JPWO2002090912A1 - マイクロチップ微細流路内液相の温度の測定方法と制御方法、そのための装置並びにマイクロチップ - Google Patents

Abstract

マイクロチップ微細流路内の液相温度を蛍光物質からの発光強度の検知によって非接触で、もしくはマイクロチップに埋設した検知手段で測定し、液相温度を赤外線レーザーの照射によって加熱することで、マイクロチップの微細流路内の液相温度を精度よく測定、制御することのできる新しい技術手段を提供する。

Description

技術分野
この出願の発明は、マイクロチップ微細流路内液相の温度の測定方法と制御方法、そのための装置並びにマイクロチップに関するものである。
背景技術
従来より、ガラス等の基板に形成した微細流路（マイクロチャンネル）を化学反応場として利用するマイクロチップが知られており、このような集積化した化学デバイスとしてのマイクロチップによって、化学合成や微量成分の精密分析を行うことが様々な観点から検討され、数多くの提案がなされてきている。
チップ上に化学過程を統合すると、分析または合成を行う途中で分析試料や試薬を取り扱う必要がなく、単一のデバイス上で流体の制御、試料の処理、多段階反応、温度制御、分離および検出を行うことが可能になるため、分析化学、生化学および医療科学等の分野で将来の大きな発展が期待される。この分野での検討のために必要とされる要素の一つは、微小空間での化学に関する知識にある。マクロスケールの系と比べて、集積化した化学系は、基本的な規模の原理の結果として派生するいくつかの利点を持っている。試薬の消費および廃棄の削減は小型によって直接的にもたらされる。また、混合および熱の制御の速度および効率に対する利益は拡散によって駆動される質量および熱の移動から生まれる。化学反応のための微小デバイスのスケールメリットは、たとえば、すでに報告されているＤＮＡフラグメントのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、プレカラムおよびポストカラム誘導体化、フローインジェクション分析法、および有機合成などへの応用によって証明されている。そして、この出願の発明者らによって、キレート反応や、酵素反応、液液抽出およびピーズ充填免疫アッセイを行うことができるマイクロチップがすでに提案されている。
しかしながら、たとえばＰＣＲや、生物化学的あるいは合成化学的反応等の各種の応用分野にこのようなマイクロチップの利用を拡大するためには、マイクロチップ微細流路内の溶液等の液相の温度を正確に測定し、微細流路内の液相反応の温度を制御することが必要であるが、従来では、このような温度測定についてはほとんど検討されておらず、また、適切に温度を制御すること、特に化学反応に必要とされる加熱手段の最適化は実現されていないのが実情であって、このため、反応温度を制御することによって反応速度や反応選択性を向上させることには大きな制約があった。ただ、このような状況については理由があった。それと言うのも、マイクロチップ微細流路内の液相の熱容量は極めて小さいため、微細流路内の液相温度を正確に測定することは極めて難しいと考えられていたからである。
そして、チップ上で反応混合物の熱処理を行うと、微小チャンネル内の熱容量が小さくデバイス基板の熱伝導性が高いために熱時間定数を小さくすることができるため、多くの応用分野でチップ上での反応混合物の熱処理が要望されている。迅速熱サイクルに電熱ジュール加熱を使用する小型化した反応器はすでに報告されており、３０℃／ｓの昇温速度と４℃／ｓの冷却速度が明らかにされている。しかしながら、電熱によるジュール加熱ブロックによるデバイスの昇温／冷却速度にはブロック自体の絶対熱容量による限界があった。その上、外部的に接触させるデバイスの場合、局部的加熱は、チップ材料の熱伝導性によって横方向の分解能に限界があり、独立した多数の加熱点を持つデバイスは製作困難である。チップ上に集積したヒータの場合でも、やはりこれらのデバイスは複雑な製造工程が必要であり、マイクロチップの設計を簡単に変更する柔軟性に制約があった。
加熱デバイスの熱容量が大きいという問題を解決し、試料への熱伝導を容易にするため、電解質の抵抗を利用して溶媒を直接加熱することが提案されてもいる。これによって最高２０℃までの昇温冷却速度が達成できた。しかし、この方法によれば、電気抵抗を測定することによって、溶液温度を直接モニターすることができるが、特に電気伝導率が変化する試料の場合、ナノリットル程度の体積を十分な精度で局部的に制御しながら加熱するには制約がある。
