JPS6356297A - 澱粉糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＶ粉糖の製造法に関し、詳しくは多孔質キトサ
ンに固定化した各種アミラーゼを充填した反応器に澱粉
液化液を供給して対応するグルコース、マルトース、マ
ルトオリゴ糖等の獣粉糖を製造する方法に関する。

［従来の技術、発明が解決しようとする問題点］固定化
酵素を利用してｙ粉糖を製造する方法については種々提
案されており、たとえば固定化したグルコアミラーゼを
利用して高濃度のグルコースを製造する方法が特公昭５
７−１７５１７号、特開昭５８−６０９８９号などに示
されている。しかし、前者の方法は生産されるグルコー
ス濃度が十分でなく、後者の方法は高濃度のグルコース
は馬鈴薯系８粉を原料として達成されており、一般に高
濃度グルコースの作りにくいコーンスターチ等を原料と
した場合については記載されていない。

また、β−アミラーゼを固定化してマルトースの製造に
利用することは特開昭５９−１９８９７７号などに示さ
れているが、酵素活性の維持に対してさらに改善するこ
とが望ましい。

さらに、マルトトリオース以上の重合度を有するマルト
オリゴ糖を生成するアミラーゼを固定化してマルトオリ
ゴ糖を製造する方法について本発明者らは既に開発した
（特願昭Ｅ１０−１２５０９３号）。

この技術は工業的にも十分に実施しうるちのであるが、
高価な酵素をより有効に利用することにおいて改善の余
地がある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、アミラーゼを固定化する担体について検
討を重ねた結果、多孔質キトサンを用いた場合に従来よ
りも通液速度を大きくすることができ、しかも酵素活性
を安定的に維持しうることを見出し、本発明に到達した
。また、固定化酵素を組合せて複合系とすることにより
目的とする澱粉糖の収率を高めることが出来ることも見
出した。

本発明は第１に、多孔質キトサンに固定化したアミラー
ゼを澱粉液化液に作用させることを特徴とする澱粉糖の
製造法に関するものであり、第２に多孔質キトサンに固
定化したアミラーゼを固定化枝切り酵素と共に澱粉液化
液に作用させることを特徴とする澱粉糖の製造法に関す
るものである。

本発明に用いるアミラーゼとしては各種のものがあり、
グルコアミラーゼはリゾプス属、アスペルギルス属、ム
ロール属、ビリカラリア属、などのカビ起源のものが主
に用いられ、特にリゾプス・デレマー起源のものが好適
である。そのほかエンドマイセス属、トリコデルマ属、
サツカロミ、セス属などの酵母やクロストリジウム・ア
セトブチリカムなどの細菌起源のものが知られている。

β−アミラーゼとしては、大豆、麦芽等の植物起源のも
ののほかにバチルス・ポリミキサ［Ｄ、　Ｆｒｅｎｃｈ
、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
、　１０４゜３３８（１９８４）ｌ　、バチルス・セレ
ウス［Ｙ、　Ｔａｋａｓａｋｉ。

Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＬ、　４０．１５１
５．１５２３　（１９７６）　］。

シュードモナス属細菌［Ｓ、　５ｉｎｋｅら、　Ｊ、Ｆ
ｅｒｍｅｎｔ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　５３．６９３．８９８　（１９７
５）　］　　、　７．トレプトミセス・ヒゲロスコピカ
ス［Ｙ、　Ｈｉｄａｋａ　　ら。

５ｔｉｒｋｅ、　２８．４１３　（１９７４）］　　、
ストレプトミセス・プレコックス［若生勝雄ら、澱粉化
学、　２５．１５５（１９７８）］等の微生物起源のも
のがある。

また、マルトトリオース以上の重合度を有するオリゴ糖
を生成するアミラーゼとしては次のものが知られている
。

マルトトリオース生成アミラーゼ［若生勝雄ら：と粉化
学、其、　１７５　（１９７９）、ストレプトミセス・
グリセウス　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅ
ｕｓ　）起源の・　もの：高埼義幸：昭和５８年度日本
農芸化学大会要旨集、　Ｐ１６！３　（１９８３）　、
バチルス　（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　１ｕｓ）属起源のもの］ マルトテトラオース生成アミラーゼ［Ｊ、　Ｆ。

Ｒｏｂｙｔ　ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ａｃｋｅｒｍａｎ　：
　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１４５．１０５　（１９７１）　
、シュードモナス・ストツツェリ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　、５ｔｕｔｚｅｒｉ　）起源のもの］ マルトペンタオース生成アミラーゼ［Ｎ。

