JPS635079B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［技術分野］ 本発明は微生物による効率的なエタノールの製
造法に関するものである。 ［従来技術］ 従来、実用化されている微生物によるエタノー
ルの製造法はエネルギー変換法としてみた場合、
必ずしもエネルギー収支が良好とは言えず、また
単位発酵槽容積あたりの生産性も高くない。この
ため、近年、生産性の向上及び生産コストの低減
を目的として新しい発酵技術の開発が進められ、
アルギン酸カルシウム、光硬化性ポリマーなどに
酵母を包括固定し連続発酵に用いる固定化酵母法
と凝集性を有する酵母を用い菌体を自然沈降させ
発酵槽に再循環或いは次の発酵に使用する凝集性
酵母法が高い生産性を与え且つ生産コストを大巾
に低下させる方法として注目を集めている。特に
凝集性酵母を用いる方法は既設の施設がそのまま
使える点また操作も容易である点から実用性の高
い方法として注目されている。 しかしながらケーンジユース等の実用原料を用
いたこれまでの報告によれば、その生産性は10〜
16ｇ／／ｈであり、固定化酵母法による生産性
と同等かやや低いものであつた。 ［目的］ そこで、本発明者らは、エタノール発酵の生産
性向上には基本的に、優良酵母菌の選択が重要で
あるとの観点から、広く、海外及び国内の土壌、
果皮、発酵食品等よりエタノール発酵能の優れた
酵母の分離を進めるとともに得られた酵母菌の各
種変異処理により、なお優秀な酵母の分離、選択
を進めてきたところ、既知の凝集酵母に較べ高い
発酵能を有する凝集性菌株を得ることができた。
そして、本酵母菌株を用いて菌体再循環連続エタ
ノール発酵を試みたところ、従来報告されていた
サツカロマイセス属などの凝集酵母を用いる連続
発酵に較べて２ないし３倍の生産性の得られるこ
とを見出した。本発明は以上の知見に基づき開発
されたものである。 すなわち、本発明は新たに発酵食品から分離さ
れたサツカロマイセス・セルビシエ IR−２株
を培養して培養物よりエタノールを採取すること
を特徴とする微生物によるエタノールの製造法に
関するものである。 ［構成］ 以下、本発明を具体的に説明する。 本発明に用いられるサツカロマイセス・セルビ
シエ IR−２株の菌学的性質は以下に示すとお
りである。 菌学的性質 Ａ 細胞及びコロニーの形態 グルコース（２％）イーストエキス（0.5％）
ペプトン（１％）の液体培地で25℃３日間培養
後の細胞の形態は惰円〜長円形で細胞径は長径
が4.0〜9.0μｍ、短径が3.0〜5.0μｍであつた。
細胞は１個または２個つらなつて存在した。 バクトイーストモルフオロジー寒天培地上で
４日間及び３週間培養後のコロニーは黄白色、
表面及び周囲の滑らかな状態にあつた。また同
じ培地上でのスライトカルチヤー３週間後の顕
微鏡観察の結果、菌糸及び偽菌糸の形成は認め
られなかつた。Fowell酢酸ナトリウム培地上
で３日後子のう胞子の形成が観察された。子の
う中の胞子数は１〜４個であり胞子はほぼ球形
でありまたその表面は滑らかであつた。 Ｂ 生理的諸性質 (a) 各種炭素源の発酵性（ダーラム管法によ
る） 発酵可能糖類：Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラク
トース、マルトース、シユークロース、ラ
フイノース1/3 非発酵性糖類：α−α−トレハロース、メリ
ビオース、ラクトース、セロビオース、メ
レジトース、メチル−α−Ｄ−グルコシ
ド、イヌリン、可溶性でんぷん (b) 各種炭素源の資化性 資化可能化合物：Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラ
クトース、シユークロース、マルトース、
ラフイノース、エタノール 資化不能化合物：Ｌ−ソルボース、セロビオ
ース、α−α−トレハロース、ラクトー
ス、メリビオース、メレジトース、Ｄ−リ
ボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、
可溶性でんぷん、イヌリン、グリセロー
ル、エリスリトール、リビトール、Ｄ−グ
ルシトール、Ｄ−マニトール、乳酸、コハ
ク酸、クエン酸 (c) 窒素源資化性テスト 資化不能化合物：硝酸カリウム、亜硝酸ナト
リウム、一塩酸エチルアミン、二塩酸カダ
ベリン、Ｌ−リジン (d) アルブチン分解性 陰性 (e) ビタミン不含培地での生育 陰性 (f) 高温での生育 37℃ 陽性 42℃ 陽性 (g) 50％グルコース イーストエキス 寒天培
地上での生育 陰性 (h) 100ppmシクロヘキシミド培地での生育
陰性 以上の菌学的性質に基づき、The yeasts ａ
taxonomic study 第３版（1984.Elsevier
Science Publishers B.V.−Amsterdam）及びJ.
