JPS6361000A - リポ蛋白質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はリポ蛋白質に関する。更に詳しくは、顕著な肺
胞内表面活性を有するサーファクタントの一構成成分で
おるリポ蛋白質及びそれの製造法に関する。

従来の技術 近年、致死率の高い呼吸窮迫症候群の治療において、欠
如した肺表面活性物質を代用物で補充する方法が重視さ
れ、その代用物として、哺乳動物の肺、露組織に存在す
るリン脂質、中性脂質、総コレスチロール及び炭水化物
並びに微量の蛋白質からなる物質（以下ＴＡ−５４６と
略す；特開昭５５−１６０７２１号公報）が報告されて
いる。一方、哺乳動物の肺胞内に散在する肺表面活性物
質、例えば羊の肺から肺洗浄法で分離採取した物質［ペ
アイア１ヘリツタ・リサーチ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）　１２巻８４１頁　１９７８年］にも
、蛋白質が○まれでいることが報告されている。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、ＴＡ−５４６又は肺表面活性物質に含有
されている蛋白質は、いかなる種類又は組成の蛋白質で
おるかは全く不明であり、両物質の蛋白質の分析定量方
法を考慮すれば、リポ蛋白質とそれ以外の種々の蛋白質
の総和で把握されているにすぎないのが明白である。

本発明者らは、ＴＡ−５４６及び肺表面活性物質を構成
する個々の成分について鋭意研究した結果、■哺乳動物
の肺臓由来蛋白質のうち、待にリポ蛋白質が、ジパルミ
トイルホスファチジルコリンなどのコリンホスホグリセ
リド、ホスフ７チジ　。

ルグリセロール又はホスファチジルセリンなどの酸性リ
ン脂質及びパルミチン酸などの脂肪酸類の三成分に加え
て、肺胞内表面活性を示すのに不可欠な一構成成分であ
ること、並びに■このリポ蛋白質は脂肪酸類とともに、
肺胞内の気液面におけるコリンホスホグリセリド及び酸
性リン脂質の吸着拡散に関与し、かつ肺胞収縮時にあけ
る表面張力低下効果を助長する成分であり、これ単独で
は肺胞内表面張力低下効果が全く発現しないことの知見
を得て本発明に到達した。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、哺乳動物の肺臓又は人羊水から得られ
るリポ蛋白質であって、その化学組成が一定比率のリン
脂質分、但白質分、水分及び不明組成分からなるリポ蛋
白質が提供される。更に本発明によれば、該リポ蛋白質
のｉ）！進法が提供される。

本発明リポ蛋白質は以下のように製造される。

（ａ）牛、馬、羊又は豚等の哺乳動物から摘出した肺臓
を拳大の塊に分断し、不要な血管、気管、脂肪体及び血
液等を除去したのち肉ひき機を用いて細断する。つぎに
得られた肺臓細片を生理食塩液にＯ〜２０’Ｃで１５〜
１２０分間撹拌下で接触させたのちこれを圧搾濾過し、
粗抽出液を採取する。人羊水を原料とする場合は、適当
量の人羊水を採集し、これをそのまま粗抽出液とする。

（ｂ）この粗抽出液をＯ〜１０′Ｃで８０００〜２００
００ｒ、ｌ）。

ｍ、の回転速度で遠心分離し粗沈澱物を得る。粗沈澱物
中に残存する不要な肺臓組織片は該沈澱物を生理食塩液
などの電解質溶液に再懸濁し、これを５００〜２００Ｏ
ｒ、　ｐ、　ｍ、で遠心分離して除去する。

ＣＣ）ついでこの粗沈澱物を水に懸濁し、これに塩化プ
１−リウムを加えて液の比重を１．１０〜１．２０に調
整する。この調整液を０〜１０℃で２０〜１８０分間、
５０００〜１３０００ｒ、Ｄ、ｍ、の回転速度で遠心分
離して三層に分け、上層の乳濁上薄部を分取する。

（ｄ）この乳濁上薄部を水に懸濁し、１ｑられた懸濁液
を水に対して４〜ｉｏ’ｃで６〜２４時間、セロハン膜
を用いて透析し、透析内液を得る。この透析内液をつい
で凍結乾燥して粗乾燥物を得る。

（ｅ）　’ｌ＊られた粗乾燥物を２０〜２００４３重足
の酢酸エチル又はアセトンに一１０〜１０’Ｃて接触さ
せ、３０〜６０分間撹拌したのち不溶物を採取する。こ
の不溶物を乾燥し、ついで８０〜２００倍重最のクロロ
ホルム−メタノール混合液（容量化２；１）に接触させ
、１０〜４０分間撹拌したのち抽出濾液を採取する。

