JP5015547B2

JP5015547B2 - ドセタキセル療法の副作用を予測する方法およびキット

Info

Publication number: JP5015547B2
Application number: JP2006292856A
Authority: JP
Inventors: 義男三木; 実磯村; 賢隆吉本
Original assignee: Japanese Foundation for Cancer Research
Current assignee: Japanese Foundation for Cancer Research
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: JP2008104437A

Description

本発明は、遺伝子多型を同定することにより、ドセタキセル療法の副作用による好中球減少症の発症のリスクを予測する方法、ならびにかかる方法を実施するためのキットに関する。

ドセタキセルは、タキソテール（登録商標）などの名称でも知られる抗腫瘍剤であり、乳癌や非小細胞肺癌等の種々の癌の治療に広く用いられている。ドセタキセル療法の最適投与量および投与スケジュールはまだあまり確立されておらず、現在種々の臨床試験が進行中である。ドセタキセル療法による副作用の主要なものの１つは好中球減少症であり、この副作用の発症のために投与量が制限されている。

ドセタキセル療法の副作用を低下させる方法として、患者の遺伝子を分析することにより副作用を予測し、その薬剤の使用または投与量を決定する方法が研究されている。このような研究から、薬剤代謝に関連するか、あるいは薬剤活性と機能的に関連している遺伝子が、薬剤の副作用の発症の原因である可能性が明らかになった。例えば、チトクロームＰ４５０ファミリー等の薬剤代謝関連遺伝子におけるいくつかのcＳＮＰsが、高い頻度でいくつかの薬剤の副作用と相関していることが示されている。しかし、これらの高リスク遺伝子多型のアレル頻度は比較的低いため、大部分の患者について副作用を生ずる可能性を説明するには不十分である。したがって、ドセタキセル療法の副作用の発症と遺伝子多型との相関に関するさらなる研究が必要とされている。

本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
ＷＯ２００５／０４５０２９

本発明の目的は、ドセタキセル療法における好中球減少症の発症の可能性を予測するための方法ならびにキットを提供することである。

本発明は、被験者から単離された遺伝子について、
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＡＴＧＴＴＣＡＡＧＧＹＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣ（配列番号１）；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＹＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣ（配列番号２）；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＧＡＧＡＴＧＡＧＣＴＹＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴ（配列番号３）；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＡＧＴＴＴＴＣＡＴＧＳＴＡＴＴＧＴＴＧＴＧ（配列番号４）；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＴＣＧＡＣＡＴＧＴＣＫＣＡＴＣＣＣＡＣＡＴ（配列番号５）；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＡＧＡＣＣＣＴＧＧＧＹＧＴＧＣＣＡＧＣＣＴ（配列番号６）；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＧＡＣＡＴＴＡＧＴＧＫＴＡＣＡＴＡＴＡＡＡ（配列番号７）；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＹＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣ（配列番号８）；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＧＧＴＴＣＴＡＣＡＴＲＡＡＡＴＴＣＣＡＡＧ（配列番号９）；および
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型ＧＧＡＣＴＴＴＣＴＡＳＴＡＡＴＣＡＡＧＡＧ（配列番号１０）；
からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子多型を同定することを含む、被験者におけるドセタキセル療法の副作用による好中球減少症の発症のリスクを予測する方法を提供する。

本発明の１つの態様においては、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／Ｇであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／Ｇであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／ＴまたはＣ／Ｔであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／ＴまたはＧ／Ｔであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／ＴまたはＣ／Ｔであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／ＧまたはＡ／Ｇであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本発明の別の態様においては、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／ＣまたはＣ／Ｇであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。

本明細書において用いる場合、遺伝子多型とは、１つの生物種におけるゲノム上の塩基配列の個体間の相違をいう。この配列の相違が、特定の遺伝子の発現量、この遺伝子によりコードされる蛋白質の性質、個体における薬剤の有効性や副作用の発生、特定の疾患へのかかりやすさなどと関連していることが知られている。遺伝子多型のうち１塩基の相違を特にＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）という。また、ジェノタイプとは試験すべき被験者の遺伝子型をいう。

