JPS6356288A - ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトリゾチーム遺伝子の微生物学的製造法に
関する。更に具体的には、本発明は化学的に合成したヒ
トリゾチーム遺伝子、熱により増幅可能なプラスミドを
用いた遺伝子工学的手法によるヒトリゾチームの製造法
に関する。

ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リンパ
腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、Ｎ−アセ
チルグルコサミンと、Ｎ−アセチルムラミン酸量のβ−
１，４結合を加水分解するムラミダーゼとしての酵素活
性を有していることが知られている。ヒト乳由来のりゾ
チームは、下記の配列で示される１３０個のアミノ酸か
らなることが知られている。〔例えば、船津ら［溶酸酵
素」５５〜５８頁　講談社すイエンティフィク（１９７
７）参照］ Ｌ’　ｙｓ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌｏｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｔ”ｙｒ−Ａ”ｒｇ−Ｇｌｙ−１１ｅ−３
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｃ”
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−５ｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔ４０ｈｒ−Ａ”ｒｇ−
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ａ”ｒｇ−３ｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌ　ｙ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇ１ｎ＝Ｉ　１ｅ−
Ａ”５ｎ−３”ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ　−Ｔｒｐ−Ｃｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ−Ｔ’°ｈｒ−
Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｙ−Ａｌａ−Ｖａ　　１−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ−Ｃｙｓ−！（ｉ　５−Ｌｅｕ−３８０ｅｒ−Ｃ”ｙ
ｓ−３ｅｒ　−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ”１ｎ−Ａ
ｓｐ　−Ａｓｎ　　−夏　　１ｅ　　−Ａ　９０１ａ−
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａ　　１−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌ　
ａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−ＶＩＯ’　　ａ　１−
Ａ’°Ｉ　　ｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｇｌ　ｙ
−１１。

−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖ”’　　ａ　　ｌ　−Ａ
ｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ　−Ａ”’　　５ｐ−Ｖ”’　　ａ
ｌ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ｖａ　　１−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖ＋３０　　ａ　１ ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し、食
品等の防腐剤あるいは医薬品としては抗菌剤、非アレル
ギー性の抗炎症薬として利用する事ができる。

ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができ
るが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすに
は効率が悪く実用的ではない。組換えＤＮＡ技術による
ヒトリゾチームの生産に関しては既に報告されている（
特開昭６ｌ−７８３８３）。

本発明者らは、翻訳活性を上昇させる目的でメンセンジ
ャーＲＮＡの構造を種々研究し翻訳開始コドン（ＡＴＧ
）及びライボゾーム結合部位（別名シャインーダルガー
ノ領域）が相補する塩基と水素結合を形成しないような
二次構造を形成するとき、翻訳活性が著しく上昇するこ
とを見出した。

さらに、３５℃以上で細胞内の７５％までプラスミドが
蓄積するため蛋白の大量発現が可能であるプラスミドｐ
ＭｃＲ７３５と温度により転写の誘導をかけることがで
きる強力な転写活性をもつλＰ、プロモーターを組み合
わせ、大量発現可能な発現ベクターを構築し、これに上
記のヒトリゾチーム遺伝子を挿入したとき、ヒトリゾチ
ームが効率よく大量に発現することを見出し、本発明を
完成した。

本発明は、上述の構造を有し、効率よく大量にヒトリゾ
チームを発現する発現ベクターで形質転換された微生物
を適当な培地で培養することを特徴とするヒトリゾチー
ムの製造法を提供するものである。

以下に本発明の製造法について具体的に説明する。

１、合成りＮＡフラグメント　　゛ 本発明により提供される転写体ｍＲＮＡの二次構造にお
いて、ライボゾーム結合部位（シャインーダルガーノ領
域）及び翻訳開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成
しない構造をとるｍＲＮＡ配列を与え、るＤＮＡフラグ
メントの具体例として下記の配列のＤＮＡを挙げること
ができる。

５′端ＣＧＴＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧ
ＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＣＧ
ＡＡＣ：ＧＴＴ　３”端この様な配列を有する上記の２
本鎖ＤＮＡは、以下の様に合成することができる。

先ず、以下にしめした様にＣｌｌ−１〜ＣＩ！−４と名
付けたオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成
する。

ＣＩ［−１：　５°ＧＡＴＣＣＴＡＡＣＧＴＡＡＧＴＣ
ＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣ３″ Ｃｎ　　２　：　３　’　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　ＣＡ　
Ｔ　Ｔ　ＣＡ　Ｇ　ＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＣＴ
Ｃ５゜Ｃｍ−３：　５’　ＴＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴ
ＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴ　　３゜Ｃｌｌ−４：　
３’　　ＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧ
Ｃ５’ 各フラグメントの合成法としてはジエステル法、トリエ
ステル法、及びホスファイト法があり、固相法、液相法
がある。

ＣＩ［−１〜Ｃ１１−４と名付けたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの合成は、固相法ホスホアミダイド法を利
用したＭｏｄｅｌ　３８０　ＤＮＡシンセサイザー（ア
プライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）社〕により容易に行うことができる。

