JPWO2005023111A1 - グルコースセンサおよびグルコース濃度測定装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、グルコース脱水素酵素を導体成分に固定化した電極（３２）を有するグルコースセンサ（２）に関する。グルコース脱水素酵素としては、グルコース脱水素活性を有する触媒活性サブユニットと、触媒活性サブユニットから供与された電子を、導体成分に授与するための電子伝達サブユニットと、を含むタンパク質複合体を使用する。好ましくは、グルコースセンサ（２）は、連続的なグルコース濃度測定を行い、あるいは複数回のグルコース濃度の測定を継続的に行うことができるように構成される。

Description

本発明は、試料中のグルコース濃度を測定するための技術に関する。

糖尿病患者にとっては、自己の血糖値を把握しておくことが重要であり、またインシュリンを投与するタイミングを、血糖値を繰り返し測定することにより決定する必要がある。血糖値の測定は、たとえば使い捨てとして構成されたグルコースセンサを用いて行われている（たとえば特許文献１参照）。この文献に記載のグルコースセンサを用いる方法では、血糖値の測定に際して穿刺装置を用いて皮膚から血液を採取する必要がある。そのため、糖尿病患者にとっては、血糖値をモニタリングする作業は煩わしく、血糖値の測定毎に皮膚に針を突き刺す必要があるために苦痛を伴う。

このような不具合を解決すべく、継続的に血糖値をモニターすることができる血糖値測定手法が提案されており（たとえば特許文献２参照）、また米国においては、シグナス社より「グルコウオッチ」として製品化されている。先の血糖値測定手法では、皮膚から採取した血液や間質液を電極に供給し、この電極を利用してグルコース濃度を測定する電極法が採用されている。この場合の電極は、血糖値測定時において皮膚のごく近傍に配置され、また電極としては、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を介して血液や間質液から取り出した電子を、電極（導体成分）に与えるように構成されている。

ＧＯＤを使用した電極法では、試料（血液や間質液）における溶存酸素の影響を受けて測定精度が低下してしまうといった問題がある。また、ＧＯＤを用いる方法では、ＧＯＤがグルコースから取り出した電子を電極（導体成分）に与える場合に、一般に、過酸化水素を生成させて、この過酸化水素を介して電極（導体成分）に電子を与える方法、あるいは電子伝達物質（たとえばフェリシアン化カリウムなどの金属錯体）を媒体として電極（導体成分）に電子を与える方法が採用されている。いずれの方法においても、皮膚から採取した血液などを、皮膚と隔離された場所においてグルコース濃度を測定する場合には人体に対する問題は殆どない。しかしながら、過酸化水素やフェリシアン化カリウムが人体にとって好ましくない物質であることに鑑みれば、先のモニタリング方法のように、皮膚のごく近傍においてＧＯＤを含んだ電極を存在させる測定方法は好ましくない。

さらに、電子伝達物質を使用する方法に関していえば、電子伝達物質を電極内に含有させ、あるいは電極表面に電子伝達物質を固定する必要が生じる。いずれにして、電子伝達物質をＧＯＤとは別に準備して、それを電極に含有させることはコスト的に不利である。

日本国特公平８−１０２０８号公報 日本国特表平９−５０３９２４号公報

本発明は、人体に悪影響を及ぼすことなく、コスト的に有利にグルコース濃度を測定できるようにすることを課題としている。

本発明の第１の側面において提供されるグルコースセンサは、グルコース脱水素酵素を導体成分に固定化した電極を有しており、上記グルコース脱水素酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）が補酵素として結合し、かつグルコース脱水素活性を有する触媒活性サブユニットと、上記触媒活性サブユニットから供与された電子を、上記導体成分に授与するための電子伝達サブユニットと、を含むタンパク質複合体であることを特徴としている。

本発明の第２の側面において提供されるグルコース濃度測定装置は、皮下組織から採取した血液または間質液に基づいて、グルコースの濃度を連続的に、あるいは複数回のグルコース濃度の測定を継続的に行うことができるように構成されたグルコース濃度測定装置であって、グルコース脱水素酵素を導体成分に固定化した電極を有するグルコースセンサと、上記血液または間質液と上記電極との間の電子授受量に相関した応答量を測定するための測定部と、上記測定部での測定結果に基づいてグルコース濃度を演算する演算部と、上記演算部においてグルコース濃度を演算するタイミングを制御する制御部と、を備えており、かつ、上記グルコース脱水素酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチドが補酵素として結合し、かつグルコース脱水素活性を有する触媒活性サブユニットと、上記触媒活性サブユニットから供与された電子を、上記導体成分に授与するための電子伝達サブユニットと、を含むタンパク質複合体であることを特徴としている。

