JPS6356288A - ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 - Google Patents
ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトリゾチーム遺伝子の微生物学的製造法に
関する。更に具体的には、本発明は化学的に合成したヒ
トリゾチーム遺伝子、熱により増幅可能なプラスミドを
用いた遺伝子工学的手法によるヒトリゾチームの製造法
に関する。
関する。更に具体的には、本発明は化学的に合成したヒ
トリゾチーム遺伝子、熱により増幅可能なプラスミドを
用いた遺伝子工学的手法によるヒトリゾチームの製造法
に関する。
ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リンパ
腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、N−アセ
チルグルコサミンと、N−アセチルムラミン酸量のβ−
1,4結合を加水分解するムラミダーゼとしての酵素活
性を有していることが知られている。ヒト乳由来のりゾ
チームは、下記の配列で示される130個のアミノ酸か
らなることが知られている。〔例えば、船津ら[溶酸酵
素」55〜58頁 講談社すイエンティフィク(197
7)参照] L’ ys−Va 1−Phe−Glu−Arg−Cy
s−Glu−Leu−Ala−Alorg−Thr−L
eu−Lys−Arg−Leu−Gly−Met−As
p−Gly−T”yr−A”rg−Gly−11e−3
er−Leu−Ala−Asn−Trp−Met−C”
ys−Leu−Ala−Lys−Trp−Glu−5e
r−Gly−Tyr−Asn−T40hr−A”rg−
Ala−Thr−Asn−Tyr−Asn−Ala−G
ly−Asp−A”rg−3et−Thr−Asp−T
yr−Gl y−11e−Phe−G1n=I 1e−
A”5n−3”er−Arg−Tyr −Trp−Cy
s−Asn−Asp−Gly −Lys−T’°hr−
Pro−Gl y−Ala−Va 1−Asn−Al
a−Cys−!(i 5−Leu−380er−C”y
s−3er −Ala−Leu−Leu−G”1n−A
sp −Asn −夏 1e −A 901a−
Asp−Ala−Va 1−Ala−Cys−Al
a−Lys−Arg−Va 1−VIO’ a 1−
A’°I rg−Asp−Pro−Gin−Gl y
−11。
腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、N−アセ
チルグルコサミンと、N−アセチルムラミン酸量のβ−
1,4結合を加水分解するムラミダーゼとしての酵素活
性を有していることが知られている。ヒト乳由来のりゾ
チームは、下記の配列で示される130個のアミノ酸か
らなることが知られている。〔例えば、船津ら[溶酸酵
素」55〜58頁 講談社すイエンティフィク(197
7)参照] L’ ys−Va 1−Phe−Glu−Arg−Cy
s−Glu−Leu−Ala−Alorg−Thr−L
eu−Lys−Arg−Leu−Gly−Met−As
p−Gly−T”yr−A”rg−Gly−11e−3
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Ala−Thr−Asn−Tyr−Asn−Ala−G
ly−Asp−A”rg−3et−Thr−Asp−T
yr−Gl y−11e−Phe−G1n=I 1e−
A”5n−3”er−Arg−Tyr −Trp−Cy
s−Asn−Asp−Gly −Lys−T’°hr−
Pro−Gl y−Ala−Va 1−Asn−Al
a−Cys−!(i 5−Leu−380er−C”y
s−3er −Ala−Leu−Leu−G”1n−A
sp −Asn −夏 1e −A 901a−
Asp−Ala−Va 1−Ala−Cys−Al
a−Lys−Arg−Va 1−VIO’ a 1−
A’°I rg−Asp−Pro−Gin−Gl y
−11。
−Arg−Ala−Trp−V”’ a l −A
la−Trp−Arg−Asn−Arg−Cys−Gl
n−Asn−Arg −A”’ 5p−V”’ a
l−Arg−Gin−Tyr−Va 1−Gin−G
ly−Cys−Gly−V+30 a 1 ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し、食
品等の防腐剤あるいは医薬品としては抗菌剤、非アレル
ギー性の抗炎症薬として利用する事ができる。
la−Trp−Arg−Asn−Arg−Cys−Gl
n−Asn−Arg −A”’ 5p−V”’ a
l−Arg−Gin−Tyr−Va 1−Gin−G
ly−Cys−Gly−V+30 a 1 ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し、食
品等の防腐剤あるいは医薬品としては抗菌剤、非アレル
ギー性の抗炎症薬として利用する事ができる。
ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができ
るが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすに
は効率が悪く実用的ではない。組換えDNA技術による
ヒトリゾチームの生産に関しては既に報告されている(
特開昭6l−78383)。
るが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすに
は効率が悪く実用的ではない。組換えDNA技術による
ヒトリゾチームの生産に関しては既に報告されている(
特開昭6l−78383)。
本発明者らは、翻訳活性を上昇させる目的でメンセンジ
ャーRNAの構造を種々研究し翻訳開始コドン(ATG
)及びライボゾーム結合部位(別名シャインーダルガー
ノ領域)が相補する塩基と水素結合を形成しないような
二次構造を形成するとき、翻訳活性が著しく上昇するこ
とを見出した。
ャーRNAの構造を種々研究し翻訳開始コドン(ATG
)及びライボゾーム結合部位(別名シャインーダルガー
ノ領域)が相補する塩基と水素結合を形成しないような
二次構造を形成するとき、翻訳活性が著しく上昇するこ
とを見出した。
さらに、35℃以上で細胞内の75%までプラスミドが
蓄積するため蛋白の大量発現が可能であるプラスミドp
McR735と温度により転写の誘導をかけることがで
きる強力な転写活性をもつλP、プロモーターを組み合
わせ、大量発現可能な発現ベクターを構築し、これに上
記のヒトリゾチーム遺伝子を挿入したとき、ヒトリゾチ
ームが効率よく大量に発現することを見出し、本発明を
完成した。
蓄積するため蛋白の大量発現が可能であるプラスミドp
McR735と温度により転写の誘導をかけることがで
きる強力な転写活性をもつλP、プロモーターを組み合
わせ、大量発現可能な発現ベクターを構築し、これに上
記のヒトリゾチーム遺伝子を挿入したとき、ヒトリゾチ
ームが効率よく大量に発現することを見出し、本発明を
完成した。
本発明は、上述の構造を有し、効率よく大量にヒトリゾ
チームを発現する発現ベクターで形質転換された微生物
を適当な培地で培養することを特徴とするヒトリゾチー
ムの製造法を提供するものである。
チームを発現する発現ベクターで形質転換された微生物
を適当な培地で培養することを特徴とするヒトリゾチー
ムの製造法を提供するものである。
以下に本発明の製造法について具体的に説明する。
1、合成りNAフラグメント ゛
本発明により提供される転写体mRNAの二次構造にお
いて、ライボゾーム結合部位(シャインーダルガーノ領
域)及び翻訳開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成
しない構造をとるmRNA配列を与え、るDNAフラグ
メントの具体例として下記の配列のDNAを挙げること
ができる。
いて、ライボゾーム結合部位(シャインーダルガーノ領
域)及び翻訳開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成
しない構造をとるmRNA配列を与え、るDNAフラグ
メントの具体例として下記の配列のDNAを挙げること
ができる。
5′端CGTAAGTCAGTGAAAAACTTAG
GAGGGTTTTTAAATGAAAGTTTTCG
AAC:GTT 3”端この様な配列を有する上記の2
本鎖DNAは、以下の様に合成することができる。
GAGGGTTTTTAAATGAAAGTTTTCG
AAC:GTT 3”端この様な配列を有する上記の2
本鎖DNAは、以下の様に合成することができる。
先ず、以下にしめした様にCll−1〜CI!−4と名
付けたオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成
する。
付けたオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成
する。
CI[−1: 5°GATCCTAACGTAAGTC
AGTGAAAAAC3″ Cn 2 : 3 ’ G A T T G CA
T T CA G TCACTTTTTGAATCCT
C5゜Cm−3: 5’ TTAGGAGGGTTTT
TAAATGAAAGTTTT 3゜Cll−4:
3’ CCAAAAATTTACTTTCAAAAG
C5’ 各フラグメントの合成法としてはジエステル法、トリエ
ステル法、及びホスファイト法があり、固相法、液相法
がある。
AGTGAAAAAC3″ Cn 2 : 3 ’ G A T T G CA
T T CA G TCACTTTTTGAATCCT
C5゜Cm−3: 5’ TTAGGAGGGTTTT
TAAATGAAAGTTTT 3゜Cll−4:
3’ CCAAAAATTTACTTTCAAAAG
C5’ 各フラグメントの合成法としてはジエステル法、トリエ
ステル法、及びホスファイト法があり、固相法、液相法
がある。
CI[−1〜C11−4と名付けたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの合成は、固相法ホスホアミダイド法を利
用したModel 380 DNAシンセサイザー(ア
プライドバイオシステムズ(Applied Bios
ystems)社〕により容易に行うことができる。
ヌクレオチドの合成は、固相法ホスホアミダイド法を利
用したModel 380 DNAシンセサイザー(ア
プライドバイオシステムズ(Applied Bios
ystems)社〕により容易に行うことができる。
化学合成したオリゴヌクレオチドは脱保護操作の際、安
定な親油性の保護基を利用して逆層分配カラムによる高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)で他の未反応混
合物から分離精製することができる。 次に、その保護
基をはずし精製すれば目的とするオリゴヌクレオチドを
得ることができる。 得られたCl−2、Cll−3の
フラグメントの5゛側をT4ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化し、Cn−1、Cll−4とT4DN
Aリガーゼで結合した後再びT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてリン酸化し、上に示した5゜側に5au3
AIサイト、3°側にTaqlサイトを有する二本鎖フ
ラグメントを合成する。
定な親油性の保護基を利用して逆層分配カラムによる高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)で他の未反応混
合物から分離精製することができる。 次に、その保護
基をはずし精製すれば目的とするオリゴヌクレオチドを
得ることができる。 得られたCl−2、Cll−3の
フラグメントの5゛側をT4ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化し、Cn−1、Cll−4とT4DN
Aリガーゼで結合した後再びT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてリン酸化し、上に示した5゜側に5au3
AIサイト、3°側にTaqlサイトを有する二本鎖フ
ラグメントを合成する。
このようにして得られたDNAフラグメントをヒトリゾ
チーム遺伝子の残りの部分と結合した後、これを発現プ
ラズミドベクターに挿入することにより本発明の組み換
えプラズミドを構築することができる。
チーム遺伝子の残りの部分と結合した後、これを発現プ
ラズミドベクターに挿入することにより本発明の組み換
えプラズミドを構築することができる。
2、ヒトリゾチーム遺伝子の調整
本発明のヒトリゾチーム遺伝子は、例えば特開昭61−
78383 或いは特開昭61−78387で記載さ
れているヒトリゾチーム遺伝子を含む組換えプラズミド
pPLHLY−1を制限酵素Taqlで消化し、得られ
たヒトリゾチーム遺伝子を含む断片を常法により単離し
、上記の合成りNAフラグメントをT4DNAリガーゼ
で結合し、5au3AIで消化したフラグメントを発現
ブラズミドpMY12−6A+aP−1に挿入したpP
LI(LY−2より5au3AIで切断することにより
調製することができる。具体的には、図面1及び2を参
照されたい。
78383 或いは特開昭61−78387で記載さ
れているヒトリゾチーム遺伝子を含む組換えプラズミド
pPLHLY−1を制限酵素Taqlで消化し、得られ
たヒトリゾチーム遺伝子を含む断片を常法により単離し
、上記の合成りNAフラグメントをT4DNAリガーゼ
で結合し、5au3AIで消化したフラグメントを発現
ブラズミドpMY12−6A+aP−1に挿入したpP
LI(LY−2より5au3AIで切断することにより
調製することができる。具体的には、図面1及び2を参
照されたい。
プラズミドpPLHLY−2を保有するE、coli
294は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる(漱工研菌寄第 8842号) 3、プラズミドベクターの作成 発現ベクターのうち好ましい具体例は、本発明の目的に
かなうよう特別に工夫されたpsM221 、222゜
231.232である。pSM221 、222 、2
31 、232はpMY12−6Amρ−1及びPMC
R735から造成する事ができる。psM221.22
2はPMCR735のEcoRI部位にPMY12−6
Amp−1のλPLプロモーターを含むEcoRI 、
Sal I断片(約3.0kbp)を挿入する事によっ
て造成することができる。またpsM231 、232
ばPMCR735c7) Xho I及びHindl[
[部位間の小断片をpMY12−6AmP−1のλPL
プロモーターを含むEcoRI −5al I断片(約
3.0kbp)と置き換えることによって造成する事が
できる。
294は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる(漱工研菌寄第 8842号) 3、プラズミドベクターの作成 発現ベクターのうち好ましい具体例は、本発明の目的に
かなうよう特別に工夫されたpsM221 、222゜
231.232である。pSM221 、222 、2
31 、232はpMY12−6Amρ−1及びPMC
R735から造成する事ができる。psM221.22
2はPMCR735のEcoRI部位にPMY12−6
Amp−1のλPLプロモーターを含むEcoRI 、
Sal I断片(約3.0kbp)を挿入する事によっ
て造成することができる。またpsM231 、232
ばPMCR735c7) Xho I及びHindl[
[部位間の小断片をpMY12−6AmP−1のλPL
プロモーターを含むEcoRI −5al I断片(約
3.0kbp)と置き換えることによって造成する事が
できる。
具体的には、実施例及び図面2及び3を参照されたい。
pMY12−6Amp−1およびpMcR735につい
ては、公知であるが、以下にその造成法を示した。
ては、公知であるが、以下にその造成法を示した。
pMY12−6 A+np−1はpMY12−6(例え
ばTsurimotoら、Mo1.Gen、Genet
、18779〜86(19B2)参照)とpBV234
(例えばOh tsuboら、Gene 20245〜
254(19B2)参照)とから以下のようにして造成
する事ができる。
ばTsurimotoら、Mo1.Gen、Genet
、18779〜86(19B2)参照)とpBV234
(例えばOh tsuboら、Gene 20245〜
254(19B2)参照)とから以下のようにして造成
する事ができる。
pBV234をPst Iで切断し、アンピシリン耐性
遺伝子の一部を含む約2.6KbPの断片をとり出し、
pHY12−6のPst I切断部位にアンピシリン耐
性遺伝子が再生する様に挿入してpMY12−6 Am
pを得る。
遺伝子の一部を含む約2.6KbPの断片をとり出し、
pHY12−6のPst I切断部位にアンピシリン耐
性遺伝子が再生する様に挿入してpMY12−6 Am
pを得る。
pMY12−6 AmpをBamf(Iで限定分解した
後、その粘着末端をDNAポリメラーゼ(クレノーフラ
グメント)を用いて修復し、DNAリガーゼで連結して
、pBV234由来のDNA断片中に含まれるBarn