化学合成したオリゴヌクレオチドは脱保護操作の際、安
定な親油性の保護基を利用して逆層分配カラムによる高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で他の未反応混
合物から分離精製することができる。　次に、その保護
基をはずし精製すれば目的とするオリゴヌクレオチドを
得ることができる。　得られたＣｌ−２、Ｃｌｌ−３の
フラグメントの５゛側をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化し、Ｃｎ−１、Ｃｌｌ−４とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで結合した後再びＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてリン酸化し、上に示した５゜側に５ａｕ３
ＡＩサイト、３°側にＴａｑｌサイトを有する二本鎖フ
ラグメントを合成する。

このようにして得られたＤＮＡフラグメントをヒトリゾ
チーム遺伝子の残りの部分と結合した後、これを発現プ
ラズミドベクターに挿入することにより本発明の組み換
えプラズミドを構築することができる。

２、ヒトリゾチーム遺伝子の調整 本発明のヒトリゾチーム遺伝子は、例えば特開昭６１−
７８３８３　　或いは特開昭６１−７８３８７で記載さ
れているヒトリゾチーム遺伝子を含む組換えプラズミド
ｐＰＬＨＬＹ−１を制限酵素Ｔａｑｌで消化し、得られ
たヒトリゾチーム遺伝子を含む断片を常法により単離し
、上記の合成りＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で結合し、５ａｕ３ＡＩで消化したフラグメントを発現
ブラズミドｐＭＹ１２−６Ａ＋ａＰ−１に挿入したｐＰ
ＬＩ（ＬＹ−２より５ａｕ３ＡＩで切断することにより
調製することができる。具体的には、図面１及び２を参
照されたい。

プラズミドｐＰＬＨＬＹ−２を保有するＥ、ｃｏｌｉ　
２９４は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる（漱工研菌寄第　８８４２号） ３、プラズミドベクターの作成 発現ベクターのうち好ましい具体例は、本発明の目的に
かなうよう特別に工夫されたｐｓＭ２２１　、２２２゜
２３１．２３２である。ｐＳＭ２２１　、２２２　、２
３１　、２３２はｐＭＹ１２−６Ａｍρ−１及びＰＭＣ
Ｒ７３５から造成する事ができる。ｐｓＭ２２１．２２
２はＰＭＣＲ７３５のＥｃｏＲＩ部位にＰＭＹ１２−６
Ａｍｐ−１のλＰＬプロモーターを含むＥｃｏＲＩ　、
Ｓａｌ　Ｉ断片（約３．０ｋｂｐ）を挿入する事によっ
て造成することができる。またｐｓＭ２３１　、２３２
ばＰＭＣＲ７３５ｃ７）　Ｘｈｏ　Ｉ及びＨｉｎｄｌ［
［部位間の小断片をｐＭＹ１２−６ＡｍＰ−１のλＰＬ
プロモーターを含むＥｃｏＲＩ　−５ａｌ　Ｉ断片（約
３．０ｋｂｐ）と置き換えることによって造成する事が
できる。

具体的には、実施例及び図面２及び３を参照されたい。

ｐＭＹ１２−６Ａｍｐ−１およびｐＭｃＲ７３５につい
ては、公知であるが、以下にその造成法を示した。

ｐＭＹ１２−６　Ａ＋ｎｐ−１はｐＭＹ１２−６（例え
ばＴｓｕｒｉｍｏｔｏら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
、１８７７９〜８６（１９Ｂ２）参照）とｐＢＶ２３４
（例えばＯｈ　ｔｓｕｂｏら、Ｇｅｎｅ　２０２４５〜
２５４（１９Ｂ２）参照）とから以下のようにして造成
する事ができる。

ｐＢＶ２３４をＰｓｔ　Ｉで切断し、アンピシリン耐性
遺伝子の一部を含む約２．６ＫｂＰの断片をとり出し、
ｐＨＹ１２−６のＰｓｔ　Ｉ切断部位にアンピシリン耐
性遺伝子が再生する様に挿入してｐＭＹ１２−６　Ａｍ
ｐを得る。

ｐＭＹ１２−６　ＡｍｐをＢａｍｆ（Ｉで限定分解した
後、その粘着末端をＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラ
グメント）を用いて修復し、ＤＮＡリガーゼで連結して
、ｐＢＶ２３４由来のＤＮＡ断片中に含まれるＢａｒｎ
旧切断部位のみが消失したｐＭＹ１２−６　Ａｍｐ−１
を得る。

ｐＭｃＲ７３５は、ｐＫＮ４１０（例えばＵｈｌｉｎら
、Ｇｅｎｅ　６９１〜１０６　（１９７９）参照）をＥ
ｃｏＲＩで処理して得られる約７．５Ｋｂｐのプラスミ
ドのＨｈａ　Ｉ部位に、ｐＢＲ３２５（例えばＢｏｌｉ
ｖａｒ、Ｇｅｎｅ　４１２１（１９７８）参照）のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子を含む約１．３ＫｂρのＨ
ｈａ　Ｉ断片を挿入して得られた約６．８Ｋｂρのプラ
スミドのＡｖａ　１１部位に更にｐＭＬ　２１（例えば
Ｈｅｒｓｆｉｅｌｄら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１２
６４４７（１９７６）参照）のカナマイシン耐性遺伝子
を含む約１．ＩＫｂｐのＡｖａ　ＩＩ断片を挿入して造
成することができる（三木、遺伝子組換え実用化技術第
４集１０７〜１１６（１９８３）参照）。

