JPS63503061A - アデノシンの放出を増加させる薬物を含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノシンの放出を増加する方法 本出願は出願番号Ｎｏ、６４６，７８５の継続出願である。

産業上の利用分野 本発明は、様々な疾患の治療方法であって、アデノシンの細胞外濃度を好都合に 増加させる方法に関するものである。

発明の背景 本発明は、政府の支持を受け、基金Ｎｏ、　ＡＭ　−１３６２２；ＲＲ−００８ ２７；およびＨＬ−１７６８２の下、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉ　 ｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）およびカリフォルニア大学によって なされたものである。この発明には、政府もいくらかの権利を有している。

アデノシンは、プリンヌクレオシドと称する生化学物質類に属しており、フォッ クスおよびケリー（Ｆｏｘ　ａｎｄ　ＫｅｌｌｙＸアニュアル・レビュース・オ ブ・バイオケミストリー、４７巻、ｐ６３５．１９７８）の記載の如く重要な生 化学的細胞調節分子であって、広範囲に及ぶ様々なタイプの細胞と相互作用し、 数えきれない生物学的作用に関与している。例えば、アデノシンは、強力な血管 拡張剤、免疫細胞機能阻害剤、マストセル（肥満細胞）の脱顆粒活性化剤、顆粒 球活性化阻害剤であり、さらに、神経伝達物質阻害剤であると推定されている。

アデノシンの広範囲に及ぶ生物学的作用に鑑みて、該分子およびその同族体を用 いた実用的な治療方法を確立することを目的とする多くの研究が既になされ、ま た継続されている。

アデノシンまたは同様のプリンヌクレオシドは、細胞の厚形質膜に固定された受 容体（レセプター）と結合することによって、細胞の原形質膜レベルで作用する と考えられていたので、これまでの仕事はもっばら該分子の細胞外濃度を高める ことに向けられていた。不幸なことに、アデノシンまｔ；はその同族体は、細胞 外濃度を有効な治療レベルに維持するために投与すべき濃度では患者にとって存 置であるために、アデノシン単独投与の治療上の有用性はほとんど無かった。従 って、アデノシンの局所的な細胞外レベルを高濃度に維持するｔ；めの別の方法 がめられていた。最もよく用いられる３つの方法は次の通りである。ａ　）パダ ーリンら（Ｐ　ａｔｅｒｓｏｎ）（アンナルス・オプ・ザ・ニューヨーク・アカ デミ−・オブ・サイエンス、２５５巻、ｐ４０２．１９７５）の記載の如く、ア デノシンの輸送を特異的に遮断する試薬を用いてアデノシンの取り込み（吸収） を阻止する。ｂ）カーソンおよびシーブミラー（Ｃａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｓｅｅ ｇｍｉｌｌａｒ）（ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーショ ン、５７巻、ｐ２７４、ｌ　９７６）の記載の如く、アデノシンの代謝を阻害し 、それにより、アデノシンを細胞外に輸送し、細胞外で使用すべく、細胞がアデ ノシンを利用し得るようにする。Ｃ）アデノシンの細胞原形質膜受容体と、アデ ノシンよりも低い解離定数で結合するように組み立てたアデノシン同族体を用い る。

細胞のアデノシンの取り込みを阻害する多種類の化学物質が存在している。ある ものは特異的に作用し、寅買上アデノシンの取り込みを競合的に阻害するが、他 は、非特異的に阻害する。テオフイリンは競合的な阻害物質であると思われるが 、ジピリダモール、およびコルヒチン、フェネチルアルコールおよヒハハヘリン 等の他の化学物質は取り込みを非特異的に阻害する。

アデノシンの代謝を変更してアデノシンの細胞外濃度を増加させる方法は、主と して、アデノシンの酵素分解を阻害する化学物質の使用に基づくものである。こ の研究の大多数はアデノシンをイノシンに変換するアデノシンデアミナーゼの阻 害物質の同定に向けられていｌ；。アデノシンデアミナーゼは、コフオーマイン ン、２′−デオキ・ンコーフオーマイシンまにはエリスロ９−（２−ヒドロキシ −３−ノニル）アデニン塩酸塩によって阻害される。

プリン環の構造上の修飾、プリン環に結合している置換基の変更、炭水化約分の 結合位置に対する修飾または結合位置における変更で表される多くのアデノシン 同族体が生成された。／・ロゲン化アデノシン誘導体は最も有望のように思われ 、ウオル７ら（ＷｏｌｆｆＸジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスｔ・リ ー、２５２巻、ｐ６８Ｌ　１９７７）の記載の如く、これらはアデノシンがもた らすと同様の生物学的作用を表す。

上記３方法は全てアデノシンそのものの使用よりも好都合であるが、それらには 幾つかの欠点がある。その重要なものは、これらの方法が、主として、毒性を示 す程の濃度で投与されねばならず、しかも大部分の細胞を（セルタイプ）に非特 異的に影響を及ぼすために、治療にとって不利益な副作用を有する化学物質の使 用によっているということである。「ヒトにおけるプリン代謝」［ドウ・パイン 、シモンズ、およびムラ−（Ｄｅ　Ｂａｒｙｎ、　Ｓｉｍｍｏｎｄｓ％Ｍｕｌｌ ｅｒ）編、プレナムプレス、ニューヨーク、１９８４］に記載されているように 、体内の大多数の細胞はアデノシンの受容体を担っている。従って、アデノシン 濃度を高めるような方法の使用は、一般に、アデノシン治療による恩恵を被る疾 患のコントロールに加えて、全身を通して正常な細胞生理を劇的に変化させる結 果となる。