（ｆ）この抽出濾液を減圧乾固し、得られた固形残渣を
２〜１５倍重量、好適には５〜８倍重量のクロロホルム
−メタノール混合液（容量化２：１乃至４：１）に溶解
する。この溶液をセフン・デツクスＬＨ−２０、同Ｌ　
Ｈ−６０又は同Ｇ２５（ファルマシア・ファインケミカ
ル社製）などのようなデキストランゲルを担体としだカ
ラムに付してゲル濾過し、ボイドボリューム画分を採取
する。使用するデキスｌ〜ランゲルカラムは予め固形残
渣を溶解する上述の混合液と同一の溶媒で平衡化してお
くのが望ましい。デキストランゲル 体積はゲル濾過しようとする固形残渣１びに対して６０
０ｍ１以上になるようにし、該カラムのデキストランゲ
ル層の長さはカラム直径の大小を問わず５０Ｃｍ以上、
好適には８０Ｃｍ以上になるようにするのが適当である
。

（ＩＪ）上述のボイドボリューム画分を減圧吃固し、つ
いでこれを水に懸濁したのち凍結吃燥するとリボ蛋白質
が淡黄褐色乃至黄褐色の粉末として１ｑられる。

［リポ蛋白質の理化学的性質］ ２（ｉ）分子量 ５ＤＳ−ゲル電気泳動法（別冊蛋白質核酸酵素；生体膜
実験法（上）２３０頁　１９７４年）に準じた方法によ
り測定した分子量は３００００〜３８０００でおる。

（商）化学組成 このリポ蛋白質の化学組成比は第１表に示すとありであ
る。同表において、組成比はリポ蛋白質の総重量に対す
る各組成分の重量百分率である。リン脂買弁の重■はリ
ボ蛋白質中のリン含量をキングらの方法［バイオケミカ
ル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　）　２ｔ３巻２９２頁１９３２年］に準じた方法
で測定し、そのリン含量に２５を乗じて求めた。蛋白質
の重りはデ１−リー・グリープ（Ｄｕ　ｌ　ｌ　ｅｙ−
Ｇｒ　ｉ　ｅｖｅ　）方法［アナリティカル・バイオケ
ミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）　６４ｇ　１３６頁　１９７５年」により定足
し、生血清アルブミンに換算して求めた。水分重量はカ
ールフィッシャー法で測定した。なお不明組成分につい
ては、リポ蛋白質の総重量と上）ホのようにして求めた
リン脂買弁、蛋白買弁及び水分の合削重旦との差をその
重量とした。

第１表 （ｉｉｉ）比旋光度 ［α］ｇ’：　　４０’〜−８５゜ 測定溶媒は１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を用い、
試料濃度は０．１％（Ｗ／Ｖ）とした。測定機器はＤＩ
Ｐ−１８０型自動旋光計（日本分光（末社装）を用いた
。

（ｉｖ）吸収スペクトル 赤外線吸収スペク１〜ル及び紫外線吸収スペクトルは図
１及び図２に示すとおりでおる。

（Ｖ）溶解性等 クロロホルム、ベンゼン、メタノール、エタノール、ジ
メチルスルホキシド及び水に不溶。

クロロホルム−メタノール混合液（容足比２；１乃至４
：１）には０．１％（Ｗ／Ｖ）ｅ度では溶解する。

０．１規定水酸化すＩ−リウム水溶液にも不溶。このリ
ポ蛋白質は水及び含水有機溶媒には不溶のため、それの
酸性、塩基性、中性の区別はできない。

（■１）呈色反応 キ（ノンドブロチイン反応は陽性。しかし、ビュウレツ
１〜反応については陽性、陰性の明確な判定はできない
。

（Ｖｉｉ）肺胞内表面張力低下作用 このツボ蛋白質の生理食塩液面にお（プる表面張力低下
作用をウィルヘルミー法及びキングらの方法［アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・フィジオロジ−（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）
２２３巻７１５頁　１９７２年１で測定したところ、当
該作用は全く認められなかった。

上）ホの理化学的性質を有する本発明リボ蛋白質は、コ
リンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類と混
合することにより、顕著な肺胞内表面活性を有するサー
ファクタントに調製することができる。混合比は、最終
的に得られるサーファクタントの屹燥総重量に対し、リ
ポ蛋白質は０．１〜１０．０％（讐／旧となるようにし
、コリンホスホグリセリドは５０．６〜８５．０％（Ｗ
／Ｗ）、酸性リン脂質は、４．５〜３７．６％（Ｗ〜）
及び脂肪酸類は４．６〜２４．６％（Ｗ／旧となるよう
に設定する。