５ａｉｔｏ　：　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、、　１５５．２９０（１９７３）、バチル
ス・リケニホルミス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ　）起源のもの；小林昭−ら：昭和５８
年度日本澱粉学会大会要旨集、Ｐ２Ｏ３（１９８３）　
　；吉儀尚浩ら：昭和５８年度日水鳥芸化学大会要旨集
、Ｐ２Ｓ５　（１９Ｂ４）　］ マルトヘキサオース生成アミラーゼ［Ｋ。

Ｋａｉｎｕ＋＋＋ａら：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　２
８．２８１　（１９７２）、エアロバクター°エアロゲ
ネス　（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇａｎｅｓ　）
起源のもの　；　Ｊ、　ｆ；、　Ｋｅｒ＋ｎｅｄｙ　ａ
ｎｄＣ，Ａ、　Ｗｈｉｔｅ　：　５ｔｉｒｋｅ、３１．
９３　（１９７９）　；谷口肇ら　：　澱粉化学、２９
．１０７　（１９８２）　；　Ｙ、　Ｔａｋａｓａｋｉ
：　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　４７．
　２１９３　（１９８３）　　］次に、上記アミラーゼ
の担体として用いる多孔賀キトサンとしては自然界に広
く存在し、甲殻類。

節足動物などに多く含まれる天然高分子キチンを脱アセ
チル化して得られるキトサンがあり、特に粒状化、多孔
質化したものや良好な吸看性渣をもたせたものが好まし
い。たとえば商品名：キトパール（富士紡績社製）は好
適なものである。これは天然高分子キチンを脱アセチル
化した後。

ジカルボン酸、ジアルデヒド、ジイソシアネート等で架
橋して耐酸性を付与したものに、さらにスペーサーとし
て脂肪族または芳香族系などの官能基を導入した多孔性
ビーズであり、ｐＨ安定性。

耐薬品性、熱安定性にすぐれている。この「キトパール
」は粒径０．１〜３．０ｍｍ　、孔径３．０μｍ以下。

比表面′ｖｉ１５〜２３０　ｍ？／ｇであるが、本発明
ではこの値に制限されるものではない。

各種アミラーゼをキトサンに固定化する方法は任意であ
り、たとえば緩衝液中で両者を接触させる方法を採用す
ることができる。その１例を示すと、「キトパールＪ　
１００　ｔｒｒｇを０．０１〜０．２０モル濃度の各種
緩衝液（ｐＨ４，０〜８．０）で上のに平衝化した後、
各種アミラーゼ５〜５００単位を緩衝液２ｎｉ）に溶解
して添加し、十分に混合する。次いで、室温にて０．５
〜２４時間放置するか、または０．５〜５．０時間往復
振どう処理（１２０ストロ一ク／分）した後、ガラスフ
ィルターで更過し、続いて種々の緩衝液５０ｍｆで洗浄
する。

このようにして得られる固定化酵素は見かけ上の固定化
率が３０％以上であり、固定化酵素の発現活性は担体湿
重量１ｇあたり４０〜２０００単位である。なお、見か
け上の固定化率は次式によって算出した値である。

酵素の固定化方法としては、上記方法のはか担体をカラ
ムに充填したのち酵素溶液を下降法または上昇法により
通液する方法も適用できる。

本発明に用いる固定化アミラーゼは担体への固定化が極
めて容易であり、しかも酵素の発現活性も実用に十分耐
えるものである。

次に、第２の本発明で用いる固定化枝切り酵素について
説明する。枝切り酵素としては、バチルス・アシドプル
リティカス、タレブシェラ・ニューモニアなどの微生物
起源のプルラナーゼやシュードモナス・アミロデラモサ
、シトファーガ属微生物等が生産するイソアミラーゼを
用いることができるが、グルコース生成アミラーゼでは
ほとんどがｐＨ４、０〜６．０、マルトオリゴ糖生成ア
ミラーゼではほとんどがｐＨ５，０〜８．５の範囲に至
適ｐＨを有するので、枝切り酵素も同様の安定かっ至適
ｐＨ範囲を有するものを用いることが望ましい。

枝切り酵素を固定化する担体については、固定化操作に
より高い発現活性を示すものであれば、どのようなもの
でも良いが、特に次の担体を用いることが好ましい。す
なわち、本発明者らは数多くの担体の中から各種枝切り
酵素を効果的に固定化しうるちのを選択すべく検討した
結果、特に微弱酸性的多孔質吸着樹脂１弱酸性カチオン
樹脂、フェノール未吸着樹脂９粒状多孔質キトサンなど
が好適な担体であることを見出した。より具体的には、
デュオライト系樹脂（ダイヤモンド・ジャムロック社製
）の商品名ｒ　Ｓ　−７８１Ｊ　’。