一方、赤外線（ＩＲ）による非接触加熱法を利用してマイクロリットルまたはそれより１桁小さい量の試料でゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅する方法がＯｄａら、およびＨｕｍｅｒとＬａｎｄｅｒｓによって発表されている。それによれば、ＩＲ照射源タングステンランプが、そして冷却を行うにはゲートを設けた圧縮空気が使用されている。この方法では６５℃／ｓの昇温速度と２０℃／ｓの冷却速度が実現した。しかし、この熱サイクルシステムはマイクロチップとの整合性が取られていないため、いくつかの操作は手動で行われた。その上、流速の制御が行われなかった。また、使用されたタングステンランプは非干渉性の非点光源であるために焦点が比較的大きく、断面積の小さいマイクロチップのチャンネルに適用するには、こうした加熱デバイスとしての効率には制限がある。
そこで、この出願の発明は、以上のような問題点を解消し、マイクロチップの微細流路内の液相温度を精度よく測定することができ、また、実際的に適切に、しかも簡便に自由度の大きい温度制御を可能とする、新しい技術手段を提供することを課題としている。
発明の開示
この出願は、上記の課題を解決するものとして、以下のとおり発明を提供する。
１．マイクロチップ微細流路内の液相温度を蛍光物質からの発光強度の検知によって非接触で測定することを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
２．蛍光物質がローダミン色素物質であることを特徴とする前記１のマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
３．マイクロチップ微細流路内の液相温度を、微細流路内の液相に接触させた温度検知手段により測定することを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
４．温度検知手段はその一部または全部がマイクロチップに埋設もしくは載置されていることを特徴とする前記３のマイクロチップ流路内液相の温度測定方法。
５．温度検知手段が熱電対であることを特徴とする前記３または４のマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
６．微細流路に対してその側部に形成した微細溝に挿入配置した熱電対により温度を測定することを特徴とする前記５のマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
７．マイクロチップ微細流路内の液相を赤外線（ＩＲ）レーザーの照射によって加熱して液相温度を制御することを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度制御方法。
８．微細流路を有するマイクロチップの配置部とともに、微細流路内の蛍光物質からの発光強度の検知部と、この発光強度から微細流路内液相の温度を算出する演算部とを備えていることを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定装置。
９．微細流路を有するマイクロチップ配置部とともに、マイクロチップ微細流路内の液相に接触する温度検知手段を備えていることを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定装置。
１０．前記８または９の温度測定装置が、マイクロチップ微細流路内液相の加熱手段とともに備えられていることを特徴とするマイクロチップ熱反応装置。
１１．加熱手段が赤外線レーザー照射手段であることを特徴とする前記１０の熱反応装置。
１２．微細流路とともに、微細流路内の液相に接触する温度検知手段が備えられていることを特徴とするマイクロチップ。
１３．温度検知手段が熱電対であることを特徴とする前記１２のマイクロチップ。
発明を実施するための最良の形態
まず、この出願の発明では、マイクロチップの微細流路内の液相温度の測定方法として、
＜Ａ＞非接触で光学的に液相温度を測定する方法
＜Ｂ＞液相との直接的接触により液相温度を測定する方法
の２種の方法を提供する。
そして、この出願の発明では、マイクロチップの微細流路内の液相温度の測定方法として、
＜Ｃ＞流路内液相に赤外線（ＩＲ）レーザーを照射して加熱する方法
を提供する。