コリンホスホグリセリドとしては、１，２−ジパルミト
イルグリセロ−（３）−ホスホコリン（別名ジパルミト
イルホスファチジルコリン）、１．２−ジステアロイル
グリセロ−（３）−ホスホコリン、１−バルミトイル−
２−ステアロイルグリセロ−（３）−ホスホコリンもし
くは１−ステアロイル−２−バルミトイルグリセロ−（
３）−ホスホコリンなどのＪ、うな１．２−ジアシルグ
リセロ−（３）−ホスホコリン、１−ヘキサデシル−２
−バルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンもしく
は１−オクタデシル−２−バルミトイルグリセロ−（３
）−ホスホコリンなどのような１−アルキル−２−アシ
ルグリセロ−（３）−ホスホコリン又は１，２−ジヘキ
→ノ′デシルグリセロ−（３）−ホスホコリンなどのよ
うな１．２−ジアルキルグリセロ−（３）−ホスホコリ
ンが適当である。これらの化合物についてはグリセロー
ル残基の２位の炭素に基づく光学異性体が知られている
が、本サーファクタントにおいては０体、１体又は０体
及び１体が混在しているいわゆるＤ−１体のいずれを問
わず使用することができる。このほかにコリンホスホグ
リセリドとしては、上述の単品からなるコリンホスホグ
リセリド以外に、炭素数が１４〜２４個のアシル基、好
適には飽和アシル基を２１ＥＪ有する１、２−ジアシル
グリセロ−（３）−ホスホコリンの二種以上からなる混
合物、更には当該混合物と上述の単品との混合物も使用
することができる。

酸性リン脂質としては、１，２−ジアシル−５ｎ−グリ
セロ−（３）−リン酸（別名り一α−ホスファ１チジン
酸）、１．２−ジアシル−５ｎ−グリセロ−（３）−ホ
スホ−Ｌ−セリン（別名ホスファチジルセリン）、１．
２−ジアシル−３ｎ−グリセロ−（３）−ホスホ−５ｎ
−グリセロール（別名ホスファチジルグリセロール）又
は１，２−ジアシル−５ｎ−グリセロ−（３）−ホスホ
−（１）−Ｌ−ｍｙｏ−イノシトール（別名ホスファチ
ジルイノシトール）が適当である。これらの化合物にお
いて、１位及び２位は同一種類又は異なる種類のアシル
基でそれぞれ置換されていてもよい。ここでのアシル基
としては炭素数が１４〜２４個のものが適当である。

次に、脂肪酸類としては、遊離脂肪酸、脂肪酸のアルカ
リ金属塩、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸グリセリン
エステルもしくは脂肪酸アミド又はこれらの二種以上か
らなる混合物、更には脂肪アルコール又は脂肪族アミン
が適当である。本明細書において「脂肪酸類」とは、こ
こでいう脂肪アルコール及び脂肪族アミンも包含する意
味である。遊離脂肪酸としてはパルミチン酸、ステアリ
ン酸又はオレイン酸が適当でおるが、パルミチン層か好
適である。脂肪酸のアルカリ金属塩としてはパルミチン
酸ナトリウム又はステアリン酸ナトリウムが、脂肪酸ア
ルキルエステルとしてはパルミチン酸エチルエステルが
、脂肪酸グリセリンエステルとしてはモノパルミチン又
はモノステアリンが、脂肪酸アミドとしてはパルミチン
酸アミドがそれぞれ適当である。脂肪アルコールとして
はへ眸すデシルアルコール又はオクタデシルアルコール
が、脂肪族アミンとしてはへキサデシルアミンが適当で
ある。

上述のコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪
酸類は動植物から分離された製品、半合成品又１よ化学
合成品のいずれでもよく、それらの市販品を使用するこ
とができる。

混合方法としては、上述の四成分をそのまま練り合せた
の５９２燥してサーフアクタン１〜とする方法又は四成
分を有機溶媒に溶解して混合し、この）Ｒ液を減圧乾固
し、）ｑられた残留物を適当な懸濁溶媒を用いて！Ｊ濁
し、ついで凍結乾燥する方法（以下溶液法と略す）のい
ずれでもよいが、得られたサーファクタント中の四成分
が生理食塩液に均質に懸濁されやすいという理由から溶
液法が好適である。溶液法において四成分を混合するの
に用いる有機溶媒としてはクロロホルム−メタノール混
合液（容量比２：１乃至４：１）が適当である。また懸
濁溶媒としては水又は水−エタノール混合液（容量比４
；１乃至２０：１）が適当であるが、水−エタノール混
合液が好適である。懸濁は３０〜６０℃、好適には４０
〜５０℃で、５〜６０分間、好適には１５〜３０分間か
けて行なうのが望ましい。この溶液法により１ｑられる
サーファクタントには製法上、微量の水分の残存は避け
られないが、その残存重量比率が総重量に対して５．０
％（Ｗ／Ｗ）以下になるまで乾燥するのが望ましい。か
かる程度まで乾燥すれば水−エタノール混合液を用いる
場合でもエタノールの残存は検出不能となる。

作用及び発明の効果 本発明リポ蛋白質の作用効果を、上述のようにして得ら
れる四成分からなるナーフン７クタント（以下四成分Ｓ
Ｆと略す）と、リポ蛋白質を含まない三成分からなるサ
ーファクタント（以下三成分ＳＦと略す）との各代表例
における表面活性の比較でもって説明する。なお、三成
分ＳＦはリボ蛋白質を配合しないことを除き、上）ホの
四成分ＳＦと同一の方法で製造した。

