JPWO2005045029A1 - パクリタキセル療法による副作用を予測する方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
パクリタキセル療法による副作用を低下させる方法として、患者の遺伝子を分析することにより副作用を予測し、その薬剤の使用または投与量を決定する方法が研究されている。このような研究から、薬剤代謝に関連するか、あるいは薬剤活性と機能的に関連している遺伝子が、薬剤の副作用の発症の原因である可能性が明らかになった。例えば、チトクロームP450ファミリー等の薬剤代謝関連遺伝子におけるいくつかのcSNPsが、高い頻度でいくつかの薬剤の副作用と相関していることが示されている(Relling,M.V.and Dervieux,T.Pharmacogeneties and cancer therapy.Nat Rev Cancer,1:99−108,2001)。しかし、これらの高リスク遺伝子多型のアレル頻度は比較的低いため、大部分の患者について副作用を生ずる可能性を説明するには不十分である。したがって、パクリタキセル療法による副作用の発症と遺伝子多型との相関に関するさらなる研究が必要とされている。
特開2003−93068は、代謝酵素CYP2C8の多型を調べることにより、患者のパクリタキセルに対する感受性を予測する方法を開示する。しかし、この出願に開示されるアミノ酸変異を伴う遺伝子変異はいずれもアレル頻度が低い。例えば、この出願の発明者らは、これらのアレル頻度が<0.007であると報告している(Soyama,A.,Y.Saito,et al.(2001).”Non−synonymous single nucleotide alterations found in the CYP2C8 gene result in reduced in vitro paclitaxel metabolism.”Biol Pharm Bull 24(12),1427−1430)。
本発明の目的は、パクリタキセル療法における顆粒球減少症の発症の可能性を予測するための方法ならびにキットを提供することである。
本発明の1つの態様においては、CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがG/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、A/GまたはA/Aであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、C/TまたはC/Cであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがG/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、A/GまたはA/Aであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、A/TまたはA/Aであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがG/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、A/GまたはA/Aであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/Aであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、A/GまたはG/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、G/TまたはG/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがC/Cであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、C/TまたはT/Tであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがC/Cであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、C/TまたはT/Tであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、BUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、C/TまたはC/Cであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
さらに本発明においては、本発明により同定されたSNPsの1またはそれ以上を任意に組み合わせて、顆粒球減少症の発症のリスクをより高い精度で予測することができる。後述の実施例に示されるように、特定のSNPsの組み合わせと顆粒球減少症の発症率との相関が特に高いことが見いだされた。すなわち、本発明は、被験者から単離された遺伝子について、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基およびBUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型を同定することを含む、被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法を提供する。
好ましくは、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tであり、かつBUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/AまたはG/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測される。また好ましくは、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/TまたはA/Aであり、かつBUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
