JPWO2003070939A1 - プロモーター活性を有するdna断片 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、担子菌、特にコリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)から得られたプロモーター活性を有する新規DNA断片、それを含む組換えDNA、該DNA断片または組換えDNAを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該宿主細胞を利用したリグニン分解酵素の高生産方法、並びに該酵素を利用した木材チップ処理方法に関する。
背景技術
現在まで、組換えDNA技術を用いて多様なポリペプチドを産生する系は大腸菌(E.coli)を中心とする宿主系を用いて行われている。しかしながら、大腸菌は宿主として適さない場合が多い。例えば、大腸菌において、ヒトなど高等生物由来の有用なポリペプチドを生産させる場合、活性型酵素タンパク質として生産されないこと、また目的ポリペプチド以外にも多数の毒性物質を産生し、目的産物の精製が非常に困難となる等の問題点がある。これらの問題点を解決する手段として下等真核生物の酵母を宿主として生産する方法が盛んに研究されているが、生産性が低いという問題点が新たに生じている。そこで、ポリペプチド産生のため、より高等生物である真核生物としてアスペルギルス(Aspergillus)属などの糸状菌、またファネロケエテ(Phanerochaete)属やコリオラス(Coriolus)属などの担子菌を宿主とした形質転換系が開発され、酵素タンパク質生産が検討されている。
担子菌は真核生物に属するが、酵母よりも動物細胞に近縁であると考えられている(T.L.Smith,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,7063(1989))。リグニン分解力が強いコリオラス・ヒルスタスはコリオラス属に属する担子菌類であり、本発明者らにより宿主・ベクター系が開発され、組換えDNA技術を用いて、これまで困難とされていたリグニンペルオキシダーゼ生産に成功している(特開平6−054691号公報)。しかしながら、用いるプロモーター領域はアミノ酸合成系酵素遺伝子であるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子やリグニン分解に関与するフェノールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域であるため、リグニンペルオキシダーゼの生産性が低く、野生株IFO 4917株をリグニンペルオキシダーゼ生産用培地(低炭素・低窒素源)で生産した時と同程度であり、またリグニンペルオキシダーゼが二次代謝産物として得られるために遺伝子発現に時間を要するなどの問題点があった。さらに、他の生物種、例えば糸状菌などの遺伝子組換えによる酵素タンパク質生産系に供されているプロモーターは、担子菌では機能しないことが報告されている(A.Lorna,et.al.,Curr.Genet.,16,35(1989))。
そこで、担子菌類で機能する、より強力な転写活性を有するプロモーターに対する関心が高まっており、本出願人は先に、コリオラス・ヒルスタス由来のグリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列を含んでなるDNA断片とそれを用いた宿主・ベクター系(特開平9−47289号公報)、また、コリオラス・ヒルスタス又はシイタケ由来のras遺伝子プロモーター領域又はpriA遺伝子プロモーター領域を含んでなるDNA断片とそれを用いた宿主・ベクター系(特開2000−342275)を見出している。
しかしながら、現在まで、セルロース分解系酵素のプロモータを用いて有用ポリペプチド、特にリグニン分解酵素を担子菌において効果的に大量に産出し得る、さらなるプロモーターDNA断片及び該断片を用いた宿主・ベクター系、該宿主・ベクター系を用いたリグニン分解酵素の高生産方法、並びに該酵素を利用した木材チップ処理方法の開発は未だ開示されていない。
発明の開示
本発明は、担子菌の宿主において有用ポリペプチド、特にリグニン分解酵素を高生産させるためのプロモーターを提供することを目的とする。また、本発明は、該プロモーターを含む宿主・ベクター系、該系を利用したリグニン分解酵素の高生産方法、並びに該酵素を利用した木材チップの処理方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、セルロース等の木質バイオマス成分の存在下で発現する担子菌、特にコリオラス・ヒルスタスのセルロース分解酵素遺伝子に着目し、コリオラス・ヒルスタスの染色体DNA制限酵素断片から各種セルロース分解酵素遺伝子をコードするDNA断片をクローン化し、この遺伝子の上流に存在するプロモーター領域を配列決定し、このプロモーター領域が宿主・ベクター系において有用ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に有効であることを見出した。
さらに、該プロモーター領域の下流に、コリオラス・ヒルスタスからクローニングしたマンガンペルオキシダーゼ遺伝子、高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子(特開平5−260978号公報)またはラッカーゼ遺伝子のシグナルペプチドを含む構造遺伝子を連結し、宿主細胞であるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損コリオラス・ヒルスタス変異株に移入することにより、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ又はラッカーゼ高生産株を取得することに成功し、本発明を完成することに至った。
したがって、本発明は以下の(1)〜(12)を提供する。
(1) 担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該DNA断片に結合されている組換えDNA、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、該リグニン分解酵素高生産宿主細胞をセルロース存在下で培養し、リグニン分解酵素を生産する工程とからなる、リグニン分解酵素の生産方法。
(2) 担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該DNA断片に結合されている組換えDNA、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、該リグニン分解酵素高生産宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とからなる、木材チップの処理方法。
(3) セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列が、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼI遺伝子、セロビオヒドロラーゼII遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、又はβ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーター配列である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片が、以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片である、(1)、(2)又は(3)に記載の方法。
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号1又は2において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(5) セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片が、以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片である、(1)、(2)又は(3)に記載の方法。
(a)配列番号13、25又は37で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号13、25又は37において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(6) セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片が、以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片である、(1)、(2)又は(3)に記載の方法。
(a)配列番号49で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号49において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(7) リグニン分解酵素をコードする遺伝子が、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子およびラッカーゼ遺伝子からなる群から選択される、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 担子菌がコリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)である、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9) 宿主細胞がコリオラス・ヒルスタスである、(1)〜(8)のいずれかに方法。
(10) (1)〜(9)のいずれかに記載の方法によって得られる木材チップ。
(11) (10)に記載の木材チップを用いたパルプの製造法。
(12) (11)に記載の方法によって得られるパルプ。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2002−048674号、2002−206762号、2002−251720号、2002−251923号及び2002−252055号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
配列表の説明
配列番号3は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。
配列番号4は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含む2.3kbp DNA断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号5は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含む2.3kbp DNA断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号6は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp DNA断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号7は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp DNA断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号8は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む1.7kbp DNA断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号9は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含むDNA断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号10は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含むDNA断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号11は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含むDNA断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号12は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含むDNA断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号16は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のプラスミドpCHCBHI31遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。なお、塩基“y”はチミジンもしくはシチジンを示し、塩基“r”はグアノシンもしくはアデノシンを示す。
配列番号17は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のプラスミドpCHCBHI31遺伝子プロモーター領域を含む2.3kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号18は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のプラスミドpCHCBHI31遺伝子プロモーター領域を含む2.3kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号19は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号20は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号21は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む2.4kbp XhoI−EcoRI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号22は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む2.4kbp XhoI−EcoRI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号23は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号24は、コリオラス属コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号28は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。塩基“i”はイノシンを示す。
配列番号29は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII(CBHII)遺伝子プロモーター領域を含む3.1kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号30は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター領域を含む3.1kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号31は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号32は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号33は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む2.4kbp XhoI−EcoRI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号34は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む2.4kbp XhoI−EcoRI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号35は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号36は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号40は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。塩基“y”はチミジンもしくはシチジンを示し、塩基“r”はグアノシンもしくはアデノシンを示す。