４、ヒトリゾチーム遺伝子のプラズミドベクターへの導
入 前記１，２の様にして合成したヒトリゾチーム遺伝子を
、上記３のプラズミドベクターの挿入部位に組込む。

組込み抛作そのものは分子生物学の分野で公知の常法に
従って行うことができる。具体的な方法については後記
の実施例を参照されたい。

方向性の判定 プラスミドに組込まれたヒトリゾチーム遺伝子の方向性
の判定は、遺伝子内に含まれる特定の塩基配列を認識す
る制限酵素（例えばＡａｔＩＩ、Ｔａｑ■等であり図面
４を参照されたい。）でその部位を切断し、遺伝子外の
特定部位を別の制限酵素を用いて切断して得られた断片
のサイズをアガロースゲル電気泳動等の通常用いられて
いる方法で分析する事により行う事ができる。

５、形質転換 （１）宿主菌 ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだＭｉ換えプラスミドを
用いて形質転換させる宿主細胞の大腸菌での具体例はＥ
、　ｃｏｌｉ２９４　（例えばＢａｃｋｍａｎ　、　Ｐ
ｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡユ４
１７４〜４１７８（１９７６）参照）である。

ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドによ
る形質転換は上記の宿主に限定されるものではなく、公
知の種々のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株誘導体（例えばＢ
ａｃｈｍａｎｎ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｒｅｖ、３６５
２５〜５５７（１９７２）参照）を使用することができ
る。

これらのＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株誘導体の多くのもの
は公認の微生物機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ
）、に寄託されており、そこから分譲が可能である（例
えばＡＴＣＣカタログ参照）。

また分子生物学の分野で公知の如く、適当なベクターを
選べばより広範囲の細菌種より適当な宿主を選択する事
も可能である。

（２）形質転換 形質転換繰作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行う事ができる（例えばＣｏｈｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、　６９
．２１１０〜２１１４（１９７２）及びＭａｎｉａｔｉ
ｓＬＯＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、２４９〜
２５３　（１９８２）参照）。

（３）形質転換体 形質転換体の一具体例は、Ｅ、　ｃｏｌｔ　２９４をｐ
ｔ、ｙ−１４、ｐＬＹ−１５，ｐＬＹ−１６及びｐＬＹ
−１７で形質転換させて得た形質転換体であって、本発
明では、それらをＥ。

ｃｏｌｉ　２９４（ＰＹＬ−１４）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　
２９４（’ｐＬＹ−１５）、Ｅ。

ｃｏｌｔ　２９４（ＰＬＹ−１６）及びＥ、　ｃｏｌｉ
　２９４（ｐＬＹ−１７）と命名し、工業技術院微生物
工業技術研究所に各々徽工研菌寄８８６６号、８８６７
号、８８６８号、８８６９号として寄託されている。

６、ヒトリゾチームの生産 この様にして得た形質転換体を、分子生物学および醗酵
学の分野で公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチ
ームが生産される。

ヒトリゾチームは公知のラジオイムノアッセイ（例えば
ＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、
２７２８０２〜２８０６　（１９７９）及びＹｕｚｕｒ
ｉｈａらＣｈｅｍ、ＰｈａｒｍＪｕｌｌ、２６９０８〜
９１４（１９７８）参照）、酵素活性測定法（例えば５
ｉｄｈａｎら、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、４５
１８１７〜１Ｂ２３（１９８１）及びＭｏｒｓｋｙ　Ａ
ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２８７７〜８５（１９８３
）参照）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のク
マジーブリリアントブルーＲ−２５０による発色等を用
いて検出、定量することができる。

また生産したヒトリゾチームは生化学及び醗酵学の分野
で公知の常法を適宜組合せて回収、精製することができ
る。前述したようにＤＮＡ技術によるヒトリゾチームの
生産に関しては報告されているが、（特開昭６ｌ−７８
３８３）本発明により多量のヒトリゾチームを生産する
ことが可能になったため回収、精製操作も容易となった
。

具体的事項に関しては、後記の実施例を参照されたい。

実施例 ＤＮＡフーグメントの人Ｊ 上に示した様に設計したフラグメントＣｌｌ−１〜Ｃ■
−４のフラグメントを固相法ホスホアミダイド法を利用
したＭｏｄｅｌ　３８０　ＤＮＡシンセサイザー〔アプ
ライドバイオシステムズ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　）社製〕により合成した。

ヌクレオシドを導入したシリカ樹脂および完全に保護し
た４種のジイソプロピルホスホアミダイドは市販のアプ
ライドバイオシステムズ　（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ　）社製のものを用いた。