さらに別の観点においては、本発明は、被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測するための診断用キットを提供する。該キットは、被験者から単離された遺伝子について、CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、およびBUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される1またはそれ以上の遺伝子多型を同定するための試薬を含有することを特徴とする。
本発明のキットに含有される試薬は、好ましくは以下の核酸分子から選択される1またはそれ以上の核酸分子である:
CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子。
ここで、核酸分子が塩基を「含む」とは、核酸分子の配列中に標的とするSNP部位に対応する塩基が含まれていることを意味し、この塩基は核酸分子の内部に位置していても、5’末端または3’末端に位置していてもよい。このような核酸分子は、SNPのタイピングにおいて、ハイブリダイゼーションプローブ、TaqManプローブ等として用いることができる。さらに、本発明の核酸分子はSNP部位の周囲の領域とは無関係な配列をさらに含有していてもよい。このような核酸分子は、SNPのタイピングにおいて、インベーダー法におけるプライマリープローブとして用いることができる。また、核酸分子が塩基に「隣接する」とは、核酸分子が、標的とするSNP部位に対応する塩基を含まないが、SNP部位に隣接する上流または下流の連続するヌクレオチド配列を含むことを意味する。配列番号1で規定される配列の11番目の塩基に「隣接する」配列の例は、配列番号1で規定される配列の1−10番目の塩基を含む配列であり、別の例は12−21番目の塩基を含む配列である。このような核酸分子は、SNPのタイピングにおいて、インベーダー法におけるインベーダープローブまたはMALDI−TOF/MS法およびプライマーエクステンション法におけるプライマーとして用いることができる。これらのプローブは、本発明の教示にしたがって、CYP2C8遺伝子またはBUB1b遺伝子の配列を参照することにより設計することができる。
また好ましくは、本発明のキットに含有される試薬は、以下のプライマー核酸分子から選択される1またはそれ以上の核酸分子である:
CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対。
これらのプライマー対は、種々のタイピング法において標的遺伝子を増幅するために用いることができる。これらのプライマー対は、本発明の教示にしたがって、CYP2C8遺伝子またはBUB1b遺伝子の配列を参照することにより設計することができる。増幅のための好適なプライマー対の設計方法は当該技術分野においてよく知られている。
発明の詳細な説明
本発明においては、パクリタキセル療法による副作用と関連する遺伝子多型を検索するため、まず薬剤代謝関連遺伝子ならびに薬理学的にパクリタキセルの作用機序に関連する遺伝子298個を選定した。次にこれら298個の遺伝子内に存在するSNPsをJSNPデータベース上で検索を行い、2,727個のSNPsを抽出した。パクリタキセルを投与した54名の乳癌患者の末梢血からDNAを抽出し、SNPsのタイピングを行ったところ、後述の実施例に示されるように、CYP2C8遺伝子内にマップされた5個のSNP(IMS−JST111898(配列番号1)、IMS−JST105874(配列番号2)、IMS−JST082397(配列番号3)、IMS−JST071852(配列番号4)、IMS−JST071853(配列番号5))、ならびにBUB1b遺伝子内にマップされた5個のSNP(IMS−JST074538(配列番号6)、IMS−JST079837(配列番号7)、IMS−JST044164(配列番号8)、IMS−JST063023(配列番号9)、IMS−JST042569(配列番号10))について、顆粒球減少症の発症との相関が見いだされた。
なお、上記のIMS−JST番号は、JSNPデータベース(http://snp.ims.u−tokyo.ac.jp/)におけるエントリー番号であり、NCBIのdbSNPデータベースをはじめとする各種データベースから検索することができる。本明細書においては、本発明において見いだされたこれらのSNPsの位置をより明確に示すために、ゲノム配列中の当該SNP部位およびその前後各10塩基を含む配列をそれぞれ配列番号1−10として示し、これらの配列番号を参照してSNPsを表している。後にシークエンスエラーや新たな多型が発見されることにより、これらの配列番号に示される塩基配列の一部が変動するかもしれないことは、当業者には明らかであろう。