配列番号41は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII(CBHI26)遺伝子プロモーター領域を含む1.1kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号42は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII(CBHI26)遺伝子プロモーター領域を含む1.1kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号43は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号44は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号45は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む2.4kbp XhoI−EcoRI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号46は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む2.4kbp XhoI−EcoRI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号47は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号48は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号52は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子を含むクローンをスクリーニングするためのプローブを示す。塩基“i”はイノシンを示す。
配列番号53は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター領域を含む3.1kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号54は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター領域を含む3.1kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号55は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号56は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号57は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む2.4kbp XhoI−EcoRI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号58は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のラッカーゼ構造遺伝子部分を含む2.4kbp XhoI−EcoRI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
配列番号59は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのセンスプライマーを示す。
配列番号60は、コリオラス・ヒルスタスIFO 4917株由来のリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を含む2.2kbp NcoI断片をPCRで合成するためのアンチセンスプライマーを示す。
発明を実施するための形態
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、第1の態様において、担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該DNA断片に結合されている組換えDNA、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、該リグニン分解酵素高生産宿主細胞をセルロース存在下で培養し、リグニン分解酵素を生産する工程とからなる、リグニン分解酵素の生産方法を提供する。
該方法の第1の工程として、担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該DNA断片に結合されている組換えDNA、を含むベクターを作製する。
本発明において、セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列とは、セルロースを分解し得る酵素のプロモーター配列であれば特に限定されないが、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼI遺伝子、セロビオヒドロラーゼII遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、又はβ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーター配列が好ましい。
担子菌はセルロース分解能を有する属種であればいかなる菌も利用可能であるが、特に、和名をアラゲカワラタケと称するコリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)が好適である。
セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片は、例えば、以下の1.〜3.に示すようなDNA断片を使用することができる。
1. 以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片。
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号1又は2において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
2. 以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片。
(a)配列番号13、25又は37で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号13、25又は37において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
3. 以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片。
(a)配列番号49で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号49において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
上記1.に記載のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片は以下のような手順で得ることができる。
コリオラス・ヒルスタスから染色体DNAを調製するには、Yeltonらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,1470(1984)]等、通常の染色体DNAの抽出法を用いることができる。次に、得られた染色体DNAをSau3AI等の適当な制限酵素で処理し、部分分解を行った後ショ糖密度勾配超遠心法で分画して10kbp〜25kbpの断片を得る。同じ付着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージDNAに、上記で得られたDNA断片を連結する。当該ファージDNAとしては、例えば、EMBL3[A−M,Frishaufら,J.Mol.Biol.170,827(1983)]λファージDNAが用いられる。得られたDNA断片連結ファージについてin vitroでパッケージングを行い、染色体DNAライブラリーとする。またサブクローニングには常用のクローニングベクター、好ましくは大腸菌クローニングベクター、例えばpUC系ベクターであるpUC18[C.Yanisch−Perron et al.,Gene,33,103(1985)]等を用いることができる。クローニングベクターは上記例示のものに制限されず、市販されるか、文献記載の公知のものが使用できる。
上記で得られた染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子の単離にあたっては、精製後のコリオラス・ヒルスタスのセロビオースデヒドロゲナーゼをリジルエンドペプチダーゼを用いて完全消化し、アミノ酸シークエンスを行い、このアミノ酸配列から推定される塩基配列に基づいて作製した合成DNAプローブを用い、プラークハイブリダイゼーションによりセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含むクローンを選択する。選択したクローンからセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片を単離し、制限酵素地図の作成および配列決定を行う。配列決定は、上記のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む断片を適当なクローニングベクター(例えばpUC19等のpUC系ベクター)に挿入し、Sangerらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977))によって行うことができる。
上記の手順により、配列番号1又は2で表されるコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含むDNA断片の塩基配列が決定された。
セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含むDNA断片は、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む断片からPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって得ることができる。PCRのためのプライマーとしては、配列番号1で表される塩基配列およびその相補配列に基づく約10〜50塩基、好ましくは約15〜30塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば配列番号4に示すセンスプライマー、配列番号5に示すアンチセンスプライマーを使用することができる。(実施例3参照)。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
本発明におけるプロモーター配列又はプロモーター領域は、構造遺伝子の転写を調節する機能を有するものであり、真核生物のプロモーター内で実質的に保存されている機能的塩基配列をモティーフ(TATA,CCAA,GCボックスなど)を少なくとも含む。従って、配列番号1で表される塩基配列はそのようなプロモーター配列の1つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列に相補的な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列も本発明の範囲内である。ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が15〜900mM、好ましくは15〜150mMであり、温度が37〜80℃、好ましくは50〜65℃での条件をいう。
なお、遺伝子に変異または改変を行うには、配列番号1又は2で表される塩基配列を基に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的変異技術(例えば、Short protocols In Molecular Biology,Third Edition,John Wiley & Sons,Inc.)を用いて実施可能である。
なお、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含むゲノムDNA断片を保有する大腸菌形質転換株、Escherichia coli JM109/pCHCDH1及びEscherichia coli JM109/pCHCDH2は、2002年2月8日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託され、それぞれ受託番号FERM BP−8278、FERM BP−8279が付与されている。これらの寄託株に含まれる配列番号1で表される塩基配列を有するDNAも、本発明に包含される。
また、上記2.に記載のセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター配列を含む単離された3種類のDNA断片は以下のような手順で得ることができる。
1)セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター配列を含む単離された第1のDNA断片
前記と同様にして、コリオラス・ヒルスタスから染色体遺伝子ライブラリーを調製した。次いで、得られた染色体遺伝子ライブラリーから、他生物種(例えばファネロケエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)等)から単離されているセロビオヒドロラーゼI遺伝子の塩基配列に基づいて作製した合成DNAプローブを用いるプラークハイブリダイゼーションによってセロビオヒドロラーゼI遺伝子とプロモーター領域をともに含むクローンを選択する。選択したクローンから目的の遺伝子を含むDNA断片を単離し、配列決定を行う。配列決定は、上記のセロビオヒドロラーゼI染色体遺伝子を含む断片を適当なクローニングベクター(例えばpUC19等のpUC系ベクター)に挿入し、Sangerらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977))によって行うことができる。
上記の手順により、配列番号14に示す塩基配列が決定された。この配列を有する遺伝子は、コリオラス属由来のセロビオヒドロラーゼI遺伝子およびその上流にセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含む4624塩基対からなるゲノム遺伝子(配列番号14)である。配列中、プロモーター領域は塩基番号1〜2293(配列番号13)に存在し、塩基番号2202〜2207にTATAAAが認められる。一方、セロビオヒドロラーゼI構造遺伝子は、塩基番号2294〜3775に存在し、3個のエキソンと2個のイントロン(介在配列)によって構成されている。具体的には、イントロン1は2586〜2637、イントロン2は2965〜3022にそれぞれ存在している。さらに塩基番号3776〜4624はターミネーターを含む3’非翻訳領域である。配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、457アミノ酸残基からなる配列番号15に示すアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含むDNA断片は、上記のセロビオヒドロラーゼI染色体遺伝子を含む断片からPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって得ることができる。PCRのためのプライマーとしては、配列番号13に示される塩基配列およびその相補的配列に基づく約10〜50塩基、好ましくは約15〜30塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば配列番号17に示すセンスプライマー、配列番号18に示すアンチセンスプライマーを使用することができる(実施例15参照)。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
なお、配列番号13に示す塩基配列はそのようなプロモーター配列の1つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列において1個または複数の塩基の欠失、置換、付加等の変異または改変を含む配列も本発明の範囲内である。このような変異または改変は、配列番号13に示す塩基配列を基にオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的突然変異技術(例えばShort protocols In Molecular Biology,Third Edition,John Wiley & Sons,Inc.)を用いて実施可能である。
2)セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター配列を含む単離された第2のDNA断片
