JPWO2004072282A1 - 腎症関連遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
糖尿病の発症機序については、重度のインスリン障害が糖尿病状態を導くことが知られている。近年インスリン障害の機序が明らかにされつつあり(稲田明理他、分子糖尿病学、Vol.10、pp.73−81、1999)、糖尿病の発症機序の解明や治療に関する研究が盛んに行われている。しかしながら、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害などの糖尿病性合併症の発症機序については、未だ有効な知見がなく、有効な診断乃至治療方法も開発されていなかった。
一方、糖尿病乃至糖尿病性合併症の診断乃至治療方法の開発のために、糖尿病モデルマウスが開発され(特開平04−248941号公報)、検討されてきた。しかし、従来の糖尿病モデルマウスは、あくまで、低インスリン症状、高血糖症状を示すにとどまっており、糖尿病性合併症に関連する症状を発症したモデルで有効なものは未だ開発されていなかった。唯一、2種類の遺伝子改変マウスを掛け合わせて得られるホモ型マウスで、糖尿病性腎症を示すものが報告されていた(J.Clinical Investigation、vol.108、No.2、p.261、2001)。しかし、これは、膵ランゲルハンス島のインスリン分泌細胞であるβ細胞に障害性に働く一酸化窒素(NO)を産生するNO合成酵素(NOS)を遺伝子的に組み込んで糖尿病を発症するマウス(J.Biol.Chem.、Vol.273、pp.2493−2496、1998)と高血糖状態が持続することで産生されるAdvanced Glycosylation Endproduct(AGE)を処理するために必要なAGE受容体を大量に発現させるトランスジェニックマウスをかけあわせてダブルトランスジェニックマウスとしたもので、両者がともに発現したときにはじめてヒト糖尿病に類似した高度蛋白尿と腎糸球体硬化が現れるものである。このモデルの場合、NOSの膵での過剰発現とNOSの過剰発現といういずれも通常はみられない状態を作り出したもので、実際の糖尿病の状態からはかけ離れているといわざるを得ない。
さらに、ICERがインスリン遺伝子の転写を抑制すること(A.Inada et al JBC 1999 vol.274 no.30 p.21095−21103;A.Inada et al BBRC 1998 vol.253 no.3 p.712−718)および糖尿病状態でICERが増加していること(A.Inada et al BBRC 1998 vol.253 no.3 p.712−718)は知られていたが、ICERと腎症との関連は知られていなかった。
このため、糖尿病性腎症をはじめとする腎症の診断乃至治療に有効な薬物の開発や、腎症乃至糖尿病性腎症の病態モデルとして有用な実験系の開発が強く求められていた。
本発明は、糖尿病性腎症を含む腎症の診断乃至治療に有用な方法、並びに、腎症の病態モデルとして有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供することを主な目的とする。
図2は、ICERIγ発現の影響を評価するために血糖値と血中パラメータの変動を調べた結果を示す。図2a及び2bは血糖値の変化を示し、白丸はワイルドタイプ(WT)、黒丸はトランスジェニックマウス(Tg)を示す。図2aは、0日目と7日目の変化を示す。Tgでは生後7日目で血糖の上昇が認められる。図2bは、20週間の血糖の変化を示す。Tgは高血糖を維持していることが分かる。図2cは血漿インシュリンの変化を示す。Tgではインシュリンは抑制されている。図2dはケトン体(アセトン、アセト酢酸およびβ−ヒドロキシ酪酸)の変化を示す図面である。Tgではケトン体は増加している。図2eはグルカゴンの変化を示す図面である。Tgではグルカゴンの産生が増加している。Fig.2f:生後7日の膵島の抗インスリン(緑)、抗ICERIγ(赤)抗体による染色を示す。Tgでは、ICERIγの発現、およびインスリン産生細胞数の減少が認められた(バーは10μm)。右端は、1つあるいは2つの細胞を示す。
図3は、ICERIγトランスジェニックマウス(Tg)とワイルドタイプ(WT)の体重の変化を調べた図面である。図3bは、0日目と7日目の変化を調べた図面であり、図3a及び図3cは、20週にわたって変化を調べた図面である。生後7日までの成長に差はないが(図3b)、6週位からTgマウスの成長が抑制される(図3c)。
図4aは尿量の変化を示す。Tgは多尿を呈している。図4bは、尿中アルブミンの排泄量の変化を示す。Tgは週齢に従って蛋白尿が増加している。図4cは尿細管障害の指標である尿NAG量の変化を示す。Tgは尿量、尿アルブミン排泄、尿中NAG量のいずれも週齢と共に増加している。尿量、尿アルブミン排泄、尿中NAG量のいずれも、TgはWTに比べて増加している。
図5は腎臓にHE染色を施し光学顕微鏡にて観察した結果を示す。Tgでは、腎盂及び尿細管の拡張が認められる。
図6は腎臓にPAS染色を施し光学顕微鏡にて観察した結果を示す。TgはWTに比べ4週で糸球体の肥大が認められ、12週で硬化が認められる。
図7は37週の糸球体を示す。Tgでは明らかな糸球体硬化がみられる(図7a,b,c)。また糸球体肥大を定量的に調べると、4週から12週で肥大が見られる(図7d)。
図8は腎臓におけるコラーゲンタイプIVの蛍光染色の結果を示す。TgではコラーゲンタイプIVの増加が認められる。
図9は、腎臓におけるコラーゲンタイプIV、ラミニンの蛍光染色の結果を示す。A、Bともに、左がWT、右がTg40週の腎臓切片を示し、C、Dはそれぞれを判定した点数を示す。Tgでは、コラーゲンタイプIV、ラミニンの増加が認められた。
図10:Tg23系統(line Tg23)の膵島の形態学(islet morphology).