まず＜Ａ＞の非接触光学式の温度測定法では、液相内に存在させた蛍光物質からの発光強度の検知をその原理としている。蛍光物質としては、微細流路での液相反応に関与しない、もしくは関与しても本質的ではない蛍光性物質の各種のものが使用されてよく、たとえばローダミン色素物質（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）がある。このような蛍光物質の発光強度の検知による微細流路内液相の温度測定方法は、微小空間で、熱容量が極めて小さい状況の温度測定にとって極めて有用である。非接触であることから、液相の加熱あるいは冷却に影響を及ぼすことはなく、精度よく温度を測定し、この測定された温度に応じて液相の加熱あるいは冷却の条件操作を的確に行うことが可能になる。
図１は、このような非接触で蛍光強度の検出から温度測定するためのシステムを例示したものである。この例においては、マイクロチップ（１）に形成された微細流路（２）における液相の温度を、蛍光強度の検出として測定可能としており、また、この例では、液相の加熱手段として、ＩＲ（赤外線）レーザーの照射手段を例示してもいる。
システム（装置）としては、微細流路（２）を有するマイクロチップ（１）の配置部とともに、蛍光強度の検知部と、この発光強度から温度を算出する演算部とを備えている。また、図１の例のようにＩＲ（赤外線）レーザー加熱手段を備えることによって、温度条件を精度良くコントロールすることのできる熱反応装置を構成することもできる。
反応の検出には、この出願の発明者らが確立した熱レンズ顕微鏡の手段等を採用することができる。
＜Ｂ＞の接触方式による温度測定では、マイクロチップの微細流路内の液相に接触する温度検知手段が用いられる。微細流路は、たとえば深さが５００μｍ以下、幅３００μｍ以下と微細であることから、このような微細流路内での液相に対して熱的な影響を及ぼすことがなく、また必要とされる液相の流れに実際的な影響をほとんど与えることがないように、温度検知手段が使用される。
このような温度検知手段としては各種の温度センサーが考慮されるが、この出願の発明においては、その一部または全部がマイクロチップに埋設もしくは載置されるもの、特に、より具体的には、熱電対を好適に使用することができる。
たとえば図２は、熱電対を温度検知手段とし、微細流路（２）に対してその側部に形成した溝（３）にこれを挿入配置して、熱電対が液相に接触するようにした例を示している。写真は、接触部（４）を拡大して例示したものである。実際にも、溝（３）についてはドリル等により形成することができ、Ｋ−型熱電対等を使用することができる。図２の例においては、液相との直接接触による影響は実質的にほとんどないものとすることができる。このことは、ＤＮＡ断片のＰＣＲにおいても確認されている。
図２に例示のように、温度検知手段が組込まれたマイクロチップは、マイクロチップの構成そのものにおいて価値のあるものとなる。
赤外線レーザー（ＩＲレーザー）の光熱効果を利用して液相を加熱するこの出願の発明の方法と装置では、流通条件下でマイクロチップ上の酵素反応を迅速かつ局部的に制御することができる。前記の非接触での分光温度検知法を利用して、温度の動的変化と立体的分布を測定し、その結果を数値シミュレーション分析の結果と比較すると、たとえば、この出願の発明の方法と装置では、従来のシステムより３０倍、小型化した電熱熱サイクルより３〜６倍速い、それぞれ６７℃／ｓおよび５３℃／ｓという超高速での昇温、冷却速度で操作することができる。赤外線レーザーを使う加熱法の特徴は、電熱加熱によるチップを使った既存のシステムと比べて、加熱対象の大きさが著しく小さく、わずか５ｎＬであるという点にある。熱容量が極めて小さい試料を直接加熱することで迅速な加熱速度を実現することができ、また、ガラス基板を使用することで、これに熱を移すことで熱の除去を効率的に行い、冷却を迅速に行うことができる。温度レベルの再現性は、滞在時間を０．５秒より短くすることで確保される。実際、チップ上の酵素反応は、ＩＲレーザーによる光熱による定期的な加熱によって、たとえば０．６秒の時間分解能で制御することに成功している。ＩＲダイオードレーザーはコンパクトであるため、システムを小型化したデザインに好適である。
赤外線（ＩＲ）レーザーによる加熱は、たとえば図３に例示したように、微細流路に沿って、多点加熱が適宜に、しかも迅速な加熱、冷却のサイクルとして制御可能であるという特徴も有している。
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。
実 施 例
実施例１
（Ａ）マイクロチップ