旧切断部位のみが消失したpMY12−6 Amp−1
を得る。
後、その粘着末端をDNAポリメラーゼ(クレノーフラ
グメント)を用いて修復し、DNAリガーゼで連結して
、pBV234由来のDNA断片中に含まれるBarn
旧切断部位のみが消失したpMY12−6 Amp−1
を得る。
pMcR735は、pKN410(例えばUhlinら
、Gene 691〜106 (1979)参照)をE
coRIで処理して得られる約7.5Kbpのプラスミ
ドのHha I部位に、pBR325(例えばBoli
var、Gene 4121(1978)参照)のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子を含む約1.3KbρのH
ha I断片を挿入して得られた約6.8Kbρのプラ
スミドのAva 11部位に更にpML 21(例えば
Hersfieldら、J、Bacteriol、12
6447(1976)参照)のカナマイシン耐性遺伝子
を含む約1.IKbpのAva II断片を挿入して造
成することができる(三木、遺伝子組換え実用化技術第
4集107〜116(1983)参照)。
、Gene 691〜106 (1979)参照)をE
coRIで処理して得られる約7.5Kbpのプラスミ
ドのHha I部位に、pBR325(例えばBoli
var、Gene 4121(1978)参照)のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子を含む約1.3KbρのH
ha I断片を挿入して得られた約6.8Kbρのプラ
スミドのAva 11部位に更にpML 21(例えば
Hersfieldら、J、Bacteriol、12
6447(1976)参照)のカナマイシン耐性遺伝子
を含む約1.IKbpのAva II断片を挿入して造
成することができる(三木、遺伝子組換え実用化技術第
4集107〜116(1983)参照)。
4、ヒトリゾチーム遺伝子のプラズミドベクターへの導
入 前記1,2の様にして合成したヒトリゾチーム遺伝子を
、上記3のプラズミドベクターの挿入部位に組込む。
入 前記1,2の様にして合成したヒトリゾチーム遺伝子を
、上記3のプラズミドベクターの挿入部位に組込む。
組込み抛作そのものは分子生物学の分野で公知の常法に
従って行うことができる。具体的な方法については後記
の実施例を参照されたい。
従って行うことができる。具体的な方法については後記
の実施例を参照されたい。
方向性の判定
プラスミドに組込まれたヒトリゾチーム遺伝子の方向性
の判定は、遺伝子内に含まれる特定の塩基配列を認識す
る制限酵素(例えばAatII、Taq■等であり図面
4を参照されたい。)でその部位を切断し、遺伝子外の
特定部位を別の制限酵素を用いて切断して得られた断片
のサイズをアガロースゲル電気泳動等の通常用いられて
いる方法で分析する事により行う事ができる。
の判定は、遺伝子内に含まれる特定の塩基配列を認識す
る制限酵素(例えばAatII、Taq■等であり図面
4を参照されたい。)でその部位を切断し、遺伝子外の
特定部位を別の制限酵素を用いて切断して得られた断片
のサイズをアガロースゲル電気泳動等の通常用いられて
いる方法で分析する事により行う事ができる。
5、形質転換
(1)宿主菌
ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだMi換えプラスミドを
用いて形質転換させる宿主細胞の大腸菌での具体例はE
、 coli294 (例えばBackman 、 P
roc 、 Natl、Acad、Sci、USAユ4
174〜4178(1976)参照)である。
用いて形質転換させる宿主細胞の大腸菌での具体例はE
、 coli294 (例えばBackman 、 P
roc 、 Natl、Acad、Sci、USAユ4
174〜4178(1976)参照)である。
ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドによ
る形質転換は上記の宿主に限定されるものではなく、公
知の種々のE、coli K−12株誘導体(例えばB
achmann、Bacteriol、Rev、365
25〜557(1972)参照)を使用することができ
る。
る形質転換は上記の宿主に限定されるものではなく、公
知の種々のE、coli K−12株誘導体(例えばB
achmann、Bacteriol、Rev、365
25〜557(1972)参照)を使用することができ
る。
これらのE、coli K−12株誘導体の多くのもの
は公認の微生物機関、例えばAmerican Typ
e Cu1ture Co11ection(ATCC
)、に寄託されており、そこから分譲が可能である(例
えばATCCカタログ参照)。
は公認の微生物機関、例えばAmerican Typ
e Cu1ture Co11ection(ATCC
)、に寄託されており、そこから分譲が可能である(例
えばATCCカタログ参照)。
また分子生物学の分野で公知の如く、適当なベクターを
選べばより広範囲の細菌種より適当な宿主を選択する事
も可能である。
選べばより広範囲の細菌種より適当な宿主を選択する事
も可能である。
(2)形質転換
形質転換繰作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行う事ができる(例えばCohenら、Pr
oc、Natl、Acad、Sci、LISA、 69
.2110〜2114(1972)及びManiati
sLOMolecular Cloning、249〜
253 (1982)参照)。
法に従って行う事ができる(例えばCohenら、Pr
oc、Natl、Acad、Sci、LISA、 69
.2110〜2114(1972)及びManiati
sLOMolecular Cloning、249〜
253 (1982)参照)。
(3)形質転換体
形質転換体の一具体例は、E、 colt 294をp
t、y−14、pLY−15,pLY−16及びpLY
−17で形質転換させて得た形質転換体であって、本発
明では、それらをE。
t、y−14、pLY−15,pLY−16及びpLY
−17で形質転換させて得た形質転換体であって、本発
明では、それらをE。
coli 294(PYL−14)、E、 coli
294(’pLY−15)、E。
294(’pLY−15)、E。
colt 294(PLY−16)及びE、 coli
294(pLY−17)と命名し、工業技術院微生物
工業技術研究所に各々徽工研菌寄8866号、8867
号、8868号、8869号として寄託されている。
294(pLY−17)と命名し、工業技術院微生物
工業技術研究所に各々徽工研菌寄8866号、8867
号、8868号、8869号として寄託されている。
6、ヒトリゾチームの生産
この様にして得た形質転換体を、分子生物学および醗酵
学の分野で公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチ
ームが生産される。
学の分野で公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチ
ームが生産される。
ヒトリゾチームは公知のラジオイムノアッセイ(例えば
YuzurihaらChem、Pharm、Bull、
272802〜2806 (1979)及びYuzur
ihaらChem、PharmJull、26908〜
914(1978)参照)、酵素活性測定法(例えば5
idhanら、Agric、Biol、Chem、45
1817〜1B23(1981)及びMorsky A
nal、Biochem、12877〜85(1983
)参照)SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のク
マジーブリリアントブルーR−250による発色等を用
いて検出、定量することができる。
YuzurihaらChem、Pharm、Bull、
272802〜2806 (1979)及びYuzur
ihaらChem、PharmJull、26908〜
914(1978)参照)、酵素活性測定法(例えば5
idhanら、Agric、Biol、Chem、45
1817〜1B23(1981)及びMorsky A
nal、Biochem、12877〜85(1983
)参照)SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のク
マジーブリリアントブルーR−250による発色等を用
いて検出、定量することができる。
また生産したヒトリゾチームは生化学及び醗酵学の分野
で公知の常法を適宜組合せて回収、精製することができ
る。前述したようにDNA技術によるヒトリゾチームの
