JPWO2005054468A1 - 抗糖尿病剤の標的タンパク質及び対応する新規抗糖尿病剤「インスフル」 - Google Patents

Abstract

チアゾリジン誘導体等の抗糖尿病剤の分子標的を明らかにする。 スクリーニング候補物質を以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質に接触させる工程と、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、抗糖尿病剤と相互作用するタンパク質 上記候補物質と上記タンパク質との相互作用を検出する工程と、を備える抗糖尿病剤のスクリーニング方法。

Description

本発明は、公知の抗糖尿病剤の標的タンパク質及び当該タンパク質を用いた新規抗糖尿病剤のスクリーニング方法に関する。

糖尿病患者はＷＨＯの推計によれば、現在（２００３年）世界中で１億５０００万人であり、２０２５年には３億人に達するといわれている。現在の米国では人口の６％が糖尿病を罹患しており、糖尿病が原因となる合併症対策コストを合わせた関連医療費は９７年には９８０億ドルに達している。世界における経口血糖降下剤の市場は８０００億〜９０００億円と推定され、２０１０年には２兆〜３兆円に達するという推定もある。

日本では９８年の調査で患者数６９０万人であり、インスリンの効き目が低下し、糖尿病の予備軍とされる耐糖能異常を示す人を合わせると１３７０万人に達した。糖尿病の薬物療法にはインスリンのような注射型剤のほかに経口型薬剤があるが、合計は１８００億〜２１００億円と推定される。

糖尿病には、インスリン分泌が著しく低下したことによって発症するインスリン依存型糖尿病（１型）と、インスリン分泌はある程度保たれているものの、なお不足しているインスリン非依存型糖尿病（２型）とがある。２型糖尿病患者の増加は特に著しく、４０歳以上の人の１０％が罹患していると言われている。わが国では糖尿病の９０％以上がこの２型糖尿病患者である。２型糖尿病は、インスリン分泌不全とインスリン抵抗性とによる病態を特徴とする。２型糖尿病におけるインスリン作用不足は次の病因による。

・膵β−細胞からのインスリン分泌不足
・肝からの糖の放出の亢進
・筋や脂肪組織など末梢組織でのインスリン抵抗性
２型糖尿病の発症に対して、インスリン抵抗性は大きく関与しているのみならず、高血圧、肥満、高脂血症などとの関連性も指摘されている。最近になって糖尿病予防・治療においてインスリン抵抗性は特に重視されている。インスリン抵抗性は、血中にインスリンが存在していても、標的組織である肝、筋肉、脂肪組織などにおいて十分な作用が発現できない状態を意味している。インスリン抵抗性は、インスリンの感受性が低下し、正常なインスリン作用が阻害されているので、通常以上の量のインスリンを必要とする。肥満のない本態性高血圧患者においてインスリン感受性は３０〜４０％の低下と報告されており、肥満のある場合はさらに感受性は低下する。従って、インスリン抵抗性は本態性高血圧全体では５０〜６０％、肥満を伴う場合は７０〜８０％、空腹時中性脂肪高値を伴う場合は８０％が認められるとされている。

インスリン抵抗性には、遺伝因子のほか、肥満、糖尿病（特に肥満を伴ったインスリン非依存型糖尿病）、過食、運動不足、ストレス、妊娠、感染症、加齢、ステロイドの長期使用などの環境因子が関わっている。インスリン抵抗性は、インスリン受容体のインスリン結合能は正常だが、インスリン受容体遺伝子の異常などにより、細胞表面のインスリン受容体が高度に減少したり、チロシンキナーゼ活性が低下したために起こる。また、インスリン受容体に対する自己抗体が生じ、インスリン抵抗性を生じることもある。

インスリン抵抗性の発現は、膵臓のβ−細胞からのインスリン過分泌という形で見られる。すなわち生体はインスリン抵抗性に打ち勝つために、インスリンを多量に分泌するので血中インスリン値が高くなり、一般に高インスリン血症が見られることが多い。

インスリン抵抗性が加わっても、膵β−細胞のインスリン分泌予備能が十分であれば、代償性のインスリン分泌亢進によって作用の不足は起こらない。しかし、膵β−細胞側に何らかの障害があって、インスリン分泌不足になると代償は困難となり、インスリンの作用不足が起こり高血糖をきたす。さらに高血糖が持続すると、高血糖が二次的に膵のインスリン分泌を抑制することになり、肝や筋でのインスリン作用も低下させ、インスリン抵抗性を増加させるなどの悪循環を起こす。

インスリン抵抗性が長く続くと、高インスリン血症そのものが、インスリン受容体の数を減少させたり、受容体のβ−サブユニットのチロシンキナーゼ活性を低下させる。高インスリン血症自体がインスリン抵抗性を悪化させ、さらにインスリンの効果が低下することになる。

従来開発されてきた経口抗糖尿病剤には以下のようなものがある（薬効分類：３９６）。

１．インスリン分泌促進剤：
１−ａスルホニル尿素剤；トルブタミド（ヘキストラスチノン他）、クロルプロパミド（ダイヤビニーズ他）、アセトヘキサミド（ジメリン）、トラザミド（トリナーゼ）、グリクロピラミド（デアメリンＳ）、グリベンクラミド（オイグルコン、ダオニール他）、グリクラジド（グリミクロン他）
１−ｂスルホニルアミド剤；グリブゾール（グルデアーゼ）
２．インスリン抵抗性改善剤：
２−ａチアゾリジン剤；トログリタゾン（ノスカール）、ピオグリタゾン
２−ｂビグアナイド剤；ブホルミン（ジベトンＳ他）、トホルミン（グリコラン、メルヒケン）
３．食後過血糖改善剤：
３−ａα−グルコシダーゼ阻害剤；アカルボース（グルコバイ）、ボグリボース（ベイスン）
これら経口糖尿病薬には種々の問題点がある。スルホニル尿素剤は糖尿病と診断されたばかりの患者に最も普通に使われる薬剤であるが、運動療法や食事療法が不十分な場合、すい臓の疲弊を必要以上に早める。αグルコシダーゼ阻害剤は血糖値に対する影響が十分ではないという指摘がある。

