JPS6366519B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は試料、殊に体液中のγ―グルタミルト
ランスペプチダーゼの活性測定法に関する。 体液、殊に血清中のγ―グルタミルトランスペ
プチダーゼ（以下γ―GTPと略）の測定は、肝
疾患、殊に肝癌、アルコール性肝炎、肝硬変等の
診断にとつて重要なものであり、近年広く実施さ
れている。 γ―GTPは生体内で次の反応を触媒する。 γ―グルタミルシステニルグリシン＋アミノ酸
→γ―グルタミルアミノ酸＋システニルグリシン 最近の研究において、この反応の基質であるγ
―グルタミルシステニルグリシンのかわりに、
種々の基質を用いても、同様の触媒作用を有する
ことが明らかとなり、γ―GTP活性測定用基質
が合成された。〔Arch.Biochem.Biophys.，91、
61（1960），Clin.Chim，Acta.，７，775（1962）〕
これらの基質としてはγ―グルタミル―β―ナフ
チルアミド及びγ―グルタミル―Ｐ―ニトロアニ
リドがあげられる。このうち、γ―グルタミル―
β―ナフチルアミドはγ―GTPによつて分解さ
れてβ―ナフチルアミンを遊離するが、この物質
は発癌性を有しているため、癌床検査試薬として
は不適当である。 従つて、現在はもつぱらγ―グルタミル―Ｐ―
ニトロアニリドがγ―GTP活性測定のために用
いられている。この基質を用いた時の反応は次式
で表わすことができる。 γ―グルタミル―Ｐ―ニトロアニリド＋グリシ
ルグリシンｒ―GTP ――――→ Ｐ―ニトロアニリン＋γ―
グルタミルグリシルグリシン ここで遊離したＰ―ニトロアニリンを直接又は
間接的に測定してγ―GTP活性値を求めること
ができる。しかしながらγ―グルタミル―Ｐ―ニ
トロアニリドは水に対する溶解性が極めて悪いた
め、４ミリモル程度の基質液しか調製できず、最
適濃度約６ミリモルよりもかなり低いレベルに制
限される。しかも、基質液を調製する際には50〜
60℃に加温して溶解しなければならず、これは少
なからず基質の分解をもたらす。また、基質液を
加温溶解して調製したとしても、数時間後には一
部が析出し、基質としての使用は不可能となる。 本発明者らはのようなγ―グルタミル―Ｐ―ニ
トロアニリドの欠点を改良すべく鋭意研究した
結、一般式 （式中、ｎは０又は１の数字を表わし、R₁，
R₂は、それぞれスルホン基又はカルボキシル基
を表わし、同一でも異なつていてもよい）で表わ
される化合物がγ―GTP活性測定のための最良
の基質であることを見い出した。 一般式（）で表わされる化合物は、グルタミ
ン酸と２，2′位に水溶性の置換基を有するアミノ
スチルベン又はアミノビフエニル誘導体との縮合
物であるため、水に対して著しい溶解性を示し、
かつ又、安定性にも優れている。 特に２，2′―ジスルホン酸、２，2′―ジカルボ
ン酸が有利であり、これらのアルカリ金属塩又は
アンモニウム塩は良好な水溶性を示すため、最適
である。 本発明の基質とγ―グルタミル―Ｐ―ニトロア
ニリドとの性質の比較を第１表に示す。驚くべき
ことに、本発明の基質は、いずれもγ―グルタミ
ル―Ｐ―ニトロアニリドより高い基質特異性を有
している。

【表】 時の値
一般式（）で表わされる化合物は公知方法
〔J.Aner.Chem.Soc.，72，2469（1950），J.Chem.
Soc，3315（1949）〕に基づいて製造することがで
き、例えば次の様にして実施される。 Ｎ―フタリル―Ｌ―グルタミン酸無水物及びア
ミノ化合物をジオキサン、酢酸、メタノール、エ
ーテル等の溶媒に溶解し、数時間還流する。減圧
下に溶媒を除去し、残渣をメタノールの如き溶媒
に溶解した後、抱水ヒドラジンを加えて、室温で
約２日間撹拌する。溶媒を除去し、水に再溶解し
た後、再結晶、吸着クロマトグラフイー等通常の
精製法で処理し、目的物を得る。 本発明による化合物を用いて、試料中のγ―
GTP活性を測定する場合、例えば、次の様にし
て実施される。 一般式（）で表わされる化合物を、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２―アミノ
―２―メチル―１，３―プロパンジオール、５，
５―ジエチルバルビツール酸、Ｎ―２―ヒドロキ
シエチルピペラジン―Ｎ―２―エタンスルホン酸
からなる群より選択される緩衝液に溶解して基質
緩衝液とする。一定温度下で基質緩衝液とγ―
GTP活性を有する試料とを接触させると基質が
分解され、該当するアミンが遊離するので、一定
時間後に適当な波長で吸光度を求める。これをあ
らかじめ得られた遊離アミンの標準の吸光度と比
較すると、分解された基質の量が求められる。
又、基質が過剰に存在する状態では、吸光度が直
線的に増加するので、単位時間当りの吸光度の変
化量すなわち反応速度から活性値を求めることも
でる。さらに、遊離したアミンを酸性でＰ―ジメ
チルアミノベンズアルデヒド又はＰ―ジメチルア
ミノシンナムアルデヒドと反応させるかあるい
は、ジアゾ化後、Ｎ―（１―ナフチル）エチレン
ジアミン、キシレノールの如カツプリングと反応
させて生成した色素量を、標準の色素量と比較す