生産に関しては報告されているが、(特開昭6l−78
383)本発明により多量のヒトリゾチームを生産する
ことが可能になったため回収、精製操作も容易となった
。
で公知の常法を適宜組合せて回収、精製することができ
る。前述したようにDNA技術によるヒトリゾチームの
生産に関しては報告されているが、(特開昭6l−78
383)本発明により多量のヒトリゾチームを生産する
ことが可能になったため回収、精製操作も容易となった
。
具体的事項に関しては、後記の実施例を参照されたい。
実施例
DNAフーグメントの人J
上に示した様に設計したフラグメントCll−1〜C■
−4のフラグメントを固相法ホスホアミダイド法を利用
したModel 380 DNAシンセサイザー〔アプ
ライドバイオシステムズ (Applied Bios
ystems )社製〕により合成した。
−4のフラグメントを固相法ホスホアミダイド法を利用
したModel 380 DNAシンセサイザー〔アプ
ライドバイオシステムズ (Applied Bios
ystems )社製〕により合成した。
ヌクレオシドを導入したシリカ樹脂および完全に保護し
た4種のジイソプロピルホスホアミダイドは市販のアプ
ライドバイオシステムズ (AppliedBiosy
stems )社製のものを用いた。
た4種のジイソプロピルホスホアミダイドは市販のアプ
ライドバイオシステムズ (AppliedBiosy
stems )社製のものを用いた。
合成法の詳細は下記の通りである。
完全に保護したヌクレオシドを導入したシリカ樹脂(1
)カラムをトリクロロ酢酸を含むジクロロメタン溶液で
室温2分間処理することにより5”位水酸基のジメトキ
シトリチル(以下DMTI”)保護基を除去し、ヌクレ
オシドの導入されたシリカ樹脂(It)とした。 次に
、完全に保護したジイソプロピルホスホアミダイド(I
[[)をテトラゾール共存下アセトニトリル中室温で3
分間前合させた。
)カラムをトリクロロ酢酸を含むジクロロメタン溶液で
室温2分間処理することにより5”位水酸基のジメトキ
シトリチル(以下DMTI”)保護基を除去し、ヌクレ
オシドの導入されたシリカ樹脂(It)とした。 次に
、完全に保護したジイソプロピルホスホアミダイド(I
[[)をテトラゾール共存下アセトニトリル中室温で3
分間前合させた。
CI)、(II)及び(III)は以下の通りである。
0COCHzCHzCONHCHzCHzCHz P
Pニジリカ樹脂、 B=Ab 2. G 1 b
u、 Cb 21 T(1)−R1ニジメトキシトリ
チル基 (n) −R1:H (II[) B=Abz、Gi bu、Cbz、
Tジメチルアミノピリジン、ルチジンを含むテトラヒ
ドロフラン中無水酢酸で室温4分間樹脂を処理してシリ
カ樹脂(n)の5゛水酸基をアセチル化し、ルチジン、
水を含むテトラヒドロフラン中ヨウ素で1分間酸化して
5価のリン酸トリエステルとした。 以下4種のジイソ
プロピルホスホアミダイド(III)を順次使用し脱ジ
メトキシトリチル化、縮合反応、アセチル化、酸化反応
を繰り返すことにより保護したオリゴヌクレオチドフラ
グメントを合成した。 最後の縮合後樹脂をトリエチル
アミンを含むチオフェノールのジオキサン溶液で50分
間処理し、リンの保護基をはずし、30%アンモニア水
で1時間処理することによりオリゴマーを樹脂より切り
離した。 回収したオリゴマーは30%アンモニア水1
0mj!で55〜60℃5時間処理することにより塩基
のアミノ基を脱保護し、高速液体クロマトグラフィーで
逆相系担体(p −Bondapak C1B、ウォー
ターズ社製)を用い、0.1モル酢酸トリエチルアミン
緩衝液(pH7,0)中アセトニトリルの直線濃度勾配
による溶出でジメトキシトリチル基をもつオリゴマーを
精製した。 次に、80%酢酸水1mlで室温20分間
処理することによりジメトキシトリチル基を除去した。
Pニジリカ樹脂、 B=Ab 2. G 1 b
u、 Cb 21 T(1)−R1ニジメトキシトリ
チル基 (n) −R1:H (II[) B=Abz、Gi bu、Cbz、
Tジメチルアミノピリジン、ルチジンを含むテトラヒ
ドロフラン中無水酢酸で室温4分間樹脂を処理してシリ
カ樹脂(n)の5゛水酸基をアセチル化し、ルチジン、
水を含むテトラヒドロフラン中ヨウ素で1分間酸化して
5価のリン酸トリエステルとした。 以下4種のジイソ
プロピルホスホアミダイド(III)を順次使用し脱ジ
メトキシトリチル化、縮合反応、アセチル化、酸化反応
を繰り返すことにより保護したオリゴヌクレオチドフラ
グメントを合成した。 最後の縮合後樹脂をトリエチル
アミンを含むチオフェノールのジオキサン溶液で50分
間処理し、リンの保護基をはずし、30%アンモニア水
で1時間処理することによりオリゴマーを樹脂より切り
離した。 回収したオリゴマーは30%アンモニア水1
0mj!で55〜60℃5時間処理することにより塩基
のアミノ基を脱保護し、高速液体クロマトグラフィーで
逆相系担体(p −Bondapak C1B、ウォー
ターズ社製)を用い、0.1モル酢酸トリエチルアミン
緩衝液(pH7,0)中アセトニトリルの直線濃度勾配
による溶出でジメトキシトリチル基をもつオリゴマーを
精製した。 次に、80%酢酸水1mlで室温20分間
処理することによりジメトキシトリチル基を除去した。
脱保護したオリゴマーは高速液体クロマトグラフィーで
逆相系担体(YMC−packAM−324山村化学研
究所社製)を用い0.1モル酢酸トリエチルアミノ緩衝
液(pH7,0)中アセトニトリルの直に895度勾配
による溶出、更にイオン交換系担体(TSK gel
DEAE−23W、東洋曹達社製)を用い20%アセト
ニトリルを含むギ酸アンモニウム緩衝液の直′gA濃度
勾配による溶出およびゲル濾過にて精製し、1jl−1
−C1l−4を各々3.9.4.6.2.4.2.60
D260ユニツト得た。
逆相系担体(YMC−packAM−324山村化学研
究所社製)を用い0.1モル酢酸トリエチルアミノ緩衝
液(pH7,0)中アセトニトリルの直に895度勾配
による溶出、更にイオン交換系担体(TSK gel
DEAE−23W、東洋曹達社製)を用い20%アセト
ニトリルを含むギ酸アンモニウム緩衝液の直′gA濃度
勾配による溶出およびゲル濾過にて精製し、1jl−1
−C1l−4を各々3.9.4.6.2.4.2.60
D260ユニツト得た。
上記4種の合成オリゴヌクレオチド(Cn−1〜C■−
4)をアニーリングし、次いでクローニングした。 ま
ず、CIr−2、CII −31tIr片各10jlg
を66mM)リス塩酸(pH7,5) 、10rnMM
gCI!z、1mMATP、1mMスペルミジン、55
単位T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)を含む1
00μ1反応液で37℃、IVf間反応させ、5゛末端
をリン酸化し、た。
4)をアニーリングし、次いでクローニングした。 ま
ず、CIr−2、CII −31tIr片各10jlg
を66mM)リス塩酸(pH7,5) 、10rnMM
gCI!z、1mMATP、1mMスペルミジン、55
単位T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)を含む1
00μ1反応液で37℃、IVf間反応させ、5゛末端
をリン酸化し、た。
反応液をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈殿でDNAを回収した。 このCn−2、Cl
l−3断片5μgと未処理のCll−1、Cll−4断
片4μgとを66mMトリス塩酸(pH7,5) 、1
0mMMgC1,,1mMATP、1mMスペルミジン
、175(1位T4リガーゼ(宝酒造)を含む200μ
!反応液中で16℃、越夜で反応させた。 反応により
生じたCll−1−C11−4jl片の結合物をフェノ
ール:クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈殿によ
り約10pgの精製DNA断片として回収した。
ノール沈殿でDNAを回収した。 このCn−2、Cl
l−3断片5μgと未処理のCll−1、Cll−4断
片4μgとを66mMトリス塩酸(pH7,5) 、1
0mMMgC1,,1mMATP、1mMスペルミジン
、175(1位T4リガーゼ(宝酒造)を含む200μ
!反応液中で16℃、越夜で反応させた。 反応により
生じたCll−1−C11−4jl片の結合物をフェノ
ール:クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈殿によ
り約10pgの精製DNA断片として回収した。
次に、この断片をヒトリゾチーム遺伝子に結合させるた