さらに本発明においては、本発明により同定されたＳＮＰsの１またはそれ以上を任意に組み合わせて、好中球減少症の発症のリスクをより高い精度で予測することができる。後述の実施例に示されるように、特定のＳＮＰsの組み合わせと好中球減少症の発症率との相関が特に高いことが見いだされた。すなわち、本発明は、被験者から単離された遺伝子について、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基およびＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型を同定することを含む、被験者におけるドセタキセル療法の副作用による好中球減少症の発症のリスクを予測する方法を提供する。

好ましくは、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／ＧまたはＧ／Ｃであり、かつＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／ＴまたはＴ／Ｔであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測される。また好ましくは、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃであり、かつＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃであるときに、好中球減少症の発症のリスクが低いと予測される。

さらに別の観点においては、本発明は、被験者におけるドセタキセル療法の副作用による好中球減少症の発症のリスクを予測するための診断用キットを提供する。該キットは、被験者から単離された遺伝子について、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、およびＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子多型を同定するための試薬を含有することを特徴とする。

本発明のキットに含有される試薬は、好ましくは以下の核酸分子から選択される１またはそれ以上の核酸分子である：
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子。

ここで、核酸分子が塩基を「含む」とは、核酸分子の配列中に標的とするＳＮＰ部位に対応する塩基が含まれていることを意味し、この塩基は核酸分子の内部に位置していても、５’末端または３’末端に位置していてもよい。このような核酸分子は、ＳＮＰのタイピングにおいて、ハイブリダイゼーションプローブ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等として用いることができる。さらに、本発明の核酸分子はＳＮＰ部位の周囲の領域とは無関係な配列をさらに含有していてもよい。このような核酸分子は、ＳＮＰのタイピングにおいて、インベーダー法におけるプライマリープローブとして用いることができる。また、核酸分子が塩基に「隣接する」とは、核酸分子が、標的とするＳＮＰ部位に対応する塩基を含まないが、ＳＮＰ部位に隣接する上流または下流の連続するヌクレオチド配列を含むことを意味する。配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基に「隣接する」配列の例は、配列番号１で規定される配列の１−１０番目の塩基を含む配列であり、別の例は１２−２１番目の塩基を含む配列である。このような核酸分子は、ＳＮＰのタイピングにおいて、インベーダー法におけるインベーダープローブまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法およびプライマーエクステンション法におけるプライマーとして用いることができる。これらのプローブは、本発明の教示にしたがって、ＥＰＨＸ２遺伝子またはＴＮＦＲＳＦ６遺伝子の配列を参照することにより設計することができる。

また好ましくは、本発明のキットに含有される試薬は、以下のプライマー核酸分子から選択される１またはそれ以上の核酸分子である：
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対。

本明細書において、特定のＳＮＰ部位について、ＳＮＰ部位の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対とは、被験者の遺伝子中の標的ＳＮＰ部位を含む領域を増幅しうるように、標的ＳＮＰ部位を挟みかつＰＣＲ反応によりこれらのプライマーに挟まれた領域の増幅産物が生成されるよう設計される１対のプライマーをいう。このようなプライマー対は、好ましくはそれぞれ１５−３０塩基の長さである。これらのプライマー対は、本発明の教示にしたがって、ＥＰＨＸ２遺伝子（ＮＣ_０００００８）またはＴＮＦＲＳＦ６遺伝子（ＮＣ_００００１０）の配列を参照することにより設計することができる。増幅すべき標的部位に対する特異性を有する好適なプライマー対の設計方法は当該技術分野においてよく知られている。

本発明においては、ドセタキセル療法の副作用と関連する遺伝子多型を検索するため、まず薬剤代謝関連遺伝子ならびに薬理学的にドセタキセルの作用機序に関連する遺伝子５０７個を選定した。次にこれら５０７個の遺伝子内に存在するＳＮＰsをＪＳＮＰデータベース上で検索を行い、３，７７３個のＳＮＰsを抽出した。ドセタキセルを投与した７７名の乳癌患者の末梢血からＤＮＡを抽出し、ＳＮＰsのタイピングを行ったところ、後述の実施例に示されるように、ＥＰＨＸ２遺伝子内にマップされた５個のＳＮＰ（ｒｓ２７４１３３４（配列番号１）、ｒｓ４１４９２４３（配列番号２）、ｒｓ４１４９２４５（配列番号３）、ｒｓ８９１４０１（配列番号４）、ｒｓ４１４９２４６（配列番号５））、ならびにＴＮＦＲＳＦ６遺伝子内にマップされた５個のＳＮＰ（ｒｓ２２３４７６７（配列番号６）、ｒｓ１５７１０１１（配列番号７）、ｒｓ２２９６６０４（配列番号８）、ｒｓ２２９６６０１（配列番号９）、ｒｓ２２９６６００（配列番号１０））について、好中球減少症の発症との相関が見いだされた。