A.Barnett、R.W.Payne＆D.Yarrow著
YEASTS：Characteristics and Identification
第１版（1983 Cambridge University Press）
により検索したところ、本菌株はサツカロマイセ
ス・セルビシエと認められ、サツカロマイセス・
セルビシエ IR−２株と命名し、微工研条寄第
754号として寄託されている。 本発明に発酵原料として好ましく用いられる炭
水化物としては砂糖きび汁（ケーンジユース）、
廃糖蜜、でんぷん糖化液、セルロース糖化液が挙
げられるが、でんぷん質原料を用いる場合まずア
ミラーゼなどの酵素で糖化した後、本発明の発酵
を添加してもよいが、原料に本発明の酵母とアミ
ラーゼなどの酵素を同時に添加して発酵させても
よい。 また、栄養源としてはリン酸−カリウム、硫酸
マグネシウム等の無機塩類、及びイーストエキ
ス、ポリペプトンなどの有機栄養源を添加しても
よい。 窒素源としては硫安、尿素などの添加が望まし
い。 培養温度は15℃から42℃の範囲で望ましくは28
℃から35℃の範囲で行なう。培養液のPHは、2.5
から7.0の範囲で、望ましくは3.5から6.0の間で行
なう。 これらの培養源を用いたエタノール発酵は通常
の発酵槽による回分発酵及び連続発酵でもよく、
また後述の如き塔型の発酵槽を用いてもよい。回
分法においては、発酵の終了後短時間ただ静置す
るだけで容易に本酵母は沈殿し、密度の高いスラ
リーを形成するため短時間で清澄な発酵液を得る
ことができ、また発酵槽底部に濃厚な酵母スラリ
ーを得ることができる。従つて、上層発酵液をぬ
きとき、原料液を加えた後、直ちに高い濃度の酵
母菌体により次の発酵工程に入ることができる。
こうした回分発酵をくり返すことで菌体濃度も増
大するため、単位時間、単位発酵槽容量あたりの
エタノール発酵速度が飛躍的に高くなる。また酵
母の沈降分離に遠心分離等の余分な工程がいらな
いため、エネルギーの節約にもなる。また連続発
酵法においては酵母の凝集沈降性が優れているの
で、小型で簡単な沈降槽により容易に発酵液より
菌を分離することができ、これを連続的に発酵槽
へ返送することで、高い菌体濃度が維持されるた
め、高いアルコール生産性が得られる。 ここで参考のため本酵母の凝集状態における発
酵能を他の酵母のそれと比較した結果を表１に示
す。 これは回分発酵終了時になお少量の培地を加
え、エタノール発酵に伴ない生成する炭酸カス量
を計測して求めたものである。発酵能は単位菌体
量あたりに換算し、相対値で示した。凝集能は、
発酵終了液をよく振とうした後メスシリンダーへ
移し、１分後の菌の沈殿層の高さを容量百分率で
示したものである。この値の小さい程、凝集性が
よく、沈降速度が速いことになる。

【表】 上表より、本IR−２株が発酵能、凝集能の両
特性に優れていることが示される。 以下に本菌体IR−２を用いたエタノール発酵
の実施例を示し、本発明をより具体的に説明す
る。なお実施例で用いた各種の測定法は次のとお
りである。 (1) エタノール濃度 発酵液を20000G5分間冷却遠心機にて遠心分
離後、上清を蒸留水にて100倍に希釈し、ガス
クロマトグラフイーにより測定した。使用カラ
ムは長さ2.1ｍで内径３mmのガラス製であり、
ポリエチレングリコール6000をコーテイングし
たユニポートＲ（ガスクロ工業社製）を充てん
し用いた。カラム温度は100℃、試料注入部温
度140℃、キヤリアガスは窒素ガスを用い、50
ml／minで通気した。 (2) 糖濃度 発酵液を(1)と同様に遠心分離した上清を10％
HClによりPH2.0以下とし、30分間湯浴上で加
水分解した後一般に用いられているソモギー変
法により測定した。 (3) フラクトース濃度 高速液体クロマトグラフイーにより測定し
た。使用カラムは、SIL−NH₂（日本分光社製）
をつめた長さ250mm内径4.6mmのステンレスカラ
ムで温度は50℃に保つた。溶離液は、アセトン
トリル（75％）＋0.015M KH₂PO₄（25％）を用
い、1.0ml／minで通液した。 (4) 菌体濃度 発酵液を目盛つき遠心分離用チユーブにと