CYP2C8(チトクロームP450,ファミリー2,サブファミリーC,ポリペプチド8)は、種々の薬物の代謝に関与するチトクロームP450であり、染色体位置10q23.33にマップされている。パクリタキセルの代謝は主に肝細胞において行われ、代謝物は胆汁中に排泄される。パクリタキセルの解毒化にはCYP2C8による加水分解能が重要な働きをしており、これによりパクリタキセルが解毒化された6α−ヒドロキシパクリタキセルに分解される(Rahman,A.,et al.Selective biotransformation of taxol to 6 α−hydroxytaxol by human cytochrome P450 2C8.Cancer Res,54:5543−5546,1994)。このため、CYP2C8蛋白質がパクリタキセルの血中濃度の決定に重要な働きをしていることが考えられる。このことはCYP2C8が副作用とも関連している可能性を示唆している。CYP2C8遺伝子にはいくつかのcSNPがあることが知られている。例えば、アミノ酸の置換を伴う5箇所のcSNPのうち一つ(416G−>A)は、パクリタキセルの代謝速度がワイルドタイプに比べて遅くなることが知られている(Bahadur,N.,et al.CYP2C8 polymorphisms in Caucasians and their relationship with paclitaxel 6alpha−hydroxylase activity in human liver microsomes.Biochem.Pharmacol.,64:1579−1589,2002;Dai,D.,.et al.Polymorphisms in human CYP2C8 decrease metabolism of the anticancer drug paclitaxel and arachidonic acid.Pharmacogenetics,11:597−607,2001)。しかし、日本人を対象としたアレル頻度の解析研究において、これらのcSNPsの頻度は極めて低いことが知られている。実際、本発明において実施したタイピングにおいても54検体から1196A>Gの変異アレルが一つ見つかったのみである。これらのことからCYP2C8遺伝子に存在する既知のcSNPsはパクリタキセルの顆粒球減少症にはほとんど関与していないことが示唆される。本発明により見いだされたSNPsは、未知のメカニズムで顆粒球減少症と関連しているものと考えられる。
BUB1b遺伝子は、出芽酵母において有糸分裂のチェックポイントに関連しているBUB遺伝子のホモログであり、染色体位置15ql5にマップされている(Cahill,D.P.,.et al Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.Nature,392:300−303,1998;Hoyt,M.A.,et al.S.cerevisiae genes required for cell cycle arrest in response to loss of microtubule function.Cell,66:507−517,1991.;Li,R.and Murray,A.W.Feedback control of mitosis in budding yeast.Cell,66:519−531,1991)。パクリタキセルの抗腫瘍効果は微小管の重合を促進させることにより発揮され、微小管がパクリタキセルの標的分子である。これらのことは、BUB1b遺伝子とパクリタキセルの薬理作用が、機能的な面で関連があることを示唆している。
本発明において、パクリタキセル療法による副作用との相関が見いだされたSNPsの位置および多型の情報を以下の表に示す。
本発明の方法においては、パクリタキセルによる治療が計画されているか、あるいはパクリタキセルを投与されている被験者から末梢血液、他の体液、細胞、組織等を採取し、これらの試料から定法によりゲノムDNAを調製する。必要な場合には、タイピングすべき部位の配列を増幅する。遺伝子多型のタイピングは、当該技術分野において知られるかまたは開発されつつある種々の方法のいずれかを用いて容易に行うことができる。タイピング方法の例としては、直接シークエンス法、インベーダー法、TaqMan法、MALDI−TOF/MS法、プライマーエクステンション法およびハイブリダイゼーション法等が挙げられるが、これらに限定されない。
直接シークエンス法を用いる場合には、SNP部位を含む領域のDNAをPCRにより増幅し、このPCR産物の配列を直接シークエンスすることにより、SNPを同定することができる。
インベーダー法を用いる場合には、SNP部位から3’側に特異的な配列を含むインベーダープローブと、テンプレートのSNP部位から5’側に特異的な配列および無関係なフラップ配列を含むプライマリープローブとを用意する。これらのプローブと、フラップと相補的な配列と自己相補的な配列を含み蛍光色素とクエンチャーとの両方で標識されているFRETプローブ、およびテンプレートの存在下でクリベースを作用させる。プライマリープローブがテンプレートとハイブリダイズすると、SNP部位にインベーダープローブの3’末端が侵入し、この構造がクリベースにより切断されてフラップが遊離する。フラップはFRETプローブと結合して、クリベースにより蛍光色素部分が切断されて、蛍光が発生する。フラップ−FRETプローブを2組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、1回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。
TaqMan法を用いる場合には、蛍光色素とクエンチャーにより標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するよう設計したプライマーでPCR反応を行う。プライマーからの伸長反応が進むと同時に、TaqDNAポリメラーゼの5’エキソヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素がクエンチャーと離れると蛍光が生じ、これを検出することによりSNPを同定することができる。
MALDI−TOF/MS法を用いる場合には、SNP部位に隣接するプライマーを作成し、PCR増幅させたサンプルDNAを鋳型として、ddNTPを用いて1塩基分だけプライマー伸長を行う。伸長反応生成物をMALDI−TOF/MSで質量分析することにより、付加したddNTPを識別する。