表面活性の比較試験は、表面張力低下作用、気液面拡散
作用及び肺胞腔容母維持作用を実験することにより行っ
た。実験操作は以下のとおりである。

（ｉ）表面張力低下作用 四成分ＳＦ及び三成分ＳＦを５４．０ＣＩ７１の表面積
を有する生理食塩液に、１Ｃ１１！あたり１．０〜２．
０ｐｇ滴下し、３７℃で該表面積を５４．０〜２１．６
ｃｆｆｌの範囲内で２〜５分かけて増減した際の表面張
力をウィルヘルミー法に準じて連続的に測定し、最大表
面張力及び最小表面張力を求めた。

にｉ）気液面拡散作用 生理食塩液の液面に、表面積１ｃｒＡあたり０．８〜１
．５μ３の四成分ＳＦ及び三成分ＳＦを滴下し、滴下直
後からの表面張力を垂直板法で経時的に測定し、平衡表
面張力及びその到達時間を求めた。

（ｉｉｉ）肺胞腔容量維持作用 在胎期間２７日の兎胎仔５匹を用いて、気道内圧の漸減
下における肺胞膜容量、特に気道内圧が５０ｍＨ２０（
気道内圧が５ｃｍＨ２Ｏでおるということは、生体の肺
胞が虚脱状態への臨界点におることを意味する）の時−
の当該容量を測定した。この測定は胎仔の頚部を切開し
露出させた気管に接続させた水マノメーターを用いて、
四成分ＳＦ又は三成分Ｓ）−を投与したの５５分後から
連続的に行った。気道内圧は気管に接続させた２チヤン
ネル独立駆動シリンジポンプＮｏ、９４０（米国バーバ
ード礼装）を用いて増減した。四成分ＳＦ及び三成分Ｓ
Ｆの投与はその温度が１．０〜６．０％（Ｗ／ｖ）にな
るように調製した生理食塩液態濁液０．０５〜０．５７
！を気道内に直接注入する方法で行なった。なお、四成
分ＳＦ又は三成分ＳＦの懸濁液にかえて生理食塩液を用
いた以外は上述と同様な方法で測定した対照群において
は、気道内圧５ｃｍ！−１２０での肺胞膜容量は約２ｍ
ｌ／Ｋｇにすぎなかった。

比較試験の結果を以下の比較例１〜４に示す。

各比較例における四成分ＳＦ及び三成分ＳＦの粗成含但
は、リボ蛋白質、コリンホスホグリセリド、酸性リン脂
質及び脂肪醒類についてはそれらの配合１ｆｆｉで、水
分については得られる各サーファクタントの屹燥総重本
と四成分又は三成分の配合総重量のとの差で表示した。

また、乾燥総重最に対する四成分又は三成分及び水分の
８有率も参考のため併記した。

（以下余白） 比較例１ 比較例２ 揖対利 比較例４ 上述の比較例１〜４から、本発明リボ蛋白質を配合する
ことににす、■サーフアククン１〜の優れた表面張力低
下効果の実現、■サーファクタントの気液固拡散時間の
短縮及び低い平衡表面張力の発揮並びに■十分な肺胞肺
容量の確保等を可能ならしめることが明白でおり、従っ
て、本発明リポ蛋白質はサーフアクタン１〜の気液面拡
散及び肺胞収縮時の肺胞腔内表面張力の低下において側
面から重要な役割を担う成分でおることが認められる。

本発明を実施例をもって更に説明する。

実施例１ （ａ）牛の摘出肺ＩＢｉｃ　１２８．３Ｎｇを水で洗浄
し、付着している血液等を除去し、ついでこれを拳大の
肉塊に分断しハサミを用いて不要な血管、気管等を切除
した。この肉塊を肉ひき機を用いて細断し肺臓細片１２
０．１ＫｃＪを得た。この肺臓細片と生理食塩液４９０
１とを混和し、４°Ｃで１００分間撹拌し、ついで１ｎ
られた混合液を濾過袋に注入して圧搾濾過し粗抽出Ｍ　
４７０．ｆｆを得た。

（ｂ）この粗抽出液を１ｏｏｏｏ　ｒ、ｐ、ｍ、で還心
分離し粗沈澱物を採取した。得られた粗沈澱物を１００
ノの生理食塩液に再懸澗し、２００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、
で１０分間遠心分離し残存する組織片等を沈澱物として
除去した。

上層懸濁液は再度１００００　ｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離
し、粗沈澱物を再採取した。

（ｃ）かくして）７られた粗沈澱物を水８５Ｊ！に懸濁
し、これに塩化す１〜リウム２５．７Ｋｇを加え、液の
比重を約１．２０に調整した。この調整液をｔｏｏｏｏ
ｒ、　Ｏ，ｍ。