グルコース脱水素酵素としては、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来するものを使用するのが好ましい。

ここで、本発明でいうブルクホルデリア属に属する微生物は、グルコース脱水素活性を有するαサブユニット（触媒活性サブユニット）、またはチトクロムＣ（βサブユニット）を含む酵素（以下、単に「ＧＤＨ」ということがある）を産出できるものであれば特に限定されないが、その中でもブルクホルデリア・セパシア、とくにブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株（以下、単に「ＫＳ１株」ということがある）を用いるのが好ましい。

ＫＳ１株は、温泉付近の土壌から分離した新規菌株であるが、その菌学的性質からブルクホルデリア・セパシアであると同定されており、平成１２年９月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に微生物受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。ＫＳ１株は、その詳細については、国際公開ＷＯ０２／３６７７９号公報に開示されているが、触媒活性サブユニットであるαサブユニット（分子量約６０ｋＤａ）、電子伝達サブユニットであるチトクロムＣに相当するβサブユニット（分子量約４３ｋＤａ）およびγサブユニット（分子量約１４ｋＤａ）を含むＧＤＨを産出することができる。ただし、分子量は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において測定したものである。

なお、本願の特許請求の範囲においては、由来菌によりαサブユニット、チトクロムＣ（βサブユニット）あるいはγサブユニットを特定することがあるが、これは各サブユニットを特定するための便法に過ぎない。すなわち、目的とするサブユニットの発現コードを含むベクターを宿主に移入して形質転換し、この形質転換体から産出されるＧＤＨをグルコース脱水素酵素として使用する場合であっても、相違点がＧＤＨ（サブユニット）の起源のみしかないときには、本願発明の技術的範囲に属することを念のためにここで確認しておく。

上記グルコースセンサは、たとえばグルコース濃度を連続的に測定し、あるいは複数回のグルコース測定を継続的に行うことができるように構成することができる。この場合、グルコースセンサは、皮下組織から血液または間質液を採取するための採取要素をさらに備え、採取要素によって採取した血液または間質液を、電極に接触させることができるように構成される。

採取要素は、たとえば皮膚に突き刺すための中空の穿刺針と、この穿刺針を介して採取された血液または間質液を滞留させるための液溜部と、を備えたものとして構成される。この場合、液溜部に滞留させた血液または間質液を電極に接触させるように構成される。
液溜部は、たとえば電極および穿刺針に接触して配置された多孔質体として構成される。

上記グルコースセンサは、電極の少なくとも一部を、皮下組織に埋め込んで使用するように構成することもできる。この場合、電極は、たとえば可撓性を有する絶縁基板上に形成される。

本発明の第１の実施の形態におけるグルコース濃度測定装置を示す正面図である。 図１のＩＩ−ＩＩ線に沿う断面図である。 図１および図２に示したグルコース濃度測定装置の分解斜視図である。 図１および図２に示したグルコース濃度測定装置のブロック図である。 本発明の第２の実施の形態におけるグルコース濃度測定装置を示す斜視図である。 図５のＶＩ−ＶＩ線に沿う断面図である。 実施例３において用いた測定システムの概略構成図である。 実施例１において、グルコース濃度を変化させたときの応答電流値の測定結果を示すグラフである。 実施例２において、グルコース濃度を変化させたときの応答電流値の測定結果を示すグラフである。 実施例３において、グルコース濃度を一定にしたときの応答電流値の経時変化を測定した結果を示すグラフである。 実施例３において、グルコース濃度を変化させたときの応答電流値の測定結果を示すグラフである。

図１に示したグルコース濃度測定装置Ｘ１は、腕などの皮膚に密着させて使用するものであり、グルコース濃度測定を連続的に行い、あるいは複数回のグルコース濃度測定を継続して行えるように構成されている。図２および図３に示したように、グルコース濃度測定装置Ｘ１は、筐体１およびグルコースセンサ２を有している。