図１および図２に例示したようにＹ形接合点を有する微小チャンネルを公知のエッチング法によって作成した。基板はガラスである。微小チャンネルは幅が２５０μｍで、深さが１００μｍである。Ｙ形接合点からうしろの反応チャンネルの長さは４．０ｃｍである。
温度測定のために、接合したチップの端からエッチングしたチャンネルに対して直角方向に、ダイヤモンドドリルでサイドチャンネルを図２の場合と同様に設けた。サイドチャンネルは、エッチングしたチャンネルと合流するところまで切削した。交差点は入り口から２ｃｍ下流にあるようにした。全体としてエッチングした微小チャンネルの幅は２５０μｍ、深さは１００μｍ、そしてサイドチャンネルの直径は５００μｍとした。
（Ｂ）チップ上の化学反応
生化学用の４−アンチアミノピリン（４−ＡＡＰ）およびＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）は同仁研究所（熊本市）から購入した。大根ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，ＥＣ１．１１．１．７、比活性度２００単位／ｍｇ）および３５％過酸化水素水（電子工業用）は、和光純薬（大阪）から購入した。すべての試薬は特に精製を行わずに使用した。水は全実験を通してすべて水精製システム（ＴＷ−６００ＲＵ、野村ミクロサイエンス、神奈川）から得た超純粋水を使用した。基質原液（２×１０^−３Ｍ，４−ＡＡＰおよびＴＯＯＳ；１０^−１Ｍ Ｈ_２Ｏ_２）はリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）によって調製した。これらは冷蔵庫中、１０℃で保存し、実験前に適宜ＰＢＳで希釈して使用した。ＨＲＰ溶液（２０単位／ｍＬ）は固体の酵素から毎日調製し、４０３ｎｍで吸光度をモニターして濃度を検定し、必要に応じてさらに希釈した。
４−ＡＡＰおよびＴＯＯＳ作業用液の濃度範囲は、２×１０^−４Ｍ、ＨＲＰは１〜５単位／ｍＬ、Ｈ_２Ｏ_２は１〜５×１０^−５Ｍとした。使用直前にＨＲＰと４−ＡＡＰとの等体積（各１ｍＬ）混合液（溶液１）と、ＴＯＯＳとＨ_２Ｏ_２との等体積混合液（溶液２）を調製した。
液体試料の流量調節（０．１〜１０μＬ／分）は、２本のシリンジ（１ｍＬ，１７１０ＴＬＬ，ハミルトン社製、Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を備えたマイクロシリンジポンプ（ＫＤＳ２００，ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，ボストン，マサチューセッツ州）で行った。既に既報に書いたように、シリンジに溶液１および溶液２を入れ、溶融シリカ製毛細管とＰＴＦＥコネクターを通して、チップ上のＹ形接合点上流の２つの入り口から各溶液をマイクロチップに注入した。
（Ｃ）赤外線（ＩＲ）レーザーによる加熱
微小チャンネルの局所の温度を上げるには、ダイオードレーザー（λ_ｃ＝１４７２ｎｍ，１５０ｍＷ；ＡＦ４Ａ２１２Ｐ１，ＡＮＲＩＴＳＵ，神奈川）を使用して溶媒を加熱した。ＩＲレーザービームはレンズで収束させ、ウェスト直径が１５０μｍのビームとした。
プログラム化した加熱実験では、デジタルからアナログに変換する変換ボード（ＤＡＣ）を搭載したコンピュータでＩＲレーザーの出力を制御した（ＰＣＩ−６０３５，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，オースチン，テキサス州）。
加熱点はＹ形接合点から下流に向かって１．５ｃｍの所に定めた。反応媒体は流通系で加熱した。４−ＡＡＰ−ＴＯＯＳ−Ｈ_２Ｏ_２−ＨＲＰ反応生成物は、さらに５ｍｍ下流に設けた熱レンズ顕微鏡（ＴＬＭ）の検出点に連続的に輸送した。
（Ｄ）熱レンズ顕微鏡（ＴＬＭ）による検出
着色反応生成物は、発明者らによってその方法が確立されたＴＬＭで検出した。簡単に述べると、５１４．５ｎｍ，２００ｍＷで運転し、１０２５Ｈｚで機械的に切られるＡｒ＋イオンレーザー（ＳＨＧ−９５，Ｌｅｘｅｌ Ｌａｓｅｒ Ｉｎｃ，フリーモント，カリフォルニア州）を励起レーザーとして使用した。反応物質は５１５ｎｍ付近に弱い吸収しか持たないが、生成物はこの領域に強い吸収を示す （λ_ｍａｘ＝５５５ｎｍ，ε＝３．２×１０４Ｍ^−１ｃｍ^−１）。プローブ用レーザーにはＨｅ−Ｎｅレーザー（６３２．８ｎｍ，５ｍＷ；Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ，カールズバッド，カリフォルニア州）を使用した。ＴＬＭ信号はアナログ−デジタル変換（ＡＤＣ）ボードを使用し、サンプリング時間２０ミリ秒でデジタル化した。データの取り込みと処理を行うプログラムは、ＬａｂＶｉｅｗソフトウェア・パッケージ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使って書いた。