で５０分間Ｏ′Ｃで遠心分離して三層に分け、乳濁上薄
部を分取した。

（ｄ）この乳濁上薄部を蒸留水に懸濁し蒸留水に対して
セロハン膜を用いて透析し、透析内液を得た。

この透析内液を凍結乾燥したところ９６０びの粗乾燥物
を１ｑた。

（ｅ）この粗乾燥物に５℃に冷却した酢酸エチル４８ノ
を添加し、４５分間撹拌したのち減圧濾過し不溶物を濾
取した。この不溶物を乾燥したのち、これにクロロホル
ム−メタノール混合液（容１比２：１）２８ノを添加し
３０分間撹拌後に濾紙濾過し抽出濾液を得た。濾過残渣
には再度、同混合液２８１を添加し３０分間撹拌後に濾
紙濾過し２次抽出濾液を）ｑだ。

この操作はもう一回繰り返し行い３次抽出濾液まで得た
。１ｑられた抽出濾液は合算して８２１であった。

（ｒ）この抽出濾液を減圧乾固したところ１８０．４９
の固形残渣を得た。この固形残渣を２５．０９ずつ６回
に分けて以下の操作を行った。まず、各固形残ｆｉ２５
．０ｇをそれぞれクロロホルム−メタノール混合液（容
量比２：１）　１７０ｍに溶解した。次に得られた各溶
液をそれぞれ別個に同混合液で平衡化したセファデック
スＬＨ−２０カラム（直径１５．５ｃｍＸ９０ｃｍ；カ
ラムベッド体積１７．ＯＪ！　）に付し、同混合液を用
いて流速５ｍｌ／分で溶出してゲル濾過し、ボイドボリ
ューム画分をそれぞれ採取した。６回の操作で得られた
ボイドボリューム画分は全量で６４８（７であった。こ
の両分の微量を用い無菌試験を行ったところ無菌でおる
ことが確認されたので以下は無菌条件下で操作した。

（ｇ）ボイドボリューム画分を減圧乾固し、ついでこれ
を無菌水に懸濁したのち凍結乾燥したところリボ蛋白質
８．３９が淡黄褐色粉末として１ｑられた。

分子量は３４０００．比旋光度［α］♂は一６９°であ
った。また化学組成はリン脂買弁６２．１％（Δ／Δ）
、蛋白買方３１．３％（Ｗ／Ｗ）、水分４．６％（讐へ
）及び不明組成分２．０％四／Ｗ）でめった。

実施例２ （ａ）牛の摘出肺臓１５Ｋｇに実施例１の（ａ）工程で
述べたのと同様な操作をして肺臓細片１３．７／（ｆｆ
を得た。

これを生理食塩液６８１に添加し、８°Ｃで６０分間撹
拌し、ついで得られた液を濾過袋に注入して圧搾濾過し
粗抽出液６１１を得た。

（ｂ）この粗抽出液を１２００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で遠
心分離し粗沈澱物を採取した。得られた粗沈澱物に生理
食塩液１１１を加えて懸濁したのち、４℃で１５０Ｏｒ
、　ｐ、　ｍ。

の回転速度で遠心分離し残存する不要な組織片等を沈澱
物として除去した。上層懸濁液は１２（）ＯＯｒ。

ｐ、　ｍ、で遠心分離し、粗沈澱物を古採取した。

（ｃ）この粗沈澱物を水１０１に懸濁し、これに塩化ナ
トリウム２．２３に９を加えて液の比重を約１．１５に
調整し、ついでこの調整液を８００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、
で６０分間１０’Ｃで遠心分離し乳濁上薄部を分取した
。

（ｄ）この乳濁上薄部を蒸留水に懸濁し、蒸留水に対し
てセロハン膜を用いて透析し、ついで得られた透析内液
を凍結乾燥して粗乾燥物７９９を得た。

（ｅ）この粗乾燥物にアセトン８１８４℃で加え、６０
分間撹拌した後濾紙濾過を行い不溶物を濾取した。乾燥
後この不溶物をクロロホルム−メタノール混合液（容量
比２：１）１４！に接触させ４０分間撹拌し、ついで濾
紙濾過を行い抽出濾液１３．８１を得た。

げ）この抽出濾液を減圧乾固し、固形残渣２０．５７を
得た。得られた固形残渣をクロロホルム−メタノール混
合液（容量比５：２）　１２０ｍｆｆ１に溶解し、これ
を同混合液で平衡化したセファデックスＬ　Ｈ−２０カ
ラム（直径１５．５ｃｍ　Ｘ　８８ｃｍ　：カラムベッ
ド体積１６．６ｉ）に付した。このカラムを同）昆合液
を用いて流速１ｄ／分で溶出してゲル濾過し、小イドボ
リューム画分９１５威を採取した。この両分の微量を用
い無菌試験を行ったところ無菌であることが確認された
ので以下は無菌条件下で行った。