筐体１は、たとえばバンド１０（図１参照）を用いて腕などに固定されるものであり、凹部１１、表示部１２、一対のコネクタピン１３ａ，１３ｂおよび図外の制御回路を有している。凹部１１は、グルコースセンサ２を着脱自在に収容するためのものである。表示部１２は、主として測定結果を表示するためのものであり、ＬＣＤなどにより構成されている。コネクタピン１３ａ，１３ｂは、後述するグルコースセンサ２の作用極３２または対極３３に接触させるためのものである。コネクタピン１３ａ，１３ｂは、グルコースセンサ２の作用極３２と対極３３との間に電圧を印加するために、あるいは電圧印加時の応答電流を測定するために利用されるものである。

グルコースセンサ２は、互いに接合されたセンサ本体３および試料採取部材４を備えており、これらを一体として筐体１に対して着脱自在とされている。このグルコースセンサ２は、たとえば使い捨てとして構成されている。もちろん、センサ本体３と試料採取部材４とを個別に筐体１に対して着脱自在とし、センサ本体３および試料採取部材４を個別に交換するように構成することもできる。

センサ本体３は、絶縁基板３０の下面３１に作用極３２および対極３３を形成したものである。絶縁基板３０には、一対の貫通孔３０ａ，３０ｂが設けられている。貫通孔３０ａは作用極３２を露出させるためのものであり、貫通孔３０ｂは対極３３を露出させるためのものである。すなわち、センサ本体３は、グルコースセンサ２を筐体１の凹部１１に収容させた状態では、コネクタピン１３ａが作用極３２に接触し、コネクタピン１３ｂが対極３３に接触し得るように構成されている。

作用極３２は、導体成分およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含んでおり、グルタルアルデヒドなどの架橋剤によって絶縁基板３０に固定されている。

導体成分は、たとえばカーボン粉末により構成されており、その含有量は、たとえば５〜１００ｍｇとされる。もちろん、導体成分としては、カーボン以外の導体粉末、あるいは多孔質に形成された導体（たとえば導体粉末の焼結体）を使用することもできる。

ＧＤＨとしては、グルコース脱水素活性を有する触媒活性サブユニットおよび電子伝達サブユニットが互いに結合したタンパク質複合体が使用される。

触媒活性サブユニットは、試料中のグルコースから電子を取り出し、この電子を電子伝達サブユニットに供与する役割を果たすものであり、補酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を有するものが使用される。したがって、電子伝達サブユニットに対しては、還元型ＦＡＤを介して、触媒活性サブユニットからの電子が供与される。

触媒活性サブユニットの含有量は、たとえば活性に換算して５〜１００Ｕに相当する量とされる。ここで、酵素１単位（１Ｕ）は、標準検定条件（ｐＨ６．０、３７℃）の下でＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）の還元にもとづく退色を、ＤＣＩＰの吸収波長である６００ｎｍにおいて経時的に計測したときに、１分ごとに１μＭグルコースを酸化する量（モル吸光係数は４．７６×１０００μＭ／ｃｍ）として定義される。

一方、電子伝達サブユニットは、触媒活性サブユニットから授与された電子を、導体成分に供与する役割を果たすものである。電子伝達サブユニットとしては、たとえばチトクロムＣが使用される。

触媒活性サブユニットおよび電子伝達サブユニットとしては、ブルクホルデリア属に属する微生物、たとえばＫＳ１株に由来するタンパク質複合体を使用するのが好ましい。ＫＳ１株由来のＧＤＨは、触媒活性サブユニットとして機能するαサブユニット（還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａ）、電子伝達タンパク質であるβサブユニット（還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａ）、およびγサブユニット（還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約１４ｋＤａ）が結合した３量体として、あるいはαサブユニットとβサブユニットからなる２量体として生成される。もちろん、ＧＤＨとしては、αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットをコードするＤＮＡを移入した形質転換体によって生成させたタンパク質複合体を使用することもできる。

上記微生物あるいは形質転換体によって目的とするＧＤＨを取得する場合には、それらのサブユニット（タンパク質）を個別に精製し、あるいはそれらを個別に準備する必要がなく、さらには電子伝達物質をＧＤＨとは別に作用極３２に含有させる必要がないため、それらの点においてコスト的に有利である。

対極３３は、たとえばカーボンペーストをスクリーン印刷により形成することができる。もちろん、対極３３は、カーボン以外の導体成分により形成することができ、スクリーン印刷以外の手法により形成することもできる。