なお、上記のｒｓ番号は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）におけるエントリー番号であり、各種データベースから検索することができる。本明細書においては、本発明において見いだされたこれらのＳＮＰsの位置をより明確に示すために、ゲノム配列中の当該ＳＮＰ部位およびその前後各１０塩基を含む配列をそれぞれ配列番号１−１０として示し、これらの配列番号を参照してＳＮＰsを表している。後にシークエンスエラーや新たな多型が発見されることにより、これらの配列番号に示される塩基配列の一部が変動するかもしれないことは、当業者には明らかであろう。

本発明において、ドセタキセル療法による副作用との相関が見いだされたＳＮＰsの位置および多型の情報を以下の表に示す。

本発明の方法においては、ドセタキセルによる治療が計画されているか、あるいはドセタキセルを投与されている被験者から末梢血液、他の体液、細胞、組織等を採取し、これらの試料から定法によりゲノムＤＮＡを調製する。必要な場合には、タイピングすべき部位の配列を増幅する。遺伝子多型のタイピングは、当該技術分野において知られるかまたは開発されつつある種々の方法のいずれかを用いて容易に行うことができる。タイピング方法の例としては、直接シークエンス法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、プライマーエクステンション法およびハイブリダイゼーション法等が挙げられるが、これらに限定されない。

直接シークエンス法を用いる場合には、ＳＮＰ部位を含む領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、このＰＣＲ産物の配列を直接シークエンスすることにより、ＳＮＰを同定することができる。

インベーダー法を用いる場合には、ＳＮＰ部位から３’側に特異的な配列を含むインベーダープローブと、テンプレートのＳＮＰ部位から５’側に特異的な配列および無関係なフラップ配列を含むプライマリープローブとを用意する。これらのプローブと、フラップと相補的な配列と自己相補的な配列を含み蛍光色素とクエンチャーとの両方で標識されているＦＲＥＴプローブ、およびテンプレートの存在下でＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）を作用させる。プライマリープローブがテンプレートとハイブリダイズすると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入し、この構造がＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）により切断されてフラップが遊離する。フラップはＦＲＥＴプローブと結合して、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）により蛍光色素部分が切断されて、蛍光が発生する。フラップ−ＦＲＥＴプローブを２組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、１回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）法を用いる場合には、蛍光色素とクエンチャーにより標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するよう設計したプライマーでＰＣＲ反応を行う。プライマーからの伸長反応が進むと同時に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素がクエンチャーと離れると蛍光が生じ、これを検出することによりＳＮＰを同定することができる。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法を用いる場合には、ＳＮＰ部位に隣接するプライマーを作成し、ＰＣＲ増幅させたサンプルＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長を行う。伸長反応生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで質量分析することにより、付加したｄｄＮＴＰを識別する。

ハイブリダイゼーション法を用いる場合には、ＳＮＰ部位を含む領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＳＮＰ部位に特異的なプローブを用いてハイブリダイゼーションにより増幅産物を検出する。さらに、これらの方法に加えて、ＲＦＬＰ法、ＤＮＡチップ法、分子ビーコン法、ライゲーション法などの種々の方法が開発されており、本発明においてはこれらのいずれをも用いることができる。

本発明の方法にしたがえば、本発明において同定されたＳＮＰ部位の１またはそれ以上についてタイピングを行い、後述の実施例において示される統計データを参照して、ドセタキセル療法による副作用の発症のリスクを予測することができる。