一方、チアゾリジン誘導体はスルホニル尿素剤のようにインスリン分泌刺激作用を介さず、膵のβ−細胞の機能を保ちつつ、生体のインスリン感受性を増強させて、糖尿病状態で亢進しているインスリン標的臓器でのインスリン抵抗性を改善して、末梢での糖利用を促進し、肝での糖放出を抑制して血糖低下作用を示す。

チアゾリジン誘導体はインスリン受容体のインスリン結合部以降に作用してインスリン抵抗性を軽減し、肝における糖産生を抑制し、末梢組織における糖利用を高め血糖を低下させる。この作用は、インスリン抵抗性の主因である細胞内インスリン情報伝達機構を正常化することによると推測されるが、その分子標的は完全には明らかになっていない。

また、糖尿病は複数の遺伝子変異、環境の問題が集積した疾患であり、症状は似ていても、その根本原因に個人差がある。糖尿病の遺伝素因として明らかになっている遺伝子にＰＰＡＲγ、β３アドレナリン受容体、アディポネクチンがある。３者の異常はそれぞれインスリン抵抗性を増悪させる。抗糖尿病剤の分子標的を明らかにすることは、患者の遺伝情報に基づくオーダーメイド医療を開発するうえにおいても重要である。
ＷＹ ＦＵＪＩＭＯＴＯ"Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ．"Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ａｐｒ ２０００；１０８ Ｓｕｐｐｌ．６ａ：９Ｓ−１４Ｓ Ｍ Ｄｉａｍａｎｔ ａｎｄ ＲＪ Ｈｅｉｎｅ"Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ ｉｎ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ"Ｄｒｕｇｓ，Ｊａｎ ２００３；６３（１３）：１３７３−１４０５

しかしながら、チアゾリジン誘導体を始めとする抗糖尿病剤は、インスリン抵抗性に対して高い有効性を示すが、その薬理作用機序については明らかになっていないのが現状である。チアゾリジン誘導体等の抗糖尿病薬の薬理作用機序、特にチアゾリジン誘導体の分子標的が明らかになれば、さらに薬理作用の明らかな新規薬剤の開発が可能となる。

そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、チアゾリジン誘導体等の抗糖尿病薬の分子標的を明らかにし、新規抗糖尿病薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するために本発明者らが鋭意検討した結果、チアゾリジン誘導体の分子標的となるタンパク質を同定することができ、当該タンパク質を用いた新規なスクリーニング方法を開発することができ、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下を包含する。

（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示され、抗糖尿病剤の標的タンパク質。

（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、抗糖尿病剤と相互作用するタンパク質
（２）上記抗糖尿病剤はチアゾリジン誘導体であることを特徴とする（１）記載の標的タンパク質。

（３）上記チアゾリジン誘導体はピオグリタゾンであることを特徴とする（２）記載の標的タンパク質。

（４）γチュブリン・リング複合体タンパク質であることを特徴とする（１）記載の標的タンパク質。

（５）以下の（ａ）又は（ｂ）に示され、抗糖尿病剤の標的タンパク質をコードする遺伝子。

（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、抗糖尿病剤と相互作用するタンパク質
（６）上記抗糖尿病剤はチアゾリジン誘導体であることを特徴とする（５）記載の標的タンパク質をコードする遺伝子。

（７）上記チアゾリジン誘導体はピオグリタゾンであることを特徴とする（６）記載の標的タンパク質をコードする遺伝子。

（８）上記標的タンパク質はγチュブリン・リング複合体タンパク質であることを特徴とする（５）記載の標的タンパク質をコードする遺伝子。

（９）スクリーニング候補物質を以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質に接触させる工程と、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、抗糖尿病剤と相互作用するタンパク質
上記候補物質と上記タンパク質との相互作用を検出する工程と、
を備える抗糖尿病剤のスクリーニング方法。

（１０）上記抗糖尿病剤はチアゾリジン誘導体であることを特徴とする（９）記載の抗糖尿病剤のスクリーニング方法。

（１１）上記チアゾリジン誘導体はピオグリタゾンであることを特徴とする（１０）記載の抗糖尿病剤のスクリーニング方法。

（１２）上記標的タンパク質はγチュブリン・リング複合体タンパク質であることを特徴とする（９）記載の抗糖尿病剤のスクリーニング方法。

（１３）（９）乃至（１２）いずれか１記載のスクリーニング方法によってスクリーニングされ、上記タンパク質と相互作用を示す物質を主成分とする抗糖尿病剤。

（１４）一般式（Ｉ）

（上記式（Ｉ）中、Ｒ_１は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜７のシクロアルキル基、炭素数７〜１１のフェニルアルキル基、フェニル基、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選ばれる１又は２のヘテロ原子を含む５又は６員環のヘテロ環である。Ｌ_１及びＬ_２は、同一又は異なり、それぞれ水素又は炭素数１〜３のアルキル基であるか、若しくは、一緒になって炭素数２〜６のシクロアルキル基を形成する。ｍは１〜５のいずれかの整数を表す。）で表されるチアゾリジン誘導体。

（１５）上記式（Ｉ）中、Ｌ_１及びＬ_２は、一緒になって形成する炭素数２〜６のシクロアルキル基であることを特徴とする（１４）記載のチアゾリジン誘導体。

（１６）上記式（Ｉ）中、Ｒ_１は水素であり、Ｌ_１及びＬ_２は一緒になって形成する炭素数２〜６のシクロアルキル基であることを特徴とする（１４）記載のチアゾリジン誘導体。

（１７）上記式（Ｉ）中、Ｒ_１は炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｌ_１及びＬ_２は一緒になって形成する炭素数２〜６のシクロアルキル基であることを特徴とする（１４）記載のチアゾリジン誘導体。

（１８）５−｛４−［２−（１−メチル−シクロヘキシルオキシ）−エトキシ］−ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオンであることを特徴とする（１４）記載のチアゾリジン誘導体。

（１９）（１４）乃至（１８）いずれか１記載のチアゾリジン誘導体の薬理上許容される塩。

（２０）（１４）乃至（１８）いずれか１記載のチアゾリジン誘導体及び／又はその薬理上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。