試料採取部材４は、皮膚から試料（血液または間質液）を採取するためのものであり、絶縁基板４０、穿刺針４１、および液吸収体４２を有している。

絶縁基板４０は、穿刺針４１および液吸収体４２を固定するためのものであり、その下面４０ａには、両面に接着性を有する粘着テープ４３が貼着されている。これにより、絶縁基板４０ひいてはグルコースセンサ２を皮膚Ｓｋに密着して固定することができる。穿刺針４１は、皮膚に突き刺して試料を採取するための部分であり、中空状に形成されている。この穿刺針４１は、絶縁基板４０を貫通し、絶縁基板４０の上面において開放している。液吸収体４２は、穿刺針４１によって採取された試料を保持するためのものであり、穿刺針４１の上端を覆うように配置されている。この液吸収体４２は、筐体１にグルコースセンサ２を収容した状態では、センサ本体３の作用極３２および対極３３に接触する。液吸収体４２は、たとえば多孔質体として形成されている。多孔質体としては、たとえば織布、不織布、編布、あるいは発泡体を使用することができる。なお、液吸収体４２に代えて、採取した試料を保持するための空間を設けてもよい。

グルコース濃度測定装置Ｘ１は、上述の要素に加えて、図４に示したように電圧印加部１４、電流値測定部１５、演算部１６および制御部１７を備えている。

電圧印加部１４は、作用極３２および対極３３に電圧を印加するためのものであり、図面上には表れていないが、コネクタピン１３ａ，１３ｂ（図２参照）に導通接続されている。

電流値測定部１５は、作用極３２と対極３３との間に電圧を印加したときの応答電流値を測定するためのものである。

演算部１６は、電流値測定部１５において測定された応答電流値に基づいて、試料中のグルコース濃度を演算するためのものである。

制御部１７は、各部１２，１４〜１６の動作を制御するためのものである。より具体的には、電流値測定部１５を制御して応答電流値を測定するタイミングを制御し、演算部１６を制御してグルコース濃度を演算させ、あるいは表示部１２を制御して表示部１２での表示内容を制御する。

図２によく表れているように、グルコース濃度測定装置Ｘ１では、グルコースセンサ２を皮膚Ｓｋに固定した上で、筐体１によってグルコースセンサ２を覆うことにより、グルコース濃度測定を連続的に行い、あるいは複数回のグルコース濃度測定を継続的に行うことができる。グルコースセンサ２を皮膚Ｓｋに固定した場合には、試料採取部材４の穿刺針４１が皮膚Ｓｋに突き刺さっている。穿刺針４１が中空に形成されていることから、液吸収体４２には、穿刺針４１を介して試料が供給される。この状態では、液吸収体４２と皮下組織との間が液絡しているために、皮下組織におけるグルコース濃度が変化した場合には、皮下組織でのグルコース濃度と平衡を保つために、液吸収体４２でのグルコース濃度が変化する。すなわち、液吸収体４２でのグルコース濃度は、皮下組織におけるグルコース濃度を反映したものとなる。

一方、液吸収体４２は、作用極３２と接触している。そのため、試料中のグルコースからは、作用極３２の触媒活性サブユニットによって電子が取り出される。この電子は、電子伝達サブユニットに供与される。作用極３２と対極３３との間には、図４に示した電圧印加部１４を介して継続的に電位差が与えられている。これは、電子伝達サブユニットに必要以上に電子が蓄積されるのを抑制し、リアルタイムで応答電流値を測定するためである。電子伝達サブユニットに供与された電子は、作用極３２と対極３３との間に電位差が与えられることによって、導体成分に供与される。作用極３２は、コネクタピン１３ａを介して電流値測定部１５に接続されているため、電流値測定部１５においては、電子伝達サブユニットから供与された電子の量が応答電流値として測定される。

図４に示した制御部１７は、連続的または一定時間毎（たとえば５分〜２時間毎）に応答電流値をサンプリングするとともに、演算部１６に対して、サンプリングされた応答電流値に基づいてグルコース濃度を連続的または一定時間毎に演算させる。演算部１６においては、予め調べられた検量線に対して、測定された応答電流値を当てはめることによりグルコース濃度が演算される。グルコース濃度の演算が終了した場合には、制御部１７は、表示部１２に対して演算部１６における濃度演算結果を表示させる。