A:生後0日(day0)から36週齢(36wk of age)までの膵切片の抗インスリン(pink)及び抗グルカゴン(red)抗体を用いた免疫組織化学染色。Tg:生まれたとき(day0)でさえすでにインスリン産生細胞(β細胞)が少なくなり、膵島(islet)は有意に増大したグルカゴン産生細胞(glucagon+)(red)で組織が極度に乱れている(severely disorganized)ようである。血糖の正常なday0の時点でβ細胞がすでに激減していることから、これらの変化は高血糖の二次的作用によるものではなくICERIγ増大に直接起因することを示す。
B:生後7日目(day7)のTgのインスリン産生細胞(矢印)の減少。(x1000)
Tgではインスリンを産生しているβ細胞が減少しており、産生している細胞においても細胞あたりのインスリン量にばらつきが大きい。
C:生後7日目の膵島をグルカゴン(緑)とβ細胞マーカーのIAPP(赤)での二重染色(dual staining)の共焦点顕微鏡(confocal microscopy)分析(x1000)
Tgではグルカゴン産生細胞が異常に多く見られ(Aの結果)、また産生量がWTの約2倍に増加している。これは、インスリン産生細胞が激減し、膵島の形が保てなくなり配列が乱れ、グルカゴン産生細胞が増加したものと考えられる。
IAPPはインスリン産生細胞で産生され、β細胞のマーカーとして用いた。β細胞のマーカーとして一般にはインスリンを用いるが、Tgでは、インスリンが少ないため、β細胞が存在していてもインスリン抗体では染まらないため、インスリン以外のβ細胞のマーカーでβ細胞の存在を確認した。
D:生後7日目のインスリン産生細胞(矢印)のscattered singlet/doublet。Tgでもβ細胞の新生は正常に起こっていることが確認された。(x400)
このマウスでは、インスリン遺伝子の転写が阻害されインスリンが激減した事に加え、インスリンを産生するβ細胞自身も少なくなった結果、正常な血糖値を保つことができなくなり高血糖値になったと考えられる
図11:Tg23系統(line Tg23)のday7での膵島の発現及び増殖
A:生後7日目の膵島(islet)をインスリンとKi67でのdual stainingをconfocalmicroscopyで分析したもの
生後7日目はもっともβ細胞の新生・増殖が盛んなときであるので、増殖マーカーであるKi67(緑:核)が発現してくるはずであるが、Tgではインスリン産生細胞であるβ細胞(赤)にKi67の発現を一切認めなかった
B:生後7日目の膵島をサイクリンAで染めたもの
生後7日目はもっともβ細胞の新生・増殖が盛んなときであるので、DNA合成に重要であるサイクリンA(緑)が発現してくるはずであるが、TgではサイクリンAの発現が減少していた。
すなわち、本発明は、以下の事項に係る。
1.転写因子CREMファミリーに属するインスリン転写抑制因子をコードすることを特徴とする腎症関連遺伝子。
2.インスリン転写抑制因子がCREMα、ICERI及びICERIγからなる群から選ばれるいずれか1つである項1に記載の遺伝子。
3.インスリン転写抑制因子がICERIγである項1に記載の遺伝子。
4.配列番号1で表される塩基配列、その相補配列又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、腎症を発症させることができる項1の遺伝子。
5.配列番号2で表される塩基配列、その相補配列又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、腎症を発症させることができる項1の遺伝子。
6.腎症が糖尿病性腎症である項1に記載の遺伝子。
7.前記遺伝子がヒト由来である項1に記載の遺伝子。
8.項1〜7のいずれか1項に記載の遺伝子を含む腎症発症剤。
9.項1〜7のいずれか1項に記載の遺伝子を含む糖尿病性腎症発症剤。
10.項7に記載の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な15塩基以上のヌクレオチド配列からなるヒト腎症判定乃至診断用プローブ。
11.転写因子CREMファミリーに属するインスリン転写抑制因子活性を有する腎症関連蛋白質。
12.CREMα、ICERI及びICERIγからなる群から選ばれるいずれか1つである項10に記載の腎症関連蛋白質。
13.ヒト由来である請求項11に記載の蛋白質。
14.項11〜13のいずれかに記載の蛋白質又はその部分に特異的に結合する抗体。
15.ヒト腎症関連蛋白質と特異的に結合する項14に記載の抗体。
16.項15に記載の抗体を含有するヒト腎症診断薬。
17.項7に記載のヒト腎症関連遺伝子に対するアンチセンスDNA。
18.項15に記載の抗体または項17に記載のアンチセンスDNAを有効成分とする腎症予防乃至治療薬。
19.項10に記載のプローブまたは項12に記載の抗体を用いて、検体における項7に記載のヒト腎症関連遺伝子の発現レベルを調べる工程を有する腎症の判定又は診断方法。
20.項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子を導入してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
21.腎症を発症する項20に記載の哺乳動物。
22.前記腎症が糖尿病性腎症である項21に記載の哺乳動物。
23.糖尿病を発症する項20に記載の哺乳動物。
24.前記糖尿病が糖尿病性腎症を併発する項23に記載の哺乳動物。
25.項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子を導入する工程を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
26.項20〜25のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該哺乳動物の腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種に対して被検物質が与える影響を測定する工程を有する腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種の予防乃至治療薬のスクリーニング方法。
27.項7に記載のヒト腎症関連遺伝子のプロモーターの制御下にマーカー遺伝子を組み込んでなる、哺乳類細胞で安定発現可能な発現ベクター。
28.項27に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳類細胞。
29.哺乳類細胞がヒト細胞である項28に記載の方法。
