JPS6352881A - ヒトリゾチ−ム遺伝子を有する組み換えプラズミド及び組み換え体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトリゾチーム遺伝子を含有する組み換えプ
ラズミド及び組み換え微生物に関する。

更に具体的には、本発明は化学的に合成したヒトリゾチ
ーム遺伝子を含有する熱により増幅可能なブラズミド或
いは該プラズミドを保持する組み換え微生物に関する。

ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リンパ
腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、Ｎ−アセ
チルグルコサミンと、Ｎ−アセチルムラミン酸量のβ−
１，４結合を加水分解するムラミダーゼとしての酵素活
性を有していることが知られている。ヒト乳由来のリゾ
チームは、下記の配列で示される１３０個のアミノ酸か
らなることが知られている。〔例えば、船津ら「溶酸酵
素」５５〜５８頁　講談社すイエンティフィク（１９７
７）参照〕 Ｌ’　　ｙｓ−Ｖａ　ｌ−ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌｏｒｇ　−Ｔｈｒ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ＝Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔ”ｙｒ−Ａ”ｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ｉ　
１ｅ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａ、Ｓｎ−Ｔｒｐ−Ｍ
ｅｔ−Ｃ３゜ｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−
ＧＩｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔ４０ｈｒ
−Ａ”ｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ”ｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇａｙ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｔ　Ｉｅ−Ａ”５ｎ−３”ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−’ｌ
’ｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔ
”ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａ　　１−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｈｉ　　ｓ−１，ｅｕ−３”ｅｒ−
Ｃ”ｙｓ−３ｅｒ−Ａｌ　　ａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｑ”
Ｉｎ−Ａｓ　ｐ　−Ａｓｎ−Ｉ　　１ｅ−Ａ”Ｉａ−Ａ
ｓｐ−Ａｌａ−Ｖａ　　Ｉ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａ　Ｉ　−Ｖ”’　　ａ　ｌ　−Ａ
”’　　ｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−１１
ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｖ”Ｏａ　　ｌ　−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ
−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ”’　　５ｐ−Ｖ”’　　ａ　　
１−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＶＩ３０　ａ　ｌ ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し、食
品等の防腐剤あるいは医薬品としては抗菌剤、非アレル
ギー性の抗炎症薬として利用する事ができる。

ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができ
るが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすに
は効率が悪く実用的ではない。組換えＤＮＡ技術による
ヒトリゾチームの生産に関しては既に報告されている（
特開昭６ｌ−７８３８３）。

本発明者らは、翻訳活性を上昇させる目的でメツセンジ
ャーＲＮＡの構造を種々研究し翻訳開始コドン（ＡＴＧ
）及びライボゾーム結合部位（別名シャインーダルガー
ノ領域）が相補する塩基と水素結合を形成しないような
二次構造を形成するとき、翻訳活性が著しく上昇するこ
とを見出した。

さらに、３５℃以上で細胞内の７５％までプラスミドが
蓄積するため蛋白の大量発現が可能であるプラスミドｐ
ＭｃＲ７３５と温度により転写の誘導をかけることがで
きる強力な転写活性をもつλＰＬプロモーターを組み合
わせ、大量発現可能な発現ベクターを構築し、これに上
記のヒトリゾチーム遺伝子を挿入したとき、ヒトリゾチ
ームが効率よく大量に発現することを見出し、本発明を
完成した。

以下に本発明について具体的に説明する。

１、合成りＮＡフラグメント 本発明により提供される転写体ｍＲＮＡの二次構造にお
いて、ライボゾーム結合部位（シャインーダルガーノ領
域）及び翻訳開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成
しない構造をとるｍＲＮＡ配列を与えるＤＮＡフラグメ
ントの具体例として下記の配列のＤＮＡを挙げることが
できる。

５°端ＣＧＴＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧ
ＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＣＧ
ＡＡＣＧＴＴ３”端この様な配列を有する上記の２本積
Ｄ　Ｎ　Ａは、以下の様に合成することができる。

先ず、以下にしめした様にＣｎ−１〜Ｃｌｌ−４と名付
けたオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成す
る。

ｃｍ−ｉ　：　ｓｏ　ＧＡＴＣＣＴＡＡＣＧＴＡＡＧＴ
ＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣ３’ Ｃｎ−２：　３°　ＧＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣＡＣ
ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＣＴＣ５’Ｃｍ−３：　　５”　
ＴＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＴＴ
ＴＴ　　　３゜Ｃｎ　−４：　　３’　　ＣＣＡＡＡＡ
ＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣ５’ 各フラグメントの合成法としてはジエステル法、トリエ
ステル法、及びホスファイト法があり、固相法、液相法
がある。

Ｃｌｌ−１〜ＣＩ［−４と名付けたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの合成は、固相法ホスホアミダイド法を利
用したＭｏｄｅｌ　３８０　Ｄ　Ｎ　Ａシンセサイザー
〔アプライドバイオシステムズ（Ａρｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）社〕により容易に行うことができる
。