（２１）抗糖尿病剤であることを特徴とする（２０）記載の医薬組成物。

（２２）一般式（ＩＩ）

（上記式（ＩＩ）中、Ｒ_１は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜７のシクロアルキル基、炭素数７〜１１のフェニルアルキル基、フェニル基、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選ばれる１又は２のヘテロ原子を含む５又は６員環のヘテロ環である。Ｌ_１及びＬ_２は、同一又は異なり、それぞれ水素又は炭素数１〜３のアルキル基であるか、若しくは、一緒になって炭素数２〜６のシクロアルキル基を形成する。ｍは１〜５のいずれかの整数を表す。ＸはＭｅＳＯ_２、ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ、ヨウ素、臭素、塩素及び水酸基からなる群から選ばれる一種である。）
で表される化合物と、一般式（ＩＩＩ）

で表される化合物とを縮合反応させる、チアゾリジン誘導体の製造方法。

本発明によれば、新規抗糖尿病剤のスクリーニングに使用することができる標的タンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子を提供することとができる。また、本発明によれば、当該標的タンパク質を用いることによって、抗糖尿病剤のスクリーニング方法を提供することができる。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−４０２１６４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

ピオグリタゾンとＦＬＪ１４７９７由来タンパク質との相互作用解析の結果を示す特性図である。 配列番号２に示すアミノ酸配列とＮＰ＿０５５２５９．１のアミノ酸配列とのアライメントを示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

チアゾリジン誘導体に対して相互作用を示すタンパク質
本発明に係るタンパク質は、抗糖尿病剤に対して相互作用を示すタンパク質である。このタンパク質は、特に、抗糖尿病薬の一種であるチアゾリジン誘導体（具体的にはピオグリタゾン）に対する相互作用を示す。ピオグリタゾンの構造式を以下に示す。

本発明に係るタンパク質と相互作用を示す抗糖尿病剤としては、チアゾリジン誘導体を挙げることができる。チアゾリジン誘導体としては、上記構造式に類似の構造式を有し、ピオグリタゾンと同様な薬理作用を有する化合物を挙げることができる。但し、タンパク質が相互作用を示すチアゾリジン誘導体としては、ピオグリタゾンに限定されず、例えばロシグリタゾン、トロゲリタゾン、シグリタゾン等を例示することができる。

本発明に係るタンパク質は、例えば、配列番号２に表すアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで、本発明に係るタンパク質としては、配列番号２に表すアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されず、配列番号２に表すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、且つ、チアゾリジン誘導体に対して相互作用を示すタンパク質も含んでいる。

アミノ酸の置換、欠失あるいは挿入の数及び部位は、その機能が保持される限り制限はないが、具体的には、配列番号２に表すアミノ酸配列において、１〜３０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失あるいは挿入されたアミノ酸配列であってもよい。

また、本発明に係るタンパク質としては、配列番号２に表すアミノ酸配列において、５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から構成され、且つ、チアゾリジン誘導体に対して相互作用を示すタンパク質であっても良い。ここで、上記相同性の数値は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。

なお、配列番号２に表されるタンパク質は、ＮＥＤＯ（新エネルギー・産業技術総合開発機構）タンパク質ｃＤＮＡ構造解析プロジェクト（Ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｄｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｂｉｐ／）においてＦＬＪ１４７９７として登録されたｃＤＮＡにコードされ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｑ９ＵＳＱ２、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ０９８７０．１及びＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０５５２５９．１と高い相同性（９３％）を示す。配列番号２に示すアミノ酸配列とＮＰ＿０５５２５９．１のアミノ酸配列とのアライメントを図２に示す。ＡＡＨ０９８７０．１及びＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０５５２５９．１は、γチュブリン・リング複合体タンパク質ＧＣＰ４遺伝子として知られている（Ｆａｖａ，Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ７６ｐ：Ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｇａｍｍａ−ｔｕｂｕｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７（４），８５７−８６８（１９９９））。したがって、本発明に係るタンパク質もまた、γチュブリン・リング複合体タンパク質ＧＣＰ４と機能的に非常に類似性の高いタンパク質であると考えられる。なお、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子については、ＷＯ０２０４５１４に公開されているが、その機能については未知であり、本発明の以前においてはチアゾリジン誘導体に対する相互作用を示すタンパク質をコードする遺伝子であることは知られていない。

一方、本発明に係る遺伝子、すなわち、本発明に係るタンパク質をコードするｃＤＮＡ（ＦＬＪ１４７９７）の塩基配列としては、例えば、配列番号１に示す塩基配列を挙げることができるが、この塩基配列に限定されるものではない。例えば、配列番号１に示す塩基配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするようにコドンを変更させた塩基配列であっても良い。また、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイするような塩基配列からなり、且つチアゾリジン誘導体に対して相互作用を示すタンパク質をコードする塩基配列も本発明に係る遺伝子に含まれる。

ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。

チアゾリジン誘導体と本発明に係るタンパク質との相互作用
以下、チアゾリジン誘導体と本発明に係るタンパク質の相互作用について説明する。

糖尿病におけるインスリン作用の不足の原因は、膵臓からのインスリン分泌量の低下、及び肝臓や筋肉におけるインスリン感受性の低下（インスリン抵抗性）の二つの機序に大別されるが、肝臓や筋肉におけるインスリン作用は以下のような細胞内機構に基づく。すなわち、インスリンが細胞表面のインスリン受容体に結合するとチロシンキナーゼが活性化され、インスリン受容体の自己リン酸化が起こる。さらに、インスリン受容体のリン酸化チロシンに細胞内基質であるＩＲＳ−１が結合し、インスリン受容体によってＩＲＳ−１のチロシンがリン酸化される。次にＩＲＳ−１のリン酸化チロシンにＰＩ３キナーゼが結合し、活性化される。活性化されたＰＩ３キナーゼは、ＰＩをＰＩ（３）Ｐに、ＰＩ（４）ＰをＰＩ（３，４）Ｐ２及びＰＩ（３，４，５）Ｐ３にリン酸化する。

ＰＩ３キナーゼによる細胞内シグナルは、たとえばＧＬＵＴ４を含む小胞に伝えられ、ＧＬＵＴ４が細胞表面にトランスロケートされてグルコースの細胞内への取り込みが促進されるものと考えられている。一方、Ｋａｐｅｌｌｅｒら（ＪＢＣ，Ｖｏｌ．２７０，ｐｐ．２５９８５−２５９９１，１９９５）及びＩｎｕｋａｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．Ｖｏｌ．３４６，ｐｐ．４８３−４８９，２００３）はヒトＡ４３１細胞あるいはＣＨＯ細胞を用いた実験ではあるが、インスリン刺激により、ＰＩ３キナーゼがγチュブリンと結合することを報告している。γチュブリンは小さなチュブリンを含み中心体に多く局在している。中心体はほぼすべての動物細胞に存在する微小管形成中心であり、細胞周期の間期には核膜の外側に接して存在しているが、間期に倍加、二等分され、有糸分裂の開始時に両側に移動して紡錘体のふたつの極になる。Ｋａｐｅｌｌｅｒらは、ＰＩ３キナーゼがインスリン刺激による微小管形成を介して、脂肪細胞等の分化増殖に影響する可能性を示唆している。