30.項28または29に記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記マーカー遺伝子の発現量を測定する工程を含むヒト腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種の予防ないし治療薬のスクリーニング方法。
31.項26または30に記載のスクリーニング方法によって得られる物質を有効成分として含有する腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種の予防ないし治療薬。
以下、本発明について、より詳細に説明する。
腎症関連遺伝子
本願発明に係る遺伝子は、転写調節因子(cAMP Responsible Element(CRE))に結合してインスリン遺伝子の転写を調節する因子CREM(cAMP responsive element modulator)のファミリーに属するインスリン転写抑制因子をコードする。本発明者は、該遺伝子が腎症の発症機序や腎症の病状の進行等に関連していることを明らかにした。
転写因子CREMのファミリーに属するインスリン転写抑制因子としては、例えば、ICERI(inducible cAMP early repressor I),ICERIγ,CREMα等が挙げられる。このうち、ICERIγが、特に有用である。
本願発明の腎症関連遺伝子には、マウス由来の遺伝子(配列番号1、2など)の他に、ヒト、ラット、サル、イヌ、ウサギ、ハムスター、ウシ、ウマなどの哺乳動物由来の腎症関連遺伝子が広く包含され、これらの遺伝子或いはその相補鎖又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドが包含される。特に、マウス由来の遺伝子は、トランスジェニックマウスの作製に有用であり、ヒト由来の遺伝子は、ヒトの腎症の診断または将来的に腎症になる可能性の評価、ヒトの腎疾患治療薬の探索に有用である。
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件とは、通常、「1xSSC,0.1%SDS,37℃」程度であり、好ましくは「0.5xSSC,0.1%SDS,42℃」程度であり、更に好ましくは「0.2xSSC,0.1%SDS,65℃」程度である。ハイブリダイゼーションによって得られるDNAは、例えばマウス由来の腎症関連遺伝子の場合、配列番号1又は2に記載の塩基配列により表わされるDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、60%以上の相同性、好ましくは75%以上の相同性、更に好ましくは90%以上の相同性を指す。さらに、ハイブリダイゼーションによって得られるDNA或いは該DNAによりコードされる腎症関連蛋白質は、腎症を発症させる作用を有する。
CREMファミリーである転写抑制因子は、インシュリン転写活性の調節因子であって、該因子が過剰に発現すると、インシュリンの産生が低下し、糖尿病様の症状が発症する。本発明者は、該因子の発現によって、糖尿病様の症状だけでなく、腎症が発症することを明らかにした。該因子の高発現によって腎症が導かれるということは、該因子及び該因子をコードする遺伝子が、腎症の発症や症状の進行等の機序に深く関与していることを示唆するものである。
このような性質を有する本発明の腎症関連遺伝子は、腎症の発症機序や進行の解明、更には、腎症患者の症状の解明などに寄与するものであり、腎症発症用、腎症解析用、腎症検出用、腎症診断用などとして有用に用い得るものである。
特に、本発明の遺伝子を高発現させると、糖尿病性腎症を発症させることから、糖尿病性腎症発症用、糖尿病性腎症解析用、糖尿病性腎症検出用、糖尿病性腎症診断用などとして有用に用い得るものである。
本発明の遺伝子は、宿主となる哺乳動物中で高発現するプロモーターの制御下に、必要に応じてベクター等に組み込み、腎症発症剤乃至糖尿病性腎症発症剤として利用できる。該腎症発症剤乃至糖尿病性腎症発症剤は、例えば、糖尿病性腎症発症モデル動物の作成などに利用することができる。
本発明の腎症関連遺伝子は、該遺伝子を高発現させると腎症(特に糖尿病性腎症)を発症させるが、腎症以外の糖尿病合併症(血管障害、網膜症、神経障害など)を同時に発現させる可能性がある。特に神経障害については、STZ(ストレプトゾトシン)誘発糖尿病モデルでもみられることから、本発明のトランスジェニックマウスでも起きている可能性が高いと考えられる。
腎症関連遺伝子とそのGeneBankアクセス番号を以下に例示する:
AJ311667,AJ292222(mouse ICERI);
S67786(mouse ICERIr);
AB031423(rat CREM17X)
S66024(rat ICERII)
U44836(human ICERI)
S68271,Z15159,Z15158(human CREM)
U04835(rat CREM)
M60285(mouse CREM)
本発明の腎症関連遺伝子は、これらに限定されず、CREMファミリーに属するインスリン転写抑制因子を広く包含し、さらにこのようなインスリン転写抑制因子とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る改変体を包含する。
本発明の腎症関連遺伝子は、全身で発現させることもできるが、膵臓、腎臓などの臓器、好ましくは膵臓、より好ましくは膵臓のランゲルハンス島細胞で選択的に発現させるのが好ましい。例えば、膵臓のランゲルハンス島細胞での選択的な発現は、腎症関連遺伝子をインスリンプロモーターの制御下に発現させればよく、他の部位/臓器での選択的発現は、発現部位/臓器で選択的に発現される遺伝子のプロモーターの制御下に本発明の腎症関連遺伝子をおけばよい。
例えば、膵臓で発現させる場合、インスリンプロモーターの他に、グルカゴン、消化酵素(トリプシン、キモトリプシン、ペプシンなど)などの膵臓で選択的に発現するのプロモーターに連結させても腎症(糖尿病性腎症を含む)及び糖尿病モデルの作製に有用であると考えられる。
本発明の腎症関連遺伝子を高発現させると、コラーゲンIVとラミニンが増加し、これらの現象は、糸球体の硬化を示している。糸球体が硬化すると、濾過能力(GFR)が落ちて腎機能傷害がおき、腎不全、最終的には尿毒症になる。また、これに付随して血管内圧も上昇し、高血圧になる。従って、本発明の腎症関連遺伝子を高発現させると、これらの各種腎疾患の病態のモデルを作製できる。
プローブ
本発明のプローブは、上記本発明の遺伝子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な15塩基以上の配列、特に本発明の遺伝子又はその相補鎖と相補的なヌクレオチド配列よりなるものであって、腎症判定乃至診断用等の腎症に関連する事項を調べる目的等に有用に用い得るものである。また、腎症解析用、腎症検出用などとしても用いることができる。本発明のプローブは、特に糖尿病性腎症判定乃至診断用として好適に用いることができる。
