작은 모두 4℃로 실시하였다. 예 2에서 제작한 본 발명의 바실로라이신 MA/리신 리액터 0.5 ㎖를 완충액 C로 평형화하였다. 이것에, 상기 상청 2.5 ㎖를 유속 0.1 ㎖/분으로 첨가하였다. 그 후, 15 ㎖의 0.5 M 염화나트륨을 함ㅇ유하는 완충액 C로 세정 (0.15 ㎖/분)한 후, 2.5 ㎖의 200 mM 아미노헥산산으로 용출하였다. 대부분의 BL 앤지오스태틴은 0 내지 1.5 ㎖의 용출액으로 용출하였다. BL 앤지오스태틴의 수량은 63 ㎍이고, 순도는 94%이었다 (도 1).

또한, 사용 후의 리액터는 1 M의 NaCl과 200 mm의 6-아미노헥산산을 포함하는 완충액 C 2.5 ㎖를 사용하여 세정하였다. 그 후, 0.02% 아지화나트륨을 포함하는 완충액 C 중에서, 4℃로 보존하였다. 이 상태로, 보존한 리액터는 2개월 이상 반복하여 사용 가능하였다.

얻은 BL 앤지오스태틴 중에서 4 ㎍을 정제수에 용해하여 10 ㎕으로 만들고, 이것에 10㎕의 샘플 완충액 (4% SDS, 10% 2-메르캅토에탄올, 20% 수크로스, 0. 004% 브롬페놀 블루을 포함하는 125 mM 트리스 염산 완충액, pH 6.8)을 가하고 그 중 10 ㎕를, 7.5% 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 전기 영동으로 분획한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루 R250로 염색하였다 (도 1).

예 5. BL 앤지오스태틴의 루이스 폐암에 대한 효과

·암종 및 암의 이식 방법, 시험 동물

루이스 폐암 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 이식하여 계대 유지하였다. 10∼14일째의 종양을 골라내어, 인산 완충 생리 식염수에 암세포를 현탁하였다. 5주령으로 구입하고, 그 후 1 주간 SPF 환경하에서 예비 사육한 BDF_l 마우스의 복부의 측부 피하에, 1 마리당 1×10⁵개의 세포를 포함하는 0.O5 ㎖의 세포 현탁액을 이식하였다. 이후의 실험도 모두 SPF 환경에서 실시하였다.

·약제 조제 방법, 투여 방법, 투여 조건

예 3의 방법으로 조제한 BL 앤지오스태틴을 동결 건조시키고, 이것을 정제수에 대하여, 2 시간, 3회 투석하였다. 얻은 용액을 동결 건조시키고, 20 ㎎/㎖가 되도록 생리 식염수에 용해하였다. 이 용액을 구멍 지름 0.22 ㎛의 필터를 사용하여 여과 멸균하였다. 이 용액을 역시 멸균 생리 식염수로 희석하고, 0.06 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖, 0.6 ㎎/㎖ 및 2 ㎎/㎖의 용액을 제작하였다. 루이스 폐암 세포를 이식한 다음날부터, 상기 BL 앤지오스태틴 용액을, 5 ㎖/㎏의 비율로 매일 1회 14일간 정맥 내에 투여하였다. 이것에 의하여, 각각의 투여량은 0.3, 1, 3 및 10 ㎎/㎏이 되었다. 대조군에는 생리 식염수를 동일한 용량으로 정맥 내에 투여하였다. 각 군의 동물수는 10 마리로 하였다.

·관찰 항목

투여 기간 중에는 종양의 크기 (단경 및 장경으로부터 종양 체적을 다음과 같이 산출: 단경의 2승×장경×0.52) 및 체중을 매일 측정하였다. 투여를 종료한 다음날, 에테르 마취하에 마우스를 치사시키고, 종양을 적출하여 그 습중량을 측정 하였다. 각 군의 최대 값 및 최소 값을 제외하고, 합계 8마리의 동물의 데이터를 통계 처리하였다. 유의차의 검정에는 던넷의 다중 비교 검정을 사용하고, 위험률 0.05% 이하를 유의차로 하였다. 또한, 대조군, 3 ㎎/㎏ 투여군 및 10 ㎎/㎏ 투여군의 대표예 각 3 개체로부터 얻은 종양에 대하여, 장경 및 단경의 측정, 세포 증식, 출혈, 괴사, 분열 세포의 조직학적 관찰 및 항(抗)폰 빌리브란트 인자 항체를 사용한 혈관 내피 세포의 면역 염색을 실시하였다.