本発明はまた、上述のタイピング法において用いるための試薬を含む、ドセタキセル療法による副作用の発症のリスクを予測するためのキットを提供する。試薬の例はプローブおよびプライマーである。本発明において同定されたＳＮＰ部位を含む遺伝子の領域を増幅するために用いられるプライマーは、好ましくは１５−３０塩基の長さであり、標的ＳＮＰ部位を挟みかつＰＣＲ反応により所望の長さの増幅産物が生成されるよう設計される。インベーダー法において用いられるプライマリープローブは、標的ＳＮＰ部位から５’側の標的領域に特異的な配列を含み、さらに無関係なフラップ配列を含む。また、インベーダー法において用いられるインベーダープローブおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法およびプライマーエクステンション法において用いられるプライマーは、標的ＳＮＰ部位に対応する塩基を含まないが、ＳＮＰ部位に隣接する上流または下流の連続するヌクレオチド配列を含む。このようなプローブおよびプライマーの設計方法ならびに合成方法は当該技術分野においてよく知られている。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

臨床サンプル
７７名の乳癌患者がドセタキセルの術前化学療法の臨床試験に登録された。各患者は病理学的に浸潤癌であることが確認された浸潤径３ｃｍ以上のＳｔａｇｅＩＩａ〜ＩＩＩｂ原発性乳癌であり、年齢７０才以下、ＰＳ（ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＳｔａｔｕｓ）は０−１、骨髄・肝・腎機能が十分保たれて（ＷＢＣ（白血球数）≧４０００、Ｐｌａｔ．（血小板数）≧１０万、Ｈｂ（ヘモグロビン量）≧１０、ＧＯＴ／ＧＰＴ＜６０／７０）おり、その他重篤な合併症を認めず、抗がん剤、放射線による前治療歴がないことが条件とされた。すなわち、ドセタキセルの術前化学療法の臨床試験が施行された７７名は、臨床上また組織学的にもほぼ同一のステージであり、全症例とも化学療法の施行歴はなかった。これらの患者に対しドセタキセルの術前化学療法（７５ｍｇ／ｍ² ３週毎に４回投与）が施行された。

副作用の定義
副作用の有無を確認するために各患者について毎週、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン量、血小板数が測定された。治療中に認められた副作用は米国ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｍｍｏｎＴｏｘｉｃｉｔｙＣｒｉｔｅｒｉａ(ＮＣＩ−ＣＴＣ)に基づいて評価されグレード分類が行われた。すべての臨床情報はＳＣＴＳ２１システム（三井情報開発）を用いて匿名化され、以後の解析に用いられた。好中球減少症を示した症例のＮＣＩ−ＣＴＣグレード別の数は表１１の通りであった。

ＳＮＰｓのタイピング
ドセタキセル療法の副作用と関連する遺伝子多型を検索するため、まず薬剤代謝関連遺伝子ならびに薬理学的にドセタキセルの作用機序に関連する遺伝子５０７個を選定した。次にこれら５０７個の遺伝子内に存在するＳＮＰｓをｄｂＳＮＰデータベース上で検索を行い、３，７７３個のＳＮＰｓを抽出した。

本研究に用いた７７症例についてインベーダー法を用いて５０７遺伝子内にある３，７７３カ所のＳＮＰのタイピングを行った。７７名の患者から末梢血１４ｍｌを採取した。末梢血からＤＮＡを抽出する方法については標準的な方法を用いた。インベーダー法によるタイピングを行う前に、標的とするＳＮＰ部位の周辺約５００ｂｐをＰＣＲ法にて増幅した。その際１０ｎｇのＤＮＡをテンプレートとして用い、また４８個のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲを行うことにより４８カ所のＤＮＡ断片を同時に増幅した。各ＳＮＰ部位周辺を増幅するために用いたプライマーはＪＳＮＰデータベースに記載されている配列に基づいて作製したものを用いた。ＰＣＲの反応は以下の組成にて行った（６．７ｍＭＭｇＣｌ₂、６７ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１６．６ｍＭＮＨ₄ＳＯ₄、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、６．７μＭＥＤＴＡ、１．５ｍＭｄＮＴＰｓ、１０％ＤＭＳＯ、１ｐｍｏｌの各プライマー, および０．０５ＵのＥｘ−Ｔａｑ）。ＰＣＲの反応は最初のディネーチャー反応は９４℃にて２分間行い、次に９４℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃３分の３ステップを３５回繰り返した。Ｍｕｌｔｉｍｅｋ９６反応ロボットを用いてＰＣＲ産物を滅菌蒸留水にて希釈した後、ＴＡＮＧＯ分注機を用いてインベーダー反応用カードに分注した。次にＣａｒｔｅｓｉａｎ分注機を用いてインベーダー反応試薬をインベーダー用反応カードに分注した。インベーダー反応試薬には、アレル特異的オリゴヌクレオチド、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）ＶＩＩ、そしてＦＡＭあるいはＲｅｄｍｏｎｄＲｅｄにてラベルされたＦＲＥＴカセットが含まれている。これらの試薬はＴｈｉｒｄＷａｖｅ社より購入した。蛍光シグナルはＴＥＣＡＮＵｌｔｒａにて検出し、ジェノタイプはＦＡＭとＲｅｄｍｏｎｄＲｅｄの信号強度を２次元チャートに展開したものを用いて決定した。