（Ｅ）微小チャンネル内の温度測定
マイクロチップの環境温度は、コントローラ（温度範囲−２５〜＋９９℃、精度および安定性±０．１℃；ＰＥ−６０，Ｌｉｎｋａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔａｄｗｏｒｔｈ，Ｕ．Ｋ．）を備えたペルチエ温度ステージによって保持した。図４に例示したように、サイドチャンネルを持つチップをステージ上に置いた。チップ上の定常状態の温度は、較正した２本の熱電対（クロメル−アルメルタイプ、導線先端直径２５μｍ；安部実装技術研究所（Ａｎｂｅ Ｓｏｌｄｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．），横浜）でモニタした。熱電対の１本はペルチエステージの上部に、残り１本は５００μｍのサイドチャンネルの内側に設置し、エポキシ接着剤でシールした。熱電対の先端は幹線チャンネル内に〜１００μｍ突き出した。局部的な光熱加熱効果を裂けるため、先端はＩＲ照射点から１ｃｍ上流にあるようにした。典型的には、両センサの温度差が０．２℃を超えないようにした。ペルチエステージを備えたマイクロチップは、ＩＲ照射光学系に対するマイクロチップの位置が乱れを与えないで液体の取扱いができるよう、しっかり安定させて取り付けた。安定した熱接触が得られるように、２つの熱電対でマイクロチップのバルク温度を絶えずモニタした。
微小チャンネル内の温度変化と空間的な温度分布は蛍光クエンチ法によってモニタした。試料にはローダミン３Ｂ染料（Ｒｈ−３Ｂｂ、Ｅｘｃｉｔｏｎ社（デイトン，オハイオ州）製，）の水溶液（１０^−５Ｍ）を使用した。蛍光の励起にはＡｒ＋イオンレーザー（５１４．５ｎｍ，１０２５Ｈｚで切る）を使用した。図４に示すように、ショートカットフィルタ（λ_５０％＝５７０ｎｍ，Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ）とバンドパス・フィルタ（λ_ｃ＝５９５±１０ｎｍ，Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｏｐｔ）で濾光した蛍光は、ロックインアンプ（ＮＦ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、横浜）とＣＣＤビデオカメラ（ＫＹ−Ｆ５５Ｂ，日本ビクター株式会社（Ｖｉｃｔｏｒ Ｃｏ．ｏｆ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ．），横浜；分解能４８０×３６０画素）に接続したシリコン・ホトダイオード（ＥＴ−２０１０，Ｅｌｅｃｔｒｏｏｐｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，トラバーズシティ，ミシガン州）でモニタした。ロックインアンプの時定数は１２〜４００ｍｓの範囲で変えた。蛍光信号は、ＴＬＭ検出の場合と同じようにＡＤＣボードでデジタル化しそれからコンピュータに送った。蛍光画像は、ビデオ・フレームグラバー・ボードを搭載したＰＣで捕捉した。
（Ｆ）結果と考察
▲１▼ まず、Ｒｈ−３Ｂ水溶液の螢光クエンチによって、微細流路（チャンネル）内の水が、ＩＲによって局所的に加熱されることを確認した。図４に示す装置で測定した結果、Ｒｈ−３Ｂの蛍光強度は溶液温度が高くなるにつれて大きく減少することがわかった。図５は、ペルチエステージでマイクロチップのバルク環境温度を制御して得られた較正曲線を示す。この曲線がＡｒ^＋イオンレーザーの励起強度に左右されないよう、蛍光強度を１０℃における強度に規格化した。測定前にチップの温度を３分間平衡化させ、それからサイドチャンネルに挿入した熱電対の読みの平均値を溶液温度として使用した。このようにして熱電対の読みをモニターした結果、溶液の温度は、検討した流速範囲（０〜５ｃｍ／ｓ）で変化しないことがわかった。水を満たした１００μｍの微小チャンネルを通過する固有拡散時間はわずか７０ｍｓに過ぎないため、溶液温度は周囲の基板温度と平衡状態にあった。固有時間に比べて溶液滞在時間ははるかに長いため（検討した最も速い線速度５ｃｍ／ｓでも０．５ｓ）、流通条件でさえこのような平衡状態が成立した。