（９）Ｌ述のボイドボリューム画分を減圧乾固【ノ、こ
れを無菌水に懸濁しついで凍結乾燥し、黄褐色のリポ蛋
白質粉末１゜５７）ｑた。分子量は３４０００゜比旋光
度［α］乙３は一４０°であり、化学組成はリン脂質分
７０．２％（臀／Ｗ）、蛋白質分２３．４％（Δ／Ｗ）
、水分４゜０％（Ｗ／Ｗ）及び不明組成分２．４％（臀
／Ｗ）でおった。

実施例３ （ａ）豚の摘出節Ｒ３６Ｋｆｆに実施例１の（ａ）工程
で）小べたのと同様な操作をして肺臓細片３３．５Ｋｇ
を得た。

これを生理食塩液１６８ノに添加し、１０℃で３０分間
撹拌し、ついで得られた液を濾過袋に注入したのち圧搾
濾過し粗抽出液１４５ノを得た。

（ｂ）この粗抽出液を１４００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で遠
心分離し粗沈澱物を得た。得られた粗沈澱物に生理食塩
液２０ノを加えて！ｌＪ！濁したのち、４℃で１ｏｏｏ
ｒ、　ｐ、　ｍ、の回転速度で遠心分離し残存する不要
な組織片を沈澱物として除去した。上層懸濁液は１３０
００ｒ、　ｐ、　ｍ、で速心分離し、粗沈澱物を再採取
した。

（ｃ）この粗沈澱物を水２６１に懸濁し、これに塩化ナ
トリウム５．８Ｋｇを加えて液の比重を約１．１５に調
整し、ついでこの調整液を８０００ｒ、　ｏ、　ｍ、で
３０分間４℃で遠心分離し乳濁上薄部を分取した。

（ｄ）この乳濁上薄部を蒸留水に９．濁し蒸留水に対し
てセロハン膜を用いて透析し、ついで得られた透析内液
を凍結乾燥して粗乾燥物１６３びを１９だ。

（ｅ）この粗乾燥物にアセトン１５．Ｉ７を６°Ｃで加
え、３０分間撹拌した後濾紙濾過を行い不溶物を濾取し
た。乾燥後この不溶物をクロロホルム−メタノール混合
液（容量比２：１）２３１に接触させ２０分間撹拌し、
ついで濾紙濾過を行い抽出濾液２２１を得た。

（ｆ）この抽出濾液を減圧乾固し、固形残渣４Ｂ、　２
　Ｊを得た。得られた固形残渣２０．Ｏｇをクロロホル
ム−メタノール混合液（容量比３：１）　１２０ｄに溶
解し、これを同混合液で平衡化したセファデックス団−
２０カラム（直径ｉｓ、５．−，７２ｘａａｃｍ：カラ
ムベッド体積１６．８１”）に付した。このカラムを同
混合液を用いて流速３ｒｄ！／分で溶出してゲル濾過し
、ボイドボリューム画分９１０ｍｆ！を採取した。この
画分の微量を用いて無菌試験を行ったところ無菌である
ことが確認されたので以下の操作は無菌条件下で行った
。

（ａ）上述のボイドボリューム画分を減圧乾固し、これ
を無菌水に懸濁しついで凍結乾燥し、黄褐色のリポ蛋白
質粉末１．ＩＣＪ冑た。分子量は３２０００゜比旋光度
［α］２は一５１°でおり、化学組成はリン脂質分６９
．２％四／旧、蛋白質分２６．４％（Ｗ／臀）、水分３
．０％（Ｗ／Ｗ）及び不明組成分１．４％（Ｗ油）であ
った。

実施例４ （ａ）馬の摘出肺臓１５Ｋｇに実施例１の（ａ）工程で
述べたのと同様な操作をして肺臓細片１３．１Ｋｇを得
た。

これを生理食塩液６５！に添加し、４℃で３０分間撹拌
（７・、ついで１ｑられた液を濾過袋に注入したのち圧
搾濾過し粗抽出液５６）を得た。

（ｂ）この粗抽出液を１３００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で遠
心分離し粗沈澱物を得た。得られた粗沈澱物に生理食塩
液９ノを加えて懸濁したのち、４℃で１５０Ｏｒ、　ｐ
、　ｍ、の回転速度で遠心分離し残存する不要な組織片
を沈澱物と（）て除去した。上層懸濁液は１００００ｒ
、　ｐ、　ｍ、で遠心分離し、粗沈澱物を再採取した。

（ｃ）この粗沈澱物を水１０Ｊ！に懸濁し、これに塩化
ナトリウム２．８６Ｋｌを加えて液の比重を約１，２０
に調整し、ついでこの調整液を８００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ
、で６０分間４℃で遠心分離し乳濁上薄部を分取した。