ｒＳ−７Ｂ２Ｊ　、　ｒＥＳ−７７１Ｊ　、　ｒｃ−４
８４Ｊ　、　ｒＡ−７Ｊ　　、ｒｓ−５ｓ７Ｊ　　、ｒ
Ａ−ｓｅ２Ｊ　ｚや前記のｒキトパール」を挙げること
ができる。

なお、枝切り酵素の固定化方法は制限されず。

たとえば前記した方法を適用することができる。

また、ネイティブ波切り酵素および固定化枝切り酵素の
活性測定方法は、基質としてプルラン（ハヤシバラ生物
化学研究所製）またはアミロペクチンを用い、それらの
至適ｐ）Ｉで反応を行なうこと以外は各種アミラーゼの
場合と同じである。

本発明で使用する原料澱粉としては種々のものが使用で
きるが、通常馬鈴薯澱粉、せ薯Ｖ粉。

コーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、キャヅサバ
Ｖ粉等を用いる。また、反応器に通液する澱粉液化液の
グルコース当量（ＤＥ）は通常、１〜３５、好ましくは
５〜２０の範囲にあるものを用いるのが良い。ここで澱
粉液化液のＤＥがワキシーコーンスターチの場合１以下
、それ以外の澱粉ではＤＥが５以下のものは老化が徴し
く、工程上の取扱いに１夫が必要である。一方、ＤＥが
３５以上になると、グルコアミラーゼによるグルコース
生成に対しては適合成が促進されてイソマルトース、パ
ノースなどの生成が増大し、グルコースの収量が低下す
る。また、各種マルトオリゴ糖の生成に対してグルコー
ス、マルトース等の低分子糖の生成が増大し、かつマル
トオリゴ糖の収量が低下するので適当でない、なお、各
種澱粉を液化する方法は特に制限はないが、通常は液化
型α−アミラーゼまたは塩酸等の酸で処理する。　次に
、マルトオリゴ糖とはマルトース、マルトトリオース、
マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキ
サオース等を意味する。

本発明者らは、固定化酵素を用いて各種澱粉糖を効率よ
く生成するため条件について種々検討を重ねた結果、次
のような因子等が大きく影響していることが判った。す
なわち、使用する基質の種類、ｅ度およびその供給量、
固定化担体の種類（物性）、固定化した酵素量、その充
填塔への充＠看、反応系の温度、　ｐＨ等の条件などで
ある。

これらを系統的に検討した結果、これら因子等の影響は
以下に示す表現および条件の範囲内において効率よくそ
れぞれの澱粉糖を生成することができることを見出した
。すなわち、本発明の方法では、固定化アミラーゼを反
応器に充填し、前述の澱粉液化液を固定化酵素単位活性
あたりの重量基準空塔速度がＩ　Ｘ　１０−４〜２　Ｘ
　１０１ｈｒ−１（１０／ｇ）弓の条件で供給すること
によって効率良く各種Ｖ粉糖を製造するものである。よ
り好ましくは、グルコアミラーゼに対してはＩ　Ｘ　１
０−４〜３　Ｘ　１Ｏ−３ｈｒ−’（ＩＵ／ｇ）−’、
β−アミラーゼに対してはｌＸｌ０−４〜４　Ｘ　１Ｏ
−３ｈｒ−１（１０／ｇ）−’、各種マルトオリゴ糖生
成アミラーゼに対しては３　Ｘ　１０＝　〜２　Ｘ　１
Ｏ−Ｉｈｒ−１（ＩＵ／ｇ）−’の条件を適用すべきで
ある。ここで、固定化酵素の単位活性あたりの重量基準
空塔速度は次のようにして求めた値である。まず、反応
器に充填するものと同じ固定化アミラーゼ１０ｍｇ　（
ｗｅｔ）を０．５ｍｊ）の１０ｍＭ各種バッフ　７−　
　（ｐＨ７，０）　（５０ｍ、ｊｌ！三角フラスコ中）
に加え、十分に馴染ませた後、反応器に供給するものと
同じ基質（澱粉の種類、濃度等も同じ）　５．Ｏｗｊ）
を加えて、反応器と同じ温度で往復振とう機により１２
０ストロ一クス／ｗｉｎ、。