めに以下のことを行った。
めに以下のことを行った。
コンセンサスSD領域を有する418bpのヒトリゾチ
ーム遺伝子を上述の大腸菌用発現ベクターpMYl 2
−6A2−6Aに組みこんだpPLHLY−1(特開昭
61−78383、或いは特開昭61−78387に記
載の方法で製造できる)220μgをlOmM)リス塩
酸(p H7,5) 、10mMMg CIlz、50
mMN a Cl 11 mMD T T存在下、6
40単位の制限酵素Taqlを加え800pl中で65
℃、1時間反応させ生じた662b’pの断片を5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含む
ゲルを切出し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノー
ルで濃縮し、フェノール:クロロホルム混液で抽出後、
エタノール沈殿により約10μgのDNAを回収した。
ーム遺伝子を上述の大腸菌用発現ベクターpMYl 2
−6A2−6Aに組みこんだpPLHLY−1(特開昭
61−78383、或いは特開昭61−78387に記
載の方法で製造できる)220μgをlOmM)リス塩
酸(p H7,5) 、10mMMg CIlz、50
mMN a Cl 11 mMD T T存在下、6
40単位の制限酵素Taqlを加え800pl中で65
℃、1時間反応させ生じた662b’pの断片を5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含む
ゲルを切出し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノー
ルで濃縮し、フェノール:クロロホルム混液で抽出後、
エタノール沈殿により約10μgのDNAを回収した。
このDNAIμgと先はどのCff−1〜CI[−4結
合物2.5μgを66mM)リス塩酸(pH7,5)
、6.6mMMgCl、、10+uMDTT、1mMA
TP、350単位T4DNAリガーゼ存在下で、30μ
lの反応液中16℃、越夜で反応させた。この反応で生
じた結合物を11011Iトリス塩酸(pH7,5)
、50mMNa C1,10mMMgC1z、1+aM
DTT、30単位の制限酵素5au3AI存在下、40
ul中、37℃、20時間で反応し、切断した。反応液
をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノール
沈殿でDNAを回収した。この断片を20μl中前記の
条件で5.54位のT4ポリヌクレオチドキナーゼと3
7℃、1時間反応させ、5゜末端をすべてリン酸化した
。この439bpの断片を5%ポリアクリアミドゲル電
気泳動により分離回収した。 この断片中には先の合成
オリゴヌクレオチドを含む全ヒトリゾチーム遺伝子が存
在する。 このDNA断片を大腸菌用発現ベクターp
MY12−6A2−6Aに組みこみ、大腸菌でヒトリゾ
チームを発現させるプラズミドI)PLHL Y−2を
構築した。 先ずpMYl2−6Amp−11,54g
を50mM)リス塩酸(pH7,5) 、100mMN
aCj!’、10mMM g C1z、1mMDTT、
60単位の制限酵素BamHIの存在下、60μβ中、
37℃、12時間反応させた。
合物2.5μgを66mM)リス塩酸(pH7,5)
、6.6mMMgCl、、10+uMDTT、1mMA
TP、350単位T4DNAリガーゼ存在下で、30μ
lの反応液中16℃、越夜で反応させた。この反応で生
じた結合物を11011Iトリス塩酸(pH7,5)
、50mMNa C1,10mMMgC1z、1+aM
DTT、30単位の制限酵素5au3AI存在下、40
ul中、37℃、20時間で反応し、切断した。反応液
をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノール
沈殿でDNAを回収した。この断片を20μl中前記の
条件で5.54位のT4ポリヌクレオチドキナーゼと3
7℃、1時間反応させ、5゜末端をすべてリン酸化した
。この439bpの断片を5%ポリアクリアミドゲル電
気泳動により分離回収した。 この断片中には先の合成
オリゴヌクレオチドを含む全ヒトリゾチーム遺伝子が存
在する。 このDNA断片を大腸菌用発現ベクターp
MY12−6A2−6Aに組みこみ、大腸菌でヒトリゾ
チームを発現させるプラズミドI)PLHL Y−2を
構築した。 先ずpMYl2−6Amp−11,54g
を50mM)リス塩酸(pH7,5) 、100mMN
aCj!’、10mMM g C1z、1mMDTT、
60単位の制限酵素BamHIの存在下、60μβ中、
37℃、12時間反応させた。
エタノール沈殿でDNAを回収後、60μlIM)リス
塩酸(pH8,0)及び2単位のアルカリ性フォスファ
ターゼで65℃、1時間処理し、5゛末端のリン酸基を
除去した。その後、フェノール:クロロホルム混合液で
抽出後、エタノール沈殿でDNAを回収した。 このベ
クター0.1ggと先はどの439bp断片を20μl
中350単位のT4DNAリガーゼを含む反応液で16
℃、越夜で反応させた。 この反応液を使ってカルシウ
ム処理した大腸菌294株を形質転換した。
塩酸(pH8,0)及び2単位のアルカリ性フォスファ
ターゼで65℃、1時間処理し、5゛末端のリン酸基を
除去した。その後、フェノール:クロロホルム混合液で
抽出後、エタノール沈殿でDNAを回収した。 このベ
クター0.1ggと先はどの439bp断片を20μl
中350単位のT4DNAリガーゼを含む反応液で16
℃、越夜で反応させた。 この反応液を使ってカルシウ
ム処理した大腸菌294株を形質転換した。
アンピシリン耐性菌を50mg#アンピシアンを含む、
L寒天培地(10g/lポリペプトン、5g/lイース
トエキストラクト、5g/l! NaC1゜1.5%
寒天)上で選択した。 得られたコロニーよりプラズミ
ドDNAをアルカリ法(Molecular Clon
ing (19B2) C84)により抽出、精製し、
各種制限酵素で切断して切断パターンを解析しヒトリゾ
チーム遺伝子が組み込まれたものを選び294株に導入
し、大腸菌294 (pPLHLY−2)株を調整した
。
L寒天培地(10g/lポリペプトン、5g/lイース
トエキストラクト、5g/l! NaC1゜1.5%
寒天)上で選択した。 得られたコロニーよりプラズミ
ドDNAをアルカリ法(Molecular Clon
ing (19B2) C84)により抽出、精製し、
各種制限酵素で切断して切断パターンを解析しヒトリゾ
チーム遺伝子が組み込まれたものを選び294株に導入
し、大腸菌294 (pPLHLY−2)株を調整した
。
この大腸菌294 (1)PLHLY=2)を工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した(徽工研菌寄第88
42号)。
院微生物工業技術研究所に寄託した(徽工研菌寄第88
42号)。
ベタ −のi
ブラズミドpMY−12−6Aa+P−1100#gを
50mMTris−1(C1pH7,5,10μlM
MgC1g、1n+M DTT、100mM NaC1
、150単位の制限酵素EcoRIを含む500μlの
反応液中で37℃、4時間消化後175111M Na
C1にし、400単位の制限酵素 Sal Iを含む8
00μlの反応液中で37℃終夜消化した0反応後1%
アガロースゲル電気泳動を行って生じた約3.0Kbp
の断片を分離し、電気的に溶出し、ブタノールでS縮し
、フェノール抽出後エタノール沈殿により10ggのD
NAを回収した。 次にこのDNA 2μgを67mM
Tris−HCl pH8,8,6,7mM MgCh
、 10n+M 2−メルカプトエタノール、 6.7
#M EDTA、 16.6mM (NH4)、so
、、 330μM dNTP(dATP、dGTP、d
CTP及びdTTP)及び3.2単位の74DNAポリ
メラーゼを含む30μlの反応液中で37℃、1時間反
応させた後フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。
50mMTris−1(C1pH7,5,10μlM
MgC1g、1n+M DTT、100mM NaC1
、150単位の制限酵素EcoRIを含む500μlの
反応液中で37℃、4時間消化後175111M Na
C1にし、400単位の制限酵素 Sal Iを含む8
00μlの反応液中で37℃終夜消化した0反応後1%
アガロースゲル電気泳動を行って生じた約3.0Kbp
の断片を分離し、電気的に溶出し、ブタノールでS縮し
、フェノール抽出後エタノール沈殿により10ggのD
NAを回収した。 次にこのDNA 2μgを67mM