上述したように、本発明に係るタンパク質は、γチュブリン・リング複合体タンパク質ＧＣＰ４と機能的に非常に類似性の高いタンパク質であると考えられるため、チアゾリジン誘導体が結合することにより、γチュブリンとＰＩ３キナーゼの結合を増強する可能性が考えられる。

一方、チアゾリジン誘導体がペルオキシソーム増殖薬活性化受容体、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ）γのリガンドとなる可能性がしめされて以来、これらのインスリン感受性改善薬がＰＰＡＲγを介するどのような機構で薬理作用を発現するのかに注目が集まっている。ＰＰＡＲは核内ホルモン受容体スーパーファミリーのひとつであり、リガンドの結合により活性化されるとｒｅｔｉｎｏｉｄ−Ｘ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−α（ＲＸＲα）と複合体を形成し、転写因子として標的遺伝子の上流にある特異的応答配列（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＰＰＲＥ）に結合して遺伝子の発現を誘導する。ＰＰＡＲの名称の由来となったペルオキシソーム増殖薬（ＰＰ）とは、細胞内顆粒ペルオキシソームを増殖させるという共通した作用を持つ一群の化学物質につけられた総称である。発見当初、ＰＰＡＲはＰＰの多面的な効果（ペルオキシソーム増殖、酵素誘導、発癌）を仲介する受容体と考えられたが、リガンド探索、標的遺伝子探索を含むその後の広範な研究から、脂質代謝を含む多くの生理機能の重要な調節因子であることが明らかになってきた。

ＰＰＡＲにはサブタイプがあり、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ（ＰＰＡＲδあるいはＮＵＣ１とも呼ばれる）及びＰＰＡＲγ（転写開始点とａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇの違いによりＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２がある）と呼ばれている。ある化学物質（リガンド）がＰＰＡＲを活性化させる能力はサブタイプによって異なり、しかも各サブタイプの発現は組織により大きく異なる。ＰＰＡＲαは肝臓、心筋、腸及び腎近位尿細管での発現が高い。ＰＰＡＲβは広い組織に発現しており、α及びγよりもそのレベルが高い場合もある。ＰＰＡＲγは主に脂肪組織及び免疫系で発現している。こうした組織分布の違いは、ＰＰＡＲサブタイプが異なる生理的役割を持つことを示唆している。

ＰＰＡＲの標的遺伝子が明らかになるにつれ、ＰＰＡＲαが主に肝臓及び心筋などにおける脂質酸化に関わる種々の遺伝子の発現を制御することが分かって来た。一方、ＰＰＡＲγは脂肪組織に高発現しており、白色脂肪組織における脂肪細胞分化終末における転写因子としての機能を持っている。ＰＰＡＲγ２は脂肪細胞の脂肪酸結合タンパクａＰ２をｔｒａｎｓ ａｃｔｉｖａｔｅする特異的転写因子ＡＲＦ−６の１成分としてクローニングされた。またＰＰＡＲγ２／ＲＸＲαはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の脂肪細胞特異的発現を誘導してグリセロール生成をもたらす。ＡＰ２及びＰＥＰＣＫの両遺伝子は脂肪細胞分化終末の指標であり、ＰＰＡＲγによりそれらが制御されることは、この受容体が脂肪細胞の表現型維持に重要な役割を果たすことを示している。しかしながら、チアゾリジン誘導体とＰＰＡＲγを直接結びつける明確な機構はまだ良く分かっていない。また、ＣＢＰ〔ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ）ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ〕のヘテロ欠損マウスが、ＰＰＡＲγヘテロ欠損マウス以上に強い抗肥満・抗糖尿病の表現型を呈することから、ＰＰＡＲγ非依存性の抗肥満・抗糖尿病の新規な情報伝達経路が存在することが示唆されている。

一方、脂肪細胞組織特異的に高発現する遺伝子の産物として発見されたアディポネクチンの欠乏も、肥満、２型糖尿病のインスリン抵抗性の重要な原因のひとつであると考えられている。これはインスリン感受性が良好なＰＰＡＲγヘテロ欠損マウスでアディポネクチンの発現が亢進していること、及びアディポネクチン遺伝子は日本人の２型糖尿病の主要な疾患感受性遺伝子であることに基づくものである。アディポネクチンは白色脂肪細胞由来の主要なインスリン感受性ホルモンであり、アディポネクチンを補充することにより、脂肪萎縮性糖尿病のインスリン抵抗性が改善される。２型糖尿病患者ではアディポネクチン不足によりインスリン抵抗性が惹起され、アディポネクチンの補充によりインスリン抵抗性が改善されるものと考えられる。また、アディポネクチンホモ欠損マウスは耐糖能低下を示すことから、アディポネクチンは生体内で抗糖尿病因子として作用していると予想される。さらに、インスリン抵抗性を呈する脂肪萎縮性糖尿病マウスやＫＫＡｙマウスへのアディポネクチンの投与実験、あるいは肥満・インスリン抵抗性のモデルマウスであるｏｂ／ｏｂマウスとアディポネクチン過剰発現トランスジェニックマウスとの掛け合わせ実験において、アディポネクチンを投与すると脂肪酸燃焼やエネルギー浪費に関わる因子の発現が増加する。これは、これらの遺伝子を標的とするＰＰＡＲαの発現量、及びＰＰＡＲαの内因性リガンド活性自体がアディポネクチン投与により増加することによる可能性が報告されている（山内ら、分子糖尿病学の進歩−基礎から臨床まで−２００３、ｐｐ．９７−１０６、金原出版）。