化学合成したオリゴヌクレオチドは脱保護操作の際、安
定な親油性の保護基を利用して逆層分配カラムによる高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　ＬＣ）で他の未反応
混合物から分離精製することができる。　次に、その保
護基をはずし精製すれば目的とするオリゴヌクレオチド
を得ることができる。　得られたＣｎ−２、ＣＩｒ−３
のフラグメントの５゛側をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化し、ＣＩＩ−Ｉ　ＣＵ−４とＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合した後再びＴ４ボリヌクレオチドキ
アーゼを用いてリン酸化し、上に示した５゛側にＳ　ａ
　ｕ　３　Ａｌサイト、３°側にＴａｑｌサイトを有す
る二本鎖フラグメントを合成する。

このようにして得られたＤＮＡフラグメントをヒトリゾ
チーム遺伝子の残りの部分と結合した後、これを発現プ
ラズミドベクターに挿入することにより本発明の組み換
えプラスミドを構築することができる。

２、ヒトリゾチーム遺伝子の調整 本発明のヒトリゾチーム遺伝子は、例えば特開昭６１−
７８３８３　　或いは特開昭６１−７８３８７で記載さ
れているヒトリゾチーム遺伝子を含む組換えプラスミド
ｐＰＬＨＬＹ−１を制限酵素Ｔａｑｌで消化し、得られ
たヒトリゾチーム遺伝子を含む断片を常法により単離し
、上記の合成りＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガ−ゼ
で結合し、５ａｕ３ＡＩで消化したフラグメントを発現
プラスミドｐＭＹ１２−６Ａｍｐ−１に挿入したｐＰＬ
ＨＬＹ−２より５ａｕ３ＡＩで切断することにより調製
することができる。具体的には、図面１及び２を参照さ
れたい。

プラスミドｐＰＬＨＬＹ−２を保有するＥ、ｃｏｌｉ　
２９４は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる（微工研菌寄第　８８４２号） ３、プラスミドベクターの作成 発現ベクターのうち好ましい具体例は、本発明の目的に
かなうよう特別に工夫されたｐｓＭ２２１　、２２２゜
２３１．２３２である。ｐｓ阿２２１，２２２，２３１
，２３２はρＭＹ１２−６Ａｍｐ−１及びｐＭｃＲ７３
５から造成する事ができる。ｐｓＭ２２１．２２２はｐ
ＭｃＲ７３５のＥｃｏＲＩ部位にｐＭＹ１２−６Ａｍｐ
−１のλＰＬプロモーターを含むＥｃｏＲＩ　、Ｓａｌ
　ｎ断片（約３．０ｋｂｐ）を挿入する事によって造成
することができる。またｐｓＭ２３１　、２３２はｐＭ
ｃＲ７３５のＸｈｏ　Ｉ及びｔｒｉｎｄｎ［部位間の小
断片をｐＭＹ１２−６Ａｍｐ−１（７）λＰＬ７’ロモ
ーターを含むＥｃｏＲＩ　−５ａｌ　ｎ断片（約３．０
ｋｂ）と置き換えることによって造成する事ができる。

具体的には、実施例及び図面２及び３を参照されたい。

ｐＭＹ１２６Ａｍｐ（およびｐＭｃＲ７３５については
、公知であるが、以下にその造成法を示した。

ｐＭＹ１２−６　Ａｍｐ−１はｐＭＹ１２−６（例えば
Ｔｓｕｒｉｍｏｔｏ　ら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
、１８７７９〜８６（１９８２）参照）とｐＢＶ２３４
（例えばＯｈ　ｔ、５ｕｂｏ　ら、Ｇｅｎｅ　２０２４
５〜２５４（１９８２）参照）とから以下のようにして
造成する事ができる。

ｐＢＶ２３４をＰｓｔ　Ｉで切断し、アンピシリン耐性
遺伝子の一部を含む約２．６Ｋｂｐの断片をとり出し、
ｐＭＹ１２−６のＰｓｔｌ切断部位にアンピシリン耐性
遺伝子が再生する様に挿入してｐＭＹ１２−６　Ａｍｐ
を得る。

ｐＭＹ１２６　ＡｍＰをＢａｍＨＩで限定分解した後、
その粘着末端をＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグメ
ント）を用いて修復し、ＤＮＡリガーゼで連結して、ｐ
ＢＶ２３４由来のＤＮＡ断片中に含まれるＢａｍ１ｌｌ
切断部位のみが消失したｐＭＹ１２−６　Ａｍｐ−１を
得る。

ｐＭｃＲ７３５は、ｐＫＮ４１０（例えばＵｈｌｉｎら
、Ｇｅｎｅ　６９１〜１０６（１９７９）参照）をＥｃ
ｏ　ＲＩで処理して得られる約７．５Ｋｂｐのプラスミ
ドのＨｈａ　１部位に、ｐＢＲ３２５（例えばＢｏｌｉ
ｖａｒ、Ｇｅｎｅ　４１２１（１９７８）参照）のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子を含む約１．３ＫｂＰの）
ｌｈａ　ｉ断片を挿入して得られた約６．８Ｋｂｐのプ
ラスミドのＡｖａ　ＩＩ部位に更にｐＭＬ　２１（例え
ばＨｅｒｓｆｉｅｌｄら、Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、１
２６４４７（１９７６）参照）のカナマイシン耐性遺伝
子を含む約１．ＩＫｂｐのＡｖａ　ｎ断片を挿入して造
成することができる（三木、遺伝子組換え実用化技術第
４集１０７〜１１６（１９８３）参照）。