ハイブリダイゼーション法を用いる場合には、SNP部位を含む領域のDNAをPCRにより増幅し、SNP部位に特異的なプローブを用いてハイブリダイゼーションにより増幅産物を検出する。さらに、これらの方法に加えて、RFLP法、DNAチップ法、分子ビーコン法、ライゲーション法などの種々の方法が開発されており、本発明においてはこれらのいずれをも用いることができる。
本発明の方法にしたがえば、本発明において同定されたSNP部位の1またはそれ以上についてタイピングを行い、後述の実施例において示される統計データを参照して、パクリタキセル療法による副作用の発症のリスクを予測することができる。本発明の方法は、好ましくはモンゴロイドに、特に好ましくは日本人に適用される。より好ましくは、本発明において同定されたCYP2C8遺伝子中のSNPと、BUB1b遺伝子中のSNPについてタイピングを行い、これらの結果を組み合わせることにより、パクリタキセル療法による副作用の発症のリスクを予測する。そのような組み合わせの例としては、
が挙げられる。
本発明はまた、上述のタイピング法において用いるための試薬を含む、パクリタキセル療法による副作用の発症のリスクを予測するためのキットを提供する。試薬の例はプローブおよびプライマーである。本発明において同定されたSNP部位を含む遺伝子の領域を増幅するために用いられるプライマーは、好ましくは15−30塩基の長さであり、標的SNP部位を挟みかつPCR反応により所望の長さの増幅産物が生成されるよう設計される。インベーダー法において用いられるプライマリープローブは、標的SNP部位から5’側の標的領域に特異的な配列を含み、さらに無関係なフラップ配列を含む。また、インベーダー法において用いられるインベーダープローブおよびMALDI−TOF/MS法およびプライマーエクステンション法において用いられるプライマーは、標的SNP部位に対応する塩基を含まないが、SNP部位に隣接する上流または下流の連続するヌクレオチド配列を含む。このようなプローブおよびプライマーの設計方法ならびに合成方法は当該技術分野においてよく知られている。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また,本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2003−375369号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
臨床サンプル
54名の乳癌患者がパクリタキセルの術前化学療法の臨床試験に登録された。患者選択の条件について要約すると以下の通りである。1)70歳以下で病理組織学敵に確認されたステージIIまたIIIaの乳癌患者であること、2)生理学的機能が適切であること(WBC>4,000mm3,血小板カウント>10,000mm3,ヘモグロビンレベル>10g/dl,血清クレアチニン濃度<1.2mg/dl,血清総ビリルビンレベル<1.5mg/dl,GOT/GPT<60/70)。本治療の前に化学療法あるいは放射線療法が施行されていないことなどである。すなわち、パクリタキセルの術前化学療法の臨床試験が施行された54名は、臨床上また組織学的にもほぼ同一のステージであり、前症例とも化学療法の施行歴はなかった。患者は、一週間に一回、80mg/m2のパクリタキセルを1時間かけて点滴投与された。この投与を12週間継続した。これらの患者に最も高頻度に観察された副作用は顆粒球減少症であり、24名の患者に認められた。
副作用の定義
副作用の有無を確認するために各患者について毎週、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン量、血小板数が測定された。治療中に認められた副作用は米国National Cancer InstituteのCommon Toxicity Criteria(NCI−CTC)に基づいて評価されグレード分類が行われた(Trotti,A.,et al.Common toxicity criteria:version 2.0.an improved reference for grading the acute effects of cancer treatment:impact on radiotherapy.Int J Radiat Oncol Biol Phys,47:13−47,2000参照)。すべての臨床情報はSCTS21システム(三井情報開発)を用いて匿名化され、以後の解析に用いられた。顆粒球減少症のグレードがNCI−CTCの分類にてグレード1〜4までを示した患者を顆粒球減少症ありとし、グレード0の患者を顆粒球減少症なしとした。顆粒球減少症あり群となし群間で年齢、発症年齢間に相関は認められなかった。
SNPsのタイピング
パクリタキセルの副作用と関連する遺伝子多型を検索するため、まず薬剤代謝関連遺伝子ならびに薬理学的にパクリタキセルの作用機序に関連する遺伝子298個を選定した。次にこれら298個の遺伝子内に存在するSNPsをJSNPデータベース上で検索を行い、2,727個のSNPsを抽出した。
本研究に用いた54症例についてインベーダー法を用いて298遺伝子内にある2,727カ所のSNPのタイピングを行った。54名の患者から末梢血14mlを採取した。末梢血からDNAを抽出する方法については標準的な方法を用いた。インベーダー法によるタイピングを行う前に、標的とするSNP部位の周辺約500bpをPCR法にて増幅した。その際10ngのDNAをテンプレートとして用い、また48個のプライマーセットを用いたマルチプレックスPCRを行うことにより48カ所のDNA断片を同時に増幅した。各SNP部位周辺を増幅するために用いたプライマーはJSNPデータベースに記載されている配列に基づいて作製したものを用いた。PCRの反応は以下の組成にて行った(6.7mM MgCl2,67mM TrisHCl,16.6mM NH4SO4,10mM 2−メルカプトエタノール,6.7μM EDTA,1,5mM dNTPs,10% DMSO,1pmolの各プライマー,および0.05UのEx−Taq)。