一方、Ｓｕｒａｐｕｒｅｄｄｉら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１１８３６−１１８４１，２００２）は、ラットの肝組織抽出液を用い、ＰＲＩＣ複合体と呼ばれるコアクチベータがＰＰＡＲαと結合してその作用を増強すること、さらにＧＳＴタグをつけたＰＰＡＲαをバイトとしたプルダウンアッセイにより、ＰＲＩＣ複合体のなかでもＴＯＧとよばれるチュブリン結合タンパク質がＰＰＡＲαと結合することを見出している。また、Ｓｐｉｔｔｌｅら（ＪＢＣ，Ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．２０７４８−２０７５３，２０００）は、ＴＯＧタンパク質はγチュブリンリング複合体と非常に類似した微小管構造に結合することを報告している。

これらの情報と本発明者らの結果を総合すると、ピオグリタゾンはγチュブリン・リング複合体との結合を介してγチュブリン・リング複合体−ＴＯＧ−ＰＰＡＲαの３者間の相互作用を増強することにより、アディポネクチンの作用をミミックして２型糖尿病患者のインスリン抵抗性を改善する可能性が考えられる。またあるいは、ＰＰＡＲγに対してもＴＯＧタンパク質に類似のタンパク質が存在すると想定した場合、ピオグリタゾンがγチュブリン・リング複合体−ＴＯＧ−ＰＰＡＲγの３者間の相互作用を亢進して、ＰＰＡＲγを活性化する可能性も考えられる。

以上のように、本発明者らは、チアゾリジン誘導体の分子標的のひとつがγチュブリン・リング複合体であり、チアゾリジン誘導体がγチュブリンリング複合体との結合を介して、ＰＩ３キナーゼのシグナル及び／又はＰＰＡＲαの作用を増強することにより、インスリン感受性を向上させ、インスリン抵抗性に対する治療効果を示す可能性があることを見出した。

本発明に係るタンパク質を用いたスクリーニング方法
以上説明したように、チアゾリジン誘導体と本発明に係るタンパク質との相互作用から、本発明に係るタンパク質を使用して、新規抗糖尿病薬のスクリーニング方法を確立することができる。

スクリーニング方法は、上述した本発明に係るタンパク質に対してスクリーング候補物質を接触させる工程の後、当該候補物質と当該タンパク質との相互作用の有無を検出する工程とを備える。

スクリーニング候補物質としては特に限定されないが、各種の低分子化合物、タンパク質を挙げることができる。

スクリーニング候補物質と本発明に係るタンパク質とを接触させる方法としては、特に限定されず、候補物質と対象物質との二分子間の相互作用を解析する方法と知れられる如何なる方法も使用することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｓｅ：ＳＰＲ）の原理を応用したリアルタイムでの相互作用解析を行う装置、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ビアコア社製）等を使用する方法や、非修飾かつ非固定で２種の分子間相互作用を分析する手法として、クロマトグラフィーを用いた手法（米国特許公報４，７６２，６１７）を挙げることができる。さらに、Ｙ．Ｄｕｎａｙｅｖｓｋｉｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｖｏｌ．１１，１１７８−１１８４（１９９７）に記載された方法や、Ｆ．Ｊ．Ｍｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７３，５７１−５８１（２００１）に記載された方法、国際公開公報ＷＯ ００／４７９９９に記載された方法、特許公表公報第２００２−５０８５１５号に記載された方法、特許公表公報第２００３−５０２６６５号に記載された方法を適宜使用することができる。

また、水晶発振子等のその他の表面プラズモン共鳴法、Ｃｏｕｐｌｅｄ ｗａｖｅｇｕｉｄｅプラズモン共鳴法、二面偏波式干渉法、カロリメトリー法、遠心沈降法、キャピラリー電気泳動法、エナジートランスファー法、蛍光偏向法、蛍光相関分析法、プロテインチップ、化合物チップ等の方法も適宜使用することができる。

本スクリーニング方法によって、本発明に係るタンパク質と間で相互作用を有すると判断された候補物質は、チアゾリジン誘導体と同様な薬理作用機序を有する新規な抗糖尿病薬としてスクリーニングされたこととなる。

スクリーニングされた新規化合物
上記スクリーニング方法によって、抗糖尿病薬の候補物質として下記一般式（Ｉ）で表されるチアゾリジン誘導体を同定した。なお、下記一般式（Ｉ）で表される化合物は新規物質である。

（上記式（Ｉ）中、Ｒ_１は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜７のシクロアルキル基、炭素数７〜１１のフェニルアルキル基、フェニル基、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選ばれる１又は２のヘテロ原子を含む５又は６員環のヘテロ環である。Ｌ_１及びＬ_２は、同一又は異なり、それぞれ水素又は炭素数１〜３のアルキル基であるか、若しくは、一緒になって炭素数２〜６のシクロアルキル基を形成する。ｍは１〜５のいずれかの整数を表す。）
具体的に上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、例えば、下記式Ａ−１で表される５−｛４−［２−（１−メチル−シクロヘキシルオキシ）−エチロキシ］−ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオンを挙げることができる

また、上記式（Ｉ）で表される化合物としては、上記Ａ−１に限定されず、下記式Ａ−２及びＡ−３を例示することができる。

上記式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（ＩＩ）

（上記式（ＩＩ）中、Ｒ_１、Ｌ_１及びＬ_２は上記式（Ｉ）と同じ定義である。ＸはＭｅＳＯ_２、ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ、ヨウ素、臭素、塩素及び水酸基からなる群から選ばれる一種である。）で表される化合物と、下記式（ＩＩＩ）

で表される化合物とを縮合反応させることで製造することができる。

例えば上記のＡ−１で表される化合物の製造方法を説明する。先ず、以下のようにして（１−メチル−シクロヘキシル）−ｔｅｒｔ−酢酸ブチルエステル（２）を合成する。

具体的には、窒素雰囲気下、氷冷した水素化ホウ素ナトリウム（油性；６０ｗｔ％３００ｍｇ）を含むＴＨＦ／ＤＭＦ（５／１）混液４０ｍＬの懸濁溶液へ、化合物（１）（７１３ｍｇ、６．２ｍｍｏｌ）を攪拌しながらゆっくりと加え、その後１０分間攪拌する。続いて氷浴を取り除き、室温で３０分間攪拌する。攪拌収量後再び氷冷する。次に、ブロモ酢酸ｔ−ブチルエステル（２．２５ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ）を加える。添加終了後、氷浴を取り除き、室温にて２時間攪拌する。その後、再び氷冷し、反応液へ水（１ｍＬ）をゆっくりと加える。反応液へ水、酢酸エチルを注ぎ、良く攪拌した後、有機相を集める。さらに酢酸エチルから抽出する。有機相を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下ろ過濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフにより精製し、化合物（２）（^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１．２８−１．３８（１３Ｈ，ｍ），１．４０（９Ｈ，ｓ），４．０２（２Ｈ，ｓ））を合成することができる。