グルコースセンサ２では、作用極３２において、酵素として、触媒活性サブユニットに対して電子伝達サブユニットが結合（サブユニット化）したＧＤＨが含有をさせられている。このため、作用極３２においては、触媒活性を有するタンパク質（触媒活性サブユニット）の周りに、作用極３２に対して電子を伝達する機能を有するタンパク質（電子伝達サブユニット）が均一に存在する環境が作り出されている。すなわち、触媒活性を有するタンパク質（触媒活性サブユニット）に対して、分子数で等量の電子伝達タンパク質（電子伝達サブユニット）が密着した状態で存在する。その結果、グルコースセンサ２では、触媒活性タンパク質と触媒電子伝達タンパク質との間の反応速度（電子授受速度）を大きくして応答感度を高めるとともに、安定した応答電流の測定を行うことができる。

次に、本発明の第２の実施の形態について、図５および図６を参照して説明する。

図５および図６に示したグルコース濃度測定装置Ｘ２は、先に説明した本発明の第１の実施の形態に係るグルコース濃度測定装置Ｘ１と同様に、バンドや粘着テープを利用して腕などの皮膚Ｓｋに密着させて使用するものである（図１参照）。このグルコース濃度測定装置Ｘ２は、グルコース濃度測定を連続的に行い、あるいは複数回のグルコース濃度の測定を継続して行うことが可能なように構成されており、グルコースセンサ５および筐体６を有している。

グルコースセンサ５は、筐体６に対して着脱自在とされており、たとえば使い捨て可能なように構成されている。このグルコースセンサ５は、絶縁基板５０上に作用極５１および対極５２が形成された形態を有している。絶縁基板５０は、皮膚Ｓｋに突き刺すための細幅部分５０ａを有するとともに、ポリイミド樹脂などにより可撓性を有するものとして形成されている。作用極５１および対極５２は、端子部５１ａ，５２ａを有している。作用極５１および対極５２は、先に説明したグルコースセンサ２の作用極３２および対極３３（図３参照）と同様にして形成されている。

筐体６は、第１および第２部材６１，６２を有しており、これらの部材６１，６２の間には、空間６３が形成されている。空間６３は、グルコースセンサ５を保持するためのものである。

第１部材６１には、表示部６４および一対のコネクタピン６５ａ，６５ｂが設けられている。表示部６４は、各種の情報を表示するためのものであり、たとえばＬＣＤにより構成されている。コネクタピン６５ａ，６５ｂは、図外の制御回路に繋がっており、空間６３にグルコースセンサ５を保持した状態においては、作用極５１および対極５２の端子部５１ａ，５２ａに接触するように構成されている。この状態においては、コネクタピン６５ａ，６５ｂを利用して作用極５１および対極５２の間への電圧の印加が可能であり、また電圧印加状態においては電流値の測定が可能となる。一方、第２部材６２には、絶縁基板５０の細幅部分５０ａを外部に突出させるための開口部６６が形成されている。

このようなグルコース濃度測定装置Ｘ２では、筐体６にグルコースセンサ５を保持させた状態において、絶縁基板５０の細幅部分５０ａを皮膚Ｓｋに突き刺すことにより、連続的にグルコース濃度測定を行い、あるいは複数回のグルコース濃度測定を継続的に行うことが可能となる。

皮膚Ｓｋに絶縁基板５０の細幅部分５０ａを突き刺した状態においては、作用極５１において血液または間質液のグルコースから電子が取り出される。この電子は、電子伝達サブユニットに供与される。電子伝達サブユニットに供与された電子は、作用極５１および対極５２の間に電位差を与えることにより作用極５１の導体成分に供与される。このときに供与された電子の量は、コネクタピン６５ａ，６５ｂを介して応答電流値として測定することができる。グルコース濃度測定装置Ｘ２においては、連続的または一定時間毎（たとえば５分〜２時間毎）に応答電流値をサンプリングするとともに、サンプリングされた応答電流値に基づいてグルコース濃度が連続的または一定時間毎に演算される。演算結果は、表示部６４において表示される。

グルコースセンサ５においても、作用極５１が触媒活性サブユニットおよび電子伝達サブユニットが結合したタンパク質複合体を含んだものとなっている。そのため、グルコースセンサ５が人体に対して悪影響を与えることはなく、また安定した応答電流の測定をコスト的に有利に行うことができる。