上記の第1のDNA断片の場合と同様にして、第2のDNA断片の配列決定を行った。その結果、配列番号26に示す塩基配列が決定された。この配列を有する遺伝子は、コリオラス属由来のセロビオヒドロラーゼI遺伝子およびその上流にセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含む4170塩基対からなるゲノム遺伝子である。配列中、プロモーター領域は塩基番号1〜2182(配列番号25)に存在し、塩基番号2099〜2104にTATAAAが認められる。一方、セロビオヒドロラーゼI遺伝子は、塩基番号2183〜3667に存在し、3個のエキソンと2個のイントロン(介在配列)によって構成されている。具体的には、イントロン1は2475〜2535、イントロン2は2862〜2917にそれぞれ存在している。さらに塩基番号3668〜4170はターミネーターを含む3’非翻訳領域である。配列の解析から推定されるアミノ酸配列は457アミノ酸残基からなる配列番号27に示されるアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含む第2のDNA断片は、上記のセロビオヒドロラーゼI染色体遺伝子を含む断片からPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって得ることができる。PCRのためのプライマーとしては、配列番号25に示される塩基配列およびその相補的配列に基づく約10〜50塩基、好ましくは約15〜30塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば配列番号29に示すセンスプライマー、配列番号30に示すアンチセンスプライマーを使用することができる(実施例25参照)。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
なお、配列番号25に示す塩基配列はそのようなプロモーター配列の1つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列において1個または複数のヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異または改変を含む配列も本発明の範囲内である。このような変異または改変は、配列番号1に示す塩基配列を基にオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的突然変異技術(例えばShort protocols In Molecular Biology,Third Edition,John Wiley & Sons,Inc.)を用いて実施可能である。
3)セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター配列を含む単離された第3のDNA断片
上記の第1のDNA断片の場合と同様にして、第3のDNA断片の配列決定を行った。その結果、配列番号38に示す塩基配列が決定された。この配列を有する遺伝子は、コリオラス属由来のセロビオヒドロラーゼI遺伝子およびその上流にセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含む3916塩基対からなるゲノム遺伝子である。配列中、プロモーター領域は塩基番号1〜1086(配列番号37)に存在し、塩基番号1001〜1006にTATAAAが認められる。一方、セロビオヒドロラーゼI構造遺伝子は、塩基番号1087〜2579に存在し、3個のエキソンと2個のイントロン(介在配列)によって構成されている。具体的には、イントロン1は1379〜1444、イントロン2は1771〜1829にそれぞれ存在している。さらに塩基番号2580〜3916はターミネーターを含む3’非翻訳領域である。配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、456アミノ酸残基からなる配列番号39に示されるアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含む第3のDNA断片は、上記のセロビオヒドロラーゼI染色体遺伝子を含む断片からPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって得ることができる。PCRのためのプライマーとしては、配列番号37に示される塩基配列およびその相補的配列に基づく約10〜50塩基、好ましくは約15〜30塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば配列番号41に示すセンスプライマー、配列番号42に示すアンチセンスプライマーを使用することができる(実施例25参照)。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
なお、配列番号37に示す塩基配列はそのようなプロモーター配列の1つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列において1個または複数の塩基の欠失、置換、付加等の変異または改変を含む配列も本発明の範囲内である。このような変異または改変は、配列番号37に示す塩基配列を基にオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的突然変異技術(例えばShort protocols In Molecular Biology,Third Edition,John Wiley & Sons,Inc.)を用いて実施可能である。
上記3.に記載のセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片は以下のような手順で得ることができる。
上記1.に記載の方法と同様にして、染色体DNAライブラリーを得た。次いで、得られた染色体DNAライブラリーから、他生物種(例えば、ファネロケエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)等)から単離されているセロビオヒドロラーゼII遺伝子の塩基配列に基づいて作製した合成DNAプローブを用い、プラークハイブリダイゼーションを行うことによって、セロビオヒドロラーゼII遺伝子を含むクローンを選択する。選択したクローンからセロビオヒドロラーゼII遺伝子を含むDNA断片を単離し、配列決定を行う。
配列決定は、上記のセロビオヒドロラーゼII遺伝子を含むDNA断片を適当なクローニングベクター(例えばpUC19等のpUC系ベクター)に挿入し、Sangerらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977))によって行うことができる。
上記の手順により、配列番号50に示す塩基配列が決定された。この配列を有する遺伝子は、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子の構造遺伝子、その上流のプロモーター領域およびターミネーターを含む3’非翻訳領域を含む4933塩基対からなるゲノム遺伝子である。
配列中、プロモーター領域は塩基番号1〜3121(配列番号49)に存在し、塩基番号3059〜3064にTATAAAが認められる。一方、セロビオヒドロラーゼIIの構造遺伝子は、塩基番号3122〜4822に存在し、7個のエキソンと6個のイントロン(介在配列)によって構成されている。具体的には、エキソン1は3122〜3221、エキソン2は3280〜3346、エキソン3は3402〜3549、エキソン4は3605〜4220、エキソン5は4275〜4363、エキソン6は4425〜4676、エキソン7は4736〜4822にそれぞれ存在している。また、イントロン1は3222〜3279、イントロン2は3347〜3401、イントロン3は3550〜3604、イントロン4は4221〜4274、イントロン5は4364〜4424そしてイントロン6は4677〜4735にそれぞれ存在している。さらに、塩基番号4823〜4933はターミネーターを含む3’非翻訳領域である。また、配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、453アミノ酸残基からなる配列番号51に示されるアミノ酸配列であることがわかった。
セロビオヒドロラーゼII遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を含むDNA断片は、セロビオヒドロラーゼII遺伝子を含む断片からPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって得ることができる。PCRのためのプライマーとしては、配列番号49で表される塩基配列およびその相補配列に基づく約10〜50塩基、好ましくは約15〜30塩基からなる配列をセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用いることができる。例えば、配列番号53に示すセンスプライマー、配列番号55に示すアンチセンスプライマーを使用することができる(実施例3参照)。
また、常法に従って化学合成によっても得ることができる。
なお、配列番号49で表される塩基配列はそのようなプロモーター配列の1つの具体例であり、プロモーター活性を有する限り、該塩基配列に相補的な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列も本発明の範囲内である。ここでストリンジェントな条件とは、配列番号49に示す塩基配列との相同性が70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、特に95%以上である、配列番号49で表す配列において1個または2個以上の塩基の欠失、置換、付加等の変異または改変を含む配列とハイブリダイゼーション可能である条件を意味し、例えば、ナトリウム濃度が15〜900mM、好ましくは15〜150mMであり、温度が37〜80℃、好ましくは50〜65℃での条件をいう。
なお、遺伝子に変異または改変を行うには、配列番号49で表される塩基配列を基に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異法などの周知の部位特異的変異技術(例えば、Short protocols In Molecular Biology,Third Edition,John Wiley & Sons,Inc.)を用いて実施可能である。
リグニン分解酵素をコードする遺伝子とは、リグニンを分解し得る酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子、ラッカーゼ遺伝子などがあげられる。これらの遺伝子は、ジーンバンクに登録されている配列、文献記載の配列等に基づいて周知のゲノムクローニングまたはcDNAクローニング法やPCR法を行うことによっても取得可能である。あるいは、寄託されている遺伝子については、分譲請求により入手可能なものを利用することができる。
また、本方法の第1の工程において、転写可能とは、宿主内でプロモーターの作用下でリグニン分解酵素をコードする遺伝子のmRNAへの転写が起こることを意味する。リグニン分解酵素をコードする遺伝子は、セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を有するDNA断片の下流に結合され、プロモーターの作動によりmRNAに転写される。
セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片とリグニン分解酵素をコードする遺伝子は、必要に応じて制限部位の導入、平滑末端化または付着末端化後、適当なDNAリガーゼを用いて連結することができる。クローニング、連結反応、PCR等を含む組換えDNA技術は、例えば、J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989やShort Protocols In Molecular Biology,Third Edition,A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.に記載されるものを利用することができる。
ベクターの種類は特に限定されないが、このベクターによって形質転換される宿主の種類に応じて選択される。ベクターとしては、原核または真核生物宿主細胞において自律複製可能または染色体中に相同組替え可能なベクターを使用することができる。プラスミド、ファージを含むウイルス、コスミドなどである。ベクターは、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター、ポリリンカー、エンハンサー、リボゾーム結合部位などを適宜含むことができる。細菌、真菌、酵母、動物、植物などの原核および真核生物用の種々のベクターが市販されているか、あるいは、文献等に記載されており、これらを利用して本発明のDNA断片または組換えDNAをベクターに導入することができる。DNA導入は、例えば、J.Sambrookら(上記)に記載される技術を使用して実施することができる。
本方法の第2の工程において、上記に規定するベクターによって形質転換されたリグニン分解酵素高生産宿主細胞を作製する。
ここで宿主細胞は、担子菌、真菌類、酵母類を含む菌類だけではなく、他の真核細胞(動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、藻類など)や原核細胞(細菌、藍藻など)であっても、リグニン分解酵素をコードする遺伝子の発現においてプロモーター活性を発揮できるならば、いずれの宿主細胞も使用可能である。このうち、好ましい宿主細胞は担子菌であり、特に好ましくはコリオラス・ヒルスタスである。例えば、具体的には、後述の実施例に記載されている、コリオラス・ヒルスタスのオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性を欠損している栄養要求性変異株OJI−1078(FERM BP−4210)を宿主として使用できる。更に選抜マーカー遺伝子としてはコリオラス・ヒルスタスから単離したオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を含む大腸菌組換え株JM109/pUCR1(特開平6−054691号公報;FERM BP−4201)を用いることができる。
形質転換法としては、塩化カルシウム/PEG法、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポーレーション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法などを例示できるが、これらに限定されない。
本方法の第3の工程においては、上記の形質転換されたリグニン分解酵素高生産宿主細胞をセルロース存在下で培養し、リグニン分解酵素を生産する。
リグニン分解酵素は、シグナルペプチドとの融合形態で発現・翻訳されるときには分泌形態で産生され、この場合には培地から直接単離することができるが、一方、ポリペプチドが非分泌形態で産生されるときには細胞を分離して、超音波処理、ホモゲナイジング等の処理により細胞を破壊して抽出液を得、この抽出液からポリペプチドを単離することができる。単離・精製は、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈殿、限外濾過、イオン交換、疎水性相互作用、HPLC、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの方法を単独にまたは組み合わせて行うことができる。
例えば、本発明のプロモーター領域の下流にマンガンペルオキシダーゼ遺伝子部分又はリグニンペルオキシダーゼ遺伝子部分又はラッカーゼ遺伝子部分を連結した組換えベクターで形質転換した宿主細胞を培養することにより、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ又はラッカーゼを大量に生産することができる。前記各遺伝子は、特に限定されず、配列が公知の各種遺伝子を用いることができるが、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているマンガンペルオキシダーゼcDNA遺伝子を含む大腸菌組換え株JM109/pBSMPOC1(FERM P−14932)、マンガンペルオキシダーゼ染色体遺伝子を含む大腸菌組換え株JM109/pBSMPOG1(FERM P−14933)、高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌組換えE.coli XL−1blue/pBSLPOG7(FERM P−12683)、また、FERM BP−2793(染色体遺伝子)、FERM P−10055(cDNA)およびFERM P−10061(cDNA)として寄託されているラッカーゼ(別称:フェノールオキシダーゼ)遺伝子を含む大腸菌組換え株(特公平7−46995号公報;特公平6−85717号公報)を用いることによって得ることができる。