４ｃｍ幅で振とうしながら酵素反応を行い、生成還元動
をＳｏｍｏｇｙ　１−Ｎｅ　１ｓｏｎ法で測定するか、
高速液体クロマトグラフィーのような分析機器で直接生
成する澱粉糖を測定して発現する活性を測定する（この
発現活性をＡ　　ＩＵ／ｇ−担体とする。）。なお、酵
素活性はそれぞれの反応条件で１分間にＩｇｍｏｌのグ
リコシド結合を切断する酵素量を１単位（１国際型位Ｉ
Ｕ）として表わすことにする。また、反応器に充填する
固定化アミラーゼをＢ　ｇ　（ｗｅｔ）　、反応器に供
給する殿粉液化液量を固形分としてＣｇ−固形分／ｈｒ
とするとき、単位活性あたりの重量基準空塔速度をＣ／
　（ＡＸＢ）ｈｒ司（ＩＵ／ｇ）川として求める。なお
、ＤＥが大きい場合には原料中に目的とする澱粉糖やそ
れよりも小さい糖を含むので、上記Ｃの値としてはそれ
らを除いた固形分量を用いるのがより実際的である。単
位活性あたりの重量基準空塔速度が２×１０司ｈｒ　ｌ
　（１０／ｇｌ　’　、グルコアミラーゼの場合ニハ３
　Ｘ　１Ｏ−３ｈｒｉ（ＩＵ／ｇ）−’、β−アミラー
ゼの場合には４　Ｘ　１０１ｈｒ−’（ＩＵ／ｇ）−’
、マルトトリオース以上の重合度を有するマルトオリゴ
糖生成アミラーゼの場合には２　Ｘ　１Ｏ−１ｈｒ−１
（ＩＵ／ｇ）川よりも大きいと、すなわち反応器中での
反応時間が短いと加水分解反応が十分におこなわれない
ため、それぞれの澱粉糖の収率が悪くなり好ましくない
。また。

マルトオリゴ糖の生成の場合には単位活性あたりの重量
基準空塔速度がＩ　Ｘ　１０＝ｈｒ−１（１０／ｇ）川
よりも小さくなると、すなわち反応器中での反応時間が
長くなると、下記の刊行物に明らかにされているように
、生成したマルトオリゴ糖がさらに過分解サレるため、
グルコース、マルトース等の低分子の糖が生成され、製
品の純度が著しく低下するばかりでなく、後に精製分離
を行なう場合の効率ルトオリゴ糖の過分解については、
マルトオリゴ糖生成アミラーゼは、反応初期にはそれぞ
れのオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース
、マルトペンタオース、マルトヘキサオース等）を特異
的に生産するが、反応後期になるにつれて生成物そのも
のを分解することが明らかにされている［　Ｔ、　Ｎａ
ｋａｋｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ　；　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒｏ
。

Ｒｅｓ、、　１２８．２９７　（１９８４）　］　。

また、グルコアミラーゼの場合は、単位活性あたりの重
量基準空塔速度がｌ　Ｘ　１Ｏ−３ｈｒ−’（ＩＵ／ｇ
）−１あたりからパノース、イソマルトース等を生成す
る逆反応が進行し、目的とするグルコースの収率が低下
し、効率的でなくなる。

一方、現実的にみて、単位活性あたりの重量基準空塔速
度がＩ　Ｘ　１０１ｈｒ−１（ＩＵ／ｇ）用具下になる
と、反応器中での滞留時間が長くなり、反応器の大きさ
も過大となり、経済的にも有効性のないものとなると共
に、原料澱粉液化液の名化による目的澱粉糖の低下を来
たし、また運転上のトラブルの原因ともなりかねない。

本発明によれば、固定化アミラーゼの使用によって固定
化しない元のアミラーゼよりも反応条件の拡大が期待で
きる。たとえばキトサンに固定化した固定化マルトテト
ラオース生成アミラーゼの場合には、温度安定性が１０
”０種度高温側に広がると共にｐＨ安定性も広範囲にわ
たり改善される。また、至適温度は固定化により１０−
１５℃上昇し、至適ｐＨ曲線も酸性側に広がることを見
出しており、固定化酵素の酵素化学的性質は可成り改善
され、元の酵素を用いる場合よりも極めて有利な条件で
反応を行なうことができる。