合成法の詳細は下記の通りである。

完全に保護したヌクレオシドを導入したシリカ樹脂（１
）カラムをトリクロロ酢酸を含むジクロロメタン溶液で
室温２分間処理することにより５”位水酸基のジメトキ
シトリチル（以下ＤＭＴＩ”）保護基を除去し、ヌクレ
オシドの導入されたシリカ樹脂（Ｉｔ）とした。　次に
、完全に保護したジイソプロピルホスホアミダイド（Ｉ
［［）をテトラゾール共存下アセトニトリル中室温で３
分間前合させた。

ＣＩ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）は以下の通りである。

０ＣＯＣＨｚＣＨｚＣＯＮＨＣＨｚＣＨｚＣＨｚ　　Ｐ
Ｐニジリカ樹脂、　　Ｂ＝Ａｂ　２．　　Ｇ　１　ｂ　
ｕ、　　Ｃｂ　２１　Ｔ（１）−Ｒ１ニジメトキシトリ
チル基 （ｎ）　−Ｒ１：Ｈ （ＩＩ［）　　　　Ｂ＝Ａｂｚ、Ｇｉ　ｂｕ、Ｃｂｚ、
　Ｔジメチルアミノピリジン、ルチジンを含むテトラヒ
ドロフラン中無水酢酸で室温４分間樹脂を処理してシリ
カ樹脂（ｎ）の５゛水酸基をアセチル化し、ルチジン、
水を含むテトラヒドロフラン中ヨウ素で１分間酸化して
５価のリン酸トリエステルとした。　以下４種のジイソ
プロピルホスホアミダイド（ＩＩＩ）を順次使用し脱ジ
メトキシトリチル化、縮合反応、アセチル化、酸化反応
を繰り返すことにより保護したオリゴヌクレオチドフラ
グメントを合成した。　最後の縮合後樹脂をトリエチル
アミンを含むチオフェノールのジオキサン溶液で５０分
間処理し、リンの保護基をはずし、３０％アンモニア水
で１時間処理することによりオリゴマーを樹脂より切り
離した。　回収したオリゴマーは３０％アンモニア水１
０ｍｊ！で５５〜６０℃５時間処理することにより塩基
のアミノ基を脱保護し、高速液体クロマトグラフィーで
逆相系担体（ｐ　−Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１Ｂ、ウォー
ターズ社製）を用い、０．１モル酢酸トリエチルアミン
緩衝液（ｐＨ７，０）中アセトニトリルの直線濃度勾配
による溶出でジメトキシトリチル基をもつオリゴマーを
精製した。　次に、８０％酢酸水１ｍｌで室温２０分間
処理することによりジメトキシトリチル基を除去した。

脱保護したオリゴマーは高速液体クロマトグラフィーで
逆相系担体（ＹＭＣ−ｐａｃｋＡＭ−３２４山村化学研
究所社製）を用い０．１モル酢酸トリエチルアミノ緩衝
液（ｐＨ７，０）中アセトニトリルの直に８９５度勾配
による溶出、更にイオン交換系担体（ＴＳＫ　　ｇｅｌ
ＤＥＡＥ−２３Ｗ、東洋曹達社製）を用い２０％アセト
ニトリルを含むギ酸アンモニウム緩衝液の直′ｇＡ濃度
勾配による溶出およびゲル濾過にて精製し、１ｊｌ−１
−Ｃ１ｌ−４を各々３．９．４．６．２．４．２．６０
Ｄ２６０ユニツト得た。

上記４種の合成オリゴヌクレオチド（Ｃｎ−１〜Ｃ■−
４）をアニーリングし、次いでクローニングした。　ま
ず、ＣＩｒ−２、ＣＩＩ　−３１ｔＩｒ片各１０ｊｌｇ
を６６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）　、１０ｒｎＭＭ
ｇＣＩ！ｚ、１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン、５５
単位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を含む１
００μ１反応液で３７℃、ＩＶｆ間反応させ、５゛末端
をリン酸化し、た。

反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈殿でＤＮＡを回収した。　このＣｎ−２、Ｃｌ
ｌ−３断片５μｇと未処理のＣｌｌ−１、Ｃｌｌ−４断
片４μｇとを６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５）　、１
０ｍＭＭｇＣ１，，１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン
、１７５（１位Ｔ４リガーゼ（宝酒造）を含む２００μ
！反応液中で１６℃、越夜で反応させた。　反応により
生じたＣｌｌ−１−Ｃ１１−４ｊｌ片の結合物をフェノ
ール：クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈殿によ
り約１０ｐｇの精製ＤＮＡ断片として回収した。

次に、この断片をヒトリゾチーム遺伝子に結合させるた
めに以下のことを行った。

コンセンサスＳＤ領域を有する４１８ｂｐのヒトリゾチ
ーム遺伝子を上述の大腸菌用発現ベクターｐＭＹｌ　２
−６Ａ２−６Ａに組みこんだｐＰＬＨＬＹ−１（特開昭
６１−７８３８３、或いは特開昭６１−７８３８７に記
載の方法で製造できる）２２０μｇをｌＯｍＭ）リス塩
酸（ｐ　Ｈ７，５）　、１０ｍＭＭｇ　ＣＩｌｚ、５０
　ｍＭＮ　ａ　Ｃｌ　１１　ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ存在下、６
４０単位の制限酵素Ｔａｑｌを加え８００ｐｌ中で６５
℃、１時間反応させ生じた６６２ｂ’ｐの断片を５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含む
ゲルを切出し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノー
ルで濃縮し、フェノール：クロロホルム混液で抽出後、
エタノール沈殿により約１０μｇのＤＮＡを回収した。