本発明の第2の態様として、担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該DNA断片に結合されている組換えDNA、を含むベクターを作製する工程と、該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、該リグニン分解酵素高生産宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とを含む、木材チップの処理方法を提供する。
担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該DNA断片に結合されている組換えDNA、を含むベクターを作製する工程、及び該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程については、上記の第1の態様において定義したとおりである。
リグニン分解酵素高生産宿主細胞は、木材チップに接種して処理することにより、パルプ製造工程において叩解エネルギー削減や蒸解時間短縮による省エネルギー化を図ることができる。
処理は、例えば以下のようにして行うことができる。
得られたリグニン分解酵素高生産宿主細胞をポテトデキストロース寒天培地上で培養した後、低温(4℃)で保存し、このプレートから打ち抜いた切片を、グルコース・ペプトン培地(グルコース2%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.2%、KH2PO4、MgSO40.05%、リン酸でpH4.5に調製)を100mlずつ含む300ml容三角フラスコに植菌し、28℃、100rpmで1週間振盪培養する。培養後、宿主細胞をろ別し、滅菌水で洗浄し、残存していた培地を除去する。
次いで、得られたリグニン分解酵素高生産宿主細胞を滅菌水と共に、ワーリングブレンダーで15sec粉砕し、絶乾重量1kgのユーカリ材の木材チップに対し、宿主細胞の乾燥重量が1gになるように植菌する。植菌後は宿主細胞が全体に行き渡るようによく撹拌する。培養は28℃で通気をしながら1週間静置培養を行う。また、木材チップ含水率が40〜65%になるように随時飽和水蒸気を通気させる。通気する際の通気量は対チップ当り、0.01vvmになるように行う。
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
1.セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
[実施例1] 染色体遺伝子ライブラリーの作製
コリオラス・ヒルスタス(IFO 4917株)の平板寒天培養から直径5mmの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、グルコース・ペプトン培地(グルコース2%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.2%、KH2PO40.1%、MgSO4・7H2O0.05%、リン酸でpH4.5に調製)200mlに植菌し、28℃で7日間回転振盪培養を行った。菌体を集菌後、1Lの滅菌水で菌体を洗浄し、液体窒素で凍結した。
この凍結菌体5gを乳鉢を用いて粉砕した。粉砕した菌体を遠心管に移し、溶菌緩衝液(100mMトリス(pH8)、100mM EDTA、100mM NaCl、さらにプロテイナーゼKを100μg/mlとなるように添加)10mlを加え、55℃で3時間インキュベートした。インキュベート後、フェノール処理、クロロホルム処理を行い、水層部分にエタノールを徐々に添加しDNAが析出したところで染色体DNAを巻取り、TE溶液に懸濁した。
得られた染色体DNA100μgを制限酵素Sau3AIで部分分解し、5〜20%ショ糖密度勾配超遠心分離(30,000rpm,18時間)により分画し、20〜40kbp断片区分を集めた。この断片区分を東洋紡社製ファージλEMBL3−BamアームにT4DNAリガーゼを用いて連結し、得られたファージDNAをSTRATAGENE社製ギガパックゴールドを用いてパッケージング後、大腸菌P2392株(前記ギガパックゴールドに含まれている)に感染せしめ染色体DNAライブラリーとした。
[実施例2] 染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片の単離
上記染色体DNAライブラリーからプラークハイブリダイゼーションによりセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含むクローンの選抜を行った。この一連の操作は常法(Sambrookら著、Molecular Cloning A Laboratory Manual/2nd Edition(1989))によった。プラークハイブリダイショーンに用いたプローブは次の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴDNA標識キットを用い3’末端をフルオレセインで標識したものである。
その結果、約40,000個のプラークの中から4個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージDNAを各種制限酵素で消化し、上記の合成DNAを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素XhoIで消化して得られた断片中に7.2kbp及び5.3kbpのDNAバンドとしてプローブにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記DNA断片7.2kbp及び5.3kbpをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターpBluescript II SK+(東洋紡社製)のXhoIサイトにサブクローニング化し、プラスミドpCHCDH1及びpCHCDH2を得た。これらのプラスミドをそれぞれ大腸菌JM109株へ形質転換した。なお、得られたコリオラス・ヒルスタス由来セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含む大腸菌形質転換株Escherichia coli JM109/pCHCDH1及びEscherichia coli JM109/pCHCDH2は、2002年2月8日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託され、それぞれ受託番号FERM BP−8278、FERM BP−8279が付与されている。次いで、サブクローニング化したDNAを大量に調製し、超遠心操作(50,000rpm,16h,15℃)で精製し、塩基配列を決定した。塩基配列の決定はUnited States Biochemical社製のシーケンシングキットを用いて行った。セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片の塩基配列を配列番号1又は2に示す。
[実施例3] セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例2で得られたコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドpCHCDH1から下記の配列番号4及び5に示す2つのプライマーを用いてPCR法を行うことにより、セロビオースデヒドロゲナーゼプロモーター領域のBamHI〜ブラントエンドを有する2.2kbp断片(断片1)を増幅した。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSMPOG1(FERM P−14933)を以下の配列番号6及び7に示す2つのプロモーターを用いてPCR法を行うことにより、マンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分ブラントエンド〜EcoRI約2.2kbp(断片2)を増幅した。
大腸菌ベクターpUC18を制限酵素BamHI〜EcoRIで切断し、上記の断片1及び2のDNA断片を混合して、T4DNAリガーゼで連結した後、大腸菌JM109株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から断片1及び断片2のDNA断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをpCDHPMNと命名した。
[実施例4] マンガンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
以下の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。
a.一核菌糸体培養
直径6mm前後のガラスビーズを約30個入れた500ml容三角フラスコにSMY培地(シュークロース1%、麦芽エキス1%、酵母エキス0.4%)100mlを分注して滅菌後、コリオラス・ヒルスタスOJI−1078株の平板寒天培地から直径5mmの寒天片をコルクボーラーで打ち抜きSMY培地に植菌し、28℃で7日間静置培養した(前培養)。ただし、菌糸を細分化するために、1日に1〜2回振り混ぜた。次に、1L容の三角フラスコにSMY培地200mlを分注し、さらに回転子を入れ、滅菌後、前培養菌糸をナイロンメッシュ(孔径30μm)で濾集し、全量を植菌し、28℃で培養した。なお、スターラーで1日2時間程度撹拌することにより菌糸を細分化した。この培養を4日間行った。
b.プロトプラストの調製
上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ(孔径30μm)で濾集し、浸透圧調節溶液(0.5M MgSO4、50mlマレイン酸バッファー(pH5.6))で洗浄した。次に、湿菌体100mgあたり1mlの細胞壁分解酵素液に懸濁し、緩やかに震盪しながら28℃で3時間インキュベートしてプロトプラストを遊離させた。細胞壁溶解酵素として、次の市販酵素製剤を組み合わせて使用した。即ち、セルラーゼ・オノズカ(cellulase ONOZUKA RS)ヤクルト社製5mg、ヤタラーゼ(Yatalase)(宝酒造社製)10mgを上記浸透圧調節溶液1mgに溶解して酵素液として用いた。
c.プロトプラストの精製
上記酵素反応液からナイロンメッシュ(孔径30μm)で菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収率を高めるため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロトプラストを上記浸透圧調節溶液で1回洗浄した。得られたプロトプラスト懸濁液を遠心分離(1,000k×g、5分間)し、上静を除去し、4mlの1Mシュークロース(20mM MOPS緩衝液、pH6.3)で再懸濁後、遠心操作を繰り返し、上記1Mシュークロース溶液で2回洗浄した。沈殿物に1Mソルビトール溶液(20mM MES、pH6.4)に40mM塩化カルシウムを加えた溶液500μlに懸濁し、プロトプラスト溶液とした。この溶液を4℃で保存した。
プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて、直接検鏡により求めた。すべての遠心操作はスウィングローターで1,000×g、5分間、室温下で行った。
d.形質転換
約106個/100μlのプロトプラスト溶液に対し実施例3で作製したプラスミド2μgを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロース及びロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに捲いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ遺伝子発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例5] 形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
酸素漂白後広葉樹パルプ(LOKP)・ペプトン培地(LOKP1%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.2%、KH2PO4、MgSO40.05%、リン酸でpH4.5に調製)を100mlずつ含む300ml容三角フラスコに、上記実施例4で得られた形質転換株50mm2の寒天片を5個接種し、28℃、100rpmで回転振盪培養した。6日後、得られた培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は0.5Mマロン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)50μl、酵素液345μl、10mM過酸化水素5μl、1mM MnSO4100μlを十分混合し、反応の結果生じるMn(III)マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にMn(III)マロン酸複合体を酵素活性が、培養開始6日目で6μmol/ml/minで認められた。ここで酵素活性単位は1分間にMn(III)マロン酸複合体1μmol増加させる活性を1ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないOJI−1078株の培養上清には本活性は認められなかった。
[実施例6] セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの下流にリグニンペルオキシダーゼ染色体遺伝子(特開平5−260978号;pBSLPOG7;FERM P−12683)の構造遺伝子領域を連結し、発現プラスミドとした。
具体的には、実施例2で得られたコリオラス・ヒルスタス由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドpCHCDH1から実施例3において配列番号4及び5に示す2つのプライマーを用いてPCR法を行うことにより、プロモーター領域のBamHI〜ブラントエンドを有する2.2kbp断片(断片3)を増幅した。また、リグニンペルオキシダーゼの構造遺伝子部分の取り出しはプラスミドpBSLPOG7をテンプレートにして以下の配列番号8に示すプライマーを用いてプライマー伸長法によりDNA断片を作製し、制限酵素HindIIIで切断することによりリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分からなる1.7kbpのDNA断片(断片4)を得た。
さらに、大腸菌ベクターをpUC18を制限酵素EcoRIとHindIIIで切断し、上記断片5及び6の2種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで連結した後、大腸菌JM109株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から上記断片3及び4のDNA断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをpCDHPLPと命名した。
[実施例7] リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例4に記載の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。約106個/100μlのプロトプラスト溶液に対し実施例6で作製したプラスミド2μgを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロース及びロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに捲いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ遺伝子発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例8] 形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
酸素漂白後広葉樹パルプ(LOKP)・ペプトン培地(LOKP1%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.2%、KH2PO4、MgSO40.05%、リン酸でpH4.5に調製)を100mlずつ含む300ml容三角フラスコに、上記実施例7で得られた形質転換株50mm2の寒天片を5個接種し、28℃、100rpmで回転振盪培養した。6日後、得られた培養液を遠心分離し、その上清を得た。
活性測定法は8mMベラトリルアルコール25μl、0.5M酒石酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)50μl、酵素液400μl、2.7mM過酸化水素25μlを十分混合し、反応の結果生じるベラトルムアルデヒドの310nmの吸光度を経時的に行い、上記培養上清中にベラトリルアルコールをベラトルムアルデヒドへと変換する酵素活性が静置培養開始5日目で300〜500ユニット/mlの範囲で認められた。ここで酵素活性単位は1分間にベラトルムアルデヒド1μmol増加させる活性を1ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないOJI−1078株の培養上清には本活性は認められなかった。