り、3500rpmで10分間遠心分離後の沈殿層の容
積を測定し、湿潤容量百分率で表わした。また
実施例にあたつてはケーンジユースのモデル培
地として台湾産非精製糖の溶解液を用いた。 実施例 １ 図１に示す第１塔１第２塔２及び沈降槽３より
なる二連塔型発酵システムを用い、菌体再循環連
続エタノール発酵を行なつた。第１塔及び第２塔
の実効容積はそれぞれ225mlであり、沈降槽の実
効容積は25mlであつた。用いた培地組成は、１
容あたり台湾紅糖（非精製糖）140ｇ（塩酸加水
分解後の単糖濃度として125ｇ）、リン酸−カリウ
ム0.2ｇ、硫酸マグネシウム７水塩0.1ｇ、塩化カ
ルシウム２水塩0.1ｇ、硫安1.5ｇであつた。オー
トクレーブで120℃15分間滅菌処理した本培地を
培地ボトル４より培地ポンプ５により連続的に第
１塔１に供給した。第１塔上部にPHセンター１０
を取付け、PH制御器１１とアルカリ液供給ポンプ
１２により自動的に第１塔内の培養液PHを3.9に
制御した。発酵槽内温度は塔の外側ジヤケツトに
温水を通水して32.5℃に制御した。 本システムにあらかじめグルコース10％、イー
ストエキス３％、ポリペプトン５％の培地で培養
したサツカロミセスセルビシエ IR−２株
（FERM BR−754号）を乾燥菌体量として50
ｇ／加えた後284ml／時の流量で上記台湾紅糖
の培地を供給させながら連続発酵を行なつた。連
続発酵開始後、第１塔下部よりエアポンプ９によ
り空気を80ml／分でまた第２塔２上部より出るガ
ス（主としてエタノール発酵に伴ない生成する炭
酸ガス）の一部を300ml／分でガスリサイクルポ
ンプ８により通気した。第１塔１中の培養液は通
気されたガスとともに第２塔下部へ連続的に流入
する。第２塔２上部でガスと分離した発酵液は沈
降槽３に流入し、ここで酵母は直ちに沈降し底部
に高濃度の菌体スラリーを形成する。上層に形成
された清澄な発酵終了液は発酵液抜出しポンプ６
により排出され次の蒸留工程（本図には示されて
いない）に移送される。沈降槽３下部にたまつた
高濃度の酵母菌体スラリーは菌体返送ポンプ７に
より第１塔下部へ返送される。こうした方法によ
り約２週間にわたり安定してエタノール濃度54.6
ｇ／、残糖4.3ｇ／（うち発酵性残糖フラク
トース2.1ｇ／）という結果が得られた。この
ときの発酵槽単位容積当りの生産速度は34.6ｇ／
／ｈであり、エタノール収率は理論値の約90％
であつた。また菌体の湿潤容量百分率は33％に達
していた。なお菌体の返送速度は約２／時で行
なつた。これは返送比（返送速度／培地供給速
度）約７の条件であつた。 実施例 ２ 実施例１と同様の装置を用い、また同様の方法
でサツカロマイセスセルビシエ IR−２株を培
養し、培地中の紅糖濃度をかえて、連続エタノー
ル発酵を行なつた。実施例１の結果を含めて表２
に結果を示す。培地供給速度は各条件において、
糖の利用率が98％以上となる範囲で可能な限り高
い値に設定した。また菌体返送比は、各条件毎に
検討し、より高い生産性が得られるよう設定し
た。なお、他のPH、温度等は実施例１と同じであ
る。

【表】 ＊ （ ）内は発酵性糖濃度を示す。
＊＊ 資化性糖としては最終的にはフラクトースの
みが残る。
以上の結果を他の酵母を使用し、類似した手法
及び培地を用いた他の文献例と比較すると２〜３
培の生産性に相当することがわかる。例えばケー
ンジユースを用いた例（Princeら：
Biotechnology letter誌 Vol.4 P.469〜）では
約71ｇ／のエタノールを生産性11ｇ／／ｈ
で、また約82ｇ／のエタノールを約８ｇ／／
ｈで生産しており、ビートジユースを用いた例
（Ramirezら：Biotechnology letter誌 Vol.5
P.650〜）では57.2ｇ／のエタノールを生産性
15.2ｇ／／ｈで生産している。 また前記のサツカロマイセスセルビシエ
IFO2018を用い同様の条件で菌体リサイクル連続
発酵を試みたところ、約62ｇ／のエタノールを
生産19ｇ／／ｈで生産した。 またアルギン酸カルシウムおよび光硬化性ポリ
マーに酵母を固定化し連続エタノール発酵に用い