このＤＮＡＩμｇと先はどのＣｆｆ−１〜ＣＩ［−４結
合物２．５μｇを６６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）　
、６．６ｍＭＭｇＣｌ、、１０＋ｕＭＤＴＴ、１ｍＭＡ
ＴＰ、３５０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下で、３０μ
ｌの反応液中１６℃、越夜で反応させた。この反応で生
じた結合物を１１０１１Ｉトリス塩酸（ｐＨ７，５）　
、５０ｍＭＮａ　Ｃ１，１０ｍＭＭｇＣ１ｚ、１＋ａＭ
ＤＴＴ、３０単位の制限酵素５ａｕ３ＡＩ存在下、４０
ｕｌ中、３７℃、２０時間で反応し、切断した。反応液
をフェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタノール
沈殿でＤＮＡを回収した。この断片を２０μｌ中前記の
条件で５．５４位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと３
７℃、１時間反応させ、５゜末端をすべてリン酸化した
。この４３９ｂｐの断片を５％ポリアクリアミドゲル電
気泳動により分離回収した。　この断片中には先の合成
オリゴヌクレオチドを含む全ヒトリゾチーム遺伝子が存
在する。　　このＤＮＡ断片を大腸菌用発現ベクターｐ
ＭＹ１２−６Ａ２−６Ａに組みこみ、大腸菌でヒトリゾ
チームを発現させるプラズミドＩ）ＰＬＨＬ　Ｙ−２を
構築した。　先ずｐＭＹｌ２−６Ａｍｐ−１１，５４ｇ
を５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）　、１００ｍＭＮ
ａＣｊ！’、１０ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１ｚ、１ｍＭＤＴＴ、
６０単位の制限酵素ＢａｍＨＩの存在下、６０μβ中、
３７℃、１２時間反応させた。

エタノール沈殿でＤＮＡを回収後、６０μｌＩＭ）リス
塩酸（ｐＨ８，０）及び２単位のアルカリ性フォスファ
ターゼで６５℃、１時間処理し、５゛末端のリン酸基を
除去した。その後、フェノール：クロロホルム混合液で
抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。　このベ
クター０．１ｇｇと先はどの４３９ｂｐ断片を２０μｌ
中３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液で１６
℃、越夜で反応させた。　この反応液を使ってカルシウ
ム処理した大腸菌２９４株を形質転換した。

アンピシリン耐性菌を５０ｍｇ＃アンピシアンを含む、
Ｌ寒天培地（１０ｇ／ｌポリペプトン、５ｇ／ｌイース
トエキストラクト、５ｇ／ｌ！　　ＮａＣ１゜１．５％
寒天）上で選択した。　得られたコロニーよりプラズミ
ドＤＮＡをアルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　（１９Ｂ２）　Ｃ８４）により抽出、精製し、
各種制限酵素で切断して切断パターンを解析しヒトリゾ
チーム遺伝子が組み込まれたものを選び２９４株に導入
し、大腸菌２９４　（ｐＰＬＨＬＹ−２）株を調整した
。

この大腸菌２９４　（１）ＰＬＨＬＹ＝２）を工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した（徽工研菌寄第８８
４２号）。

ベタ　−のｉ ブラズミドｐＭＹ−１２−６Ａａ＋Ｐ−１１００＃ｇを
５０ｍＭＴｒｉｓ−１（Ｃ１ｐＨ７，５，１０μｌＭ　
ＭｇＣ１ｇ、１ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＮａＣ１
、１５０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを含む５００μｌの
反応液中で３７℃、４時間消化後１７５１１１Ｍ　Ｎａ
Ｃ１にし、４００単位の制限酵素　Ｓａｌ　Ｉを含む８
００μｌの反応液中で３７℃終夜消化した０反応後１％
アガロースゲル電気泳動を行って生じた約３．０Ｋｂｐ
の断片を分離し、電気的に溶出し、ブタノールでＳ縮し
、フェノール抽出後エタノール沈殿により１０ｇｇのＤ
ＮＡを回収した。　次にこのＤＮＡ　２μｇを６７ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８，８，６，７ｍＭ　ＭｇＣｈ
、　１０ｎ＋Ｍ　２−メルカプトエタノール、　６．７
　＃Ｍ　ＥＤＴＡ、　１６．６ｍＭ　（ＮＨ４）、ｓｏ
、、　３３０μＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ及びｄＴＴＰ）及び３．２単位の７４ＤＮＡポリ
メラーゼを含む３０μｌの反応液中で３７℃、１時間反
応させた後フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。

一方、プラズミドｐＭＣＲ７３５２０／Ｊｇを５０μｌ
Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ
１ｚ、１００ｍＭ　ＮａＣ１−’３０３０単制限酵素）
１ｉｎｄｌｌ［及び４０単位の制限酵素Ｘｈ。

■を含む２００μ！の反応液で３７℃、８時間消化した
後、フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。