[実施例9] セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例2で得られたプラスミドpCHCDH1をテンプレートにして以下の配列番号9及び10に示す2つのプライマーを用いたPCRを実施し、BamHI処理を行うことによりBamHI〜ブラントエンドを有するDNA断片(断片7)を得た。
一方、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドOJ−POG−E1(寄託番号BP−2793)を以下の配列番号11及び12に示す2つのプライマーを用いてPCR法により増幅した。
得られたPCR断片を上記のTA−Clonoingベクターへ導入し、プラスミドpTALACを得た。プラスミドpTALACを制限酵素XhoIで消化後、修飾酵素Klenow fragmentを用いて平滑化し、その後、制限酵素EcoRIで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分(断片6)を得た。
大腸菌ベクターpUC18をBamHIとEcoRIで消化したのち、上記断片7及び8のDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで連結した後、大腸菌JM109株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から上記2種類のDNA断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをpCDHPLACと命名した。
[実施例10] ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例4に記載の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。約106個/100μlのプロトプラスト溶液に対し実施例9で作製したプラスミド2μgを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロース及びロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに捲いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例11] 形質転換体によるラッカーゼの生産
酸素漂白後広葉樹パルプ(LOKP)・ペプトン培地(LOKP1%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.2%、KH2PO4、MgSO40.05%、リン酸でpH4.5に調製)を100mlずつ含む300ml容三角フラスコに、上記実施例10で得られた形質転換株を50mm2の寒天片を5個接種し、28℃、100rpmで回転振盪培養した。6日後、得られた培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)50μl、5mM 2,2’−azino−bis(3−ethilbenzthiazoline−6−sulfonate)(ABTS)50μl、酵素液400μlを加え、反応の結果生じるABTSの酸化物を420nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始5日目で40ユニット/mLで認められた。ここで、酵素活性単位は1分間に1μmolのABTSを酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないOJI−1078株の培養上清にはわずか5ユニット/mlしか認められなかった。
2.セロビオヒドロラーゼI遺伝子のプロモーター配列を含む第1のDNA断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
[実施例12] 染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター配列を含むDNA断片の単離
実施例1と同様にして、染色体遺伝子ライブラリーを得た。得られた該ライブラリーからプラークハイブリダイゼーションによりセロビオヒドロラーゼI遺伝子を含むクローンの選抜を行った。この一連の操作は常法[Sambrookら著、”Molecular Cloning A LaboratoryManual/2nd Edition(1989)]によった。
プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは下記配列番号16の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴDNA標識キットを用い3’末端をフルオレセインで標識したものである。
ただし、配列番号16で塩基Yは塩基TまたはCを示し、塩基Rは塩基GまたはAを示す。
その結果、約40,000個のプラークの中から4個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージDNAを各種制限酵素で消化し、上記の合成DNAを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素EcoRIならびにBamHIで消化して得られた断片中に単一のDNAバンドとして4.6kbpにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記DNA断片4.6kbpをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターpUC19のEcORI−BamHIサイトにサブクローン化し、大腸菌JM109株へ形質転換し、プラスミドpCHCBHI31を得た。サブクローン化したDNA断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はApplied Biosystems社製のBigDye Terminator Cycle Sequencingキットを用いて反応を行い、Applied Biosystems社製DNAシークエンサーPRISM 310を用いて泳動を行い、塩基配列を解析した。
塩基配列を配列番号14に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼI遺伝子は2つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号15に示す。
[実施例13] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドpCHCBHI31を制限酵素NcoIで消化した後、修飾酵素Klenow fragmentを用いて平滑化を行い、自己連結を行い、NcoIサイトを消失させる。得られたNcoIサイト消失プラスミドから以下に示す2つのプライマー(1,2)を用いてPCR法により、プロモーター領域2.3kbpとして増幅し、pUC18のSmaIサイトへT4DNAリガーゼを用いて連結し、プラスミドpCHCBHI31Pを得た。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSMPOG1(寄託番号FERM P−14933)を以下に示す2つのプライマー(3,4)を用いてPCR法によりマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分NcoI約2.2kb断片を増幅する。
得られたPCR断片をIn Vitrogen社製のTA cloning kitを用いて挿入し、pTAMPとした。次に、得られたpTAMPを制限酵素NcoIで消化し、約2.2kbを切り出し、上記pCHCBHI31PのNcoIサイトへ挿入し、プラスミドpCHCBHI31PMPを得た(図1)。
[実施例14] マンガンペルオキシダーゼを高生産する形質転換体の作製
実施例4と同様にして、プロトプラストを調製・精製した。次いで、以下のようにして形質転換を行った。
106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液100μlに対し、実施例13で作製したプラスミドpCHCBHI31PMP 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。つぎに、液量に対し等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。つぎに、0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例15] 形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
上記実施例14で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、MnSO4・5H2O48mg/l、リン酸でpH5.0に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は0.5Mマロン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)50μl、酵素液345μl、10mM過酸化水素5μl、1mM MnSO4100μlを充分に混合し、反応の結果生じるMn(III)マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にMn(III)マロン酸複合体を酵素活性が培養開始6日目で3.5μmol/ml/minで認められた。ここで酵素活性単位は1分間にMn(III)マロン酸複合体1μmol増加させる活性を1ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないOJI−1078株の培養上清には本活性は認められなかった。
[実施例16] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例13で得られたプラスミドpCHCBHI31Pを制限酵素NcoI(宝酒造社製)で消化後、Klenow fragmentを用いて平滑化した。その後、制限酵素EcoRIで消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドOJ−POG−E1(FERM BP−2793)を以下に示す2つのプライマー(5,6)を用いてPCR法により増幅した。
得られたPCR断片を上記のTA−cloningベクターへ導入し、プラスミドpTALACを得た。
プラスミドpTALACを制限酵素XhoIで消化後、修飾酵素klenow fragmentを用いて平滑化する。その後、制限酵素EcoRIで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼI発現ベクターpCHCBHI31Pへ導入した。
得られたプラスミドをpCHCBHI31PLACと命名した(図2)。
[実施例17] ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例16で得たpCHCBHI31PLACを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のOCT遺伝子保持するプラスミド(pUCR1)を同時に導入すること(PEG法もしくはエレクトロポーレーション法など)により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるDNAは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液を100μlに対し実施例16で作製したプラスミドpCHCBHI31PLAC 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。
次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例18] 形質転換体によるラッカーゼの生産
上記実施例17で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、CuSO4・5H2O100mg/l、リン酸でpH5.0に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)50μl、5mM ABTS(2,2’−azino−bis(3−ethilbenzthiazoline−6−sulfonate)50μl、酵素液400μlを加え、反応の結果生じるABTSの酸化物を420nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始5日目で35ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位は1分間に1μmolのABTSを酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清にはわずか5ユニット/mlしか認められなかった。
[実施例19] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例13で得られたプラスミドpCHCBHI31Pを制限酵素NcoI(宝酒造社製)で消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSLPOG7/E.coli JM109(FERM P−12683)を以下に示す2つのプライマー(7,8)を用いてPCR法により増幅した。
得られたPCR断片を上記のTA−cloningベクターへ導入し、プラスミドpTALiPを得た。
プラスミドpTALiPを制限酵素NcoIで消化し、リグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼI発現ベクターpCHCBHI31Pへ導入した。
得られたプラスミドをpCHCBHI31PLiPと命名した(図3)。
[実施例20] リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例19で得たpCHCBHI31PLiPを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を同時に導入すること(PEG法もしくはエレクトロポーレーション法など)により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるDNAは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液を100μlに対し実施例9で作製したプラスミドpCHCBHI31PLiP 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。
次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例21] 形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
上記実施例20で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、5mMベラトリルアルコール、リン酸でpH4.5に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酒石酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)100μl、8mMベラトリルアルコール25μl、酵素液350μl、5.4mM過酸化水素25μlを加え、反応の結果生じるベラトルアルデヒドを310nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始5日目で0.8ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位は1分間に1μmolのベラトルアルデヒドを生成するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清にはリグニンペルオキシダーゼ活性は認められなかった。
3.セロビオヒドロラーゼI遺伝子のプロモーター配列を含む第2のDNA断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
[実施例22] 染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼI遺伝子の単離
実施例12と同様にして、染色体遺伝子ライブラリーからクローンの選抜を行った。プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは下記配列番号28の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴDNA標識キットを用い3’末端をフルオレセインで標識したものである。