ることにより活性値を得ることも可能である。 次に本発明をさらに詳細に説明するために、以
下の実施例をかかげるが、これにより本発明の範
囲が制限されるものではない。 実施例 １ γ―グルタミル―４―アミノ―4′―ニトロスチ
ルベン―２，2′―ジスルホン酸の製造 ４―アミノ―4′―ニトロスチルベン―２，2′―
ジスルホン酸4.0ｇ（0.01モル及びＮ―フタリル
―Ｌ―グルタミン酸無水物2.6ｇ（0.01モル）を
ジオキサン50mlに解し、３時間環流する。冷却
後、減圧下にジオキサンを除去すると褐色の油状
物を得る。この油状物をメタノール100mlに解し、
2.0ｇの85％抱水ヒドラジンを加え、室温で48時
間撹拌する。減圧下に溶媒を除去し、残渣を75ml
の水に懸濁させ不溶物を去する。液を1Nの
アンモニア水でPH７に調製し、これを500mlのア
セトン中に撹拌しながら加えて冷却する。生じた
沈殿を集め、メタノールで洗浄し、真空乾燥する
とγ―グルタミル―４―アミノ―4′―ニトロスチ
ルベン―２，2′―ジスルホン酸のジアンモニウム
塩が得られる。 収量 3.2ｇ（理論値の56.8％） UV吸収 λmax360nm 薄層クロマトグラフイー〔シリカゲルプレート
（メルク社製）、展開溶媒；イソプロパノー
ル：酢酸：水＝50：15：20〕Rf＝0.17 実施例 ２ γ―グルタミル―４―アミノ―4′―ニトロスチ
ルベン―２，2′―ジスルホン酸を基質として用
いる血清γ―GTP活性の測定 γ―グルタミル―４―アミノ―4′―ニトロスチ
ルベン―２，2′―ジスルホン酸ジアンモニウム塩
0.34ｇ、グリシルグリシン0.9ｇを0.1Mトリス緩
衝液（PH8.5）100mlに溶解して基質緩衝液とす
る。基質緩衝液3.0mlを37℃に保ち、これに被検
血清50μlを加え、記録計付分光光度計（日立124
型）を用いて、波長490nmで吸光度を記録し、１
分間当りの平均の吸光度変化量（ΔE／min.）を
求める。 国際単位（IU）は37℃において１分間に１マ
イクロモルの基質を分解する時の酵素活性を１単
位と定義しており、通常、血清１ml当りのミリ単
位で表現する。 従つて次式からγ―GTPの活性値が計算され
る。 活性値（ミリ単／ml）＝Ｖ／ε・ｌ・ｖ×1000×ΔE ε：４―アミノ―4′―ニトロスチルベン―２，
2′―ジスルホン酸の分子吸光係数1.33
〔cm²／μMd〕（490nm） Ｖ：反応液の全量 0.05ml ｖ：血清の使用量 3.05ml ｌ：キユベツトの層長 １cm 実施例 ３ γ―グルタミル―４―アミノ―4′―ニトロビフ
エニル―２，2′―ジカルボン酸の製造 ４―アミノ―4′―ニトロビフエニル―２，2′―
ジカルボン酸4.6ｇ（0.02モル）及びＮ―フタリ
ル―Ｌ―グルタミン酸無水物5.2ｇ（0.02モル）
を100mlのＮ，Ｎ―ジメチルホルムアミドに溶解
し、100℃に２時間保つ。不溶物を去し、減圧
下に溶媒を除去する。残渣を100mlのメタノール
に溶解し、４ｇの85％抱水ヒドラジンを加え、室
温で48時間撹拌する。減圧下に溶媒を除去した
後、残渣を100mlの水に溶解し、陰イオン交換樹
脂アンバーライトIRA―400（ロームアンドハース
社製）を充填したカラムクロマトグラフイーにか
ける。1N水酸化ナトリウム及び水、各500mlでグ
ラジエントに溶離し、フラクシヨンコレクターで
溶出液を50mlずつ集め、各フラクシヨンについ
て、薄層クロマトグラフイーを実現する。実施例
１に示した溶媒系でRf＝0.2に１％ニンヒドリン
溶液を噴霧してオレンジ色に発色する単一のスポ
ツトを有するフラクシヨンを集め、凍結乾燥する
と、γ―グルタミル―４―アミノ―4′―ニトロビ
フエニル―２，2′―ジカルボン酸ジナトリウム塩
が得られる。 収量 1.8ｇ（理論値の46.3％） UV吸収 λmax 340nm 実施例 ４ γ―グルタミル―４―アミノ―4′―ニトロビフ
エニル―２，2′―ジカルボン酸を基質として用
いる血清γ―GTP活性の測定 γ―グルタミル―４―アミノ―4′―ニトロビフ
エニル―２，2′―ジカルボン酸ジナトリウム116
mg、グリシルグリシン450mgを0.1Mトリス緩衝液
（PH8.5）50mlに溶解して基質緩衝液とする。別
に、Ｐ―ジメチルアミノシンナムアルデヒド100
mgを0.1N HCl水溶液100mlに溶解して発色液を
調製する。基質緩衝液１mlを37℃に保ち、これに
被検血清20μlを加え、37℃で30分間インキユベー
トした後、発色液３mlを加える。水を対照として
580nmで吸光度を測定する。活性値既知の標準血
清についても、同様の操作を実施し、吸光度を求
める。次式から検体のγ―GTP活性値が得られ
る。 活性値〔mu／ml〕＝検体の吸光度／標準血清の吸光度 ×標準血清の活性値〔mu／ml〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 基質として一般式 （式中、ｎは０又は１の数字を表わし、R₁，
   R₂は、それぞれスルホン基又はカルボキシル基
   を表わし、同一でも異なつていてもよい）で表わ
   される化合物を用いるγ―グルタミルトランスペ
   プチダーゼ活性測定法。