次にこのＤＮＡを６７＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ
８，８，６゜７＋ｏＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール、６．７μＭ　ＥＤＴＡ、１６．６
ｍＭ　（ＮＨ４）２５０４．３３０７７Ｍ　ｄＮＴＰ（
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）及び５単
位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを含む３０μｌの反応液中
で３７℃、１時間反応させた後フェノール抽出、エタノ
ール沈殿を行った。

更にこのＤＮＡをＩＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ８，
０および２単位のアルカリ性フォスファターゼを含む８
０μｌの反応液中で６５℃、１時間反応させた後フェノ
ール抽出、エタノール沈殿を行った。

上記の処理を施したｐＭＣＲ７３５０，５μｇ及びｐＭ
Ｙ１２−６　Ａ＋ｎｐ−１３，０Ｋｂｐ断片０．３　ｐ
ｇを２０１１ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７，６，１０
ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、５ｍＭ　ＡＴＰ
及び５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む３０μｌの反応
液中で室温４５時間インキュベートして連結させた。

次にこの反応液を用いて大腸［Ｅ、ｃｏｌｉ　２９４株
を形質転換し、クロラムフェニコール抵抗性（２５Ｍｇ
／ｍｌ）の形質転換体を得た。これらの形質転換体より
プラズミドＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの分
析を行って図２に示される様な発現ベクターｐｓＭ２３
１　、　ｐＳＭ２３２を含む形質転換体を選びだした。

同様にプラズミドｐＭｃＲ７３５をＥｃｏＲＩで消化し
、ポリメラーゼ反応、アルカリ性フォスファターゼ処理
をした後ｐＭＹ１２−６　ＡｍＰ−１３，０Ｋｂｐ断片
と連結し、大腸菌Ｅ、ｃｏｌ　１２９４株を形質転換し
、カナマイシン抵抗性（５０Ｍｇ／ｍｌ）の形質転換体
を得た。これらの形質転換体よりプラズミドＤＮＡを調
製し、制限酵素開裂パターンの分析を行って図面３に示
されるような発現ベクターｐｓＭ２２１．ｐｓＭ２２２
を含む形質転換体を選びだした。

、　　え　　の プラズミドｐｓＭ２２１５／ｌｊｇを５０＋＋＋Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ　・Ｉ（Ｃ１ｐ！（７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１
ｚ、１ａ＋Ｍ　ＤＴＴ、１００ａ＋Ｍ　ＮａＣ１及び３
６単位の制限酵素Ｂａｍ旧を含む３０μｌの反応液中で
３７℃、４時間インキュベートした後、フェノール抽出
。

エタノール沈殿を行った。

次にこのＤＮＡをＩＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ８，
０及び１゜５単位のアルカリ性フォフアスターゼを含む
５０μｌの反応液中で６５℃、１時間インキニーベート
した後フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。

プラズミドｐＰＬＨＬ−２７６＃ｇを１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｈ、　１ｍＭ
　ＤＴＴ、　５０ｍＭ　ＮａＣ１及び１５０４１位の制
限酵素５ａｕ３ＡＩを含む５００μｌの反応液中で３７
℃、１２時間インキュベートした後５ｚポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、４３９ｂｐのヒトリゾチーム
遺伝子を回収した。

上記ｐｓＭ２２１０．５μｇ及びヒトリゾチーム遺伝予
約０．１／ｊｇを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・ＩＣＩ　ｐＨ
７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、
５ｍＭ　ＡＴＰ及び５単位の７４ＤＮＡ’ｌＪガーゼを
含む２０μｌの反応液中１６℃、１２時間インキュベー
トして連結させた。

次にこの反応液を用いて、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ２９４株
を形質転換し、カナマイシン抵抗性（５０μｓ　／ｍｌ
）の形質転換体を得た。

これらの形質転換体よりプラズミドＤＮＡを調製し、制
限酵素開裂パターンの分析を行って図面３に示される様
なヒトリゾチーム遺伝子がＡＰＬプロモーターと同一方
向に挿入された組換えブラズミドｐＬＹ＝１４を含む形
質転換体を選びだした。この形質転換体をＥ、ｃｏｌｉ
　２９４（ＰＬＹ−１４）と命名した。

プラズミドｐｓＭ２２２．ｐｓＭ２３１．ｐｓＭ２３２
を用いて、上記と同様にして、そのＢａｍＨ１部位にヒ
トリゾチーム遺伝子を挿入し、Ｅ、ｃｏｌｉ　２９４株
を形質転換した。得られたクロラムフェニコール抵抗性
（ＰＳＭ２２２の場合はカナマイシン抵抗性）の形質転
換体よりプラズミドＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パタ
ーンの解析を行って、ヒトリゾチーム遺伝子がλＰＬプ
ロモーターと同一方向に挿入された組換えプラズミドを
選びだした。この形質転換体をそれぞれＥ、　ｃｏｌｉ
　２９４（ｐＬＹ−１５）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（
ｐＬＹ−１６）、Ｅ、　ｃｏｌｔ　２９４（ｐＬＹ−１
７）と命名した。