·관찰 결과 및 고찰

대조군과 비교하여, 루이스 폐암 이식 후 10일째 이행, 3 및 10 ㎎/㎏ BL 앤지오스태틴 투여군에 있어서, 종양 체적이 유의하게 저하되었다 (도 2). 10 ㎎/kg 투여군에 있어서도, 모든 관찰 기간에서, 종양 체적은 대조군의 1/2 이하이었다. 0.3 및 1 ㎎/㎏ 투여군에 있어서도 종양 성장의 억제가 관찰되었다. 그러나 통계적으로 유의한 차이를 나타낸 것은 0.3 mg/㎏ 투여군에서 14 및 15일째이었고, 1 ㎎/㎏ 투여군에서 14일째이었다 (도 2). 또한, 이식 후 15일째에 종양을 적출하여, 그 습중량을 측정하였지만, BL 앤지오스태틴 투여군에서는 대조군과 비교하여, 50-70%의 값이 되었다 (도 3). 0.3, 3 및 10 ㎎/㎏투여군에 있어서의 차이는 통계적으로 유의한 차이였다. 한편, 사육 기간을 통하여 각 군의 체중에 유의한 차이는 볼 수 없었다 (도 4). 또한, 동물의 일반 상태도, 시험군간의 차이는 나타나지 않았다.

적출한 종양의 병리 조직학적 검사의 결과를 표 1에 정리하였다. 대조군에서는 세포 증식이 고도로 나타나고 (도 5A), 출혈이 가벼운 정도로 나타났으며 (도 5B), 괴사가 경미하게 (도 5B), 그리고 분열 세포가 중간 정도로 (도 5C) 인정되었 다. 또한, 항(抗)폰 빌리브란트 인자 항체에 의한 혈관 내피 세포의 면역 염색에서는 양성 세포의 비율이 가벼운 정도에서 중간 정도로 인정되었다 (도 5D). BL 앤지오스태틴 3 ㎎/㎏ 투여군에서는 세포 증식이 중간 정도로 (도 5E), 출혈이 경도에 (도 5F), 괴사가 경도에 (도 5F), 분열 세포가 중간 정도로 (도 5G), 폰 빌리브란트 인자 양성 세포의 비율이 경미한 정도에서 중간 정도로 (도 5H) 인정되었다. 또한, BL 앤지오스태틴 10 ㎎/㎏ 투여군에서는 세포 증식이 경미한 것에서부터 중간 정도로 (도 5I), 출혈이 경미한 정도에서부터 중간 정도로 (도 5J), 괴사가 가벼운 정도부터 고도한 정도로 (도 5J), 분열 세포가 경미한 정도에서 가벼운 정도로 (도 5K), 폰 빌리브란트 인자 양성 세포의 비율이 경미한 정도에서 가벼운 정도로 (도 5L) 인정되었다.

이상으로부터, 1일당 0.3 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏의 BL 안지오스태틴의 정맥내 투여는 피하 이식 루이스 폐암의 성장 억제에 유효하다는 것이 나타났다. 또한, 종양의 병리 조직학적 검사의 결과로부터, BL 안지오스태틴의 투여에 의하여, 종양세포의 분열 증식의 저하, 괴사의 증가가 일어나는 것이 나타났다. 또는 항(抗)폰 빌리브란트 인자 항체에 의한 혈관 내피 세포의 면역 염색에 의하여, BL 앤지오스태틴이 암의 신생 혈관을 억제하고 있는 것이 확인되고, 이 혈관 신생 저해 작용이 상술한 종양 세포의 분열 증식의 저하, 괴사의 증가를 가져오는 것으로 생각할 수 있다. 또한, 시험 동물의 체중이나 일반 상태에 영향을 주지 않기 때문에, BL 앤지오스태틴은 중대한 부작용을 초래하는 것으로 추측된다. 임상 예측성이 우수한 루이스 폐암의 성장을 억제함으로써, 다른 많은 암 (유방암, 폐암, 인두암, 췌장암, 간암, 결장암, 자궁암, 난소암 등 )에 대하여, 억제 효과를 나타내는 것으로 생각된다.

본 발명의 제암제는 유방암, 폐암, 인두암, 위암, 췌장암, 간암, 결장암, 자궁암, 난소암, 전립선암 등의 치료에 사용할 수 있다.

Claims (4)

1. BL 앤지오스태틴을 유효 성분으로서 함유하는 제암제.
2. 제1항에 있어서, BL 앤지오스태틴은 포유 동물에 유래하는 것인 제암제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, BL 앤지오스태틴은 사람 플라스미노겐의 Glu¹-Ser⁴⁴¹, Glu¹-Val⁴⁴⁹, pH e⁷⁵-Ser⁴⁴¹ 및 pH e⁷⁵-Val⁴⁴⁹ 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제암제.
4. 아래의 공정, 즉,

   아가로스 겔상에 바실로라이신 MA 및 라이신을 고정한 어피니티 트랩 리액터를 완충액으로 평형화하는 공정과,

   구연산 처리한 혈청을 첨가하는 공정과,

   염화나트륨를 포함하는 완충액으로 세정하는 공정 및 6-아미노헥산산으로 용출하는 공정

   으로 이루어지는 제1항에 기재된 BL 앤지오스태틴의 제조 방법으로서, 상기 완충액이 이소프로필 알코올을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 제조 방법.

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