ただし、配列番号28で塩基Yは塩基TまたはCを示し、塩基Rは塩基GまたはAを示す。
その結果、約40,000個のプラークの中から4個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージDNAを各種制限酵素で消化し、上記の合成DNAを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素SalIで消化して得られた断片中に単一のDNAバンドとして4.2kbpにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記DNA断片4.2kbpをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターpUC19のSalIサイトにサブクローン化し、大腸菌JM109株へ形質転換し、プラスミドpCHCBHI27を得た。サブクローン化したDNA断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はApplied Biosystems社製のBigDye Terminator Cycle Sequencingキットを用いて反応を行い、Applied Biosystems社製DNAシークエンサーPRISM 310を用いて泳動を行い、塩基配列を解析した。
塩基配列を配列番号26に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼI遺伝子は2つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号27に示す。
[実施例23] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドpCHCBHI27から以下に示す2つのプライマー(1,2)を用いてPCR法により、プロモーター領域2.1kbpとして増幅し、pUC18のSmaIサイトへT4DNAリガーゼを用いて連結し、プラスミドpCHCBHI27Pを得た。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSMPOG1(寄託番号FERM P−14933)を以下に示す2つのプライマー(3,4)を用いてPCR法によりマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分NcoI約2.2kb断片を増幅する。
得られたPCR断片をIn Vitrogen社製のTA cloning kitを用いて挿入し、pTAMPとした。次に、得られたpTAMPを制限酵素NcoIで消化し、約2.2kbを切り出し、上記pCHCBHI27PのNcoIサイトへ挿入し、プラスミドpCHCBHI27PMPを得た(図4)。
[実施例24] 形質転換体
実施例4と同様にして、プロトプラストを調製・精製した。次いで、以下のようにして形質転換を行った。
106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液100μlに対し、実施例23で作製したプラスミドpCHCBHI27PMP 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。つぎに、液量に対し等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。つぎに、0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例25] 形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
上記実施例24で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、MnSO4・5H2O48mg/l、リン酸でpH5.0に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は0.5Mマロン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)50μl、酵素液345μl、10mM過酸化水素5μl、1mM MnSO4100μlを充分に混合し、反応の結果生じるMn(III)マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にMn(III)マロン酸複合体を酵素活性が培養開始6日目で8.5μmol/ml/minで認められた。ここで酵素活性単位は1分間にMn(III)マロン酸複合体1μmol増加させる活性を1ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清には本活性は認められなかった。
[実施例26] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例23で得られたプラスミドpCHCBHI27Pを制限酵素NcoI(宝酒造社製)で消化後、Klenow fragmentを用いて平滑化した。その後、制限酵素EcoRIで消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドOJ−POG−E1(FERM BP−2793)を以下に示す2つのプライマー(5,6)を用いてPCR法により増幅した。
得られたPCR断片を上記のTA−cloningベクターへ導入し、プラスミドpTALACを得た。
プラスミドpTALACを制限酵素XhoIで消化後、修飾酵素klenow fragmentを用いて平滑化する。その後、制限酵素EcoRIで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼI発現ベクターpCHCBHI27Pへ導入した。
得られたプラスミドをpCHCBHI27PLACと命名した(図5)。
[実施例27] ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例26で得たpCHCBHI27PLACを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のOCT遺伝子保持するプラスミド(pUCR1)を同時に導入すること(PEG法もしくはエレクトロポーレーション法など)により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるDNAは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液を100μlに対し実施例26で作製したプラスミドpCHCBHI27PLAC 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。
次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例28] 形質転換体によるラッカーゼの生産
上記実施例27で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、CuSO4・5H2O100mg/l、リン酸でpH5.0に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)50μl、5mM ABTS(2,2’−azino−bis(3−ethilbenzthiazoline−6−sulfonate)50μl、酵素液400μlを加え、反応の結果生じるABTSの酸化物を420nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始5日目で57ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位は1分間に1μmolのABTSを酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清にはわずか5ユニット/mlしか認められなかった。
[実施例29] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例23で得られたプラスミドpCHCBHI27Pを制限酵素NcoI(宝酒造社製)で消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSLPOG7/E.coli JM109(FERM P−12683)を以下に示す2つのプライマー(7,8)を用いてPCR法により増幅した。
得られたPCR断片を上記のTA−cloningベクターへ導入し、プラスミドpTALiPを得た。
プラスミドpTALiPを制限酵素NcoIで消化し、リグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼI発現ベクターpCHCBHI27Pへ導入した。
得られたプラスミドをpCHCBHI27PLiPと命名した(図6)。
[実施例30] リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例29で得たpCHCBHI27PLiPを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を同時に導入すること(PEG法もしくはエレクトロポーレーション法など)により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるDNAは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液を100μlに対し実施例29で作製したプラスミドpCHCBHI27PLiP 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。
次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例31] 形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
上記実施例30で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、5mMベラトリルアルコール、リン酸でpH4.5に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酒石酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)100μl、8mMベラトリルアルコール25μl、酵素液350μl、5.4mM過酸化水素25μlを加え、反応の結果生じるベラトルアルデヒドを310nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始5日目で1.5ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位は1分間に1μmolのベラトルアルデヒドを生成するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清にはリグニンペルオキシダーゼ活性は認められなかった。
4.セロビオヒドロラーゼI遺伝子のプロモーター配列を含む第3のDNA断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
[実施例32] 染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオヒドラーゼI遺伝子の単離
実施例12と同様にして、染色体遺伝子ライブラリーからクローンの選抜を行った。プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは下記配列番号40の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴDNA標識キットを用い3’末端をフルオレセインで標識したものである。
ただし、配列番号40で塩基Yは塩基TまたはCを示し、塩基Rは塩基GまたはAを示す。
その結果、約40,000個のプラークの中から4個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージDNAを各種制限酵素で消化し、上記の合成DNAを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素PstIならびにNheIで消化して得られた断片中に単一のDNAバンドとして3.9kbpにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記DNA断片3.9kbpをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターpBluescriptsII SK−のPstI−SpeIサイトにサブクローン化し、大腸菌JM109株へ形質転換し、プラスミドpCHCBHI26を得た。サブクローン化したDNA断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はApplied Biosystems社製のBigDye Terminator Cycle Sequencingキットを用いて反応を行い、Applied Biosystems社製DNAシークエンサーPRISM 310を用いて泳動を行い、塩基配列を解析した。
塩基配列を配列番号38に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてコリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼI遺伝子は2つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号39に示す。
[実施例33] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドpCHCBHI26を制限酵素NcoIで消化し、klenow fragmentを用いて平滑末端とした後、T4DNAリガーゼを用いて自己連結を生じさせ、NcoIサイトが消失したプラスミドpCBCBHI26−NcoIを得た。次に上記プラスミドを以下に示す2つのプライマー(1,2)を用いてPCR法により、プロモーター領域1.1kbpとして増幅し、pUC18のSmaIサイトへT4DNAリガーゼを用いて連結し、プラスミドpCHCBHI26Pを得た。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSMPOG1(寄託番号FERM P−14933)を以下に示す2つのプライマー(3,4)を用いてPCR法によりマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分NcoI約2.2kb断片を増幅する。
得られたPCR断片をIn Vitrogen社製のTA cloning kitを用いて挿入し、pTAMPとした。次に、得られたpTAMPを制限酵素NcoIで消化し、約2.2kbを切り出し、上記pCHCBHI26PのNcoIサイトへ挿入し、プラスミドpCHCBHI26PMPを得た(図7)。
[実施例34] コリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)形質転換法
実施例4と同様にして、プロトプラストを調製・精製した。次いで、以下のようにして形質転換を行った。
106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液100μlに対し、実施例33で作製したプラスミドpCHCBHI26PMP 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。つぎに、液量に対し等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。つぎに、0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例35] 形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
上記実施例34で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、MnSO4・5H2O48mg/l、リン酸でpH5.0に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は0.5Mマロン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)50μl、酵素液345μl、10mM過酸化水素5μl、1mM MnSO4100μlを充分に混合し、反応の結果生じるMn(III)マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にMn(III)マロン酸複合体を酵素活性が培養開始6日目で5.5μmol/ml/minで認められた。ここで酵素活性単位は1分間にMn(III)マロン酸複合体1μmol増加させる活性を1ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清には本活性は認められなかった。