た例（新燃料油開発技術研究組合昭和59年度公開
年報 P.132、133、145）と比較してもIR−２株
で得られた表２に示す生産性は1.5倍以上である。 また他の例（Limtongら：Journal of
Fermentation Technology、Vol.62 P.55−62）
ではイーストエキス６ｇ／、リン酸−カリウム
８ｇ／、硫酸マグネシウム７水塩２ｇ／、硫
安４ｇ／を含むグルコース合成培地（グルコー
ス濃度150ｇ／）を用い、彼らの分離したサツ
カロミセス・セルビシエTJ1株を使用した菌体リ
サイクル連続発酵により67.8ｇ／のエタノール
を生産性20ｇ／／ｈで生産している。（同文献
P.58）この結果を本実施例２のTS／51ｇ／の
結果（67.7ｇ／のエタノールを28.6ｇ／／ｈ
で生産している。）と比較すると、本実施例の培
地にはイーストエキスを含まず、他の塩類濃度も
低く低栄養であるにもかかわらずLimtongらの値
を約40％以上上回つていることがわかる。 以上の結果から本酵母菌株IR−２を用いるエ
タノール発酵の生産性が従来優れた生産性を与え
ると報告された他の例を大幅に上回るものである
ことが示される。 実施例 ３ IR−２菌株を用い回分発酵のくり返し実験を
行なつた。培地は台湾紅糖202ｇ／（塩酸分解
後の全糖濃度181ｇ／、このうち発酵性糖濃度
177ｇ／）、リン酸１カリウム0.2ｇ／、硫酸
マグネシウム７水塩0.1ｇ／、塩化カルシウム
２水塩0.1ｇ／を含むものを用いた。培地は120
℃15分間の加圧滅菌後用いた。窒素源としては後
述するように尿素を１ｇ／別に発酵開始時に加
えた。実験には三角フラスコを用い、マグネチツ
クスターラー上で連続的に撹拌しつつ行ない生成
する炭酸ガスをガスホルダーに補集することによ
り発酵経過を追つた。あらかじめサツカロマイセ
スセルビシエ IR−２株をグルコース（10％）
イーストエキス（0.3％）、ポリペプトン（0.5％）
の培地で前培養した後、三角フラスコに接種し培
養を開始した。発酵終了後20分間撹拌を停止し酵
母を凝集沈降させた後、上層の発酵液を全液量の
３／４ぬきとり、同量の新鮮培地を添加しまた尿素
を１ｇ／添加した後、撹拌を開始し、次の回分
発酵を行なつた。こうしたくり返し回分発酵を10
回行なつた結果、１〜６回目までは酵母菌濃度が
増大し、発酵所用時間も短縮されていき、７回目
以降は酵母菌濃度は約湿潤容量百分率で13％と一
定となり発酵所用時間は約５時間となつた。最終
エタノール濃度は82〜83ｇ／に達しており、沈
降分離時間20分間を入れて計算した発酵槽内全液
量当りのエタノール生産性は、約11.5ｇ／／ｈ
に達した。この値は現在広くブラジル国でケーン
ジユースや廃糖みつの発酵に採用されている菌体
再利用くり返し回分発酵法であるMelle−Boinot
法（メルボノ法）の生産性に較べ約３倍に相当す
るものである。メルボノ法では発酵液を遠心分離
し、菌体を再利用している。即ち、本IR−２菌
株を用いるくり返し回分法は、短時間、発酵終了
液を静置するだけで菌体の分離が行なえるため、
遠心分離工程が不要であり、設備コスト及びエネ
ルギー消費が大幅に低減できるだけではなく高い
生産性が得られるため発酵槽をより小型化するこ
とが可能であり、省エネルギー省コストのすぐれ
た方法であるといえる。 ［発明の効果］ 本発明方法は、エタノールの生産性が極めて高
いため、工業的に実施する場合、生産コストを大
巾に低減することが可能である。

【図面の簡単な説明】

図はエタノールの連続発酵装置のフロシートを
示し、図中の１は第１塔、２は第２塔、３は沈降
槽、４は培地ボトル、５は培地ポンプ、６は発酵
液抜出しポンプ、７は菌体返送ポンプ、８はガス
リサイクルポンプ、９はエアーポンプ、１０はPH
センサー、１１はPH制御器、１２はアルカリ液供
給ポンプをそれぞれ示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ サツカロマイセス属セルビシエ IR−２株
   を培養して培養物よりエタノールを採取すること
   を特徴とする微生物によるエタノールの製造法。