ジェノタイピングを行った３，７７３ＳＮＰｓのうち３，１４４ＳＮＰｓについては８０％以上の症例においてタイピングの決定を行うことができた。この３，１４４ＳＮＰsは４９８個の遺伝子をカバーしていた。ジェノタイプの正確性について検討を行うため、ランダムに選んだ３ＳＮＰｓのタイピングデータをＲＦＬＰ法にて決定したジェノタイプと比較したところ、調べた約１，０００超のジェノタイプの全てで両タイピング法での結果が一致した。このことからタイピングの正確性は非常に高いものであることが示唆された。また、各ＳＮＰについてＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡状態であるかどうかについてカイ２乗検定を用いて行ったところ、調べた全てのＳＮＰｓがＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの平衡状態にあることが示唆された。

副作用と関連するＳＮＰｓの検索および相関解析
副作用と相関するＳＮＰを同定するためにまず、副作用がある群とない群間でのジェノタイプの分布について、２ｘ３分割表を用いた独立性の検定を行った。その結果２個の遺伝子について複数のＳＮＰｓが、好中球減少症と相関を認めた。これらのＳＮＰは各々ＥＰＨＸ２遺伝子内にマップされた５個のＳＮＰ、ならびにＴＮＦＲＳＦ６遺伝子内にマップされた５個のＳＮＰであった。これらのＳＮＰは以下のとおりである：ｒｓ２７４１３３４（配列番号１）、ｒｓ４１４９２４３（配列番号２）、ｒｓ４１４９２４５（配列番号３）、ｒｓ８９１４０１（配列番号４）、ｒｓ４１４９２４６（配列番号５）、ｒｓ２２３４７６７（配列番号６）、ｒｓ１５７１０１１（配列番号７）、ｒｓ２２９６６０４（配列番号８）、ｒｓ２２９６６０１（配列番号９）、ｒｓ２２９６６００（配列番号１０）。

また、これら１０個のＳＮＰｓについて優性遺伝モデルあるいは劣性遺伝モデルを想定した２ｘ２分割表を作成し、独立性の検定をＦｉｓｈｅｒ’ｓｅｘａｃｔｔｅｓｔを用いて行った。ＥＰＨＸ２遺伝子の検定結果を表１２に、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子の検定結果を表１３に示す。

最も高い相関を認めたＳＮＰは、ＥＰＨＸ２遺伝子にマップされたＳＮＰではｒｓ４１４９２４６（配列番号５）(ｐ＝０．０００８９)であり、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子にマップされたＳＮＰではｒｓ２２９６６０４（配列番号８）(ｐ＝０．００１７)であった。

ジェノタイプの組み合わせによる副作用出現確率の推定
次に好中球減少症発症の予測モデルの構築を行った。計算にはロジスティック回帰モデルを用いた。その際４個の変数を用い、ＥＰＨＸ２遺伝子上のＳＮＰのジェノタイプ２種類と、ＴＮＦＲＳＦ６遺伝子上のＳＮＰのジェノタイプ２種類を各々割り当てた。ｌｉｋｅｈｏｏｄｒｅｔｉｏｔｅｓｔを用い最も適切なＳＮＰの組み合わせを検索し、ＥＰＨＸ２遺伝子上のｒｓ８９１４０１（配列番号４）とＴＮＦＲＳＦ６遺伝子上のｒｓ２２９６６０４（配列番号８）の組み合わせを選択した。最も高い確率を示したジェノタイプの組み合わせはｒｓ８９１４０１でＧアレルを持ち（Ｇ／ＧもしくはＧ／Ｃ）かつｒｓ２２９６６０４でＴアレルを持つ場合（Ｔ／ＴもしくはＣ／Ｔ）の場合で、副作用出現確率は０．９６８であった。逆にｒｓ８９１４０１がＴアレルのホモ接合体（Ｃ／Ｃ）かつｒｓ２２９６６０４がＣアレルのホモ接合体(Ｃ／Ｃ)の場合、副作用出現の確率が最も低い（０．０４３）と推定された。これら２つの組み合わせの場合は副作用出現の有無が予測可能と考えられた。その他のジェノタイプの組み合わせでは副作用出現確率は０．５前後であり、副作用の有無を予測することは困難であった。このように２つのＳＮＰのジェノタイプの組み合わせにより、ドセタキセル療法による好中球減少症出現の有無を予測するシステムが構築された。