本発明の方法により、たとえばマルトオリゴ糖を製造す
る場合、マルトオリゴ幻の目的とする純度に応じて様々
な製造方式゛をとり得る。たとえば純度２０〜６０％程
度のマルトオリゴ糖は、４０％（ｗ／ｗ）の澱粉液化液
を前述の固定化マルトオリゴ糖アミラーゼを充填した反
応器に前述の条件で供給することによって得られる。ま
た、さらに高純度（６０〜１００％）のマルトオリゴ糖
は、上記反応器から得られた生成物をさらに精製分離す
ることにより得られる。この場合の精製分離手段は特に
制限はなく種々の方法をとりうるが、たとえば限外濾過
、ゲルが過、カチオン交換樹脂カラムクロマトグラフィ
ー、カーボンカラムクロマトグラフィー等の手段が有効
である。また、上記精製分離を行なった際に得られる未
分解物の一部または全部を固定化マルトオリゴ糖生成酵
素を充填した反応器へ再循環させて供給原料の一部とす
ることによって原料澱粉液化液あたりのマルトオリゴ糖
収量を増大させることができる。さらに、該未分解物の
一部または全部をそのままリミットデキストリンとして
利用することもできる。

次に固定化アミラーゼと共に固定化枝切り酵素を併用す
る第２の発明について説明する。

固定化アミラーゼと併用する固定化枝切り酵素性ベース
で前者ｌに対して後者０．１〜５、好ましくは０．２〜
２の範囲とする。固定化枝切り酵素の比率を上限以上と
しても、相応する効果が奏されない上に、反応器の大き
さが比例的に大きくなるので経済的に好ましくない。こ
こで、枝切り酵素を併用した場合の単位活性あたりの％
”（Ｉ基準空塔速度は、前述の式において発現活性（Ａ
ＩＵ／ｇ）としては枝切り酵素の発現活性は考慮せずに
使用するアミラーゼの発現活性だけを考慮して求めれば
よい。

両酵素を併用する複合酵素系の場合、反応器の形態と充
填方法は種々の態様が考えられる。たとえば、２種の固
定化酵素を別々の容器に充填する方法、２種の固定化酵
素を混合してから同じ容器に充填する方法、さらには２
種のネイティブ酵素を一定の比率で混合した後、同時に
固定化し、容器に充填する方法等がある。

［発明の効果］ 本発明の方法によれば、グルコース、マルトース、マル
トトリオース以上の重合度゛を有するマルトオリゴ糖を
製造するにあたり、固定化酵素単位活性あたりの重量基
準空塔速度を従来よりも大きくでき、しかも酵素活性は
長時間にわたり安定に保持される。そのため、目的とす
る澱粉糖を効率よく、かつ高収率にて製造することがで
きる。とりわけ、アミラーゼと共に枝切り酵素を用いて
固定化複合酵素系とした場合、目的物質の収率は格段と
向上する。

また、原料澱粉としてコーンスターチを使用した場合で
もネイティブ酵素と同程度に高濃度の澱粉ａ（特にグル
コース）を得ることができる。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ 担体として多孔質キトサン（商品名：キトパールＢＯＷ
　３５０５．　　富士紡績■製）を用い、リゾプス・デ
レマー起源のグルコアミラーゼ（新日本化学■製）を固
定化した。すなわち、担体のキトサンを２０ｍＮ酢酸緩
衝液（ｐＪ（５，５）で十分に平衝化した後、１００ｔ
ｊ）容の三角フラスコに湿重量で１０ｇの担体を秤量し
、これにグルコアミラーゼを担体１ｇあたり１０５０単
位（液ｉ１０ｍＪ）添加した。次いで、室温で１時間往
復振とぅ（１２０ストロ一ク／分）して固定化した。さ
らに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｎｓ、ｏ）で蛋白質が溶出
しなくなるまで十分に洗浄し、固定化グルコアミラーゼ
標品を得た。この標品にっいて前述した方法により発現
活性を測定したところ４３５１Ｕ／ｇ−担体であった。

この固定化グルコアミラーゼ１０ａ＋ｊ）をガラスカラ
ム（直径１０ｍｍ　、長さ２０ｍｇ＋）に充填し、基質
として３０％（ｗ／ｗ）　（７）　コー　ンスターチ液
化液（ＤＥ＝　１１゜ｐＨ５，５）を用イテ温度５０’
Ｃ、空塔速度０．２５．０．５および１．０ｈｒ−１（
単位活性あたりの重量基準空塔速度はそれぞれ２．４８
Ｘ　１０−４　、４．９５Ｘ　１０−４＄　ヨび９．８
９Ｘ　１Ｏ−４ｈｒ−１（１０／ｇ）−’）　（７）各
条件で連続的に通液した。なお、空塔速度は下記の式に
より計算した。結果を第１表に示す。

比較例１ 担体として多孔性弱塩基性アニオン交換樹脂デュオライ
トＡ−７（ダイヤモンドジャムロック社製）を使用し、
特開昭５８−ｆ！０９８９号の実施例１に記載の方法で
固定化したこと以外は実施例１と同様に行なった。なお
、固定化酵素の発現活性は１５７　Ｉυ／ｇ−担体であ
った。この固定化酵素を用いて実施例１と同様に実験を
行なった（単位活性あたりの重量基準空塔速度はそれぞ
れ８．８５Ｘ　ｔｏ−４。