Tris−HCl pH8,8,6,7mM MgCh
、 10n+M 2−メルカプトエタノール、 6.7
#M EDTA、 16.6mM (NH4)、so
、、 330μM dNTP(dATP、dGTP、d
CTP及びdTTP)及び3.2単位の74DNAポリ
メラーゼを含む30μlの反応液中で37℃、1時間反
応させた後フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。
一方、プラズミドpMCR73520/Jgを50μl
M Tris・HCI pH7,5,10mM MgC
1z、100mM NaC1−’3030単制限酵素)
1indll[及び40単位の制限酵素Xh。
M Tris・HCI pH7,5,10mM MgC
1z、100mM NaC1−’3030単制限酵素)
1indll[及び40単位の制限酵素Xh。
■を含む200μ!の反応液で37℃、8時間消化した
後、フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。
後、フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。
次にこのDNAを67++M Tris−HCI pH
8,8,6゜7+oM MgC1z、10mM 2−メ
ルカプトエタノール、6.7μM EDTA、16.6
mM (NH4)2504.33077M dNTP(
dATP、dGTP、dCTP及びdTTP)及び5単
位のT4DNAポリメラーゼを含む30μlの反応液中
で37℃、1時間反応させた後フェノール抽出、エタノ
ール沈殿を行った。
8,8,6゜7+oM MgC1z、10mM 2−メ
ルカプトエタノール、6.7μM EDTA、16.6
mM (NH4)2504.33077M dNTP(
dATP、dGTP、dCTP及びdTTP)及び5単
位のT4DNAポリメラーゼを含む30μlの反応液中
で37℃、1時間反応させた後フェノール抽出、エタノ
ール沈殿を行った。
更にこのDNAをIM Tris −HCI pH8,
0および2単位のアルカリ性フォスファターゼを含む8
0μlの反応液中で65℃、1時間反応させた後フェノ
ール抽出、エタノール沈殿を行った。
0および2単位のアルカリ性フォスファターゼを含む8
0μlの反応液中で65℃、1時間反応させた後フェノ
ール抽出、エタノール沈殿を行った。
上記の処理を施したpMCR7350,5μg及びpM
Y12−6 A+np−13,0Kbp断片0.3 p
gを2011IMTris−HCl pH7,6,10
mM MgC1z、10mM DTT、5mM ATP
及び5単位のT4DNAリガーゼを含む30μlの反応
液中で室温45時間インキュベートして連結させた。
Y12−6 A+np−13,0Kbp断片0.3 p
gを2011IMTris−HCl pH7,6,10
mM MgC1z、10mM DTT、5mM ATP
及び5単位のT4DNAリガーゼを含む30μlの反応
液中で室温45時間インキュベートして連結させた。
次にこの反応液を用いて大腸[E、coli 294株
を形質転換し、クロラムフェニコール抵抗性(25Mg
/ml)の形質転換体を得た。これらの形質転換体より
プラズミドDNAを調製し、制限酵素開裂パターンの分
析を行って図2に示される様な発現ベクターpsM23
1 、 pSM232を含む形質転換体を選びだした。
を形質転換し、クロラムフェニコール抵抗性(25Mg
/ml)の形質転換体を得た。これらの形質転換体より
プラズミドDNAを調製し、制限酵素開裂パターンの分
析を行って図2に示される様な発現ベクターpsM23
1 、 pSM232を含む形質転換体を選びだした。
同様にプラズミドpMcR735をEcoRIで消化し
、ポリメラーゼ反応、アルカリ性フォスファターゼ処理
をした後pMY12−6 AmP−13,0Kbp断片
と連結し、大腸菌E、col 1294株を形質転換し
、カナマイシン抵抗性(50Mg/ml)の形質転換体
を得た。これらの形質転換体よりプラズミドDNAを調
製し、制限酵素開裂パターンの分析を行って図面3に示
されるような発現ベクターpsM221.psM222
を含む形質転換体を選びだした。
、ポリメラーゼ反応、アルカリ性フォスファターゼ処理
をした後pMY12−6 AmP−13,0Kbp断片
と連結し、大腸菌E、col 1294株を形質転換し
、カナマイシン抵抗性(50Mg/ml)の形質転換体
を得た。これらの形質転換体よりプラズミドDNAを調
製し、制限酵素開裂パターンの分析を行って図面3に示
されるような発現ベクターpsM221.psM222
を含む形質転換体を選びだした。
、 え の
プラズミドpsM2215/ljgを50+++M T
ris ・I(C1p!(7,5,10mM MgC1
z、1a+M DTT、100a+M NaC1及び3
6単位の制限酵素Bam旧を含む30μlの反応液中で
37℃、4時間インキュベートした後、フェノール抽出
。
ris ・I(C1p!(7,5,10mM MgC1
z、1a+M DTT、100a+M NaC1及び3
6単位の制限酵素Bam旧を含む30μlの反応液中で
37℃、4時間インキュベートした後、フェノール抽出
。
エタノール沈殿を行った。
次にこのDNAをIM Tris −HCI pH8,
0及び1゜5単位のアルカリ性フォフアスターゼを含む
50μlの反応液中で65℃、1時間インキニーベート
した後フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。
0及び1゜5単位のアルカリ性フォフアスターゼを含む
50μlの反応液中で65℃、1時間インキニーベート
した後フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。
プラズミドpPLHL−276#gを10mM Tri
s−HCIpH7,5,10mM MgCh、 1mM
DTT、 50mM NaC1及び15041位の制
限酵素5au3AIを含む500μlの反応液中で37
℃、12時間インキュベートした後5zポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、439bpのヒトリゾチーム
遺伝子を回収した。
s−HCIpH7,5,10mM MgCh、 1mM
DTT、 50mM NaC1及び15041位の制
限酵素5au3AIを含む500μlの反応液中で37
℃、12時間インキュベートした後5zポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、439bpのヒトリゾチーム
遺伝子を回収した。
上記psM2210.5μg及びヒトリゾチーム遺伝予
約0.1/jgを20mM Tris ・ICI pH
7,6,10mM MgC1z、 10mM DTT、
5mM ATP及び5単位の74DNA’lJガーゼを
含む20μlの反応液中16℃、12時間インキュベー
トして連結させた。
約0.1/jgを20mM Tris ・ICI pH
7,6,10mM MgC1z、 10mM DTT、
5mM ATP及び5単位の74DNA’lJガーゼを
含む20μlの反応液中16℃、12時間インキュベー
トして連結させた。
次にこの反応液を用いて、大腸菌E、coli294株
を形質転換し、カナマイシン抵抗性(50μs /ml
)の形質転換体を得た。
を形質転換し、カナマイシン抵抗性(50μs /ml
)の形質転換体を得た。
これらの形質転換体よりプラズミドDNAを調製し、制
限酵素開裂パターンの分析を行って図面3に示される様
なヒトリゾチーム遺伝子がAPLプロモーターと同一方
向に挿入された組換えブラズミドpLY=14を含む形
質転換体を選びだした。この形質転換体をE、coli
294(PLY−14)と命名した。
限酵素開裂パターンの分析を行って図面3に示される様
なヒトリゾチーム遺伝子がAPLプロモーターと同一方
向に挿入された組換えブラズミドpLY=14を含む形
質転換体を選びだした。この形質転換体をE、coli
294(PLY−14)と命名した。
プラズミドpsM222.psM231.psM232
を用いて、上記と同様にして、そのBamH1部位にヒ
トリゾチーム遺伝子を挿入し、E、coli 294株
を形質転換した。得られたクロラムフェニコール抵抗性
(PSM222の場合はカナマイシン抵抗性)の形質転
換体よりプラズミドDNAを調製し、制限酵素開裂パタ
ーンの解析を行って、ヒトリゾチーム遺伝子がλPLプ
ロモーターと同一方向に挿入された組換えプラズミドを
選びだした。この形質転換体をそれぞれE、 coli
294(pLY−15)、E、 coli 294(
pLY−16)、E、 colt 294(pLY−1
7)と命名した。