感度は温度の上昇と共に低下するものの、検討した温度範囲（１０〜９０℃）で観察された強度の低下は５倍を超えた。蛍光強度が低下する原因は、染料分子の励起状態での寿命が短くなるためではないかと思われる。事実、図５に示した蛍光クエンチの結果は、公知の文献に記載されている、よく似た蛍光性分子Ｒｈ−Ｂの、より狭い温度範囲１４〜６３℃における水溶液データと定量的に一致した。
異なる日に作成した規格化した較正曲線は図３に示したとおり非常に安定しており、ＲＳＤは３％であることが確認された。蛍光クエンチ法による温度測定の精度は±０．５℃であった。較正曲線は、検討した範囲で溶液の流速には無関係であった。
ＩＲ出力が一定の条件で温度上昇ΔＴの初期溶液温度Ｔへの依存性を調べた結果によれば、ΔＴは、比例定数ΔＴ／Ｔ＝−０．０７℃の関係によって、Ｔが高くなるにつれて低下した。このことは、１４７０ｎｍにおける水のモル吸光係数が温度の上昇と共に低下するという公知の報告と一致した。水のこうした特性のために、初期温度が異なると、ΔＴ対ＩＲレーザー出力の依存性が、高いＩＲ出力において、わずかに直線から外れた。しかし、いずれにしても所与の初期温度とＩＲレーザー出力において、ΔＴの再現性はかなり良好であった（ＲＳＤ＝４％）。
▲２▼ 蛍光顕微鏡画像を見ると、ＩＲレーザーをチャンネルに照射したときに局部的に強度が低下していることがはっきりと認められた。溶液の流速を変えたときの温度分布画像を図６に示す。この画像は長さ１ｍｍ、幅２５０μｍの微小チャンネルを上から見たものである。各画像の頂部と底部の境が、水とガラスの界面に相当する。マイクロチップはペルチエステージによって一定の温度に保たれ、ＩＲレーザーはチャンネルの所定部分のみを加熱した。もとの強度画像は、１０℃で得られた画像で規格化され、各画素に対して得られた蛍光強度比は図５の較正曲線を使ってその温度に変換した。
得られた画像は、チャンネルに沿う空間温度分布が溶液の流速の影響を、明確に反映していることを示した。温度の局部化は低流速に対してＩＲ照射体積と密接に関係し、流速が速くなるほど局部は広がり下流側に移動した。微小チャンネルに沿った空間分布が均一でないことは画像からわかる。これには２つの理由があった：顕微鏡対物レンズの焦点面でのＩＲ強度は空間ガウス分布をとること、水−ガラス界面における基板バルクへの熱移動は効果的に行われること、である。全体として、検討した流速範囲に対して、水−ガラス界面近くの温度はＩＲビーム中心部の最高温度の４０〜５０％であった。
この観察は、数値シミュレーションの結果と一致した。事実、画像から、温度分布をチャンネルに沿って詳しく調べてみると、計算された依存性との間に相関性のあることがわかった。数値シミュレーションにおいて、ただ１つのパラメータ、熱源の出力密度を合わせることにより、実験データと計算データとが定量的に一致した。このパラメータの調節は、界面でのＩＲ照射の散乱と反射、およびチップの真の３Ｄ形状を考慮するためのものである。
上述の一致によって、ガラス基板への移動が主要な熱の散逸経路であることを確認することが可能となった。すなわち、低流速における拡散による熱移動と、高流速で水が流れる場合は、さらに対流による熱の除去が加わり、この熱移動は促進されることである。
▲３▼ 温度の動的な変化特性を実験的に得るために、ロックインアンプによる検知スキームを使用し、ＩＲビーム中心部の単一スポット測定に蛍光クエンチ法を使用した。蛍光クエンチ法によって測定した温度の迅速サイクリングを図７に示す。１０ｃｙｃｌｅｓ．３．５ｓ／ｃｙｃｌｅ，ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ：１．１８ｓ ｐｅｒ ｓｔｅｐ．である。ＩＲレーザー出力をプログラミングして３種類のレベルサイクルの各サイクルを発生させた。最初のレベルＴ_１はＩＲレーザーのゼロ出力（０ｍＷ）に相当し、最大レベルＴ_３はＩＲレーザーの最大出力（１００ｍＷ）に相当する。それに対して中間レベルＴ_２はＩＲレーザーの出力を変えること（１０，２０，３０，４０，６０，７０，８０ｍＷ）によって調節した。観測されたサイクル間の温度再現性は、拡散による熱散逸経路に固有の再現性から生じ、後者の再現性はペルチエステージによって一定温度に保たれたガラス基板の熱伝導性の高さによってもたらされた。昇温も冷却も平衡温度に到達した。過不足の問題が完全に排除された。結果として、このシステムは、十分な分解能で滞在時間が１ｓより短い温度サイクルを生み出すことができる。