（ｄ）この乳濁上薄部を蒸留水に懸濁し、蒸留水に対し
てセロハン膜を用いて透析し、ついで得られた透析内液
を凍結乾燥して粗乾燥物７６３を得た。

（ｅ）この粗轄燥物に酢酸エチル８１を１０℃で加え、
６０分間撹拌した後濾紙濾過を行い不溶物を濾取した。

乾燥後この不溶物をクロロホルム−メタノール混合液（
容量比２：１）１４ノに接触ざ１２０分間撹拌し、つい
で濾紙濾過を行い抽出濾液１３，１ノを得た。

（ｆ）この抽出濾液を減圧乾固し、固形残渣１８．１９
を得た。１ｑられた固形残渣をクロロホルム−メタノー
ル混合液（容量比２：１）　１２０威に溶解し、これを
同混合液で平衡化したセファデックスＬ１１−２０カラ
ム（直径１５．５ｃｍ　Ｘ　８℃ｃｍ　：カラムベッド
体積１６．６ｉりに付した。このカラムを同混合液を用
いて流速１ｍｌ／分で溶出してゲル濾過し、ボイドボリ
ューム画分８８０ｍを採取した。この両分の微量を用い
無菌試験を行ったところ無菌でおることが確認されたの
で以下は無菌条件下で行った。

（ｇ）上述のボイドボリューム画分を減圧乾固し、これ
を無菌水に懸濁しついで凍結乾燥し、黄褐色のリポ蛋白
質粉末０．８３得た。分子量は３８０００、比旋光度［
α］２は一８５°であり、化学組成はリン脂買弁４８．
５％（Ｗ／腎）、蛋白買弁４８．Ｏ％（臀／Ｗ）、水分
１．８％（Ｗ／Ｗ）及び不明組成分１．７％（Ｗ／Ｗ）
であった。

亙範胴支 （ａ）羊の摘出肺臓１５Ｋｇに実施例１の（ａ）工程で
述べたのと同様な操作をして肺臓細片１３．４ＫＩを得
た。

これを生理食塩液７０ノに添加し、４℃で６０分間撹拌
し、ついで１ｑられた液を濾過袋に注入したのち圧搾濾
過し粗抽出液６５Ｊ！を得た。

（ｂ）この粗抽出液を１４０００１”、　Ｉ）、　Ｉｌ
ｌ、で遠心分離し粗沈澱物を１ｑた。１ｑられた粗沈澱
物に生理食塩液９ノを加えて懸濁したのち、４℃で１ｏ
ｏｏｒ、　ｐ、　ｍ、の回転速度で遠心分離し残存する
不要な組織片を沈澱物として除去した。上層懸濁液は１
００００ｒ、　ｐ、　ｍ、で遠心分離し、粗沈澱物を再
採取した。

（ｃ）この粗沈澱物を水１０１に懸濁し、これに塩化ナ
トリウム２．８６　Ｋびを加えて液の比重を約１．２０
に調整し、ついでこの調整液をａｏｏｏｒ、　ｐ、　ｍ
、で６０分間４℃で遠心分離し乳濁上薄部を分取した。

（ｄ）この乳濁上薄部を蒸留水にｉＪ濁し、蒸留水に対
してセロハン膜を用いて透析し、ついで得られた透析内
液を凍結乾燥して粗乾燥物７１９を得た。

（ｅ）この粗乾燥物に酢酸エチル８Ｊ！を１０℃で加え
、６０分間撹拌した後濾紙濾過を行い不溶物を濾取した
。乾燥後この不溶物をクロロホルム−メタノール混合液
（容量比２：１）１４ｆ！に接触させ３０分間撹拌し、
ついで濾紙濾過を行い抽出濾液１３．７Ｊを１ｑだ。

（ｆ）この抽出濾液を減圧乾固し、固形残渣１７．５９
を１がた。得られた固形残渣をクロロホルム−メタノー
ル混合液（容量比２：１）　１２０ｄに溶解し、これを
同混合液で平衡化したセファデックス［ト２０カラム（
直径１５．５ＣｍＸ　Ｂ８Ｃｍ　；カラムベッド体積１
６，６、ｆ７）に付した。このカラムを同混合液を用い
て流速１ｍｌ／分で）容出してゲル濾過し、ボイドボリ
ューム画分８６０１１１！７を採取した。この両分の微
量を用いて無菌試験を行ったところ無菌でおることが確
認されたので以下の操作は無菌条件下で行った。

（（１）上述のボイドボリューム画分を減圧乾固し、こ
れを無菌水に懸濁しついで凍結乾燥し、黄褐色のリポ蛋
白質粉末０．７７得た。分子量は３００００、比旋光度
［α］２は一７９°でおり、化学組成はリン脂買弁４７
．９％（Ｗ／旧、蛋白買弁４４．８％（Ｗ／Ｗ）、水分
５．０％（訂讐）及び不明組成分２．３％（Δ／Ｗ）で
めった。