PCRの反応は最初のディネーチャー反応は94℃にて2分間行い、次に94℃15秒、60℃15秒、72℃2分の3ステップを35回繰り返した。Multimek96反応ロボットを用いてPCR産物を滅菌蒸留水にて希釈した後、TANGO分注機を用いてインベーダー反応用カードに分注した。次にCartesian分注機を用いてインベーダー反応試薬をインベーダー用反応カードに分注した。インベーダー反応試薬には、アレル特異的オリゴヌクレオチド、Cleavase VII、そしてFAMあるいはRedmond RedにてラベルされたFRETカセットが含まれている。これらの試薬はThird Wave社より購入した。蛍光シグナルはTECAN Ultraにて検出し、ジェノタイプはFAMとRedmond Redの信号強度を2次元チャートに展開したものを用いて決定した。
ジェノタイピングを行った2,727SNPsのうち2,123SNPsについては80%以上の症例においてタイピングの決定を行うことができた。ジェノタイプの正確性について検討を行うため、ランダムに選んだ3SNPsのタイピングデータをRFLP法にて決定したジェノタイプと比較した所、調べた約1,000超のジェノタイプの全てで両タイピング法での結果が一致した。このことからタイピングの正確性は非常に高いものであることが示唆された。また、各SNPについてHardy−Weinberg平衡状態であるかどうかについてカイ2乗検定を用いて行ったところ、調べた全てのSNPsがHardy−Weinbergの平衡状態にあることが示唆された。
副作用と関連するSNPsの検索および相関解析
まず最初に、各遺伝子毎にハプロタイプブロック構造の構築を行った。同一遺伝子内にマップされたSNPについて、任意の2つのSNP間の連鎖不平衡係数|D’|をすべての組み合わせについて推定し、これをSNPの位置順に並べたマトリックスを作成した。もし2つのSNP間の|D’|が0.9以上であれば、2遺伝子間はハプロタイプブロックを形成しているものと推定した。その結果、タイピングを行った298遺伝子は419個のハプロタイプブロックに分割されることが分かった。
次に副作用と相関するSNPを同定するために、2段階のスクリーニングを行った。第一段階では、副作用がある群とない群間でのジェノタイプの分布について、2x3分割表を用いた独立性の検定を行った。第一段階のスクリーニングにより顆粒球減少症と相関を認める2箇所のハプロタイプブロックが見いだされた。これらのハプロタイプブロックには各々CYP2C8遺伝子内にマップされた5個のSNP、ならびにBUB1b遺伝子内にマップされた5個のSNPが含まれていた。p値の最低値はCYP2C8遺伝子を含むハプロタイプブロックでは0.0065、BUB1b遺伝子を含むハプロタイプブロックでは0.010であった。
第一段階で同一ハプロタイプブロック内あるいは同一遺伝子内にある全てのSNP p値が0.05以下であるものを第2段階の解析に用いた。第2段階では、優性遺伝モデルあるいは劣性遺伝モデルを想定した2x2分割表を作成し、独立性の検定をFisher’s exact testを用いて行った。
第2段階の解析では2つの遺伝子にマップされたSNPのいずれも劣性遺伝形式を想定した場合より高い相関を認めた。最も高い相関を認めたSNPはCYP2C8遺伝子にマップされたSNPではIMS−JST071852(p=0.0020,オッズ比10.7)であり、BUB1b遺伝子にマップされたSNPではIMS−JST074538(p=0.0062,オッズ比5.11)であった。CYP2C8遺伝子内に存在する3箇所の既知のcSNPが、本研究で使用したSNPsと関連があるかどうかを調べるため、これら3箇所のcSNPsのジェノタイプをRFLP法を用いて決定した。その結果一症例に1196A>G部位のヘテロ接合体を認めたのみで、他の症例では3箇所のcSNP全てでワイルドタイプであった。このことからCYP2C8遺伝子内に存在する3箇所のcSNPsの頻度は非常に低いものと推定された。また、BUB1b遺伝子内にマップされる一個のSNP(IMS−JST044164)における多型はアミノ酸置換(Arg−>Gln)を伴うcSNPである。本研究ではワイルドタイプであるArgを持つアレルをホモに持つ割合が顆粒球減少症を示す患者で多いことが示された。
ジェノタイプの組み合わせによる副作用出現確率の推定
CYP2C8遺伝子上の一個のSNPとBUB1b遺伝子上の一個のSNPのジェノタイプの組み合わせの各々について副作用出現の確率を計算した。計算にはロジスティック回帰モデルを用いた。その際4個の変数を用い、CYP2C8遺伝子上のSNPのアレルタイプ2種類と、BUB1b遺伝子上のSNPのアレルタイプ2種類を各々割り当てた。likelihood ratio testを用い最も適切なSNPの組み合わせを検索し、CYP2C8遺伝子上のIMS−JST071852とBUB1b遺伝子上のIMS−JST074538の組み合わせを選択した(p<0.000532)。この2つのSNPsのジェノタイプ別の副作用出現確率を表13に示す。アレル頻度はJSNPデータベースより得られた各々のSNPのアレル頻度より推定した。
本発明により、2つの遺伝子の2個のSNPを用いれば顆粒球減少症発症の可能性を確実に予測することができることが示された。CYP2C8遺伝子上のIMS−JST071852とBUB1b遺伝子上のIMS−JST074538のジェノタイプの組み合わせがT/TとA/A、あるいはT/TとG/Gの組み合わせであれば顆粒球減少症を発症する確立が非常に高いと考えられる。JSNPデータベースにおいて公開されているアレル頻度をもとにすれば、これら2つのジェノタイプの組み合わせの日本人における頻度はそれぞれ0.12と0.04である。他方、顆粒球減少症を発症する確率が低いと考えられるジェノタイプの組み合わせは、A/TとA/G、あるいはA/AとA/Gの組み合わせであり、これらの組み合わせの日本人における頻度はそれぞれ0.23と0.14である。以上の結果を組み合わせれば、日本人の約半数についてはパクリタキセル治療における顆粒球減少症の発症の有無を予測できることがわかる。