本発明の好ましい実施形態の1つにおいて、該プローブはヒトの腎症診断の対象となるヒト腎症関連遺伝子の配列の一部を有するものである。
本発明のプローブは、適当な標識を付与し、疾患マーカーとして利用することもできる。
本発明のプローブ又は疾患マーカーは、検体試料に接触させて、プローブと結合する遺伝子またはその発現産物(mRNA)の有無や量を測定する工程等に用いることによって、腎症乃至糖尿病性腎症の発症の有無や進行度の判断などの腎症乃至糖尿病性腎症の診断乃至判定に有効に用いることができる。
蛋白質
本発明の蛋白質は、転写因子CREMファミリーに属するインスリン転写抑制因子活性を有し、腎症に関連した機能を有する。具体的には、該蛋白質は腎症の発症や進行、症状の進展等に関する機能を有する。本発明の蛋白質は、腎症のうち、特に糖尿病性腎症に関連した機能を有している。
インスリン転写抑制因子としては、例えば、CREMα、ICERI及びICERIγなどが挙げられる。このうち、ICERIγが特に有用である。
本発明の蛋白質を取得する方法は特に限定されないが、例えば、以下のような方法で得ることができる。
本発明の遺伝子、例えば、配列番号1又は2に記載の配列を有する遺伝子を、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで得られた発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作成する。ベクターとしては、例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、SV40系ベクター、バキュロウィルスベクターなどを用いることができる。宿主としては、例えば、菌類、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞などを用いることができる。
作成した形質転換体を培養し、培養物中に生成蓄積する蛋白質を採取することによって、本発明の腎症関連蛋白質を得る。生産された蛋白質は、公知の精製方法、例えば、無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法、免疫沈降法などの公知の精製技術を用いることによって、分離精製することができる。また公知の方法で適宜製剤化することもできる。
本発明の蛋白質は、腎症の発症や進行の機序との強い関連性を有すると考えられ、腎症の診断や、腎症の発症機序の解析、腎症の悪性度の判定などに有効に利用することができる。
抗体
本発明の抗体は、上記本発明の腎症関連蛋白質またはその一部と特異的に結合する抗体であって、腎症関連蛋白質を検出又は測定しうるものであり、腎症関連蛋白質検出用、腎症診断用、腎症検出用又は腎症判定用、腎症治療用などとして有用に用い得るものである。本発明の抗体は、腎症のうち、特に糖尿病性腎症に対し、好適に用いることができる。
本発明の蛋白質又はその一部と特異的に結合し得るものであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の何れであってもよい。
モノクローナル抗体は、例えば、次のように製造される。本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを抗原として免疫された非ヒト哺乳動物、例えばマウスから、抗体価の認められる個体を選択し、最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を探取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する。該ハイブリドーマを培養して、抗体を産生し、適宜分離精製を行うことによって、モノクローナル抗体を得ることができる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法(Nature,256,495,1975)やその変法(J.Immunol.Method,39,285,1980、Eur.J.Biochem.,118,437,1981、Nature,285,446,1980)に従い、実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルス等が用いられる。また、本発明のモノクローナル抗体を適宜公知の方法を用いてヒト化抗体として用いてもよい。
ポリクローナル抗体は、例えば、次のように作成できる。蛋白質抗原自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、モノクローナル抗体の製造方法と同様に非ヒト哺乳動物に免疫を行う。該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより、得ることができる。
本発明の抗体を用いることにより、腎症関連蛋白質の検出または測定を行うことができる。また、本発明の抗体を利用して、腎症(糖尿病性腎症を含む)の検出、判定又は診断等を行うことができる。例えば、検体から調製した試料に、本発明の抗体を接触させ、腎症関連蛋白質の発現量や存在する部位を検出乃至測定することによって、腎症の発症や重症度、予後の判定や診断などを行うことができる。特に、腎症のうち、糖尿病性腎症に対し、有用に利用できる。
また、本発明の抗体は、適宜製剤化して、腎症診断薬や検出乃至判定薬、または腎症の予防乃至治療薬等として用いることもできる。腎症診断薬は、例えば、腎症関連蛋白質に関する検出乃至測定を行う医薬などとして利用できる。また、腎症の予防乃至治療薬は、例えば、腎症関連蛋白質の発現又は機能を抑える医薬などとして利用できる。本発明の抗体を含有する医薬は、特に、糖尿病性腎症の診断薬、または、糖尿病性腎症の予防乃至治療薬として、有用に利用できる。
予防または治療剤
本発明の腎症関連遺伝子は、腎症、特に糖尿病の合併症としての腎症を発症させることができる。従って、該遺伝子の発現ないし機能を抑制する物質は、腎症の予防ないし治療剤だけでなく、糖尿病性腎症の予防ないし治療剤、さらには糖尿病の予防ないし治療剤としても有用である。