４、ヒトリゾチーム遺伝子のプラスミドベクターへの導
入 前記１，２の様にして合成したヒトリゾチーム遺伝子を
、上記３のプラスミドベクターの挿入部位に組込む。

組込み操作そのものは分子生物学の分野で公知の常法に
従って行うことができる。具体的な方法については後記
の実施例を参照されたい。

方向性の判定 プラスミドに組込まれたヒトリゾチーム遺伝子の方向性
の判定は、遺伝子内に含まれる特定の塩基配列を認識す
る制限酵素（例えばＡａｔｌＩ、Ｔａｑ■等であり図面
４を参照されたい。）でその部位を切断し、遺伝子外の
特定部位を別の制限酵素を用いて切断して得られた断片
のサイズをアガロースゲル電気泳動等の通常用いられて
いる方法で分析する事により行う事ができる。

５、形質転換 （１）宿主菌 ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドを用
いて形質転換させる宿主細胞の大腸菌での具体例はＥ、
　ｃｏｌｉ２９４　（例えばＢａｃｋｍａｎ　、　Ｐｒ
ｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡユ４
１７４〜４１７８（１９７６）参照）である。

ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドによ
る形質転換は上記の宿主に限定されるものではなく、公
知の種々のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株誘導体（例えばＢ
ａｃｈｍａｎｎ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｒｅｖ、３６５
２５〜５５７（１９７２）参照）を使用することができ
る。

これらのＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株誘導体の多くのもの
は公認の微生物機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ
）、に寄託されており、そこから分譲が可能である（例
えばＡＴＣＣカタログ参照）また分子生物学の分野で公
知の如く、適当なベクターを選べばより広範囲の細菌種
より適当な宿主を選択する事も可能である。

（２）形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行う事ができる（例えばＣｏｈｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＪＳＡ、　６９
．２１１０〜２１１４（１９７２）及びＭａｎｉａｔｉ
ｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、２４９〜２
５３　（１９８２）参照）。

（３）形質転換体 形質転換体の一具体例は、Ｅ、　ｃｏｌｔ　２９４をｐ
ＬＹ−１４、ｐＬＹ−１５，ｐＬＹ−１６及びｐＬＹ−
１７で形質転換させて得た形質転換体であって、本発明
では、それらをＥ。

ｃｏｌｉ　２９４（ｐＹＬ−１４）、Ｅ、　ｃｏｌｔ　
２９４（ｐＬＹ−１５）、Ｅ。

ｃｏｌｉ　２９４（ｐＬＹ−１６）及びＥ、　ｃｏｌｔ
　２９４（ｐＬＹ−１７）と命名し、工業技術院微生物
工業技術研究所に各々徽工研菌寄８８６６号、８８６７
号、８８６８号、８８６９号として寄託されている。

６、ヒトリゾチームの生産 この様にして得た形質転換体を、分子生物学および醗酵
学の分野で公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチ
ームが生産される。

ヒトリゾチームは公知のラジオイムノアッセイ（例えば
ＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、
２７２８０２〜２８０６　（１９７９）及びＹｕｚｕｒ
ｉｈａらＣｈｅｍ、Ｐｂａｒｍ、Ｂｕｌｌ、２６９０８
〜９１４（１９７８）参照）、酵素活性測定法（例えば
５ｉｄｈａｎら、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、４
５１８１７〜１８２３（１９８１）及びＭｏｒｓｋｙ　
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２８７７〜８５（１９８
３）参照”）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
のクマジープリリアントブルーＲ−２５０による発色等
を用いて検出、定量することができる。

また生産したヒトリゾチームは生化学及び醗酵学の分野
で公知の常法を適宜組合せて回収、精製することができ
る。前述したようにＤ　Ｎ　Ａ技術によるヒトリゾチー
ムの生産に関しては報告されているが、（特開昭６ｌ−
７８３８３）本発明により多量のヒトリゾチームを生産
することが可能になったため回収、精製操作も容易とな
った。

具体的事項に関しては、後記の実施例を参照されたい。

実施例 ＤＮＡフラグメントの人 上に示した様に設計したフラグメントＣｎ−１〜Ｃｎ−
４のフラグメントを固相法ホスホアミダイド法を利用し
たＭｏｄｅｌ　３８０　ＤＮＡシンセサイザー〔アプラ
イドバイオシステムズ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ　）社製〕により合成した。

ヌクレオシドを導入したシリカ樹脂および完全に保護し
た４種のジイソプロピルホスホアミダイドは市販のアプ
ライドバイオシステムズ　（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ　）社製のものを用いた。

合成法の詳細は下記の通りである。

完全に保護したヌクレオシドを導入したシリカ樹脂（１
）カラムをトリクロロ酢酸を含むジクロロメタン溶液で
室温２分間処理することにより５゛位水酸基のジメトキ
シトリチル（以下ＤＭＴｒ）保護基を除去し、ヌクレオ
シドの導入されたシリカ樹脂（Ｉｆ）とした。　次に、
完全に保護したジイソプロピルホスホアミダイドＣＩＩ
Ｉ）をテトラゾール共存下アセトニトリル中室温で３分
間縮合させた。