本実施例においては、酵素電極の応答特性について、バッチ式の反応槽を用いて検討した。

酵素電極は、プラスチックチューブ（直径５ｍｍ、長さ３０ｍｍ）の内部に、酵素とカーボン粉末を固定化した構成とした。酵素およびカーボン粉末の固定化は、酵素とカーボンペース（２０ｍｇ）の混合物をプラスチックチューブに充填した後に、プラスチックチューブの内部に、架橋剤としての１％グルタルアルデヒドを含む１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を３０分間含浸させることにより行った。架橋剤における過剰なアルデヒド基は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中で２０分間処理することにより不活性化した。酵素電極は、使用する前に、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬して平衡化しておいた。酵素としては、ＫＳ１株由来のαサブユニット（触媒活性サブユニット）、βサブユニット（電子伝達サブユニット）およびγサブユニットからなるＣｙＧＤＨ（９２．１Ｕ／ｍｇ）、またはＫＳ１株由来のαサブユニット（触媒活性サブユニット）およびγサブユニットからなるαＧＤＨ（２１．３Ｕ／ｍｇ）を使用し、２種類の酵素電極を作成した。酵素電極においては、酵素の含有量を１０Ｕに相当する量とした。

応答特性は、濃度の異なる複数のグルコース溶液について、応答電流を測定した結果に基づいて検討した。応答電流値は、目的濃度に調整されたグルコース溶液を保持した反応槽に対して、酵素電極、参照電極および対極を浸漬するとともに、酵素電極と対極との間に電圧を印加し、参照電極を基準電極として測定した。グルコース溶液は、グルコースを１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させることにより作成した。グルコース溶液の濃度は、０ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、８ｍＭ、１２ｍＭ、２１ｍＭ、３０ｍＭおよび４７ｍＭに設定した。参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用い、対極としてはＰｔ電極を用いた。印加電圧値は＋４００ｍＶとし、応答電流値の測定は、反応槽の温度を２５℃または３７℃に維持して行った。応答電流値の測定結果については、図８に示した。

図８から分かるように、βサブユニット（電子伝達サブユニット）を有しないαＧＤＨを用いた酵素電極では、グルコース濃度の増加に伴う応答電流値の増加量が小さく、作用極における導体成分とαサブユニットとの間で、適切な電子伝達が行われていないことが伺える。これに対して、βサブユニットを有するＣｙＧＤＨを用いた酵素電極では、グルコース濃度の増加に伴う応答電流値の増加量が大きく、良好な応答特性が得られている。すなわち、βサブユニットをαサブユニットに結合（サブユニット化）させることにより、作用極における導体成分とαサブユニットとの間で、適切な電子伝達が行われていることが伺える。このような傾向は、測定温度を２５℃および３７℃に設定した場合のいずれにおいても伺える。したがって、電子伝達タンパク質が結合したＧＤＨを用いた酵素電極では、金属錯体などの電子伝達物質を用いることなく、電極法において、グルコース濃度の測定を行うことができる。

本実施例においては、印加電圧が酵素電極の応答特性に与える影響について、バッチ式の反応槽を用いて検討した。酵素電極は、基本的には実施例１と同様にして作成した。ただし、酵素としては、比活性５６．５Ｕ／ｍｇであるＣｙＧＤＨを用い、また酵素電極における酵素の含有量を５０Ｕに相当する量とした。応答特性については、目的濃度のグルコース溶液を３７℃に維持し、印加電圧を＋４００ｍＶおよび＋２５０ｍＶとした場合のそれぞれについて、応答電流値を測定した結果に基づいて検討した。グルコース溶液の濃度は、０ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、８ｍＭ、１２ｍＭ、２１ｍＭ、および４７ｍＭに設定した。応答電流値の測定結果については、図９に示した。

図９から分かるように、印加電圧値が＋２５０ｍＶの場合には、印加電圧値が＋４００ｍＶの場合に比べて応答電流値が小さくなっているものの、印加電圧値が＋４００ｍＶおよび＋２５０ｍＶのいずれの場合においても適切に応答電流値を測定できるといえる。したがって、電子伝達タンパク質が結合したＧＤＨを用いた場合には、印加電圧値が比較的に小さくても適切に応答電流値を測定し、グルコース濃度を測定することができる。この結果は、連続的あるいは継続的な血糖値モニターを行う場合のように、連続的に電圧を印加する必要がある場合に、あるいは連続的または継続的な血糖値モニターを行うためのグルコース濃度測定装置を、電池によって駆動する場合に、優位に作用する。