大旗ｆＰＪ　６ （ａ）　２５人分の人羊水９．６ノを採集し、これをぞ
のまま粗抽出液とした。

（ｂ）この粗抽出液を１４０００ｒ、　ｐ、　ｍ、で遠
心分離し粗沈澱物を得た。１ｑられた粗沈澱物に生理食
塩液２３０ｍを１川えて懸濁したのち、４℃で１５００
ｒ、　ｐ、　ｍ。

の回転速度で遠心分離し上層懸濁液を得た。この上層懸
濁液を１２００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で遠心分離し、粗沈
澱物を再採取した。

（ｃ）この粗沈澱物を水５０ＩｎＩｌｋ１．懸濁し、こ
れに塩化ナトリウム１４．３ｇを加えて液の比重を約１
．２０に調整し、ついでこの調整液を８００Ｏｒ、　ｌ
）、　ｍ、で６０分間４℃で遠心分離し乳濁上薄部を分
取した。

（ｄ）この乳濁上薄部を蒸留水に懸濁し、蒸留水に対し
てセロハン膜を用いて透析し、ついで得られた透析内液
を凍結乾燥して粗乾燥物２．３９を得た。

（ｅ）この粗乾燥物に酢酸エチル２３０戒を８℃で７Ｊ
Ｄえ、３０分間撹拌した後濾紙濾過を行い不溶物を濾取
した。乾燥後この不溶物をクロロホルム−メタノール混
合液（容量比２：１）　４００ｄに接触させ３０分間撹
拌し、ついで濾紙濾過を行い抽出濾液３９０ｍ１を得た
。

（ｆ）この抽出濾液を減圧乾固し、固形残渣６８０／Ｊ
ｉｆｆを得た。得られた固形残渣をクロロホルム−メタ
ノール混合液（容量比３：１）　４７に溶解し、これを
同混合液で平衡化したセファデックスしト２０カラム（
直径２．４８　ｃｍＸ９０ｃｍ　：カラムベッド体積４
３５ｄ）に付した。このカラムを同混合液を用いて流速
０．２ｍ／分で溶出してゲル濾過し、ボイドボリューム
画分２４７を採取した。この両分の微量を用いて無菌試
験を行ったところ無菌でおることが確認されたので以下
の操作は無菌条件下で行った。

（（］）上述のボイドボリューム画分を減圧乾固し、こ
れを無菌水に懸濁しついで凍結乾燥し、黄褐色のリポ蛋
白質粉末２５ｍｇ得た。分子量は３６０００、比旋光度
［α１ル３は一６３°でおり、化学組成はリン脂質分６
６．３％（Ｗ／す）、蛋白質分２８．９％四／Ｗ）、水
分２．８％（Ｗ／旧及び不明組成分２．０％（Ｗ／Ｗ）
であった。

なあ、本実施例にあける水分の測定は微但水分測定法で
行った。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明リポ蛋白質のＫＢｒ錠法による赤外線吸収
スペクトルを示し、図２は該リポ蛋白質１．３７ｍｇを
１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液１０ｍ１に溶解して
得られた溶液を用いて測定した紫外線吸収スペクトルを
示す。 図２ 吸光度

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳動物の肺臓又は人羊水から得られるリポ蛋白
   質であつて、総重量に対する組成比が、リン脂質分は４
   ７．９〜７０．２％（Ｗ／Ｗ）、蛋白質分は２３．４〜
   ４８．０％（Ｗ／Ｗ）、水分は１．８〜５．０％（Ｗ／
   Ｗ）及び不明組成分は１．４〜２．４％（Ｗ／Ｗ）であ
   り、分子量が３００００〜３８０００であることを特徴
   とするリポ蛋白質。
2. （２）（ａ）哺乳動物の肺臓細片を生理食塩液に接触さ
   せるか又は人羊水を採集し、粗抽出液を得る工程、（ｂ
   ）該粗抽出液を遠心分離し粗沈澱物を得る工程、（ｃ）
   該粗沈澱物の水性懸濁液に塩化ナトリウムを添加して比
   重を調整し、得られた調整液を遠心分離して乳濁上薄部
   を分取する工程、（ｄ）該乳濁上薄部の水性懸濁液を透
   析して透析内液を得、ついでこれを凍結乾燥して粗乾燥
   物を得る工程、（ｅ）該粗乾燥物を酢酸エチル又はアセ
   トンに接触させて不溶物を採取し、この不溶物をクロロ
   ホルム−メタノール混合液に接触させ、抽出液を採取す
   る工程、（ｆ）該抽出液からデキストランゲルを用いた
   ゲル濾過により、ボイドボリューム画分を採取する工程
   及び（ｇ）該ボイドボリューム画分を減圧乾固し、得ら
   れた固形残渣の水性懸濁液を凍結乾燥する工程からなる
   ことを特徴とするリポ蛋白質の製造法。