Claims (16)
- 被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法であって、前記被験者から単離された遺伝子について、CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、およびBUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される1またはそれ以上の遺伝子多型を同定する工程を含む方法。
- 被験者から単離された遺伝子が、以下の(a)〜(e):
(a)CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがG/Gである;
(b)CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tである;
(c)CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがG/Gである;
(d)CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tである;
(e)CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがG/Gである;
のうち1またはそれ以上である場合に、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測する、請求項1記載の方法。 - 被験者から単離された遺伝子が、以下の(f)〜(j):
(f)CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/GまたはA/Aである;
(g)CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがC/TまたはC/Cである;
(h)CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/GまたはA/Aである;
(i)CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/TまたはA/Aである;
(j)CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/GまたはA/Aである;
のうち1またはそれ以上である場合に、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測する、請求項1記載の方法。 - 被験者から単離された遺伝子が、以下の(A)〜(E):
(A)BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/Aである;
(B)BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tである;
(C)BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがC/Cである;
(D)BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがC/Cである:
(E)BUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tである;
のうち1またはそれ以上である場合に、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測する、請求項1記載の方法。 - 被験者から単離された遺伝子が、以下の(F)〜(J):
(F)BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/GまたはG/Gである;
(G)BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがG/TまたはG/Gである;
(H)BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがC/TまたはT/Tである;
(I)BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがC/TまたはT/Tである;
(J)BUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがC/TまたはC/Cである;
のうち1またはそれ以上である場合に、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測する、請求項1記載の方法。 - 被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法であって、前記被験者から単離された遺伝子について、(1)CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される1またはそれ以上の遺伝子多型を同定する工程、および(2)BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、およびBUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される1またはそれ以上の遺伝子多型を同定する工程、を含む方法。