−九ズチ：１弓礪危里 Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（ｐＬＹ−１４）を５ｍｌの修
正り培地（１０ｇ／Ｉｔポリペプトン、５ｇ／ｌイース
トエキストラクト、５　ｇ／／ＮａＣ１，５０ｍｇ／　
ｌカナマイシン）に接種し、３０℃で一夜培養した。培
養液１ｍ７！を新たな上記培地１００ｍ　ｌに加え、３
０℃で１〜６時間培養した後、４２℃で誘轟し、さらに
２〜１０時間培養を継続した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（ｐＬＹ−１５）、Ｅ、　ｃｏ
ｌｔ　２９４（ｐＬＹ−１６）、Ｅ、　ｃｏｌｔ　２９
４（ｐＬＹ−１７）に関しても上記と同様にして培養し
た（Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（ｐＬＹ−１６）、Ｅ、　
ｃｏｌｔ　２９４　（ｐＬＹ−１７）に関しては、培地
に２５ｍｇ／ｊ！クロラムフェニコールを加える）。　
各々については、適当時間培養した後、１．５１！培養
液をとり菌体を遠心分離した。

ユｊ±二人夏定１ 大腸菌２９４　（ＰＰＬＨＬＹ−２）株及び大腸菌２９
４（ｐＰＬＨＬＹ−１）株で発現されにリゾチームの検
出、定量はウェスタンブロッティングを用いたラジオイ
ムノアッセイ法でＩｚｓ■−プロティン−Ａにより定量
した。

大腸菌２９４　（ＰＰＬＨＬＹ−２）株及び大腸菌２９
４（ｐＰＬＨＬＹ−１）株を１００ｍ１修正り培地（１
０ｇ／ｌポリペプトン、５　ｇ／　ｌ　　イーストエキ
ストラクト、５ｇ／７！　Ｎａｃｌ、５０ｍｇ＃！　　
アンピシリン）で３０℃で振盪培養し、ＯＤ６．。０．
２に達した時点から２時間ごとに１．５ｍ６培養液をサ
ンプリングした。

集めた菌体は以下の方法により定量した。まず培養液１
．５１ｎＡの菌体を３種の異なる量の標品のリゾチーム
とともにＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｚｍｌｉ　、　
Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８０　（１９７０））に従って
１７１０量を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した。　次にトランスファーパンツ？
−（２５１１１Ｍ）リス、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８
，３，１５％ＭｅＯＨ，０，１％５ＤＳ）中ゲルのタン
パク質をニトロセルロース膜（Ｓ＆５ＢＡ８５）上に電
気泳動的に移行させた（４℃、３０　Ｖ、　　１２時間
）。ニトロセルロース膜は、２％ＢＳＡ　（ウシ血清ア
ルブミン）を含むＰＢＳバッファー（リン酸緩衝溶液）
中３７℃、１時間反応し、蛋白の吸着していない部分を
ブロックした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０．　　リゾ
チーム抗体（ミドリ十字製）を加え３７℃、３時間反応
した。

ＰＢＳＴ　（０，０５％７ｗｅ　ｅ　ｎ　２０を含むＰ
ＢＳ）で洗浄後、２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（５０ｍＭ
トリスバッファーｐＨ８，０＋　　０．９％ＮａＣ１，
０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中、１２５１−プロティン
Ａ　１０μＣｉ　（アマ−ジャム社製）と３７℃、７０
分反応した。　ＴＢＳＴで洗浄後、オートラジオグラフ
ィーを行い、１４．７にダルトンに相当するバンドを切
取りＴ−カウンターにより放射能量を測定した。　大腸
菌由来のリゾチームは３種の異なる量の標品のリゾチー
ムにより作成した検量線を基準にして定量した。この方
法により大腸菌中のりゾチームを経時変化をおって定量
したのが図５である。ｐＰＬＩＩＬＹ−１では６時間後
に３５　ｐ　ｇ　／　ｍ　１２　ｃｕｌｔｕｒｅの発現
量がみられたのに対し、ｐＰＬｌ（ＬＹ−２の場合は８
時間後に最裔６８μｇ／　ｍ　１　ｃｕｌｔｕｒｅの発
現がみられた。

大腸菌２９４　（ＰＰＬＨＬＹ−２）株及び大腸菌２９
４（ｐＬＹ−１４）、大腸菌２９４　（ｐＬＹ−１５）
　、大腸菌２９４（ＰＬＹ−１６）、大腸菌２９４　（
ＰＬＹ−１７）株で発現されたりゾチームの検出、定量
は、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる分離後、コマジ−ブリリアントブルーＲ−２５０に
よる発色をデンシトメーターで測定することにより行っ
た。

まず、培養液１．５ｍβ菌体を３種の異なる量の標品の
リゾチームとともにＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍ
ｌｉＮａｔｕｒｅ　２２７６８０（１９７０））に従っ
て１／１０ｆｆｉを１５％５Ｏ５−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離した。次の染色液（１０％酢酸
、２５％イソプロピルアルコール０．０２５％、コマジ
−ブリリアントブルーＲ−２５の中、３７℃３時間振と
うした後、脱色液（２０％メタノール、１０％酢酸）で
数回脱色し、ヒトリゾチームの量をコンピユーテイング
デンシトメーターＡＣＤ−１８型（アト−株式会社製）
で定量した。