本実施例においては、酵素電極を用いての連続的なグルコース濃度のモニターの可能性について、フローセルを用いて検討した。具体的には、（１）７２時間の連続モニター試験、（２）作成初期（未使用）の酵素電極と、７２時間の連続モニターに使用後の酵素電極の応答特性について検討した。

（１）連続モニター試験
連続モニター試験は、図７に概略構成を示した測定システム７を用いて行った。この測定システム７は、反応セル７０に、酵素電極７１、参照電極７２および対極７３を保持させ、反応セル７０の内部にグルコース溶液を供給したときに、これらの電極７１〜７３がグルコース溶液に接触するように構成されたものである。各電極７１〜７３は、ポテンシオスタット７４に接続されている。反応セル７０には、流路７５が規定されており、反応セル７０は、グルコース溶液を連続的に供給・排出可能なフローセルとして構成されている。反応セル７０には、目的とする濃度のグルコース溶液が保持された容器７６から、ポンプ７７の動力を介してグルコース溶液が連続的に供給されるように構成されている。測定システム７では、酵素電極７１として実施例２と同様にして作成したもの、参照電極７２としてフローセル用のＡｇ／ＡｇＣｌ電極、対極７３としてはステンレスチューブが用いられている。

応答電流値は、酵素電極７１と対極７３との間に電圧を印加するとともに、参照電極７２を基準電極として測定した。印加電圧値は＋２５０ｍＶとした。応答電流値の測定は、反応セル７０に対して５ｍＭのグルコース溶液（ｐＨ７．０）を０．１ｍｌ／ｍｉｎの流速で連続的に供給するとともに、グルコース溶液の温度を３７℃に維持した状態において、連続的に測定した。応答電流値の経時変化については、図１０に示した。図１０においては、縦軸の応答電流を、測定時間が「０」のときの値を１００とした相対値として示してある。

（２）使用前後の酵素電極の応答特性
使用前（０ｈ）および使用後（７２ｈ）の酵素電極の応答特性は、図７に示した測定システム７を用いて、目的濃度のグルコース溶液を３７℃に維持した状態において０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で供給し、印加電圧を＋２５０ｍＶとして測定した応答電流値に基づいて検討した。グルコース溶液は、０ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１５．０ｍＭ、２０．０ｍＭおよび２５ｍＭの順に段階的上昇させた後、先とは逆に段階的に濃度を減少させて供給した。応答電流値の測定結果については、図１１に示した。

図１０から分かるように、７２時間の連続モニター試験においては、応答電流値が経時的に低下しているものの、７２時間後においても一定量の応答電流値が測定されている。一方、図１１から分かるように、７２時間の連続モニターに使用した後の酵素電極は、使用前の酵素電極に比べて応答特性が悪くなっているが、グルコース濃度を測定するのに十分な応答特性を有している。これらの結果は、電子伝達タンパク質が結合したＧＤＨを用いた酵素電極においては、７２時間の連続モニター試験後においてもＧＤＨが十分な残存活性を有しており、たとえばＣｙＧＤＨを用いた酵素電極を用いて連続モニターが可能であることを示唆している。

すなわち、酵素電極での応答電流値の経時的劣化を予め調べておいた上で、経時劣化の予測に基づいて、測定値や演算値を補正すれば、連続モニターが可能となる。また、酵素電極を改良して経時劣化を抑制するようにすれば、連続モニターが可能となる。さらには、酵素電極の経時的劣化に伴う応答電流値の減少分を、印加電圧を経時的に増加させて応答電流値を強制的に増大させて相殺すること、すなわち図１１に示した応答電流値が一定値で推移するように印加電圧を制御することにより、連続モニターが可能となる。

連続モニター試験からは、次の知見も得られる。すなわち、最初の１８時間程度の間の応答電流値の減少量が大きく、その後の応答電流値は比較的に安定している。したがって、酵素電極（グルコースセンサ）をある程度意図的に劣化させた後に実際のグルコース濃度測定を行うといった使用方法も考えられる。

また、図１１から分かるように、使用前（０ｈ）および使用後（７２ｈ）の酵素電極（グルコースセンサ）は、グルコース濃度を上昇させる過程（０ｍＭ→２５ｍＭ）とグルコース濃度を減少させる過程（２５ｍＭ→０ｍＭ）との間に良好な相関関係が見受けられる。このことは、血糖値を連続的にモニターする場合のように、グルコース濃度が経時的に変動する環境下において、適切にグルコース濃度を測定できることを意味している。