（Ｉ）、（ＩＩ）及び（Ｉ［ｌ］は以下の通りである。

ＯＣＯＣＨｚＣＨｚＣＯＮ　ＨＣＨｚＣＨｚＣＨｚ　　
　ＰＰニジリカ樹脂、Ｂ＝Ａｂｚ、Ｇｉ　ｂｕ、Ｃｂｚ
、ＴＣＩ）＝Ｒ１ニジメトキシトリチル基 （ｎ）　＝Ｒ１：　Ｈ ＣＨ（ＣＩ（：＋）　ｚ （ＩＩＩ）　　　　Ｂ＝Ａｂｚ、Ｇｉｂｕ、Ｃｂｚ、Ｔ
ジメチルアミノピリジン、ルチジンを含むテトラヒドロ
フラン中無水酢酸で室温４分間樹脂を処理してシリカ樹
脂（ＩＩ）の５′水酸基をアセチル化し、ルチジン、水
を含むテトラヒドロフラン中ヨウ素で１分間酸化して５
価のリン酸トリエステルとした。　以下４種のジイソプ
ロピルホスホアミダイド（Ｉ［ｒ）を順次使用し脱ジメ
トキシトリチル化、縮合反応、アセチル化、酸化反応を
繰り返すことにより保護したオリゴヌクレオチドフラグ
メントを合成した。　最後の縮合後樹脂をトリエチルア
ミンを含む・チオフェノールのジオキサン溶ン夜で５０
分間処理し、リンの保護基をはずし、３０％アンモニア
水で１時間処理することによりオリゴマーを樹脂より切
り離した。　回収したオリゴマーは３０％アンモニア水
１０ｍｊｌ！で５５〜６０”Ｃ５時間処理することによ
り塩基のアミノ基を脱保護し、高速液体クロマトグラフ
ィーで逆相系担体（μｍＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１Ｂ、ウ
ォーターズ社′Ｍ）を用い、０．１モル酢酸トリエチル
アミン緩衝液（ｐＨ７，０）中ア七ト二トリルの直線濃
度勾配による溶出でジメトキシトリチル基をもつオリゴ
マーを精製した。　次に、８０％酢酸水１ｍ６で室温２
０分間処理することによりジメトキシトリチル基を除去
した。脱保護したオリゴマーは高速液体クロマトグラフ
ィーで逆相系担体（ＹＭＣ−ｐａｃｋＡＭ−３２４山村
化学研究所社製）を用い０．１モル酢酸トリエチルアミ
ン緩衝液（ｐＨ７，０）中アセトニトリルの直線濃度勾
配による溶出、更にイオン交換系担体（ＴＳＫ　　ｇｅ
ｌＤＥＡＥ−２３Ｗ、東洋曹達社製）を用い２０％アセ
トニトリルを含むギ酸アンモニウム緩衝液の直線濃度勾
配による溶出およびゲル濾過にて精製し、ｃｎ−ｉ〜Ｃ
１１−４を各々３．９．４．６．２．４．２．６０Ｄ２
６０ユニツト得た。

上記４種の合成オリゴヌクレオチド（Ｃｒｌ　−１〜Ｃ
ｎ−４）をアニーリングし、次いでクローニングした。

　まず、Ｃｍ−２、Ｃｍ−３１１１片各１０℃ｇを６６
ｍＭ１−リス塩酸（ｐＨ７，５）　、１０１１ＭＭ　ｇ
　Ｃ１ｚ、１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン、５５単
位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を含む１０
０μ！反応液で３７℃、１時間反応させ、５゛末端をリ
ン酸化した。

反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈殿でＤＮＡを回収した。　このＣＵ−２、ＣＩ
［−３断片５μｇと未処理のＣ１１−１、ＣＵ−４断片
４ｐｇとを６６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）　、１０
ｍＭＭｇＣ，ｊ２ｚ、１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭスペルミジ
ン、１７５０単位Ｔ４リガーゼ（宝酒造）を含む２００
μ！反応液中で１６℃、越夜で反応させた。　反応によ
り生じたＣｎ−１〜Ｃ■−４断片の結合物をフェノール
：クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈殿により約
１０μｇの精製ＤＮＡ断片として回収した。