温度の上昇下降速度を詳細に検査するため、図８ｂは、実験的に求めた１ｓ間のＩＲ照射の時間推移を示す。比較のため計算で求めた１ｓ間の照射の推移もあげてある。図から直線近似で得られた実験による昇温速度は６７℃／ｓ、冷却速度は５３℃／ｓであった。昇温に対しては１００％レベルまで上がるに要する時間（０．４ｓ）、冷却に対しては０％レベルまで下がるに要する時間（０．５１ｓ）で温度差ΔＴ＝２７℃を割った。実験によって観測されたＩＲレーザービーム中心部の昇温冷却速度は、検討した条件の範囲内では初期温度および流速には無関係であり、数値解析の結果と良く一致した。
この出願の発明の非接触ＩＲレーザー加熱法によると、観測された極めて迅速な昇温、冷却速度は、他の加熱デバイスに対して報告されているものをしのいでいる。ジュール効果に基づく接触式電熱ヒータを備えたマイクロチップの場合、３０℃／ｓおよび４℃／ｓのそれぞれ昇温速度および冷却速度が実現された。微小チャンネル内の電解質を電熱で直接加熱する方法によって、昇温速度も冷却速度も共に最高２０℃まで上げることができたが、加熱される体積は、依然として数μＬであった。直接加熱される体積をさらに〜１５０ｎＬ程度まで減らすと、６０℃／ｓおよび２０℃／ｓのそれぞれ昇温速度および冷却速度が得られた。迅速な昇温冷却速度は、加熱される体積が５ｎＬであって熱容量が２×１０^−５Ｊ／Ｋと小さいこと、そして微小チャンネルの表面積対体積の比が２８０ｃｍ^−１で大きいことによって実現されたものである。開始温度から高い温度への遷移も、また逆の遷移もその実現に１ｓもかからないため、チップ上の迅速な温度制御が可能になる。送風機や圧縮空気を送るシステムを反復的に使用しなくても、むしろチップ全体は一定の温度に保ったままガラス基板への自然な熱移動によって、迅速な冷却が可能であることは注目に値する。
▲４▼ 前記のチップ上での化学反応では、微小チャンネル内を流れる溶液の体積がきわめて小さい、ＩＲレーザー加熱デバイスを、流通条件下での化学反応の迅速な温度制御に応用した。微小チャンネル内のＩＲレーザービームの位置は、Ｒｈ−３Ｂ溶液の蛍光を見ながら調節した。シリンジ溶液を変えてもＩＲレーザーの位置に支障は発生しなかった。加熱の効率は、流すＲｈ−３Ｂ溶液を逐次取り替えることによって検査した。したがって、８：２水−エタノール混合物で３回（１ｍＬ）、それから純水（１ｍＬ）でマイクロチップを洗浄したのち、チップ中で酵素反応を行った。
酵素反応の速度は温度が高くなるにつれて速くなるため、ペルチエステージを１０℃に冷却して初期速度を低く保った。反応条件は、最適となるように酵素濃度と流速によって調節し、ＩＲレーザー加熱中に発生する反応生成物プラグのきれいなＴＬＭ検出を確保した。要点は、局部加熱に対する感度を十分維持しながら、ＩＲを照射しない時は、生成物の蓄積のバックグラウンドをできるだけ小さくすることであった。最適条件として、ＨＲＰ濃度を２．５単位／ｍＬ（溶液１）、Ｈ_２Ｏ_２濃度を１０^−５Ｍ（溶液２）、流速を５μＬ／分（線速度６．７ｍｍ／ｓ）とした。予備実験から、酵素溶液の原液にＩＲを連続照射したあとでもＨＲＰ活性度は変わらないことが確認された。
流通条件下で行ったＩＲレーザー加熱によるチップ上の反応の制御に対する代表的な結果を図９に示す。この実験中ＩＲレーザーは定期的に運転した。レーザーは、指示された時間に対して５０％のデューティサイクルでオン・オフした。時間的な推移から、ＴＬＭ信号はＩＲ照射のそれと関連した規則的なパターンに従うことがわかった。
１ｓより短いＩＲ照射時間で反応の迅速な制御データを明らかにするため、ＴＬＭ信号を高速でフーリエ変換（ＦＦＴ）した。ＴＬＭ信号から得られる規格化ＦＦＴスペクトルを図１０に示す。このスペクトルは雑音レベルを超えたシャープな特徴的な周波数を示した。１ｓおよび０．６ｓの場合、おそらくその周波数で雑音の寄与が増すためと思われるいくつかの高調波が観測された。特徴的な周波数は、使用されるＩＲ照射時間と一致した。このことは、反応速度がＩＲ照射によって外部から制御されることを裏づけている。
実施例２
図１１は、実施例１と同様にして、４５サイクルＰＣＲの場合のローダミン−３Ｂの蛍光強度検知のプロファイルを例示したものである。サイクルは、
ＩＲ＝１２０ｍＷ，９５℃−２ｓ
ＩＲ＝０ｍＷ，６８℃−６ｓ
の加熱、冷却のサイクルを示したものである。
実施例３
図２および図４に例示したマイクロチップ内に設けた熱電対による温度検知手段を用いて、ＤＮＡ ｍｅｌｔｉｎｇの温度変化を観察した。
ｄｓ−ＤＮＡ特異染料 ＳＹＢＥＲ−ＧｒｅｅｎＩで標識されたＰＣＲ増幅後のＤＮＡ断片を微小チャンネル内に導入し、外部加熱手段によって６０から９８℃に加熱した。昇温速度は０．２℃／ｓとした。