次に、以下のようにして、化合物（２）から２−（１−メチル−シクロヘキシル）−エタノール（３）を合成する。

具体的には、窒素雰囲気下、氷冷した水素化アルミニウムリチウム（３０４ｍｇ、８ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ懸濁溶液４ｍＬに、化合物（２）（２５４ｍｇ、２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２ｍＬを攪拌しながらゆっくりと加える。添加終了後、反応容器を６０℃に加温し、２時間攪拌する。攪拌終了後、再び氷冷し、反応液へ飽和硫酸ナトリウム水溶液を水素の発生がなくなるまでゆっくりと加える。セライト上で残渣をろ過し、残渣を酢酸エチルで洗浄する。ろ液と洗浄液を合わせ、減圧下濃縮する。粗精製品をシリカゲルカラムクロマトグラフにより精製することで化合物（３）（^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１．２８−１．３８（１３Ｈ，ｍ），３．５０−３．７５（４Ｈ，ｍ））を合成することができる。

次に、以下のようにして、化合物（３）から５−｛４−［２−（１−メチル−シクロヘキシルオキシ）−エトキシ］−ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（Ａ−１）を合成する。

具体的には、窒素雰囲気下、化合物（３）（１５８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）のトルエン（２ｍＬ）溶液にトリブチルホスフィン（２３４ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌する。続いて、この溶液を、５−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−チアゾリジン−２，４−ジオン（２４６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）と１，１’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド）（２００ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）とを含むトルエン（２ｍＬ）溶液に室温にて加え、終夜攪拌する。攪拌終了後、さらに酢酸エチルを加え、残渣をセライト上でろ別する。残渣を更に酢酸エチルで洗浄し、ろ液と洗浄液を合わせる。減圧下濃縮し、粗精製品をシリカゲルカラムクロマトグラフにより精製することで、化合物（Ａ−１）（^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１．２８−１．３８（１３Ｈ，ｍ），３．４６（２Ｈ，ｄ），３．７９（２Ｈ，ｔ），４．１１（２Ｈ，ｔ），４．１３（１Ｈ，ｔ），６．７２（２Ｈ，ｄ），７．００（２Ｈ，ｄ））を合成することができる。

なお、出発原料として化合物（１）の代わりにシクロヘキサノールを使用する以外は、上述した合成方法と同様に各反応を行うことによって、上述した化合物Ａ−２（^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１．２８−１．４２（１０Ｈ，ｍ），２．８５（１Ｈ，ｍ），３．４６（２Ｈ，ｄ），３．７９（２Ｈ，ｔ），４．１１（２Ｈ，ｔ），４．１３（１Ｈ，ｔ），６．７０（２Ｈ，ｄ），７．００（２Ｈ，ｄ））を合成することができる。また、出発原料としてシクロペンタノールを使用する以外は、上述した合成方法と同様に各反応を行うことによって、上述した化合物Ａ−３（^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：１．５１−１．６０（８Ｈ，ｍ），２．８５（１Ｈ，ｍ），３．４６（２Ｈ，ｄ），３．７９（２Ｈ，ｔ），４．１１（２Ｈ，ｔ），４．１０（１Ｈ，ｔ），６．７２（２Ｈ，ｄ），７．００（２Ｈ，ｄ））を合成することができる。

一方、上記一般式（Ｉ）で表される新規化合物は、薬理上許容される塩としてもよい。「薬理上許容される塩」としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸又はリン酸等の無機酸の塩；パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸又はクエン酸等の有機酸の塩；アンモニウム、トリメチルアンモニウム又はトリエチルアンモニウム等の有機塩基の塩；ナトリウム又はカリウム等のアルカリ金属の塩；ヨウ化メチル、ヨウ化エチル等のハロゲン化アルキルとの四級塩；及びカルシウム又はマグネシウム等のアルカリ土類金属の塩等を挙げることができる。新規化合物（Ｉ）としては、その水和物を含む意味であり、化合物（Ｉ）に対して任意の数の水分子を配位していてもよい。また、新規化合物（Ｉ）としてはそのプロドラッグを含み意味である。プロドラッグとは、生体内で代謝的に分解される基を有する新規化合物（Ｉ）の誘導体であり、生体内での代謝過程により、新規化合物（Ｉ）に変換されることで薬理作用を発現する化合物である。適当なプロドラッグ誘導体を選択する方法及び製造する方法は、例えばＤｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９８５に記載されている。

例えば、新規化合物（Ｉ）がカルボキシを有する場合は、当該カルボキシと適当なアルコールを反応させることによって製造されるエステル誘導体、又は当該カルボキシと適当なアミンを反応させることによって製造されるアミド誘導体のようなプロドラッグが例示される。例えば、新規化合物（Ｉ）がヒドロキシを有する場合は、例えば当該ヒドロキシと適当なアシルハライド又は適当な酸無水物とを反応させることに製造されるアシルオキシ誘導体のようなプロドラッグが例示される。例えば、新規化合物（Ｉ）がアミノを有する場合は、そのアミノと適当な酸ハロゲン化物又は適当な混合酸無水物とを反応させることにより製造されるアミド誘導体のようなプロドラッグが例示される。

新規化合物（Ｉ）が不斉炭素原子を有する場合には、ラセミ体、両対掌体及び全ての立体異性体（ジアステレオマー）を含む。また、新規化合物（Ｉ）が二重結合を有する場合には、二重結合の置換基配置につき、幾何異性体が存在するときはそのいずれをも含む。

以上のような新規化合物（Ｉ）は、新規な抗糖尿病薬として作用を有する医薬組成物となる。当該医薬組成物を抗糖尿病薬として投与する場合、経口的、非経口的のいずれの方法でも投与することができる。経口投与は常法に従って錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、液剤、シロップ剤、バッカル剤又は舌下剤等の通常用いられる剤型に調製して投与すればよい。非経口投与は、例えば筋肉内投与、静脈内投与等の注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等、通常用いられるいずれの剤型でも好適に投与することができる。