本発明により、２つの遺伝子の２個のＳＮＰを用いれば好中球減少症発症の可能性を確実に予測することができることが示された。ＪＳＮＰデータベースにおいて公開されているアレル頻度をもとにすれば、ＳＮＰのジェノタイプの組み合わせの日本人における頻度を求めることができる。その結果、副作用の出現確率が最も高い組み合わせのジェノタイプ頻度は７６％、最も低い組み合わせのジェノタイプ頻度は１％であった。

上で構築したドセタキセル療法の好中球減少症発症の予測モデルを検証するために、別のレジメンにて治療が行われた乳癌・肺癌の患者のサンプルを用いてＳＮＰタイピングを行った。これらのサンプルでは、ドセタキセル３５ｍｇ／ｍ²を週一回ずつ３回投与することを１クールとして３クールまで化学療法が行われた。これらの患者での好中球減少症のグレード別の数は以下の通りであった。

本治療レジメンでは、上述のものと比べＧｒａｄｅ４などの重症な好中球減少症の数が少ない。そこで検証にあたってはＧｒａｄｅ０の場合を副作用なし、Ｇｒａｄｅ１以上の場合を副作用有りと定義し、ＥＰＨＸ２遺伝子上のｒｓ８９１４０１ならびにＴＮＦＲＳＦ６遺伝子上ｒｓ２２９６６０４のジェノタイプの組み合わせから推定された副作用有り無しの予測との一致性を検討した。

肺癌症例と乳癌症例併せて４６症例のうち、好中球減少症の予測が可能なジェノタイプの組み合わせを持っている症例が２８症例認められた。これら２８症例の内訳は、副作用の出現確率が最も高いジェノタイプの組み合わせ（ｒｓ８９１４０１でＧアレルを持ち（Ｇ／ＧもしくはＧ／Ｃ）かつｒｓ２２９６６０４でＴアレルを持つ場合（Ｔ／ＴもしくはＣ／Ｔ））が２７例、最も低いジェノタイプの組み合わせ（ｒｓ８９１４０１がＣアレルのホモ接合体（Ｃ／Ｃ）かつｒｓ２２９６６０４がＣアレルのホモ接合体(Ｃ／Ｃ)）が1例であった。これらのジェノタイプの組み合わせによる副作用出現予想と、実際の副作用出現の有無が一致しているかについて検討したところ、正しく予測できた症例が２１症例、誤判別症例が７症例であり、正診率は７５％であった。内訳は表１５の通りである。このように本予測システムでは、副作用のスペクトラムが異なるレジメンを用いた予測においても７５％の正診率で予測することができることから、種々の異なるレジメンで治療されたドセタキセル療法の症例においても応用可能であることが示唆された。

Claims

被験者におけるドセタキセル療法の副作用による好中球減少症の発症のリスクを予測する方法であって、前記被験者から単離された遺伝子について、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基およびＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型を同定することを含む方法。
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／ＧまたはＧ／Ｃであり、かつＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／ＴまたはＣ／Ｔであるときに、好中球減少症の発症のリスクが高いと予測する、請求項１記載の方法。
ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃであり、かつＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃであるときに、好中球減少症の発症のリスクが低いと予測する、請求項１記載の方法。
被験者におけるドセタキセル療法の副作用による好中球減少症の発症のリスクを予測するための診断用キットであって、前記被験者から単離された遺伝子について、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型を同定するための試薬、およびＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型を同定するための試薬を含有することを特徴とするキット。
前記キットが、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子、およびＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む、請求項４記載の診断用キット。
前記キットが、ＥＰＨＸ２遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対、およびＴＮＦＲＳＦ６遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対を含む、請求項４記載の診断用キット。