腎症関連遺伝子の発現ないし機能抑制剤、該遺伝子のアンチセンスDNA、腎症関連蛋白質に対する抗体などは、腎症、糖尿病性腎症、糖尿病の予防ないし治療剤として有用であり得る。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明におけるトランスジェニック非ヒト哺乳動物とは、上記本発明の遺伝子を導入し、遺伝子組換えにより作成した、ヒト以外の哺乳動物のことをいう。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ウサギ、ラットなどが挙げられる。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作成する方法としては、例えば、位相差顕微鏡下で前核期卵子の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法(マイクロインジェクション法)、胚性幹細胞(ES細胞)を使用する方法、レトロウィルスベクターまたはアデノウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵子に感染させる方法、または、精子を介して遺伝子を卵子に導入する精子ベクター法などが挙げられる。
本発明の1つの好ましい実施形態において、腎症関連遺伝子(例えばICER、ICERIγ)のトランスジェニックマウス(Tgマウス)は、該遺伝子を膵臓のβ細胞に特異的に過剰発現させる。その結果、高血糖に起因して糖尿病になり、それが原因で腎症、即ち、純粋な糖尿病性腎症を引き起こすことができる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、腎症に特徴的な以下の症状を示す。
1)尿量、尿中アルブミン量、及び尿中NAG量が大量になる;
2)腎盂の肥大を示す;
3)腎細管の拡大を示す;
4)糸球体の初期の肥大と繊維化、その後の硬化が観察される。
更に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、重度の糖尿病に特徴的な、以下の症状も示す。
5)多飲;
6)多尿;
7)低体重;
8)高血糖;
9)低インスリン。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物モデルでの最も重要な症状は、1)の尿中アルブミン量の増大と2)〜4)の症状(腎盂の肥大、腎細管の拡大、糸球体の初期の肥大と繊維化、その後の硬化)である。これまでの糖尿病モデルでは尿量の増加は認められたものの、蛋白尿は認められていなかった。唯一ダブルトランスジェニックマウスで認められていますが、実際の糖尿病の状態とはかけ離れていると考えられ、特に糖尿病の合併症としての糖尿病性腎症の症状(蛋白尿や糸球体硬化)を示すモデルは本発明により初めて提供された。
従って、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、腎症モデル動物だけでなく糖尿病モデル動物として有用に利用し得るものである。
特に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ヒトの糖尿病性腎症によく類似した症状を発症していることから、糖尿病性腎症モデル動物として、有用である。例えば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて、腎症乃至糖尿病性腎症の診断乃至治療薬の候補物質のスクリーニングを行うことができる。また、候補物質の適切な投与量や投与時期、副作用などを調べることもできる。
スクリーニング
本発明を適用すれば、腎症乃至糖尿病性腎症診断乃至治療薬の候補物質のスクリーニングを効率よく行うことができる。
例えば、上記本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該哺乳動物の腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種に対して被検物質が与える影響を測定することによって、腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種の診断乃至治療薬の候補物質のスクリーニングを行うことができる。
また、ヒト転写抑制因子、例えばヒトICERIγのプロモーター、及び、該プロモーターにより発現され得るよう連結されたレポーター遺伝子を含むベクターにより形質転換されたヒト形質転換細胞株の培養系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標として、腎症乃至糖尿病性腎症、糖尿病の治療に有効な物質のスクリーニングを行うこともできる。
これらのスクリーニング方法によって得られた物質を有効成分として、適宜製剤化、又は適当な薬学的許容担体と組み合わせて調製することにより、腎症乃至糖尿病性腎症の治療剤乃至診断薬を作成することができる。
ICERIγトランスジェニックマウスの作製
ICERIγcDNAを、トランスジェニックプラスミドplns−1のヒトインスリンプロモーター下流に挿入した。トランスジーンカセット(plns−ICERIγプラスミド)は制限酵素によって切り出し、精製し、C57BL/6xC57BL/6マウス(純C57BL/6マウス)の受精卵に導入した。トランスジェニックマウス(Tg)は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、tail DNAのPCR(polymerase chain reaction)解析により確認した;
human insulin promoter,5’−ATGGGCTCTGAGACTATAAAGCCAG−3’(forward);SEQ ID NO.1
rabbit β globin,5’−TGGATCCTGAGAACTTCAGG−3’(forward1);SEQ ID NO.2
5’−GCTGGTTATTGTGCTGTCTC−3’(forward2);SEQ ID NO.3
ICERIγ,5’−CAGTTTCATCTCCAGTTACAGCCAT−3’(reverse1);SEQ ID NO.4 and
5’−CTGCTTTATGGCAATAAGG−3’(reverse2);SEQ ID NO.5。
トランスジーンのコピー数は、サザンブロット法にて検討した。すべての実験においてトランスジェニックマウスでない同腹子(wild−type;WT)を使用した。すべてのマウスは京都大学動物施設指針に従って扱った。
血糖値、血中パラメーター、血圧、HbA1cの測定
血糖値は尻尾より得た全血でenzyme−electrode法により測定した。血は麻酔下で膵島を単離する前にすばやく心臓より探取した。
インスリン、ケトン、グルカゴンは、以下のELISA kitを用いて測定した。
インスリン(insulin):MORINAGA Institute of Biological Science、
ケトン体(ketone):Sanwa Kagaku、
グルカゴン(glucagons):Yanaihara Institute Inc.