１．３７Ｘ　１０１および２．７４Ｘ　１Ｏ−３ｈｒ−
’（ＩＵ／ｇ）−’）　、結果を第１表に示す。

０．２５　　　　　　９５．２　　　　　９４．２０．
５　　　　　　９Ｂ、７　　　　　９３．８１・０　　
　　　　９５．２　　　　　８７．４実施例２ 担体として多孔質キトサン（商品名：キトパールＢＣＩ
ＩＩ　３５０５．　　富士紡績■製）を用い、β−アミ
ラーゼ（大豆起源、長瀬産業■製）を常法により固定化
した。得られた固定化β−アミラーゼの発現活性は２３
０１０／ｇ−担体であった。

この固定化β−アミラーゼをガラスカラム（直径２７■
、長さ１３０　ｍ＋ｏ）に充填し、基質として２５％（
ｖ／＋１）　ノ’１３粉液化液（ＤＥ＝　７　、　ｐＨ
６，０）を用いて温度５０℃、空塔速度０．２　、０．
５　、１．０および１．５ｈｒｉ　　（単位活性あたり
の重量基準空塔速度はそれぞれ３．０９Ｘ　１０−４．
７．７３Ｘ　１０−４．１．５５Ｘ　１０−３オよび２
．３２Ｘ　１Ｏ−３ｈｒ−１（ＩＵ／ｇ）川）の各条件
で連続的に通液した。結果を第２表に示す、また、空塔
速度１．５ｈｒ−１で連続通液したときの反応液中のマ
ルトース含量の経時変化を第１図に示す。

比較例２ 担体としてデュオライト系吸着樹脂Ｓ　−７８１（ダイ
ヤモンドジャムロック社製）を使用し、実施例２と同様
にしてβ−アミラーゼの固定化を行なった。固定化β−
アミラーゼの発現活性はＩＨＩＵ／ｇ−担体であった。

この固定化酵素１０ａｊ）を実施例２と同様にガラスカ
ラムに充填し、基質として２５％（ｗ／ｗ）のｙ粉液化
液（ＤＥ＝　７　、　ｐＨ８，０）を用イテ温度５０°
Ｃ９空塔速度０．２　、０．５　、１．０および１．５
ｈｒ−’　　（単位活性あたりの重量基準空塔速度はそ
れぞれ３．５９Ｘ１０−４．８．９８Ｘ１０−４．１．
８０ＸｌＯ−３および２．７０Ｘ　１Ｏ−３ｈｒ　’　
（１０／ｇ）川）の各条件で連続通液した。結果を第２
表に示す。

０．２　　　　　　５２．５　　　　　５２．４０．５
　　　　　　５２．５　　　　　４４．８１．０　　　
　　　５２．３　　　　　３７．５１．５　　　　　　
５２．１　　　　　３０．３第２表および第１図から明
らかなように本発明によれば従来の固定化酵素を用いた
場合よりも速い空塔速度で高いマルトース生成量が得ら
れ、しかも３０日後でも活性の低下はほとんど認められ
ず、半減期は１年以上であった。

実施例３ 酵素としてマルトテトラオース生成アミラーゼ（シュー
ドモナス・ストッツェリ起源、比活性８０．８１０／ａ
ｇ・タンパク）、を用い固定化用担体としてキトサンビ
ーズ（商品名：キトパールＥＣ：Ｗ　３５０５．富士紡
績社製）を使用して固定化酵素を得た。すなわち、担体
２０ｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪバッファー（ｐＨ
７，０）で充分に平衝化した後、１００ＩＩＩ！の同一
バッファーに溶解した２０，０００　ＩＵの酵素を添加
し、室温で１時間往復振とう（３００ｍｊ？容三角フ歩
容三角フラスコ中ローク／分、４ｃ＋ｏ幅）しながら酵
素を担体に固定化した０次いで、濾紙テ’Ｉ濾過した後
、１ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ’バッファー（ｐＨ７，０
）で蛋白質が溶出しなくなるまで十分に洗浄し、発現活
性が３５０１０／ｇ−担体の固定化マルトテトラオース
生成酵素を得た。