次に、この断片をヒトリゾチーム遺伝子に結合させるた
めに以下のことを行った。

コンセンサス５Ｄｆｉ、ＪＴ域を有する４１８ｂｐのヒ
トリゾチーム遺伝子を上述の大腸菌用発現ベクターｐＭ
Ｙ１２＝６Ａｍｐ−１に組みこんだｐＰＬＨＬＹ−１（
特開昭６１−７８３８３、或いは特開昭６１−７８３８
７に記載の方法で製造できる）２２０μｇを１０ｍＭ）
リス塩酸（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇＣｊ２ｚ、５
０ｍＭＮａＣｌ　、、１ｍＭＤＴＴ存在下、６４０単位
の制限酵素ＴａｑＩを加え８００μｌ中で６５℃、１時
間反応させ生じた６６２ｂｐの断片を５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含むゲルを切出
し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノールで濃縮し
、フェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタノール
沈殿により約１０μｇのＤＮＡを回収した。このＤＮＡ
Ｉμｇと先はどのＣｎ−１〜Ｃｌｌ−４結合吻２．５μ
ｇを６６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）　、６．６ｍＭ
ＭｇＣ１２，１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、３５０単
位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下で、３０μｌの反応液中１
６℃、越夜で反応させた。この反応で生じた結合物を１
０ｍＭ）リス塩酸ＣｐＨ７，５）　、５０ｍＭＮａｃＩ
、１０ｍＭＭｇＣｊ２ｚ、１ｍＭＤＴＴ、３０単位の制
限酵素５ａｕ３ＡＩ存在下、４０μｌ中、３７℃、２０
時間で反応し、切断した。反応液をフェノール：クロロ
ホルム混液で抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し
た。この断片を２０μｌ中前記の条件で５．５単位のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼと３７℃、１時間反応させ
、５′末端をすべてリン酸化した。この４３９ｂｐの断
片を５％ポリアクリアミドゲル電気泳動により分離回収
した。　この断片中には先の合成オリゴヌクレオチドを
含む全ヒトリゾチーム遺伝子が存在する。　　このＤＮ
Ａ断片を大腸菌用発現ベクターｐＭｙｉ　２−６Ａ２−
６Ａに組みこみ、大腸菌でヒトリゾチームを発現させる
ブラズミドｐＰＬＨＬＹ−２を構築した。　先ずｐＭＹ
１２−６Ａｍｐ−１１，５μｇ　　　を５０＋ｎＭ）リ
ス塩酸（ｐＨ７，５）　、１００ｍＭＮａ　Ｃ１−１０
ｍＭＭｇＣ１ｚ、１ｍＭＤＴＴ、６０単位の制限酵素Ｂ
ａｍＨＩの存在下、６０μβ中、３７℃、１２時間反応
させた。

エタノール沈殿でＤＮＡを回収後、６０μｌ中ＩＭトリ
ス塩酸（ｐＨ８，０）及び２単位のアルカリ性フォスフ
ァターゼで６５”ｃ、１時間処理し、５゛末端のリン酸
基を除去した。その後、フェノール：クロロホルム混合
液で抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。　こ
のベクター０．１μｇと先はどの４３９ｂｐ断片を２０
μｌ中３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液で
１６℃、越夜で反応させた。　この反応液を使ってカル
シウム処理した大腸菌２９４株を形質転換した。

アンピシリン耐性菌を５０ｍｇ／ｉ！アンピシリンを含
むし寒天培地（１０ｇ＃ポリペプトン、５ｇ／ｌイース
トエキストラクト、５ｇ／Ｉ　　ＮａＣ１゜１．５％寒
天）上で選択した。　得られたコロニーよりプラズミド
ＤＮＡをアルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　（１９８２）　ＣＩ５）により抽出、精製し、各
種制限酵素で切断して切断パターンを解析しヒトリゾチ
ーム遺伝子が組み込まれたものを選び２９４株に導入し
、大腸菌２９４　（ｐＰＬＨＬＹ−２）株を調整した。

この大腸菌２９４　（ｐＰＬＨＬＹ−２）を工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した（微工研菌寄第８８４
２号）。

、ベクターの８周 プラズミドｐＭＹ　１２６　ＡｍＰ−１１００μｇを５
０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣＩｚ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１
５０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを含む５００μｌの反応
液中で３７℃、４時間消化後１７５ｍＭ　ＮａＣＩにし
、４００単位の制限酵素　Ｓａｌ　Ｉを含む８００μｌ
の反応液中で３７℃終夜消化した。反応後１％アガロー
スゲル電気泳動を行って生じた約３．ＯＫｂρの断片を
分離し、電気的に溶出し、ブタノールで濃縮し、フェノ
ール抽出後エタノール沈殿により１０℃ｇのＤＮＡを回
収した。　次にこのＤＮＡ　２μｇを６７ｍＭＴｒｉｓ
　−ＨＣＩ　ｐＨ８，８，６，７ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　
１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール、　６．７　ｐＨ
ＥＤＴＡ、　１６．６ｍＭ　（ＮＨ，）ｔｓ０４．３３
０　、ｕＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
及びｄＴＴＰ）及び３．２単位のＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼを含む３０μｌの反応液中で３７℃、１時間反応させ
た後フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。

一方、ブラズミドｐＭｃＲ７３５２０℃ｇを５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ何（Ｃ１，ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ
、１００ｍＭ　ＮａＣ１，３０単位の制限酵素旧ｎｄｌ
［Ｉ及び４０単位の制限酵素Ｘｈｏ　Ｉを含む２００μ
ｌの反応液で３７℃、８時間消化した後、フェノール抽
出、エタノール沈殿を行った。

次にこのＤＮＡを６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８
，８，６゜７ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　２−メルカ
プトエタノール、６．７μＭ　ＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ
　（ＮＨ４）２ＳＯ，、，３３０ｕＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）及び５単位の
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを含む３０μｌの反応液中で３
７℃、１時間反応させた後フェノール抽出、エタノール
沈殿を行った。

更にこのＤＮＡをＬＭ　Ｔｒｉｓ　−）ＩＣＩ　ｐＨ８
，０および２単位のアルカリ性フォスファターゼを含む
８０μβの反応液中で６５℃、１時間反応させた後フェ
ノール抽出、エタノール沈殿を行った。