血圧は、Tail cuff methodを用いて測定した。
HbA1cはDCA 2000 analyzerを用いて測定した。
膵島の単離、インスリン分泌、コンテント
膵島はコラゲナーゼ法によって単離した。インスリン分泌能、インスリンコンテント及びDNAコンテントは、12週齢のTg(n=5)およびWT(n=5)から単離されたフレッシュな膵島を用いてバッチインキュベーション法(batch incubation)、RIA,フルオロメトリックアッセイ(fluorometric assay)によって測定した。
RNA単離、Reverse transcriptase−polymerase chain reaction
Total RNAは10週齢のTg(n=10)とWT(n=10)からフレッシュに単離された膵島からTRIZOL試薬(GibcoBRL)を用いて抽出した。Total islet RNAの存在は電気泳動によって確認した。1本鎖cDNAはSuperscript Reverse Transcriptaseを用いてtotal islet RNAから合成した。トランスジーンから発現されるICERIγmRNAの発現はマウスislet cDNAと以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR法にて検討した。
rabbit β globin;5’−TGGATCCTGAGAACTTCAGG−3’(forward;SEQ ID NO.2)and ICERIγ;5’−CTGCTTTATGGCAATAAGG−3’(reverse;SEQ ID NO.5)、
コントロールβ−actin;5’−ATCCGTAAAGACCTCTATGC−3’(forward;SEQ ID NO.6),
5’−AACGCAGCTCAGTAACAGTC−3’(reverse;SEQ ID NO.7)。
これらのプライマーはゲノムDNAとmRNAを区別するためにまたRNA準備段階でDNAがコンタミしていないかどうか確認することができるように遺伝子のイントロンをまたぐようにデザインされている。イントロンを含むTgゲノムDNAとトランスジーンをもたないWT islet cDNAをコントロールとして使用した。PCR conditionsは40cycles of 94℃for15s、55℃for15s、72℃for30s、72℃for 5minであった。PCR産物は2%アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
ウェスタンブロッティング
Tgの膵島においてICER蛋白の発現を検討するためにウェスタンブロッティングを行った。10週齢のTg(n=3)とWT(n=3)から単離した膵島を細胞溶解液(50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl,1%TritonX−100,1% sodium deoxycholate,0.1%SDS,22mM EDTA,1%Trasilol)の中でつぶし、遠心法によって不溶解物を除いた後、上清(30μg)を4−20%ポリアクリルアミドSDSゲルに泳動し、トランスバッファー(25mM Tris,190mMグリシン,20%メタノール)中でポリビニリデンジフルオリドメンブレン(polyvinyliden difluoride membranes)にトランスファーした。メンブレンは5%スキムミルク含有リン酸緩衝液(skim milk in phosphate−buffered saline)でブロッキングし、抗CREM抗体(diluted to 1:250;Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)で2時間37℃でインキュベートした。続けて2次抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ(houseradish peroxidase−linked anti−rabbit)IgG(Amersham Pharmacia Biotech)で30分37℃でインキュベートした。これらのそれぞれのステップでは5% Tween 20/リン酸緩衝液で10分3回ずつ洗った。検出は、ECLプロトコール(Amersham Pharmacia Biotech)に従って行った。
ノーザンブロッティング
Total islet RNA(20μg)を1xMOPS(5xMOPS:0.1M MOPS,40mM sodium acetate,5mM EDTA),6.7%ホルムアルデヒド(formaldehyde)及び50%ホルムアミド(formamide)の液中で55℃15分denatureした後に、1.2%ホルムアルデヒドアガロースゲル(formaldehyde agarose gel)で電気泳動し、メンブレンにブロッティングした。65℃で1時間プレハイブリした後、ラットインシュリンcDNAプローブで一晩ハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリ、ハイブリダイゼーションともに65℃で5x sodium chloride−sodiumucitrate(SSC),0.1%sodium dodecylsulfate液中で行った。メンブレンは65℃で0.1x SSC and 0.1% sodiums dodecylsulfate液で2回30分洗った。プローブのラベリングとデテクションはGene Images random prime labeling & detection system(Amersham Pharmacia Biotech)を用いた。
尿量、尿中アルブミン量、尿中NAG量
上記のように作成した4週齢から36週齢のマウスを個々のmetabolicケージに飼い、24時間畜尿を行った。畜尿中はマウスが自由に餌と水を得ることができるようにした。尿中アルブミン量と尿中NAG量の測定はそれぞれAlubuwell kit(Exocell Inc.),NAG test kit(Shionogi)を使用した。
組織学的検討
(I)腎臓(半分)をメチルカルノイ液で固定後、パラフィン包理を行い、ミクロトームにて2μMに薄切した。その標本に、PAS、PAM染色後を施し、光学顕微鏡にて観察した。残りの腎臓片は蛍光染色に供した。
糸球体面積はPAS染色検体を用いて解析した。硬化指数はPAM染色検体をスコア化して(スコア0−3:0=染色なし、1=3分の1以上、2=3分の1から3分の2、3=3分の2以上)測定した。