次に直径２７ｍｍ、長さ１３０　ｍｍのガラスカラムに
マルトテトラオース生成固定化酵素１ＯＩＩＦを充填し
た・基質として２６．２％（ｗ／ｗ）の澱粉液化液（Ｄ
Ｅ＝７　、　ｐＨ７，２）を用い、温度４５°Ｃ９空塔
速度２．０゜５．０および１０．０ｈｒｌ　（単位活性
あたりの重量基準空塔速度はそれぞれ２．４２Ｘ　１０
−３　、６．０５Ｘ　１０−３および１．２１Ｘ　１Ｏ
−２ｈｒｌ（ＩＵ／ｇ）−’）　（７）各条件で連続通
液した。その結果を第３表に示す、また空塔速度２．０
ｈｒｉの条件で連続通液したときの反応液中のマルトテ
トラオース含量の経時的変化を第２図に示す。

比較例３ 担体としてデュオライト系吸着樹脂Ｓ−７６１を用いて
実施例３と同様な方法で得た固定化マルトテトラオース
生成アミラーゼ１０ｇ（発現活性２１５　ＩＵ／ｇ）を
反応器に充填し、これに原料として２６．２％（ｗ／ｗ
）の澱粉液化液（ＤＥ＝　７　、　ｐＨ７，２）を２４
ｍＩ！／ｈｒ、温度４５°Ｃ１空塔速度２．０．５．０
および１０ｈｒｌ　（単位活性あたりの重量基準空塔速
度はそれぞれ３．４８Ｘ　１０−３．８．７１Ｘ　１０
−”および１．７４Ｘ１０−２ｈｒ−’（１０／ｇ）川
）の条件で連続通液した。ソノ量の経時変化を第２図に
示す。

２．０　　　　　　４４．５　　　　　４２．６５．０
　　　　　　４４．　ｌ　　　　　　３７．２１０．０
　　　　　　４１．７　　　　　３１．５以上のように
、本発明によれば、従来の固定化酵素を用いた場合より
も高純度のマルトテトラオースが得られる。

比較例４ 実施例３と同様な方法で得た固定化マルトテトラオース
生成アミラーゼ（ただし、発現活性２７３１０／ｇ）　
８．８　ｇを反応器に充填し、これに１０％（ｗ／ｗ）
の澱粉液化液（ＤＥ＝　８．０．　　ｐｌ（＝　ｅ、ｓ
　）を用いて温度４０℃、流速１　、１ｍ１）／ｈｒの
条件（単位活性あたりの重量基準空塔速度は（８，８３
Ｘ　１Ｏ−５ｈｒ　１（１０／ｇ）川）で連続通液して
反応生成物を得た。この生成物の組成を第４表に示す。

比較例５ 実施例３と同様な方法で得た固定化マルトテトラオース
生成アミラーゼ（ただし発現活性４６．７１０／ｇ）　
６．８　ｇを反応器に充填し、これに３０％（ｗ／ｗ）
のＳ粉液化液（ＤＥ＝８．０．　ｐＨ８，８）を用いて
温度４０℃、流速２１０ｍ１）／ｈｒの条件（単位活性
あたりの重量基準空塔速度は２．２９Ｘ　１０−　’ｈ
ｒ　’　（ＩＵ／ｇ）−’）で連続通液して反応生成物
を得た。この生成物の組成を第４表に示す。

Ｇｌ　〜Ｇ３　”＋　　　８５．０　　、　　１７．３
Ｇ４　　　　　　”２　　　　１１．０　　　　　　　
　１１．ＯＧ５　　　　　−３　　　、　　　４．０　
　　　　　　　　？８．７◆１　グルコース、マルトー
スおよびマルトトリオース 中２　マルトテトラオース 弓　マルトペンタオース以上の成分 以北のように、単位活性あたりの重量基準空塔速度がＩ
　Ｘ　１Ｏ−４ｈｒｉ（１０／ｇｌ’よりも小さい場合
および２　Ｘ　ｉＯ−１ｈｒ−’　（ＩＵ／ｇ）−’よ
りも大きい場合はいずれもマルトテトラオースの収率が
小さくなっていることが判る。

実施例４ 枝切り酵素であるプルラナーゼ（クレブシェラ・ニュー
モニア起源、比活性５０１Ｕ／ｍｇ−蛋白質。

天野製薬株式会社製）を用いてｐＨ８，０のリン酢バッ
ファーを使用したこと以外は実施例１と同様の方法でキ
トパールＢＯＷ　３５０５に固定化した。得られた固定
化プルラナーゼの発現活性は１２９　ＩＵ／ｇ　−担体
であった。

次に、直径１０ｍｍ　、長さ２００ｍβのガラスカラム
２本を用いて固定化グルコアミラーゼ４ｖｌ！と」二連
の方法で得られた固定化プルラナーゼ９．ＯｍＪ（発現
活性比は約３＝１）を混合して充填した。