また、当該医薬組成物の有効量に対して、剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤とを必要に応じて混合し医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。具体的には、賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウムもしくは結晶セルロース等、結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンもしくはポリビニルピロリドン等、崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末もしくはラウリル硫酸ナトリウム等、滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴールもしくはメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤もしくは乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良く、経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。

新規化合物（Ｉ）の抗糖尿病薬としての投与量は、患者の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路等を考慮した上で設定することが望ましいが、成人に経口投与する場合、通常１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは５〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。非経口投与の場合には投与経路により大きく異なるが、通常０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましく１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。これを１日１回〜数回に分けて投与すれば良い。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

［参考例１］ヒト完全長ｃＤＮＡクローンからのタンパク質発現方法
１．発現プラスミドの作成
ヒト完全長ｃＤＮＡクローンの目的遺伝子に対して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙシステムを用いキットのプロトコールに従い、ＰＣＲクローニングベクターＧａｔｅｗａｙｐＤＯＮＲ２０１とＢＰ反応を行うことによりエントリーベクターを得た。Ｇａｔｅｗａｙシステムのデスティネーションベクターとしては、東洋紡績（株）の小麦胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成システム（ＰＲＯＴＥＩＯＳ）に適応するｐＥＵ３−ＮＩＩ（東洋紡績）を基にして、Ｇａｔｅｗａｙシステムが利用できるようＧａｔｅｗａｙ組換え配列を有するＧａｔｅｗａｙカセットを導入し、さらに発現タンパク質のＮ末端領域にヒスチジンタグとＦＬＡＧタグ配列を有するペプチドが発現するようにＰＣＲ法を用いて改変したダブルタグデスティネーションベクターを作成した。

作成したダブルタグデスティネーションベクターとエントリーベクターを用い、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙシステムを用いプロトコールに従いＢＰ反応を実施し、大腸菌コンピテントセルＤＨ５αに形質転換し、発現ベクターが導入されたクローンを選択した。得られたクローンからＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（キアゲン）を用いて、キットのプロトコールに従ってプラスミドを調製した。得られたプラスミドは、ＰＲＯＴＥＩＯＳ（東洋紡績）のプロトコールに従い、フェノール・クロロホルム処理を行いＲＮＡ分解酵素の不活化処理を施し、精製発現プラスミドを得た。

２．精製タンパク質の取得
東洋紡績（株）の小麦胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成システム（ＰＲＯＴＥＩＯＳ）により組換えタンパク質を合成した。上記１．に記載した方法で取得した発現プラスミドからＰＲＯＴＥＩＯＳのプロトコールに従いｍＲＮＡを作成した。取得したｍＲＮＡを２０μｇ使用し、９６穴マイクロタイタープレートの２穴分でＰＲＯＴＥＩＯＳのプロトコールに従いタンパク質を合成させた。合成したタンパク質は、高速遠心分離処理により沈殿を除去し、取得した可溶性の画分を抗ＦＬＡＧタグ抗体を固定化したＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｎｉｔｙ Ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ社）を用い、プロトコールに従い精製を行い、精製タンパク質を得た。

［参考例２］ビアコアを用いたヒトタンパク質−医薬品相互作用における結合解離定数の決定方法
ビアコア社市販のＳ５１用ＣＭ５センサーチップを１Ｍ ＥＤＣ，１．３３Ｍ ＮＨＳ及び１６ｍｇ／ｍｌ ＡＢ−ＮＴＡ（ｐＨ９．２）を用いてセンサーチップ表面のＮＴＡ化を施し、Ｓ５１用ＮＴＡセンサーチップとした。これに小麦胚芽系で発現させ、ＦＬＡＧ ｔａｇで精製した蛋白質を固定化した。固定化は、０．５Ｍ ＮｉＣｌ_２、０．４Ｍ ＥＤＣ、０．１Ｍ ＥＤＣ、リガンド溶液（蛋白質）、１Ｍ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ｐＨ８．５を順次、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ５１の流路系にインジェクションして行った。固定化の際のＲｕｎｎｉｎｇ ＢｕｆｆｅｒはＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた。リガンドが固定化されたセンサーチップを用いて以下のＡｓｓａｙを行った。Ｒｕｎｎｉｎｇ ＢｕｆｆｅｒとしてＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）、０．００５％ Ｐ_２０、１００ｕＭ ｍｉｎｅｒａｌ ｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｃａ（ＯＡｃ）_２、Ｚｎ（ＯＡｃ）_２・２Ｈ_２Ｏ、Ｃｕ（ＯＡｃ）_２・Ｈ_２Ｏ、Ｃｏ（ＯＡｃ）_２・４Ｈ_２Ｏ、Ｍｎ（ＯＡｃ）_２・４Ｈ_２Ｏ、Ｍｇ（ＯＡｃ）_２・４Ｈ_２Ｏ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）にＤＭＳＯをｆｉｎａｌ５％になるように加えて調製したものを用いた。測定化合物は６２．５ｕＭ〜０．２４４ｕＭまで１／２希釈ずつ９ｐｏｉｎｔ調製した。溶媒の組成がＲｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと同様になるように調製し、０濃度測定として化合物の含まれていない溶媒だけのものを調製した。また、化合物溶液、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中に含まれるＤＭＳＯの効果の補正（ｓｏｌｖｅｎｔ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）として、３．８−５．１％のＤＭＳＯ（８ｐｏｉｎｔ）を含むＲｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと同様の溶液を調製し、これらの測定結果をもとにして補正を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ５１のＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙプログラムを実施し、固定化されたリガンド（蛋白質）とアナライト（化合物；６２．５ｕＭ〜０．２４４ｕＭ）の相互作用を測定し、専用ソフトウェアにて解析を行った。

［実施例１］ピオグリタゾンとＦＬＪ１４７９７由来タンパク質の相互作用解析
参考例１の方法に従ってＦＬＪ１４７９７よりタンパク質の発現精製を行い、参考例２の方法に従ってピオグリタゾンとＦＬＪ１４７９７から発現精製したタンパク質の相互作用を解析した。結果を図１に示した。ピオグリタゾンの用量に依存して結合量が増大し、かつ高用量では結合の飽和がみられることから、特異的な相互作用であることが確認された。ＢｉａｃｏｒｅＳ５１専用ソフトウェアを用いて結合解離定数を算出したところ、ＫＤ＝９．０３８×１０^−６Ｍであった。