を用いて、上記と同様にして、そのBamH1部位にヒ
トリゾチーム遺伝子を挿入し、E、coli 294株
を形質転換した。得られたクロラムフェニコール抵抗性
(PSM222の場合はカナマイシン抵抗性)の形質転
換体よりプラズミドDNAを調製し、制限酵素開裂パタ
ーンの解析を行って、ヒトリゾチーム遺伝子がλPLプ
ロモーターと同一方向に挿入された組換えプラズミドを
選びだした。この形質転換体をそれぞれE、 coli
294(pLY−15)、E、 coli 294(
pLY−16)、E、 colt 294(pLY−1
7)と命名した。
−九ズチ:1弓礪危里
E、 coli 294(pLY−14)を5mlの修
正り培地(10g/Itポリペプトン、5g/lイース
トエキストラクト、5 g//NaC1,50mg/
lカナマイシン)に接種し、30℃で一夜培養した。培
養液1m7!を新たな上記培地100m lに加え、3
0℃で1〜6時間培養した後、42℃で誘轟し、さらに
2〜10時間培養を継続した。
正り培地(10g/Itポリペプトン、5g/lイース
トエキストラクト、5 g//NaC1,50mg/
lカナマイシン)に接種し、30℃で一夜培養した。培
養液1m7!を新たな上記培地100m lに加え、3
0℃で1〜6時間培養した後、42℃で誘轟し、さらに
2〜10時間培養を継続した。
E、 coli 294(pLY−15)、E、 co
lt 294(pLY−16)、E、 colt 29
4(pLY−17)に関しても上記と同様にして培養し
た(E、 coli 294(pLY−16)、E、
colt 294 (pLY−17)に関しては、培地
に25mg/j!クロラムフェニコールを加える)。
各々については、適当時間培養した後、1.51!培養
液をとり菌体を遠心分離した。
lt 294(pLY−16)、E、 colt 29
4(pLY−17)に関しても上記と同様にして培養し
た(E、 coli 294(pLY−16)、E、
colt 294 (pLY−17)に関しては、培地
に25mg/j!クロラムフェニコールを加える)。
各々については、適当時間培養した後、1.51!培養
液をとり菌体を遠心分離した。
ユj±二人夏定1
大腸菌294 (PPLHLY−2)株及び大腸菌29
4(pPLHLY−1)株で発現されにリゾチームの検
出、定量はウェスタンブロッティングを用いたラジオイ
ムノアッセイ法でIzs■−プロティン−Aにより定量
した。
4(pPLHLY−1)株で発現されにリゾチームの検
出、定量はウェスタンブロッティングを用いたラジオイ
ムノアッセイ法でIzs■−プロティン−Aにより定量
した。
大腸菌294 (PPLHLY−2)株及び大腸菌29
4(pPLHLY−1)株を100m1修正り培地(1
0g/lポリペプトン、5 g/ l イーストエキ
ストラクト、5g/7! Nacl、50mg#!
アンピシリン)で30℃で振盪培養し、OD6.。0.
2に達した時点から2時間ごとに1.5m6培養液をサ
ンプリングした。
4(pPLHLY−1)株を100m1修正り培地(1
0g/lポリペプトン、5 g/ l イーストエキ
ストラクト、5g/7! Nacl、50mg#!
アンピシリン)で30℃で振盪培養し、OD6.。0.
2に達した時点から2時間ごとに1.5m6培養液をサ
ンプリングした。
集めた菌体は以下の方法により定量した。まず培養液1
.51nAの菌体を3種の異なる量の標品のリゾチーム
とともにLaemmliの方法(Laezmli 、
Nature227.680 (1970))に従って
1710量を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した。 次にトランスファーパンツ?
−(25111M)リス、192mMグリシン、pH8
,3,15%MeOH,0,1%5DS)中ゲルのタン
パク質をニトロセルロース膜(S&5BA85)上に電
気泳動的に移行させた(4℃、30 V、 12時間
)。ニトロセルロース膜は、2%BSA (ウシ血清ア
ルブミン)を含むPBSバッファー(リン酸緩衝溶液)
中37℃、1時間反応し、蛋白の吸着していない部分を
ブロックした後、0.05%Tween20. リゾ
チーム抗体(ミドリ十字製)を加え37℃、3時間反応
した。
.51nAの菌体を3種の異なる量の標品のリゾチーム
とともにLaemmliの方法(Laezmli 、
Nature227.680 (1970))に従って
1710量を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した。 次にトランスファーパンツ?
−(25111M)リス、192mMグリシン、pH8
,3,15%MeOH,0,1%5DS)中ゲルのタン
パク質をニトロセルロース膜(S&5BA85)上に電
気泳動的に移行させた(4℃、30 V、 12時間
)。ニトロセルロース膜は、2%BSA (ウシ血清ア
ルブミン)を含むPBSバッファー(リン酸緩衝溶液)
中37℃、1時間反応し、蛋白の吸着していない部分を
ブロックした後、0.05%Tween20. リゾ
チーム抗体(ミドリ十字製)を加え37℃、3時間反応
した。
PBST (0,05%7we e n 20を含むP
BS)で洗浄後、2%BSAを含むTBST(50mM
トリスバッファーpH8,0+ 0.9%NaC1,
0,05%Tween20)中、1251−プロティン
A 10μCi (アマ−ジャム社製)と37℃、70
分反応した。 TBSTで洗浄後、オートラジオグラフ
ィーを行い、14.7にダルトンに相当するバンドを切
取りT−カウンターにより放射能量を測定した。 大腸
菌由来のリゾチームは3種の異なる量の標品のリゾチー
ムにより作成した検量線を基準にして定量した。この方
法により大腸菌中のりゾチームを経時変化をおって定量
したのが図5である。pPLIILY−1では6時間後
に35 p g / m 12 cultureの発現
量がみられたのに対し、pPLl(LY−2の場合は8
時間後に最裔68μg/ m 1 cultureの発
現がみられた。
BS)で洗浄後、2%BSAを含むTBST(50mM
トリスバッファーpH8,0+ 0.9%NaC1,
0,05%Tween20)中、1251−プロティン
A 10μCi (アマ−ジャム社製)と37℃、70
分反応した。 TBSTで洗浄後、オートラジオグラフ
ィーを行い、14.7にダルトンに相当するバンドを切
取りT−カウンターにより放射能量を測定した。 大腸
菌由来のリゾチームは3種の異なる量の標品のリゾチー
ムにより作成した検量線を基準にして定量した。この方
法により大腸菌中のりゾチームを経時変化をおって定量
したのが図5である。pPLIILY−1では6時間後
に35 p g / m 12 cultureの発現
量がみられたのに対し、pPLl(LY−2の場合は8
時間後に最裔68μg/ m 1 cultureの発
現がみられた。
大腸菌294 (PPLHLY−2)株及び大腸菌29
4(pLY−14)、大腸菌294 (pLY−15)
、大腸菌294(PLY−16)、大腸菌294 (
PLY−17)株で発現されたりゾチームの検出、定量
は、15%5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる分離後、コマジ−ブリリアントブルーR−250に
よる発色をデンシトメーターで測定することにより行っ
た。
4(pLY−14)、大腸菌294 (pLY−15)
、大腸菌294(PLY−16)、大腸菌294 (
PLY−17)株で発現されたりゾチームの検出、定量
は、15%5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる分離後、コマジ−ブリリアントブルーR−250に
よる発色をデンシトメーターで測定することにより行っ
た。
まず、培養液1.5mβ菌体を3種の異なる量の標品の
リゾチームとともにLaemmliの方法(Laemm
liNature 227680(1970))に従っ
て1/10ffiを15%5O5−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離した。次の染色液(10%酢酸
、25%イソプロピルアルコール0.025%、コマジ
−ブリリアントブルーR−25の中、37℃3時間振と
うした後、脱色液(20%メタノール、10%酢酸)で
数回脱色し、ヒトリゾチームの量をコンピユーテイング
デンシトメーターACD−18型(アト−株式会社製)
で定量した。
リゾチームとともにLaemmliの方法(Laemm
liNature 227680(1970))に従っ
て1/10ffiを15%5O5−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離した。次の染色液(10%酢酸