一方、基質として３０％（Ｗ／胃）のコーンスターチ液
化液（ＤＥ＝　１１．　ｐＨ５，５）を用い、温度５０
℃、空塔速度０．２５．０．５および１．０ｈｒ−１（
単位活性あたりの重量基準空塔速度はそれぞれ２．４８
Ｘ　１０１．４．９５ＸＩＯ−３および９．８９Ｘ　１
０１ｈｒ−’（ＩＵ／ｇ）−’）の条件で連続通液した
。得られた結果を第５表に示す。

第　　５　　表 ０．２５　　　９５．８　　９５．２ ０．５　　　９７．３　　９８．７ １．０　　　９Ｇ、１　　９５．２ 表に示すごとく、単独固定化酵素系よりも複合固定化酵
素系の方が反応生成物中のグルコース濃度が約１％上昇
した。

実施例５ 実施例２と同様にして得た固定化β−アミラーゼ１０ｍ
βと実施例４と同様にして得た固定化プルラナーゼ１０
ｍｉ！を混合（発現活性比はβ−アミラーゼ：プルラナ
ーゼ＝２．１　　：　１．０　）　Ｌ、てそれぞれ充填
した。基質として２５．０％（ｗ／りの澱粉液化液（Ｄ
Ｅ＝　７　、　ｐＨ６，０）を用いて温度５０°Ｃ９流
速１５ｍｊ）／ｈｒ　　（単位活性あたりの重量基準空
塔速度は２．３２Ｘ　１（１３ｈｒ−１（ＩＵ／ｇ）川
）の条件で連わ’を通液した。運転日数０．１５．３０
Ｅｌ後のカラム流出液の膠１組成を第６表に示す。表に
示すごとく、複合固定化酵素系の方がβ−アミラーゼの
みの単一酵素系よりもマルトース純度が約１０〜１２％
上昇し、また３０日経過後でも活性の低下はほとんどみ
られなかった。

第　　６　　表 ０　　５３．０％　　６４．２％ １５　　５１．８％　　Ｂ４．２％ ３０　　５０．１％　　６４．０％ 実施例６ 実施例３と同様にして得た固定化マルトテトラオース生
成酵素１０ｍ！！と実施例３と同様にして得た固定化プ
ルラナーゼ５ｍｊ？を混合（発現活性比。

β−アミラーゼ：プルラナーゼ＝４．１）’ｌ、てそれ
ぞれ充填した。基質として２６．２％（ｗ／ｗ）の澱粉
液化液（ＤＥ＝　７　、　ｐＨ７，２）を用いて温度４
０℃、流速２４ｊ？／ｈｒ　（単位活性あたりの重量基
準空塔速度は４．０８Ｘ　１Ｏ−３ｈｒ−’（ＩＵ／ｇ
）−’）の条件で連続通液した。運転日数０．１５．３
０日後のカラム流出液の糖組成を第７表に示す。表に示
すごとく、複合固定化酵素系の方が固定化マルトテトラ
オース生成酵素のみの単一酵素系よりもマルトテトラオ
ース純度が約５％上昇し、また３０日経過後でも活性の
低下はほとんどみられなかった。

第　　７　　表 ０　　４５．２％　　５０．５％ １５　　４４．０％　　４８．３％ ３０　　４２．９％　　４６．２％

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２における反応液中のマルトース含量の
経時変化を示し、第２図は実施例３および比較例３にお
ける反応液中のマルトテトラオース含量の経時変化を示
す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）多孔質キトサンに固定化したアミラーゼを澱粉液
   化液に作用させることを特徴とする澱粉糖の製造法。
2. （２）アミラーゼがグルコアミラーゼ、β−アミラーゼ
   およびマルトオリゴ糖生成アミラーゼのいずれかである
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）澱粉がコーンスターチである特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の方法。
4. （４）多孔質キトサンに固定化したアミラーゼを固定化
   枝切り酵素と共に澱粉液化液に作用させることを特徴と
   する澱粉糖の製造法。
5. （５）アミラーゼがグルコアミラーゼ、β−アミラーゼ
   およびマルトオリゴ糖生成アミラーゼのいずれかである
   特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）澱粉がコーンスターチである特許請求の範囲第４
   項または第５項記載の方法。
7. （７）枝切り酵素がバチルス・アシドプルリティカスま
   たはクレブシェラ・ニューモニア起源のプルラナーゼも
   しくはシュードモナス・アミロデラモサまたはシトファ
   ーガ属微生物起源のイソアミラーゼである特許請求の範
   囲第４〜６項のいずれかに記載の方法。