図１に示した結果から、ピオグリタゾンとＦＬＪ１４７９７由来タンパク質とが相互作用することが明らかとなった。したがって、ＦＬＪ１４７９７由来タンパク質は、抗糖尿病薬として知られているピオグリタゾン（チアゾリジン誘導体）の標的タンパク質であることが判明した。このことより、ＦＬＪ１４７９７由来タンパク質とスクリーニング候補物質とを作用させることで、新規抗糖尿病剤のスクリーニングを行うことができる。すなわち、ＦＬＪ１４７９７由来タンパク質と候補物質との相互作用を、例えば参考例２の方法で検出するような系を構築することによって、新規抗糖尿病薬のスクリーニングを行うことができる。

［実施例２］新規化合物（Ｉ）とＦＬＪ１４７９７由来タンパク質の相互作用解析
実施例１で使用したピオグリタゾンに代えて上述した化合物Ａ−１、Ａ−２及びＡ−３を使用した以外は、実施例１と同様にしてＦＬＪ１４７９７由来タンパク質と各化合物との相互作用を解析した。実施例１と同様に算出されたＫＤ値を表１に示す。

表１から判るように、いずれの化合物おいてもＦＬＪ１４７９７由来タンパク質に対する特異的な相互作用がみられた。この結果より、上述した一般式（Ｉ）で表される化合物がＦＬＪ１４７９７由来タンパク質すなわちγチュブリン・リング複合体タンパク質に対して相互作用を示すことが明らかとなった。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (22)

1. 以下の（ａ）又は（ｂ）に示され、抗糖尿病薬の標的タンパク質。
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、抗糖尿病薬と相互作用するタンパク質
2. 上記抗糖尿病薬はチアゾリジン誘導体であることを特徴とする請求項１記載の標的タンパク質。
3. 上記チアゾリジン誘導体はピオグリタゾンであることを特徴とする請求項２記載の標的タンパク質。
4. γチュブリン・リング複合体タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の標的タンパク質。
5. 以下の（ａ）又は（ｂ）に示され、抗糖尿病薬の標的タンパク質をコードする遺伝子。
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、抗糖尿病薬と相互作用するタンパク質
6. 上記抗糖尿病薬はチアゾリジン誘導体であることを特徴とする請求項５記載の標的タンパク質をコードする遺伝子。
7. 上記チアゾリジン誘導体はピオグリタゾンであることを特徴とする請求項６記載の標的タンパク質をコードする遺伝子。
8. 上記標的タンパク質はγチュブリン・リング複合体タンパク質であることを特徴とする請求項５記載の標的タンパク質をコードする遺伝子。
9. スクリーニング候補物質を以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質に接触させる工程と、
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、抗糖尿病薬と相互作用するタンパク質
   上記候補物質と上記タンパク質との相互作用を検出する工程と、
   を備える抗糖尿病薬のスクリーニング方法。
10. 上記抗糖尿病薬はチアゾリジン誘導体であることを特徴とする請求項９記載の抗糖尿病薬のスクリーニング方法。
11. 上記チアゾリジン誘導体はピオグリタゾンであることを特徴とする請求項１０記載の抗糖尿病薬のスクリーニング方法。
12. 上記標的タンパク質はγチュブリン・リング複合体タンパク質であることを特徴とする請求項９記載の抗糖尿病薬のスクリーニング方法。
13. 請求項９乃至１２いずれか一項記載のスクリーニング方法によってスクリーニングされ、上記タンパク質と相互作用を示す物質を主成分とする抗糖尿病薬。
14. 一般式（Ｉ）
    

    

    （上記式（Ｉ）中、Ｒ_１は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜７のシクロアルキル基、炭素数７〜１１のフェニルアルキル基、フェニル基、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選ばれる１又は２のヘテロ原子を含む５又は６員環のヘテロ環である。Ｌ_１及びＬ_２は、同一又は異なり、それぞれ水素又は炭素数１〜３のアルキル基であるか、若しくは、一緒になって炭素数２〜６のシクロアルキル基を形成する。ｍは１〜５のいずれかの整数を表す。）で表されるチアゾリジン誘導体。
15. 上記式（Ｉ）中、Ｌ_１及びＬ_２は、一緒になって形成する炭素数２〜６のシクロアルキル基であることを特徴とする請求項１４記載のチアゾリジン誘導体。
16. 上記式（Ｉ）中、Ｒ_１は水素であり、Ｌ_１及びＬ_２は一緒になって形成する炭素数２〜６のシクロアルキル基であることを特徴とする請求項１４記載のチアゾリジン誘導体。
17. 上記式（Ｉ）中、Ｒ_１は炭素数１〜１０のアルキル基であり、Ｌ_１及びＬ_２は一緒になって形成する炭素数２〜６のシクロアルキル基であることを特徴とする請求項１４記載のチアゾリジン誘導体。
18. ５−｛４−［２−（１−メチル−シクロヘキシルオキシ）−エトキシ］−ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオンであることを特徴とする請求項１４記載のチアゾリジン誘導体。
19. 請求項１４乃至１８いずれか１項記載のチアゾリジン誘導体の薬理上許容される塩。
20. 請求項１４乃至１８いずれか１項記載のチアゾリジン誘導体及び／又はその薬理上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
21. 抗糖尿病薬であることを特徴とする請求項２０記載の医薬組成物。
22. 一般式（ＩＩ）
    

    

    （上記式（ＩＩ）中、Ｒ_１は、水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜７のシクロアルキル基、炭素数７〜１１のフェニルアルキル基、フェニル基、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選ばれる１又は２のヘテロ原子を含む５又は６員環のヘテロ環である。Ｌ_１及びＬ_２は、同一又は異なり、それぞれ水素又は炭素数１〜３のアルキル基であるか、若しくは、一緒になって炭素数２〜６のシクロアルキル基を形成する。ｍは１〜５のいずれかの整数を表す。ＸはＭｅＳＯ_２、ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ、ヨウ素、臭素、塩素及び水酸基からなる群から選ばれる一種である。）
    で表される化合物と、一般式（ＩＩＩ）
    

    

    で表される化合物とを縮合反応させる、チアゾリジン誘導体の製造方法。

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