Ａｒ^＋イオンレーザー（４８８ｎｍ、１００ｍＷ）を蛍光励起源として用いた。
図１２は、ＤＮＡ ｍｅｌｔｉｎｇの結果を示したものである。実線は５００ｂｐのλ−ファージＤＮＡ断片の場合を、破線はＮＴＣ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）試料の場合を示している。
温度検知手段としてのチップ埋込み型の熱電対が有効であることが確認された。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、マイクロチップの微細流路内の液相温度を精度よく測定することができ、また迅速に、かつ適切に温度制御することのできる新しい技術手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、非接触での蛍光強度による温度測定のシステムを例示した構成図である。
図２は、熱電対による温度測定の例を示した図である。
図３は、赤外線レーザーの複数点での照射を例示した図である。
図４は、実施例における装置構成例を示した図である。
図５は、蛍光強度による温度測定の較正曲線を例示した図である。
図６は、ＩＲレーザー照射にともなう溶液の流速毎の温度分布図である。
図７は、蛍光クエンチによって測定した温度の迅速サイクリングを例示した図である。
図８は、実験的に求めた／ｓ間のＩＲ照射の時間推移を例示した図である。
図９は、ＩＲレーザー加熱によるチップ上の反応制御の結果を例示した図である。
図１０は、ＴＬＭ信号から得られた規格化ＦＦＴスペクトルを示した図である。
図１１は、ＰＣＲサイクルの蛍光強度検知のプロファイルを例示した図である。
図１２は、ＤＮＡ ｍｅｌｔｉｎｇの状態を熱電対手段による温度検知として例示した図である。

Claims (13)

1. マイクロチップ微細流路内の液相温度を蛍光物質からの発光強度の検知によって非接触で測定することを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
2. 蛍光物質がローダミン色素物質であることを特徴とする請求項１のマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
3. マイクロチップ微細流路内の液相温度を、微細流路内の液相に接触させた温度検知手段により測定することを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
4. 温度検知手段はその一部または全部がマイクロチップに埋設もしくは載置されていることを特徴とする請求項３のマイクロチップ流路内液相の温度測定方法。
5. 温度検知手段が熱電対であることを特徴とする請求項３または４のマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
6. 微細流路に対してその側部に形成した微細溝に挿入配置した熱電対により温度を測定することを特徴とする請求項５のマイクロチップ微細流路内液相の温度測定方法。
7. マイクロチップ微細流路内の液相を赤外線（ＩＲ）レーザーの照射によって加熱して液相温度を制御することを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度制御方法。
8. 微細流路を有するマイクロチップの配置部とともに、微細流路内の蛍光物質からの発光強度の検知部と、この発光強度から微細流路内液相の温度を算出する演算部とを備えていることを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定装置。
9. 微細流路を有するマイクロチップ配置部とともに、マイクロチップ微細流路内の液相に接触する温度検知手段を備えていることを特徴とするマイクロチップ微細流路内液相の温度測定装置。
10. 請求項８または９の温度測定装置が、マイクロチップ微細流路内液相の加熱手段とともに備えられていることを特徴とするマイクロチップ熱反応装置。
11. 加熱手段が赤外線レーザー照射手段であることを特徴とする請求項１０の熱反応装置。
12. 微細流路とともに、微細流路内の液相に接触する温度検知手段が備えられていることを特徴とするマイクロチップ。
13. 温度検知手段が熱電対であることを特徴とする請求項１２のマイクロチップ。

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