蛍光染色においては、組織をただちにOCTコンパウンドに包理し、アセトン−ドライアイスにて凍結した。このブロックをクライオスタットにて3.5μMに薄切した。1次抗体はウサギポリクローナル抗マウス(rabbit polyclonal anti−mouse)コラーゲンタイプ(CALBIOCHEM)およびウサギポリクローナル抗マウス(rabbit polyclonal anti−mouse)コラーゲンタイプIV(Progen Biotechnik)を使用した。2次抗体はFITC標識ヤギ抗ウサギ(goat anti−rabbit)(Burlingame)を使用した。
(II)取り出した腎臓と膵臓の一部はカルノイ固定あるいは10%フォルマリン固定した後パラフィン包埋した。残りは冷アセトン固定の後、OCT包埋にて凍結切片(4μm)にした。一部の腎臓切片(3μm)はPAS(periodic acid−Schiff)染色に用いた。それぞれの週齢において6〜8個の腎臓を用いて盲検法により形態学的検討を行った。免疫染色は以下の1次抗体を用いて行った;
抗ICERIγ抗体(1:500;Dr.J.F.Habenerより提供された,Massachusetts General Hospital,Howard Hughes Medical Institute,MA);抗インスリン抗体(1:500;DAKO,Kyoto,Japan);抗コラーゲンI抗体(1:50;Calbiochem);抗コラーゲンIV抗体(1:250;Progen);及び、抗ラミニン抗体(1:100;Sigma)。
1次抗体はFITC標識2次抗体あるいはテキサスレッド標識2次杭体(1:200)で蛍光検出した。またビオチン標識の2次抗体で検出後、DABで染色を行った。染色切片は共焦点顕微鏡(Zeiss LSM 410)で撮影した。糸球体におけるコラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニンの発現は盲検法により半定量的に検討した。判定には以下の点数を用いた;0=正常、1=変化が糸球体内の25%以下、2=変化が25−50%、3=変化が50−75%、4=変化が75%以上。
(2)データ解析
上記のデータは平均±標準誤差(SE)で表示した。統計学的比較はStudent’s t−testを用いて行った。P値は0.05未満を有意差があるものと考えた。
(3)評価
トランスジェニックマウスにおけるICERIγ発現
上記方法で作成したICERIγトランスジェニックマウスを用いて、ICERIγ過剰発現による影響を評価した。用いたコンストラクトを図1aに示す。評価には、Tg7、Tg12及びTg23の3系のトランスジェニックマウスを使用した。ICER mRNAの存在は、rabbit β globin及びICERIγ特異的オリゴヌクレオチドに特異的な配列を増幅してReverse transcriptase−polymerase chain reaction(RT−PCR)で確認した。トランスジーンから転写されたICERIγmRNAに対応する、イントロンがスプライスされたPGR産物が、ICERIγトランスジェニックマウスで検出された(図1b参照)。イントロンを含むTgゲノムDNAと、フラグメントを含まないワイルドタイプマウス(Wild−type mice(WT))islet cDNAをコントロールとして使用した。またICERIγ蛋白発現を抗CREM抗体で確認した。CREM抗体がICERを認識することは既に報告されている。ウェスタンブロットを行った結果、トランスジェニックマウスにICERIγが過剰発現していることがわかった(図1c参照)。更に、10週齢のICERIγトランスジェニックマウスとWTコントロールから抽出したtotal islet RNAを使用して、インシュリンmRNAの発現レベルを解析した。ICERIγトランスジェニックマウスのインシュリンmRNAの発現量はコントロールと比べて明らかに低かった(図1d参照)。
インシュリンmRNAのダウンレギュレーションとICERIγ高発現が対応していることは、ICERIγがインシュリンの転写活性の抑制に関与していることを示唆するものである。
さらに、インスリン産生細胞(β細胞)は、day0では既に少なくなっており、β細胞の減少はICERIγが直接の原因である(図10A〜D)。
Tgでは、β細胞に過剰発現したICERIγがcell cycleの中のDNA合成期に重要な働きをするサイクリンAの発現を抑制し、β細胞の増殖が抑制されることによりβ細胞数が減少したものと考えられる(図11)。
ICERIγ高発現の影響
ICERIγ高発現の影響を評価するために、血中パラメーターを測定した。ICERIγトランスジェニックマウスは重度の糖尿病を発症した。ICERIγトランスジェニックマウスの血糖レベルは、0日目は標準であったが、7日目では著しく増加しており、更に、2週齢でも増加しており、その後も高いレベルを示した(図2a及びb参照)。血漿インシュリン濃度は著しく低く、6週目ではコントロールの5分の1にすぎなかった(図2c参照)。血中ケトンレベルは、6週目及び12週目で著しく高く、更に死亡前まで増加した(図2d参照)。血漿グルカゴンレベルも著しく高かった(図2e参照)。トランスジェニックマウス(Tg)では、ICERIγの発現、およびインスリン産生細胞数の減少が認められた(Fig.2f)。
0日目と7日目の体重はコントロールと同様であったが(図3b参照)、ICERIγトランスジェニックマウスの体重は増加せず、8週齢後にわずかな増加を示した(図3a及び3c参照)。
次いで、3系のトランスジェニックの雄と雌について、血漿パラメーターと体重を比較した。結果を表1に示す。
トランスジーン陽性の3系のICERIγトランスジェニックマウス(Tg7,Tg12およびTg23)を確立した。結果は、各群少なくとも10動物の平均±SEで表す。12週齢の雄と雌のどちらにおいても、ICERIγトランスジェニックマウスのみが低インシュリンと高血糖を示した。Tg7及びTg12は、Tg23とは異なるコピー数のトランスジーンを含有しているが、体重、血糖レベル、インシュリンレベルにおいて意味のある差異は見られなかった。これらの結果は、ICERIγの特異的な高発現と重度の糖尿病の症状との間に強い関連があることを示すものである。
腎臓への影響
更に、ICERIγトランスジェニックマウス(Tg)における腎臓への影響を評価した。尿量の変化を調べたところ、Tgでは多尿を呈していた(図4a)。また、尿中アルブミンの排泄量を調べたところ、Tgでは、週齢に従って蛋白尿が増加していた(図4b)。また、尿細管障害のマーカーである尿NAGを解析したところ、Tgでは週齢と共に増加していた(図4c)。このように、Tgの尿量、尿中アルブミン量、尿中NAG量を測定した結果、いずれも、WT(コントロール)に比べて極めて大量であった。
更に、28週齢のWTとTgについて、比較して解析を行った。比較した結果を表2に示す。
表2中、*はP<0.05で有意であることを示す。