上記の処理を施したＰＭＣＲ７３５０，５μｇ及びｐＭ
Ｙ１２−６　Ａｍｐ−１３，０Ｋｂｐ断片０．３　ｐｇ
を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−１（ＣＩ　ｐＨ７，６，１０
ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、５ｍＭ　ＡＴＰ
及び５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む３０μｌの反応
液中で室温４５時間インキュベートして連結させた。

次にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４
株を形質転換し、クロラムフェニコール抵抗性（２５℃
ｇ／ｍｌ）の形質転換体を得た。これらの形質転換体よ
りブラズミドＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの
分析を行って図２に示される様な発現ベクターｐｓＭ２
３１　、９５Ｍ２３２を含む形質転換体を選びだした。

同様にプラズミドρＭＣＲ７３５をＥｃｏＲＴで消化し
、ポリメラーゼ反応、アルカリ性フォスファクーゼ処理
をした後ｐＭＹ１２−６　Ａｍｐ−１３，０Ｋｂｐ断片
と連結し、大腸菌Ｅ、ｃｏｌ　１２９４株を形質転換し
、カナマイシン抵抗性（５０μｓ／ｍ　］　）の形質転
換体を得た。これらの形質転換体よりブラズミドＤＮＡ
を調製し、制限酵素開裂パターンの分析を行って図面３
に示されるような発現ベクターｐｓＭ’２２１　、　ｐ
ｓＭ２２２を含む形質転換体を選びだした。

光里紙換え体■作成 ブラズミドｐｓＭ２２１５μｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣＬ、１ｍＭ　
ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＮａＣＩ及び３６単位の制限酵素
Ｂａ用旧を含む３０μｌの反応液中で３７゛ｃ、４時間
インキュベートした後、フェノール抽出。

エタノール沈殿を行った。

次にこのＤＮＡを１％　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ８，
０及び１゜５単位のアルカリ性フォフアスターゼを含む
５０μｌの反応液中で６５℃、１時間インキューベー）
した後フェノール抽出、エタノール沈殿を行った。

ブラズミドｐＰＬＨＬ−２７６μｇを１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　１ｍ
Ｍ　ＤＴＴ、　５０ｍＭ　ＮａＣ１及び１５０単位の制
限酵素５ａｕ３ＡＩを含む５００μｌの反応液中で３７
°Ｃ１１２時間インキユヘートした後５ｚポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、４３９ｂｐのヒトリゾチー
ム遺伝子を回収した。

上記ｐｓＭ２２１０．５μｇ及びヒトリゾチーム遺伝予
約０．１ｔｔｇを２０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ
７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、５
ｍＭ　ＡＴＰ及び５単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを含む
２０ｐβの反応液中１６°Ｃ１１２時間インキュベート
して連結させた。

次にこの反応液を用いて、大腸菌Ｅ　、ｃｏｌｉ２９４
株を形質転換し、カナマイシン抵抗性（５０ｐｇ　／ｍ
ｌ）の形質転換体を得た。

これらの形質転換体よりブラズミドＤＮＡを調製し、制
限酵素開裂パターンの分析を行って図面３に示される様
なヒトリゾチーム遺伝子がλＰＬプロモーターと同一方
向に挿入された組換えプラズミドｐＬＹ−１４を含む形
質転換体を選びだした。この形質転換体をＥ、ｃｏｌｉ
　２９４（ｐＬＹ−１４）と命名した。

プラズミドｐｓＭ２２２　、　ｐｓＭ２３１　、　ｐｓ
Ｍ２３２を用いて、上記と同様にして、そのＢａｍＨ１
部位にヒトリゾチーム遺伝子を挿入し、Ｅ、ｃｏｌｉ　
２９４株を形質転換した。得られたクロラムフェニコー
ル抵抗性（ＰＳＭ２２２の場合はカナマイシン抵抗性）
の形質転換体よりプラズミドＤＮＡを調製し、制限酵素
開裂パターンの解析を行って、ヒトリゾチーム遺伝子が
λＰＬプロモーターと同一方向に挿入された組換えプラ
ズミドを選びだした。この形質転換体をそれぞれＥ、ｃ
ｏｌｔ　２９４（ｐＬＹ−１５）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　２
９４（ｐＬＹ−１６）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（ｐＬ
Ｙ−１７）と命名した。

−九ズｌ：展づ１１里 Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（ｐＬＹ−１４）を５ｍＡの修
正し培地（１０ｇ／ｌポリペプトン、５ｇ／ｌイースト
エキストラクト、５　ｇ＃！ＮａＣｌ、　５０ｍｇ／　
ｉカナマイシン）に接種し、３０℃で一夜培養した。培
養液１　ｍｌを新たな上記培地１００ｍ　ｌに加え、３
０℃で１〜６時間培養した後、４２℃で誘導し、さらに
２〜１０時間培養を継続した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（ｐＬＹ−１５）、Ｅ、　ｃｏ
ｌｔ　２９４（ｐＬＹ−１６）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９
４（ｐＬＹ−１７）に関しても上記と同様にして培養し
た（Ｅ、ｃｏｌｉ　２９４（ｐＬＹ−１６）、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　２９４　（ｐＬＹ−１７）に関しては、培地に２
５ｍｇ／Ｉ！クロラムフェニコールを加える）。　各々
については、適当時間培養した後、１．５ｍＡ！培養液
をとり菌体を遠心分離した。