- 被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法であって、前記被験者から単離された遺伝子について、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基およびBUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型を同定することを含む請求項6記載の方法。
- CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがT/Tであり、かつBUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/AまたはG/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測する、請求項7記載の方法。
- CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/TまたはA/Aであり、かつBUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基におけるジェノタイプがA/Gであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測する、請求項7記載の方法。
- 被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測するための診断用キットであって、前記被験者から単離された遺伝子について、CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型、およびBUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される1またはそれ以上の遺伝子多型を同定するための試薬を含有することを特徴とするキット。
- 前記試薬が、
CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;および
BUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
からなる群より選択される1またはそれ以上の核酸分子である、請求項10記載の診断用キット。 - 前記試薬が、
(1)CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;および、CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子からなる群より選択される1またはそれ以上の核酸分子;および
(2)BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;およびBUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子からなる群より選択される1またはそれ以上の核酸分子;
を含む、請求項10記載の診断用キット。 - 前記試薬が、
CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;および
BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも10個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子;
を含む、請求項10記載の診断用キット。 - 前記試薬が、
CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;
BUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対。
からなる群より選択される1またはそれ以上のプライマー対である、請求項10記載の診断用キット。 - 前記試薬が、
(1)CYP2C8遺伝子中の配列番号1で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;CYP2C8遺伝子中の配列番号2で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;CYP2C8遺伝子中の配列番号3で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;および、CYP2C8遺伝子中の配列番号5で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;からなる群より選択される1またはそれ以上のプライマー対、および
(2)BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;BUB1b遺伝子中の配列番号7で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;BUB1b遺伝子中の配列番号8で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;BUB1b遺伝子中の配列番号9で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;BUB1b遺伝子中の配列番号10で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;からなる群より選択される1またはそれ以上のプライマー対;
を含む、請求項10記載の診断用キット。 - 前記試薬が、
CYP2C8遺伝子中の配列番号4で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対;および
BUB1b遺伝子中の配列番号6で規定される配列の11番目の塩基を含む領域に対応するDNAを増幅するよう設計されたPCRプライマー対
を含む、請求項10記載の診断用キット。
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