Tgのグリコヘモグロビン(HbA1c)量は、ワイルドタイプ(WT)に比べて著しく増加していた。血圧は、Tgの方がWTに比べて低くなっていた。また、TgはWTに比べて低体重となっているにも関わらず、腎臓の体重に対する比重(Kidney/body weight(%))は、TgがWTよりもかなり大きくなっていた。
更に、ICERIγトランスジェニックマウスの腎臓に関し、組織学的な検討を行った。その結果、腎の腫大や腎盂や尿細管の拡張が見られた(図5)。Tgマウスでは、糸球体は4週齢で肥大し(図6)、12週齢で硬化が認められた。37週齢では、Tgでは明らかな糸球体硬化がみられた(図7a,b,c)。糸球体肥大を定量的に調べると、4週から12週で肥大が見られた(図7d)。また繊維化を示すコラーゲンタイプIV、ラミニンの増加がみられた(図8、9)。
これらはヒトの糖尿病性腎症とよく似た症状であり、本発明が、腎症になりにくいstrain(C57BL/6)の初の糖尿病性腎症モデルマウスとして有用であることを示すものである。
本発明の遺伝子又は蛋白質を利用することによって、腎症、特に糖尿病性腎症の診断乃至治療を有効に行うことができる。例えば、本発明の遺伝子に基づくプローブや本発明の蛋白質に結合する抗体を用いることによって、腎症乃至糖尿病性腎症の発症の診断乃至判定や発症機序の解明等を行うことができる。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、腎症、特に糖尿病性腎症とよく似た症状を発症していることから、腎症、特に糖尿病性腎症の適正な評価モデルとして有効に利用し得る。
更に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物等を用いれば、腎症乃至糖尿病性腎症の判定乃至診断や、若しくは腎症乃至糖尿病性腎症の予防乃至治療薬の有効成分のスクリーニング等を効率よく行うこともできる。
本発明は、腎症乃至糖尿病性腎症の診断乃至治療において、極めて優れた手段を提供するものである。
Claims (31)
- 転写因子CREMファミリーに属するインスリン転写抑制因子をコードすることを特徴とする腎症関連遺伝子。
- インスリン転写抑制因子がCREMα、ICERI及びICERIγからなる群から選ばれるいずれか1つである請求項1に記載の遺伝子。
- インスリン転写抑制因子がICERIγである請求項1に記載の遺伝子。
- 配列番号1で表される塩基配列、その相補配列又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、腎症を発症させることができる請求項1の遺伝子。
- 配列番号2で表される塩基配列、その相補配列又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、腎症を発症させることができる請求項1の遺伝子。
- 腎症が糖尿病性腎症である請求項1に記載の遺伝子。
- 前記遺伝子がヒト由来である請求項1に記載の遺伝子。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の遺伝子を含む腎症発症剤。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の遺伝子を含む糖尿病性腎症発症剤。
- 請求項7に記載の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な15塩基以上のヌクレオチド配列からなるヒト腎症判定乃至診断用プローブ。
- 転写因子CREMファミリーに属するインスリン転写抑制因子活性を有する腎症関連蛋白質。
- CREMα、ICERI及びICERIγからなる群から選ばれるいずれか1つである請求項10に記載の腎症関連蛋白質。
- ヒト由来である請求請求項11に記載の蛋白質。
- 請求項11〜13のいずれかに記載の蛋白質又はその部分に特異的に結合する抗体。
- ヒト腎症関連蛋白質と特異的に結合する請求項14に記載の抗体。
- 請求項15に記載の抗体を含有するヒト腎症診断薬。
- 請求項7に記載のヒト腎症関連遺伝子に対するアンチセンスDNA。
- 請求項15に記載の抗体または請求項17に記載のアンチセンスDNAを有効成分とする腎症予防乃至治療薬。
- 請求項10に記載のプローブまたは請求項12に記載の抗体を用いて、検体における請求項7に記載のヒト腎症関連遺伝子の発現レベルを調べる工程を有する腎症の判定又は診断方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子を導入してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 腎症を発症する請求項20に記載の哺乳動物。
- 前記腎症が糖尿病性腎症である請求項21に記載の哺乳動物。
- 糖尿病を発症する請求項20に記載の哺乳動物。
- 前記糖尿病が糖尿病性腎症を併発する請求項23に記載の哺乳動物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子を導入する工程を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
- 請求項20〜25のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該哺乳動物の腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種に対して被検物質が与える影響を測定する工程を有する腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種の予防乃至治療薬のスクリーニング方法。
- 請求項7に記載のヒト腎症関連遺伝子のプロモーターの制御下にマーカー遺伝子を組み込んでなる、哺乳類細胞で安定発現可能な発現ベクター。
- 請求項27に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳類細胞。
- 哺乳類細胞がヒト細胞である請求項28に記載の方法。
- 請求項28または29に記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記マーカー遺伝子の発現量を測定する工程を含むヒト腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種の予防ないし治療薬のスクリーニング方法。
- 請求項26または30に記載のスクリーニング方法によって得られる物質を有効成分として含有する腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも1種の予防ないし治療薬。
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