一九ズｌニメ弓（社）【髪 大腸菌２９４　（ＰＰＬＨＬＹ−２）株及び大腸菌２９
４（ｐＰＬＨＬＹ−１）株で発現されたリゾチームの検
出、定量はウェスタンブロッティングを用いたラジオイ
ムノアッセイ法で１２！ｉｉ−プロティン−Ａにより定
量した。

大腸菌２９４　（ＰＰＬＨＬＹ−２）株及び大腸菌２９
４（ｐＰＬＨＬＹ−１）株を１００ｍｊ！修正り培地（
１０ｇ＃！ポリペプトン、５　ｇ／　１２　　イースト
エキストラクト、５ｇ／ｌ　　ＮａＣ１，５０ｍｇ／ｊ
！　　７ンピシリン）で３０℃で振盪培養し、０Ｄ６６
゜０．２に達した時点から２時間ごとに１．５＋ｎｊ！
培養液をサンプリングした。

集めた菌体は以下の方法により定量した。まず培養液１
．５＋＋＋１の菌体を３種の異なる量の標品のリゾチー
ムとともにＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ　、
　Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８０　（１９７０））に従っ
て１７１０量を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離した。　次にトランスファーバッフ
ｙ−，（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８
，３，１５％ＭｅＯＨ，０，１％５ＤＳ）中ゲルのタン
パク質をニトロセルロース膜（Ｓ＆５ＢＡ８５）上に電
気泳動的に移行させたく４℃、３０　Ｖ、　　１２時間
）。ニトロセルロース膜は、２％ＢＳＡ　（ウシ血清ア
ルブミン）を含むＰＢＳバッファー（リン酸緩衝溶液）
中３７℃、１時間反応し、蛋白の吸着していない部分を
ブロックした後、０．０５％’ｌ’ｗｅｅｎ２０．　　
リゾチーム抗体（ミドリ十字製）を加え３７℃、３時間
反応した。

ＰＢＳＴ　（０，０５％７’ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
）で洗浄後、２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（５０ｍＭ）リ
スバッフ７−ｐＨ８，０，０，９％ＮａＣ１，０，０５
％Ｔｗｅｅｎ２０）中、＋ｚｓｌ−プロテインＡ　１０
μＣｉ　（アマ−ジャム社製）と３７°Ｃ１７０分反応
した。　　ＴＢＳＴで洗浄後、オートラジオグラフィー
を行い、１４．７　Ｋダルトンに相当するバンドを切取
りγ−カウンターにより放射能量を測定した。　大腸菌
由来のリゾチームは３種の異なる量の標品のリゾチーム
により作成した検量線を基準にして定量した。この方法
により大腸菌中のりゾチームを経時変化をおって定量し
たのが図５である。ｐＰＬＨＬＹ”ｌでは６時間後に３
５　μｇ　／　ｍ　１２　ｃｕｌｔｕｒｅの発現量がみ
られたのに対し、ｐＰＬＨＬＹ−２の場合は８時間後に
最高６８μｇ／　ｍ　１　ｃｕｌｔｕｒｅの発現がみら
れた。

大腸菌２９４　（ｐＰＬ）ＩＬＹ−２）株及び大腸菌２
９４（ｐＬＹ−１４）　、大腸菌２９４（ρＬＹ−１５
）　、大腸菌２９４（ｐＬＹ−１６）、大腸菌２９４（
ρＬＹ−１７）株で発現されたリゾチームの検出、定量
は、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる分離後、コマジ−ブリリアントブルーＲ−２５０に
よる発色をデンシトメーターで測定することにより行っ
た。

まず、培養液１．５ｍＡ菌体を３種の異なる量の標品の
リゾチームとともにＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍ
ｌｉＮａｔｕｒｅ　２２７６８０（１９７０））に従っ
て１／１０世を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離した。次の染色液（１０％酢酸、２
５％イソプロピルアルコール０．０２５％、コマジ−ブ
リリアントブルーＲ−２５０）中、３７℃３時間振とう
した後、脱色液（２０％メタノール、１０％酢酸）で数
回脱色し、ヒトリゾチームの量をコンピユーテイングデ
ンシトメーターＡＣＤ−１８型（アト−株式会社製）で
定量した。

結果の一例をあげれば下記の通りである。

Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（ｐＬＹ−１４）　　０．２６　　
６　　７．６％Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（ｐＬＹ−１５）　
　０．２６　　６　　６．０％Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（Ｐ
ＬＹ−１６）　　　０．２６　　　６　　　５．１　　
％Ｅ、ｃｏ１ｉ２９４（ｐＬＹ−１７）　　　０．２６
　　　６　　　４．８　％Ｅ、ｃｏｌｉ２９４（ｐＰＬ
ＨＬＹ−２）　０．２６　　　６　　　３．５　％発明
の効果 ｐＰＬＨＬＹ−２とｐＰＬＨＬＹ−１ではヒトリゾチー
ム遺伝子のＳＤ配列よりＡＴＧコドンまでの塩基配列の
み異なるためヒトリゾチームの発現はこの合成りＮＡに
由来する領域に依存していることは明らかである。