結果の一例をあげれば下記の通りである。

Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（ｐＬＹ−１４）　　０．２６　　
６　　７．６％Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（ｐＬＹ−１５）　
　０．２６　　６　　６．０％Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（ｐ
ＬＹ−１６）　　　０．２６　　　６　　　５．１　　
％Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（ｐＬＹ−１７）　　　０．２６
　　　６　　　４．８　　％Ｅ、ｃｏｌｉ２９４（ｐＰ
ＬＨＬＹ−２）　０．２６　　　６　　　３．５　％発
明の効果 ｐＰＬＨＬＹ−２とｐＰＬＨＬＹ−１ではヒトリゾチー
ム遺伝子のＳＤ配列よりＡＴＧコドンまでの塩基配列の
み異なるためヒトリゾチームの発現はこの合成りＮＡに
由来する領域に依存していることは明らかである。

又、Ｅ、ｃｏｌ　１２９４（ｐＰＬＨＬＹ−２）とＥ、
ｃｏｌｉ２９４（ＰＬＹ−１４）　、　Ｅ、ｃｏｌ　３
２９４　（ＦＬＹ−１５）　、　Ｅ、ｃｏｌ　１２９４
　（ｐＬＹ−１６）　、　Ｅ、　ｃ。

１ｉ２９４（ｐＬＹ−１７）では、発現ベクターのみ異
なるため、ヒトリゾチームの発現の差は各々のプラズミ
ドであるｐＳＭ２２１　、　ｐｓＭ２２２　、　ｐｓＭ
２３１　、　ｐｓＭ２３２の差に依存するものである。

【図面の簡単な説明】

図面１は、ヒトリゾチーム遺伝子を含む組換えプラズミ
ドｐＰＬＨＬＹ−１（特開昭６１−７８３８３或いは特
開昭６１−７８３８７に記載）を合成フラグメントを用
い５Ｄ−ＡＴＧＳＪｉ域を改変したヒトリゾチーム遺伝
子の発現ベクターｐＭＹ　１２−６　Ａｍｐ−１へのク
ローニングを示したものである。 図面２は熱によって増幅可能な発現用ベクターｐｓＭ２
３１，２３２及び発現用組換えプラズミドｐＬＹ−１６
，１７の作成法を示したものである。 図面３は熱によって増幅可能な発現用ベクターｐＳＭ２
２１，２２２及び発現用組換えプラズミドｐＬＹ−１４
，１５の作成法を示したものである。 図面４は、ｐＰＬＨＬＹ−２に挿入されているヒトリゾ
チーム遺伝子の塩基配列および制限酵素認識部位を示し
たものである。 図面５は、大腸菌２９４　（ＰＰＬＩ（ＬＹ−２）株、
大腸菌２９４（ｐＰＬＨＬＹ−１）株によるヒトリゾチ
ーム発現量を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）転写体ｍＲＮＡの二次構造において、ライボゾーム
   結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素結合
   を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒトリゾ
   チーム翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
   コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
   ードするＤＮＡ配列の一部を表す。下線を付したＡＧＧ
   ＡＧＧはライボゾーム結合部位を表す） を５′端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞
   中で熱によって増幅可能であって、温度で誘導可能であ
   り、かつヒトリゾチームを発現する組み換えプラスミド
   により形質転換された微生物を適当な培地で培養し産生
   されたヒトリゾチーム蛋白質を回収することを特徴とす
   るヒトリゾチームの製造法 ２）微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する大腸菌
   （Ｅ．ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第１項記載の製
   造法 ３）ヒトリゾチーム遺伝子が下記のヌクレオチド配列で
   表される構造遺伝子を含むヒトリゾチーム遺伝子である
   特許請求の範囲第１項もしくは第２項記載のヒトリゾチ
   ームの製造法 【遺伝子配列があります】 ４）ヒトリゾチーム遺伝子が、構造遺伝子の３′端に２
   個の翻訳終止信号ＴＡＡＴＧＡを有するヒトリゾチーム
   遺伝子である特許請求の範囲第３項記載のヒトリゾチー
   ムの製造法 ５）λファージのＰ＿Ｌプロモーターを含む組み換えプ
   ラズミドベクターを用いることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載のヒトリゾチームの製造法 ６）プラズミドベクターとしてｐＳＭ２２１、ｐＳＭ２
   ２２、ｐＳＭ２３１、ｐＳＭ２３２を用いることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載のヒトリゾチームの製
   造法７）組換えプラスミドがｐＬＹ−１４、ｐＬＹ−１
   ５、ｐＬＹ−１６、ｐＬＹ−１７である特許請求の範囲
   の第１項記載のヒトリゾチームの製造法 ８）形質転換微生物がＥ．ｃｏｌｉ２９４（ｐＬＹ−１
   ４）、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ｐＬＹ−１５）、Ｅ．ｃｏ
   ｌｉ２９４（ｐＬＹ−１６）、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ｐ
   ＬＹ−１７）株である特許請求の範囲第１項記載のヒト
   リゾチームの製造法