Claims (20)

1. グルコース脱水素酵素を導体成分に固定化した電極を有しており、
   上記グルコース脱水素酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチドが補酵素として結合し、かつグルコース脱水素活性を有する触媒活性サブユニットと、上記触媒活性サブユニットから供与された電子を、上記導体成分に授与するための電子伝達サブユニットと、を含むタンパク質複合体であることを特徴とする、グルコースセンサ。
2. 上記グルコース脱水素酵素は、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来するものである、請求項１記載のグルコースセンサ。
3. 上記電子伝達サブユニットは、チトクロムＣである、請求項２に記載のグルコースセンサ。
4. 上記触媒活性サブユニットは、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであり、上記チトクロムＣは、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである、請求項３に記載のグルコースセンサ。
5. 上記グルコース脱水素酵素は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約１４ｋＤａであるγサブユニットをさらに含んでいる、請求項４に記載のグルコースセンサ。
6. グルコース濃度を連続的に測定し、あるいは複数回のグルコース濃度の測定を継続的に行うことができるように構成されている、請求項１に記載のグルコースセンサ。
7. 皮下組織から血液または間質液を採取するための採取要素をさらに備えており、
   上記採取要素によって採取した血液または間質液を、上記電極に接触させることができるように構成されている、請求項６に記載のグルコースセンサ。
8. 上記採取要素は、皮膚に突き刺すための中空の穿刺針と、この穿刺針を介して採取された血液または間質液を滞留させるための液溜部と、を備えており、
   上記液溜部に滞留させた血液または間質液を上記電極に接触させるように構成されている、請求項７に記載のグルコースセンサ。
9. 上記液溜部は、上記電極および上記穿刺針に接触して配置された多孔質体である、請求項８に記載のグルコースセンサ。
10. 上記電極の少なくとも一部を、皮下組織に埋め込んで使用するように構成されている、請求項６に記載のグルコースセンサ。
11. 上記電極は、可撓性を有する絶縁基板上に形成されている、請求項１０に記載のグルコースセンサ。
12. 皮下組織から採取した血液または間質液に基づいて、グルコースの濃度を連続的に、あるいは複数回のグルコース濃度の測定を継続的に行うことができるように構成されたグルコース濃度測定装置であって、
    グルコース脱水素酵素を導体成分に固定化した電極を有するグルコースセンサと、
    上記血液または間質液と上記電極との間の電子授受量に相関した応答量を測定するための測定部と、
    上記測定部での測定結果に基づいてグルコース濃度を演算する演算部と、
    上記演算部においてグルコース濃度を演算するタイミングを制御する制御部と、
    を備えており、かつ、
    上記グルコース脱水素酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチドが補酵素として結合し、かつグルコース脱水素活性を有する触媒活性サブユニットと、上記触媒活性サブユニットから供与された電子を、上記導体成分に授与するための電子伝達サブユニットと、を含むタンパク質複合体であることを特徴とする、グルコース濃度測定装置。
13. 上記グルコース脱水素酵素は、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来するものである、請求項１２記載のグルコース濃度測定装置。
14. 上記電子伝達サブユニットは、チトクロムＣである、請求項１３に記載のグルコース濃度測定装置。
15. 上記触媒活性サブユニットは、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであり、上記チトクロムＣは、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである、請求項１４に記載のグルコース濃度測定装置。
16. 皮下組織から血液または間質液を採取するための採取要素をさらに備えており、
    上記採取要素によって採取した血液または間質液を、上記電極に接触させることができるように構成されている、請求項１２に記載のグルコース濃度測定装置。
17. 上記採取要素は、皮膚に突き刺すための中空の穿刺針と、この穿刺針を介して採取された血液または間質液を滞留させるための液溜部と、を備えており、
    上記液溜部に滞留させた血液または間質液を上記電極に接触させるように構成されている、請求項１６に記載のグルコース濃度測定装置。
18. 上記液溜部は、上記電極および上記穿刺針に接触して配置された多孔質体である、請求項１７に記載のグルコース濃度測定装置。
19. 上記電極の少なくとも一部を、皮下組織に埋め込んで使用するように構成されている、請求項１２に記載のグルコース濃度測定装置。
20. 上記電極は、可撓性を有する絶縁基板上に形成されている、請求項１９に記載のグルコース濃度測定装置。

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