又、Ｅ、ｃｏｌｉ２９４（ｐＰＬＨＬＹ−２）　　とＥ
、ｃｏｌ　１２９４（ｐＬＹ−１４）　、　Ｅ、ｃｏｌ
　１２９４　（ｐＬＹ−１５）　、　Ｅ、　ｃｏｌ　１
２９４　（ｐＬＹ−１６）　、　Ｅ、ｃ。

！１２９４（ｐＬＹ−１７）では、発現ベクターのみ異
なるため、ヒトリゾチームの発現の差は各々のプラスミ
ドであるｐｓＭ２２１．ｐｓＭ２２２．ρ５Ｍ２３１．
ρ５Ｍ２３２の差に依存するものである。

【図面の簡単な説明】

図面１は、ヒトリゾチーム遺伝子を含む組換えプラスミ
ドρＰＬＨＬＹ−１（特開昭６１−７８３８３或いは特
開昭６１−７８３８７に記載）を合成フラグメントを用
い５Ｄ−ＡＴＧ領域を改変したヒトリゾチーム遺伝子の
発現ベクターρＭＹ　１２−６　Ａｍｐ−１へのクロー
ニングを示したものである。 図面２は熱によって増幅可能な発現用ベクターｐＳＭ２
３１，２３２及び発現用組換えプラスミドρＬＹ−１６
，１７の作成法を示したものである。 図面３は熱によって増幅可能な発現用ベクターｐｓＭ２
２１，２２２及び発現用組換えプラスミドｐＬＹ−１４
，１５の作成法を示したものである。 図面４は、ｐＰＬＨＬＹ−２に挿入されているヒトリゾ
チーム遺伝子の塩基配列および制限酵素認識部位を示し
たものである。 図面５は、大腸菌２９４　（ｐＰＬＨＬＹ−２）株、大
腸菌２９４（ｐＰＬＨＬＹ−１）株によるヒトリゾチー
ム発現量を示したものである。 図面の浄書（内容に変更なし） 図面５ ヒトリゾチームの発現 時間 図面２ 図面の浄書（内容；：変更なし） ＞　　刀 Ａ’７＾− 図面３ 図面の浄１１Ｆ（内容に変更なし） 手続補正書（方式） 昭和６１年１１月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）転写体ｍＲＮＡの二次構造において、ライボゾーム
   結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素結合
   を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒトリゾ
   チーム翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片 ５′端ＣＧＴＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴ￥Ａ
   ＧＧＡＧＧ￥ＧＴＴＴＴＴＡＡ￥ＡＴＧ￥ＡＡＡＧＴＴ
   ＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴ３′端 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
   コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
   ードするＤＮＡ配列の一部を表す。 下線を付したＡＧＧＡＧＧはライボゾーム結合部位を表
   す） を５′端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞
   中で熱によって増幅可能であって、温度で誘導可能であ
   り、かつヒトリゾチームを発現することを特徴とする組
   み換えプラズミド ２）ヒトリゾチーム遺伝子が下記のヌクレオチド配列で
   表される構造遺伝子を含むヒトリゾチーム遺伝子である
   特許請求の範囲第１項記載の組み換えプラズミド 【遺伝子配列があります】 ３）ヒトリゾチーム遺伝子が、構造遺伝子の３′端に２
   個の翻訳終止信号ＴＡＡＴＧＡを有するヒトリゾチーム
   遺伝子である特許請求の範囲第２項記載の組み換えプラ
   ズミド ４）プラズミドベクターとしてλファージのＰ＿Ｌプロ
   モーターを用いた特許請求の範囲第１項記載の組み換え
   プラズミド ５）プラズミドベクターがｐＳＭ２２１、ｐＳＭ２２２
   、ｐＳＭ２３１或いはｐＳＭ２３２である特許請求の範
   囲第１項記載の組み換えプラズミド ６）ｐＬＹ−１４、ｐＬＹ−１５、ｐＬＹ−１６もしく
   はｐＬＹ−１７として特定される特許請求の範囲第１項
   記載の組換えプラズミド ７）プラズミドベクターｐＳＭ２２１、ｐＳＭ２２２、
   ｐＳＭ２３１或いはｐＳＭ２３２ ８）転写体ｍＲＮＡの二次構造において、ライボゾーム
   結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素結合
   を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒトリゾ
   チーム翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片 ５′端ＣＧＴＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴ￥Ａ
   ＧＧＡＧＧ￥ＧＴＴＴＴＴＡＡ￥ＡＴＧ￥ＡＡＡＧＴＴ
   ＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴ３′端 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
   コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
   ードするＤＮＡ配列の一部を表す。 下線を付したＡＧＧＡＧＧはライボゾーム結合部位を表
   す） を５′端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞
   中で熱によって増幅可能であって、温度で誘導可能であ
   り、かつヒトリゾチームを発現することを特徴とする組
   み換えプラズミドを保持する微生物 ９）大腸菌に属することを特徴とする特許請求の範囲第
   ８項記載の微生物 １０）Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ｐＬＹ−１４）、Ｅ．ｃｏ
   ｌｉ２９４（ｐＬＹ−１５）、Ｅ．ｃｏ１ｉ２９４（ｐ
   ＬＹ−１６）、もしくはＥ．ｃｏｌｉ２９４（ｐＬＹ−
   １７）として特定される特許請求の範囲第８項記載の微
   生物