[実施例36] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例33で得られたプラスミドpCHCBHI26Pを制限酵素NcoI(宝酒造社製)で消化後、Klenow fragmentを用いて平滑化した。その後、制限酵素EcoRIで消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドOJ−POG−E1(寄託番号BP−2793)を以下に示す2つのプライマー(5,6)を用いてPCR法により増幅した。
得られたPCR断片を上記のTA−cloningベクターへ導入し、プラスミドpTALACを得た。
プラスミドpTALACを制限酵素XhoIで消化後、修飾酵素klenow fragmentを用いて平滑化した。その後、制限酵素EcoRIで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼI発現ベクターpCHCBHI26Pへ導入した。
得られたプラスミドをpCHCBHI26PLACと命名した(図8)。
[実施例37] ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例36で得たpCHCBHI26PLACを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のOCT遺伝子保持するプラスミド(pUCR1)を同時に導入すること(PEG法もしくはエレクトロポーレーション法など)により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるDNAは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液を100μlに対し実施例36で作製したプラスミドpCHCBHI26PLAC 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。
次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例38] 形質転換体によるラッカーゼの生産
上記実施例37で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、CuSO4・5H2O100mg/l、リン酸でpH5.0に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)50μl、5mM ABTS(2,2’−azino−bis(3−ethilbenzthiazoline−6−sulfonate)50μl、酵素液400μlを加え、反応の結果生じるABTSの酸化物を420nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始5日目で52ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位は1分間に1μmolのABTSを酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清にはわずか5ユニット/mlしか認められなかった。
[実施例39] セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例33で得られたプラスミドpCHCBHI26Pを制限酵素NcoI(宝酒造社製)で消化し、発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSLPOG7/E.coli JM109(FERM P−12683)を以下に示す2つのプライマー(7,8)を用いてPCR法により増幅した。
得られたPCR断片を上記のTA−cloningベクターへ導入し、プラスミドpTALiPを得た。
プラスミドpTALiPを制限酵素NcoIで消化し、リグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を得、上記処理したセロビオヒドロラーゼI発現ベクターpCHCBHI26Pへ導入した。
得られたプラスミドをpCHCBHI26PLiPと命名した(図9)。
[実施例40] リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製;
実施例39で得たpCHCBHI26PLiPを用いてアルギニン要求性コリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)を形質転換する場合、選択マーカーとしてコリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を同時に導入すること(PEG法もしくはエレクトロポーレーション法など)により形質転換体を得た。ここで、形質転換に供与することができるDNAは環状、もしくは直鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
約106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液を100μlに対し実施例39で作製したプラスミドpCHCBHI26PLiP 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。
次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例41] 形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
上記実施例40で得られた形質転換株を500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、5mMベラトリルアルコール、リン酸でpH4.5に調整)に50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酒石酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)100μl、8mMベラトリルアルコール25μl、酵素液350μl、5.4mM過酸化水素25μlを加え、反応の結果生じるベラトルアルデヒドを310nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に酵素活性が培養開始5日目で1.0ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位は1分間に1μmolのベラトルアルデヒドを生成するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清にはリグニンペルオキシダーゼ活性は認められなかった。
5.セロビオヒドロラーゼII遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片を用いたリグニン分解酵素の生産と利用
[実施例42] 染色体遺伝子ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼII遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片の単離
実施例1と同様にして、染色体遺伝子ライブラリーを得た。得られた該ライブラリーからプラークハイブリダイゼーションによりセロビオヒドロラーゼII遺伝子のプロモーター領域を含むクローンの選抜を行った。この一連の操作は常法(Sambrookら著、Molecular Cloning A Laboratory Manual/2nd Edition(1989))によった。プラークハイブリダイショーンに用いたプローブは、ファネロケエテ・クリソスポリウムのセロビオヒドロラーゼIIの塩基配列に基づいて作製した、以下の配列番号52に示す合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴDNA標識キットを用い3’末端をフルオレセインで標識したものである。
その結果、約100,000個のプラークの中から8個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージDNAを各種制限酵素で消化し、上記の合成DNAを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、制限酵素EcoRVならびにNcoIで消化して得られた断片中に単一のDNAバンドとして5.0kbpにハイブリダイズするクローンが認められた。
上記DNA断片を回収するため、制限酵素NcoIで消化後Klenow断片により平滑化し、さらにEcoRVで消化することにより得られる5.0kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターpUC19のSmaIサイトにサブクローン化し、プラスミドpCHCBHIIを得た。このプラスミドを大腸菌JM109株へ形質転換した。また、前記のサブクローン化したDNA断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はApplied Biosystems社製のBigDye Terminator Cycle Sequencingキットを用いて反応を行い、Applied Biosystems社製DNAシークエンサーPRISM 310を用いて泳動を行い、塩基配列を解析した。その塩基配列を配列番号50に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内において、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子は6つのイントロンにより分断されていた。また、塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号51に示した。
[実施例43] セロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーターによるマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス・ヒルスタス由来セロビオヒドロラーゼII遺伝子のプロモーター配列を含む、実施例42で得られたプラスミドpCHCBHIIから、以下の配列番号53及び54に示す2つのプライマーを用い、PCR法により増幅し、プロモーター領域3.1kbpを得た。
このPCRにより得られたDNA断片を大腸菌クローニングベクターpUC18のSmaIサイトへT4DNAリガーゼを用いて連結し、プラスミドpCHCBHIIPを得た。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来マンガンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSMPOG1(FERM P−14933)を、以下の配列番号55及び56に示す2つのプライマーを用い、PCR法により増幅し、マンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子NcoI切断部分約2.2kb断片を得た。
このPCRにより得られたDNA断片をIn Vitrogen社製のTA cloning kitを用いてTA cloningベクターに挿入し、pTAMPとした。次に、得られたpTAMPを制限酵素NcoIで消化し、約2.2kbを切り出し、上記のプラスミドpCHCBHIIPのNcoIサイトへ挿入し、コリオラス・ヒルスタス由来のセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター配列とマンガンペルオキシダーゼ構造遺伝子を含むプラスミドpCHCBHIIPMPを得た(図10)。
[実施例44] コリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例4と同様にしてプロトプラストの調製・精製を行った。次いで、以下のようにして形質転換を行った。
106個/100μl濃度のプロトプラスト溶液100μlに対し、実施例33で作製したプラスミドpCHCBHIIPMP 2μgを環状、もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。次に、液量に対し等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。次に、0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。
さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドpCHCBHIIPMPが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例45] 形質転換体によるマンガンペルオキシダーゼの生産
500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、MnSO4・5H2O48mg/l、リン酸でpH5.0に調整)に、上記実施例44で得られた形質転換株の50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は0.5Mマロン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)50μl、酵素液345μl、10mM過酸化水素5μl、1mM MnSO4100μlを充分に混合し、反応の結果生じるMn(III)マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行った。
その結果、上記培養上清中には、マンガンペルオキシダーゼの酵素活性によって生成されるMn(III)マロン酸複合体が培養開始6日目で6μmol/ml/min認められた。ここで酵素活性単位は1分間にMn(III)マロン酸複合体1μmol増加させる活性を1ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないOJI−1078株の培養上清には本活性は認められなかった。
[実施例46] セロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーターによるラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例43で得られたプラスミドpCHCBHIIPを制限酵素NcoI(宝酒造社製)で消化後、Klenow fragmentを用いて平滑化した。その後、制限酵素EcoRIで消化し、セロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来ラッカーゼ遺伝子を含むプラスミドOJ−POG−E1(BP−2793)を以下に示す配列番号57及び58のプライマーを用いてPCR法により増幅した。
得られたPCRによるDNA断片を実施例3と同様にTA−cloningベクターへ導入し、プラスミドpTALACを得た。
プラスミドpTALACを制限酵素XhoIで消化後、修飾酵素klenow fragmentを用いて平滑化した。その後、制限酵素EcoRIで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子部分を得た。
実施例43で得られたセロビオヒドロラーゼII発現ベクターpCHCBHIIPのNcoIサイトへラッカーゼ構造遺伝子部分を導入し、プラスミドpCHCBHIIPLACを得た(図11)。
[実施例47] ラッカーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例44記載の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。約106個/100μlのプロトプラスト溶液に対し実施例46で作製したプラスミドpCHCBHIIPLAC 2μgを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロース及びロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに捲いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするラッカーゼ発現プラスミドpCHCBHIIPLACが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例48] 形質転換体によるラッカーゼの生産