、25%イソプロピルアルコール0.025%、コマジ
−ブリリアントブルーR−25の中、37℃3時間振と
うした後、脱色液(20%メタノール、10%酢酸)で
数回脱色し、ヒトリゾチームの量をコンピユーテイング
デンシトメーターACD−18型(アト−株式会社製)
で定量した。
結果の一例をあげれば下記の通りである。
E、co1i294(pLY−14) 0.26
6 7.6%E、co1i294(pLY−15)
0.26 6 6.0%E、co1i294(p
LY−16) 0.26 6 5.1
%E、co1i294(pLY−17) 0.26
6 4.8 %E、coli294(pP
LHLY−2) 0.26 6 3.5 %発
明の効果 pPLHLY−2とpPLHLY−1ではヒトリゾチー
ム遺伝子のSD配列よりATGコドンまでの塩基配列の
み異なるためヒトリゾチームの発現はこの合成りNAに
由来する領域に依存していることは明らかである。
6 7.6%E、co1i294(pLY−15)
0.26 6 6.0%E、co1i294(p
LY−16) 0.26 6 5.1
%E、co1i294(pLY−17) 0.26
6 4.8 %E、coli294(pP
LHLY−2) 0.26 6 3.5 %発
明の効果 pPLHLY−2とpPLHLY−1ではヒトリゾチー
ム遺伝子のSD配列よりATGコドンまでの塩基配列の
み異なるためヒトリゾチームの発現はこの合成りNAに
由来する領域に依存していることは明らかである。
又、E、col 1294(pPLHLY−2)とE、
coli294(PLY−14) 、 E、col 3
294 (FLY−15) 、 E、col 1294
(pLY−16) 、 E、 c。
coli294(PLY−14) 、 E、col 3
294 (FLY−15) 、 E、col 1294
(pLY−16) 、 E、 c。
1i294(pLY−17)では、発現ベクターのみ異
なるため、ヒトリゾチームの発現の差は各々のプラズミ
ドであるpSM221 、 psM222 、 psM
231 、 psM232の差に依存するものである。
なるため、ヒトリゾチームの発現の差は各々のプラズミ
ドであるpSM221 、 psM222 、 psM
231 、 psM232の差に依存するものである。
図面1は、ヒトリゾチーム遺伝子を含む組換えプラズミ
ドpPLHLY−1(特開昭61−78383或いは特
開昭61−78387に記載)を合成フラグメントを用
い5D−ATGSJi域を改変したヒトリゾチーム遺伝
子の発現ベクターpMY 12−6 Amp−1へのク
ローニングを示したものである。 図面2は熱によって増幅可能な発現用ベクターpsM2
31,232及び発現用組換えプラズミドpLY−16
,17の作成法を示したものである。 図面3は熱によって増幅可能な発現用ベクターpSM2
21,222及び発現用組換えプラズミドpLY−14
,15の作成法を示したものである。 図面4は、pPLHLY−2に挿入されているヒトリゾ
チーム遺伝子の塩基配列および制限酵素認識部位を示し
たものである。 図面5は、大腸菌294 (PPLI(LY−2)株、
大腸菌294(pPLHLY−1)株によるヒトリゾチ
ーム発現量を示したものである。
ドpPLHLY−1(特開昭61−78383或いは特
開昭61−78387に記載)を合成フラグメントを用
い5D−ATGSJi域を改変したヒトリゾチーム遺伝
子の発現ベクターpMY 12−6 Amp−1へのク
ローニングを示したものである。 図面2は熱によって増幅可能な発現用ベクターpsM2
31,232及び発現用組換えプラズミドpLY−16
,17の作成法を示したものである。 図面3は熱によって増幅可能な発現用ベクターpSM2
21,222及び発現用組換えプラズミドpLY−14
,15の作成法を示したものである。 図面4は、pPLHLY−2に挿入されているヒトリゾ
チーム遺伝子の塩基配列および制限酵素認識部位を示し
たものである。 図面5は、大腸菌294 (PPLI(LY−2)株、
大腸菌294(pPLHLY−1)株によるヒトリゾチ
ーム発現量を示したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)転写体mRNAの二次構造において、ライボゾーム
結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素結合
を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒトリゾ
チーム翻訳開始部位をコードするDNA断片 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す。下線を付したAGG
AGGはライボゾーム結合部位を表す) を5′端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞
中で熱によって増幅可能であって、温度で誘導可能であ
り、かつヒトリゾチームを発現する組み換えプラスミド
により形質転換された微生物を適当な培地で培養し産生
されたヒトリゾチーム蛋白質を回収することを特徴とす
るヒトリゾチームの製造法 2)微生物がEscherichia属に属する大腸菌
(E.coli)である特許請求の範囲第1項記載の製
造法 3)ヒトリゾチーム遺伝子が下記のヌクレオチド配列で
表される構造遺伝子を含むヒトリゾチーム遺伝子である
特許請求の範囲第1項もしくは第2項記載のヒトリゾチ
ームの製造法 【遺伝子配列があります】 4)ヒトリゾチーム遺伝子が、構造遺伝子の3′端に2
個の翻訳終止信号TAATGAを有するヒトリゾチーム
遺伝子である特許請求の範囲第3項記載のヒトリゾチー
ムの製造法 5)λファージのP_Lプロモーターを含む組み換えプ
ラズミドベクターを用いることを特徴とする特許請求の
範囲第1項記載のヒトリゾチームの製造法 6)プラズミドベクターとしてpSM221、pSM2
22、pSM231、pSM232を用いることを特徴
とする特許請求の範囲第1項記載のヒトリゾチームの製
造法7)組換えプラスミドがpLY−14、pLY−1
5、pLY−16、pLY−17である特許請求の範囲
の第1項記載のヒトリゾチームの製造法 8)形質転換微生物がE.coli294(pLY−1
4)、E.coli294(pLY−15)、E.co
li294(pLY−16)、E.coli294(p
LY−17)株である特許請求の範囲第1項記載のヒト
リゾチームの製造法
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19876886A JPS6356288A (ja) | 1986-08-25 | 1986-08-25 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19876886A JPS6356288A (ja) | 1986-08-25 | 1986-08-25 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6356288A true JPS6356288A (ja) | 1988-03-10 |
Family
ID=16396607
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP19876886A Pending JPS6356288A (ja) | 1986-08-25 | 1986-08-25 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6356288A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110438106A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-11-12 | 北京华韵国丰新材料科技有限公司 | 一种人工设计的纳米溶菌酶和纳米溶菌酶的制备方法 |
-
1986
- 1986-08-25 JP JP19876886A patent/JPS6356288A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110438106A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-11-12 | 北京华韵国丰新材料科技有限公司 | 一种人工设计的纳米溶菌酶和纳米溶菌酶的制备方法 |
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