500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、CuSO4・5H2O100mg/l、リン酸でpH5.0に調整)に、上記実施例47で得られた形質転換株の50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)50μl、5mM ABTS(2,2’−azino−bis(3−ethilbenzthiazoline−6−sulfonate)50μl、酵素液400μlを加え、反応の結果生じるABTSの酸化物を420nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行った。その結果、上記培養上清中に酵素活性が培養開始5日目で40ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位(ユニット)は、1分間に1μmolのABTSを酸化するのに必要とされる酵素量とした。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないOJI−1078株の培養上清には、酵素活性はわずか5ユニット/mlしか認められなかった。
[実施例49] セロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーターによるリグニンペルオキシダーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
実施例43で得られたプラスミドpCHCBHIIPを制限酵素NcoI(宝酒造社製)で消化し、セロビオヒドロラーゼII発現ベクター部分とした。
次に、コリオラス・ヒルスタス由来高温誘導リグニンペルオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSLPOG7/E.coli JM109(FERM P−12683)を以下に示す配列番号59及び60の2つのプライマーを用いてPCR法により増幅した。
得られたPCR断片を実施例43と同様にTA−cloningベクターへ導入し、プラスミドpTALiPを得た。次いで、プラスミドpTALiPを制限酵素NcoIで消化し、リグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を得た。
実施例43で得られたセロビオヒドロラーゼII発現ベクターpCHCBHIIPのNcoIサイトへリグニンペルオキシダーゼ構造遺伝子部分を導入し、プラスミドpCHCBHHPLiPを得た(図12)。
[実施例50] リグニンペルオキシダーゼを高分泌生産するコリオラス・ヒルスタス形質転換体の作製
実施例44に記載の方法により、コリオラス・ヒルスタスのプロトプラスト溶液を得た。約106個/100μlのプロトプラスト溶液に対し実施例49で作製したプラスミドpCHCBHIIPLiP 2μgを環状もしくは直鎖状で添加した。さらに選択マーカーとして、コリオラス・ヒルスタス由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドpUCR1を0.2μg添加し、30分間氷冷した。
次に、等量のPEG溶液(50%PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地(寒天1%)に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃で4日間培養を行い、形質転換体を得た。
さらに上記形質転換株からDNAを調製し、目的とするリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドpCHCBHIIPLiPが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
[実施例51] 形質転換体によるリグニンペルオキシダーゼの生産
500ml容の三角フラスコに50mlのパルプ・ペプトン液体培地(晒パルプ30g/l、ペプトン10g/l、KH2PO41.5g/l、MgSO4・7H2O0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、5mMベラトリルアルコール、リン酸でpH4.5に調整)に上記実施例10で得られた形質転換株の50mm2の寒天片を5個接種し、28℃で6日間、振盪下で培養した。6日後、得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
酵素活性は1M酒石酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)100μl、8mMベラトリルアルコール25μl、酵素液350μl、5.4mM過酸化水素25μlを加え、反応の結果生じるベラトルアルデヒドを310nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行った。上記培養上清中に、酵素活性が培養開始5日目で1.2ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位(ユニット)は、1分間に1μmolのベラトルアルデヒドを生成するのに必要とされる酵素量とした。一方、同条件下で培養した供与DNAを含まないコリオラス・ヒルスタスOJI−1078株(FERM BP−4210)の培養上清にはリグニンペルオキシダーゼ活性は認められなかった。
[実施例52] マンガンペルオキシダーゼを高分泌生産する形質転換体を用いたチップ処理
実施例44により選抜したマンガンペルオキシダーゼ高分泌生産する形質転換株をポテトデキストロース寒天培地上で28℃にて培養した後、4℃で保存した。このプレートから直径5mmのコルクボーラーで打ち抜いた切片を5つずつ、グルコース・ペプトン培地(グルコース2%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.2%、KH2PO4、MgSO40.05%、リン酸でpH4.5に調製)を100mlずつ含む300ml容三角フラスコに植菌し、28℃、100rpmで1週間震盪培養した。培養後、菌体をろ別し、菌体に残存した培地を滅菌水で洗浄した。菌体は滅菌水と共に、ワーリングブレンダーで10sec粉砕し、絶乾重量1kgのユーカリ材に対し、菌体の乾燥重量が10mgになるように植菌した。植菌後は菌が全体に行き渡るようによく撹拌した。培養は28℃で通気をしながら1週間静置培養を行った。チップ含水率が40〜65%になるように随時飽和水蒸気を通気させた。通気する際の通気量は対チップ当り、0.01vvmになるように行った。
[実施例53] マンガンペルオキシダーゼ高分泌生産する形質転換体による機械パルプの製造
ラジアータパイン材を用い実施例52に準じてチップ処理を行った。処理後の木材チップをラボ用リファイナー(熊谷理機社製)を用いて叩解して、カナディアンスタンダードフリネスを200mlとした後、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製はTappi試験法T205om−81に準拠して、パルプ手抄きシートの物理試験はTappi法T220om−83に準拠して行った。使用電力量はワットメーター(Hiokidenki model3133)と積分計(model3141)を用いた。チップ収率測定は水分を含んだ木材チップを容器に絶乾重量で1kg分取し、処理前後のチップ絶乾重量を測定し、以下の式を用いてチップ収率を算出した。
(処理後の絶乾重量)/(処理前の絶乾重量)×100
表1に示すようにセロビオースデヒドロゲナーゼを抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、引裂き強さ、破裂強さ共に増加した。野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、紙力は低下した。
[実施例54] マンガンペルオキシダーゼ高分泌生産する形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例52に準じてユーカリ材のチップ処理を行った後、絶乾重量400gのチップを測りとりオートクレーブ内で液比5、硫化度30%、有効アルカリ17%(Na2Oとして)となるように蒸解白液を加え、蒸解温度を150℃にてクラフト蒸解を行った。クラフト蒸解終了後、黒液を分離し、得られたチップを高濃度離解機によって解繊後、濾布で遠心脱水と水洗浄を3回繰り返した。次いでスクリーンにより、未蒸解物を除き、遠心脱水し蒸解未漂白パルプを得た。
上記のクラフト蒸解して得られたパルプに対して、NaOHを2.0質量%添加し、酸素ガスを注入し、100℃、酸素ゲージ圧0.49MPa(5kg/cm2)で60分間処理を行った。
上記で得たパルプを下記に示すように、D−E−P−Dの4段漂白処理を行った。最初の二酸化塩素処理(D)は、パルプ濃度が10質量%となるように調製し、二酸化塩素を0.4質量%添加し、70℃、40分間処理を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を10質量%に調製し、苛性ソーダを1質量%添加し、70℃、90分間のアルカリ抽出処理(E)を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を10質量%に調製し、過酸化水素0.5質量%、苛性ソーダ0.5質量%を順次添加し、70℃、120分間の過酸化水素処理(P)を行った。次いで、イオン交換水にて洗浄、脱水後、パルプ濃度を10%に調製し、二酸化塩素0.25質量%を添加し、70℃、180分間二酸化塩素処理(D)を行った。最後にイオン交換水にて洗浄、脱水後、JIS P 8123に準じた白色度86.0%の漂白パルプを得た。
上記で得たパルプ濃度が4質量%のパルプスラリーをリファイナーによりフリーネスが410ml(CSF)となるように叩解した。
[実施例55] Ka価の測定、パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、パルプ手抄きシートの物理試験
カッパー価の測定は、JIS P 8211に準じて行った。パルプ物理用試験用手抄きシートの調製はTappi試験法T205−om81に準拠して、パルプ手抄きシートの物理試験はTappi法T220om−83に準拠して行った。表2に示すように、形質転換体、野生株で木材チップを処理すると蒸解後のKa価は減少し、精選収率は増加し、粕率は減少した。また、表3に示すように野生株と比較すると、形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。
産業上の利用性
本発明は、宿主の担子菌、特にコリオラス・ヒルスタスで機能し、かつ該宿主においてリグニン分解酵素を大量に生産させるためのプロモーター配列を提供するものであり、遺伝子組換えによる酵素の大量生産が困難とされてきた、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼおよびラッカーゼ等のリグニン分解酵素の効率的な生産を可能とし、さらに該酵素を高生産する宿主細胞を用いて木材チップを処理することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、実施例13に記載されるマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドpCHCBHI31PMPの構造を示す図である。
図2は、実施例16に記載されるラッカーゼ発現プラスミドpCHCBHI31PLACの構造を示す図である。
図3は、実施例19に記載されるリグニンペルオキシダーゼ発現ベクターpCHCBHI31PLiPの構造を示す図である。
図4は、実施例23に記載されるマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドpCHCBHI27PMPの構造を示す図である。
図5は、実施例26に記載されるラッカーゼ発現プラスミドpCHCBHI27PLACの構造を示す図である。
図6は、実施例29に記載されるリグニンペルオキシダーゼ発現ベクターpCHCBHI27PLiPの構造を示す図である。
図7は、実施例33に記載されるマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドpCHCBHI26PMPの構造を示す図である。
図8は、実施例36に記載されるラッカーゼ発現プラスミドpCHCBHI26PLACの構造を示す図である。
図9は、実施例39に記載されるリグニンペルオキシダーゼ発現ベクターpCHCBHI26PLiPの構造を示す図である。
図10は、実施例43に記載されるマンガンペルオキシダーゼ発現プラスミドpCHCBHIIPMPの構造を示す図である。
図11は、実施例46に記載されるラッカーゼ発現プラスミドpCHCBHIIPLACの構造を示す図である。
図12は、実施例49に記載されるリグニンペルオキシダーゼ発現プラスミドpCHCBHIIPLiPの構造を示す図である。
Claims (12)
- 担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該DNA断片に結合されている組換えDNA、を含むベクターを作製する工程と、
該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、
該リグニン分解酵素高生産宿主細胞をセルロース存在下で培養し、リグニン分解酵素を生産する工程とからなる、リグニン分解酵素の生産方法。 - 担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片と、リグニン分解酵素をコードする遺伝子とを含み、該遺伝子が転写可能なように該DNA断片に結合されている組換えDNA、を含むベクターを作製する工程と、
該ベクターを用いた形質転換を行い、リグニン分解酵素高生産宿主細胞を調製する工程と、
該リグニン分解酵素高生産宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とからなる、木材チップの処理方法。 - セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列が、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼI遺伝子、セロビオヒドロラーゼII遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、又はβ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーター配列である、請求項1又は2に記載の方法。
- セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片が、以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片である、請求項1、2又は3に記載の方法。
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号1又は2において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。 - セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片が、以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片である、請求項1、2又は3に記載の方法。
(a)配列番号13、25又は37で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号13、25又は37において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼI遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。 - セルロース分解酵素遺伝子のプロモーター配列を含むDNA断片が、以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列を有する、セロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター配列を含む単離されたDNA断片である、請求項1、2又は3に記載の方法。
(a)配列番号49で表される塩基配列。
(b)(a)の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。
(c)配列番号49において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼII遺伝子プロモーター活性を有する塩基配列。 - リグニン分解酵素をコードする遺伝子が、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子およびラッカーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 担子菌がコリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 宿主細胞がコリオラス・ヒルスタスである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法によって得られる木材チップ。
- 請求項10に記載の木材チップを用いたパルプの製造法。
- 請求項11に記載の方法によって得られるパルプ。
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