従って、上記の如く、複雑な副作用を伴わずにアデノシンまたはアデノシン同族 体の細胞外濃度を高める方法であって、アデノシン濃度の増大によって最も恩恵 を受ける細胞を選択的に標的とすべくアデノシン濃度を増大させる方法が、治療 上極めて有用であることは理解されるであろう。

発明の要約 本明細書には疾病を和らげるだめの新規な方法であって、プリンヌクレオシド、 特に非毒性のプリンヌクレオシド、５−アミノ−１−（β−Ｄ−リボフラノシル ）イミダゾール−４−カルボキサミド（ＡＩＣＡリポッシド）、並びに、ｌ−β −Ｄ−リボフラノシルー１．２゜４−トリアゾール−３−カルボキサミド（リバ ビリン）およびアロプリノール・リポッシド（あるいは、体内でリボシドに変換 されうるアロプリノール塩基）を用いてアデノシンまたはアデノシンの細胞外濃 度を増大する方法が記載されている。後者の化合物が患者に投与されると、細胞 に取り込まれ、モノおよび時にはトリホスフェートに変換される。アデノシンま たはイノシンは、発作活動時や血流減少時のような急速な細胞エネルギーの消費 の際に細胞内生化学反応によって、アゾンシントリホスフェートから生成される 。イノシンは、アデノ予ンよりもはるかに多く生成される（約１００：１）。

次いで、これらの化合物は細胞外に拡散し、細胞の直ぐ外側に高濃度で存在する ことになる。Ａ　Ｉ　ＣＡリボシドの如きプリンヌクレオシドはアデノシンの産 生を促進する。アデノシン放出の増大は、少なくとも部分的に５ヌクレオチダー ゼ活性の減少によっている。下記のダイアダラム（図表）から明らかなように、 ５′ヌクレオチダーゼ活性の減少時には、ＩＭＦは迅速にはイノシンに清掃され ず、より多くのヌクレオチドがＡＭＰに変換され、それが蓄積してアデノシンに 変換される。ＡＭＰ（１ｍＭ）のに＋ｎはＩＭＦ（１ｍＭ）のそれの約１０倍で ある。アデノシン濃度は患者全体としては有意に変化せず、また、変化は迅速に ＡＭＰが消費される領域でのみ起きることから、この治療方法は、全身的なアデ ノシンの放出を引き起こさないといえる。

ダイアグラム　ｌ ダイアグラム１．アデノシンの代謝。このダイアグラムは、細胞でのアデノシン の生成および分解経路を示す図であφ。アデノシンはまた、細胞内に輸送され、 あるいは細胞から放出され得る。２′−デオキシアデノシンの代謝には、これら の経路のあるものが利用され得る。図中、■はＳ−アデノシルメチオニン　メチ ルトランスフェラーゼ、２はＳ−アデノシルホモシスティンン　ヒドロラーゼ、 ３はアデノジッド　デアミナーゼ、４はプリン　ヌクレオシド　ホス７オリラー ゼ、５および６はキサンチン　オキシダーゼ、７は輸送機構、８はアデノシン　 ホス７オリラーゼ、９はアデノシン　キナーゼ、ｌＯは５゛ヌクレオチダーゼお よび非特異的ホスファターゼ、１１はアデニレート　キナーゼ、１２はヌクレオ シド　ジホス７才キナーゼ、１３はアデニレート　シクラーゼを表す。

このように、プリンヌクレオシド、ＡＩＣＡリボシド、リバビリンおよびアロプ リノールは、細胞外アデノシン濃度を調節するための他の方法に付随する毒性や 非特異的な取り込みの問題を伴うことなく、細胞外で、アデノシンを局所的に高 濃度にするために医学上有益な手段を与えることが明らかとなった。

図面の簡単な説明 第１図は、５−アミノ−１，−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４− カルボキサミドの、リンパ球によるアデノシン放出に対するイン・ビトロ作用を 示しているグラフである。

笑２図は、イヌの冠状動脈を狭窄した時の局所心筋血流に対する、５−アミノ− １−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド（ＡＩＣＡ リボシド）のイン・ビポ作用を示しているグラフである。局所心筋血流は、放射 標識したミクロスフェア（小球）を狭窄後の５分目（白抜き）および６００分目 斜線）に左心房に注入して測定した。これは、平均値＋標準偏差を用いてグラフ 化している。

第３図は、冠状静脈のアデノシン濃度に対するＡＩＣＡリボシド処置の作用を示 したグラフである。冠状静脈血を、冠状動脈の狭窄の前後の様々な時間に等量の 冷却２Ｎ過塩素厳中に採取した。これらの抽出液から上溝を得、これをアラニン およびフレオン（Ｆｒｅｏｎ）を用いて中和し、高速液体クロマトグラフィーに よって測定した。

５匹の生理食塩水処理イヌ（ロ）８よび６匹のＡＩＣＡリボシド処理イヌ（・） に関する平均アデノシン濃度子／−標準偏差をグラフ化している。

第４図は、対照マストセルおよびリバビリン処理マストセルからのβ−へキソサ ミニダーゼ放出を示しているグラフである。３−７日間培地のみで培養するか（ ロ）、又は１０Ｍリバビリンの培地で培養した（口）マウス骨髄由来のマストセ ルを、カルシウム・イオノフオア（イオン透過担体）でチャレンジした。休止お よび刺激細胞からのβ−ヘキソサミニダーゼ放出を、同じ実験を７回行った実験 値の平均値＋／−標準誤差として表している。＊は対照細胞と有意差があること を表している（ｐ＜０．０５）。同様の結果が、抗−ＤＮＰ　ＩｇＥ感受性マス トセルのＤＮＰ−ＢＳＡ抗原刺激によっても得られｔ；。

第５図は、マストセルのβ−へキソサミニダーゼ放出に対するリバビリンの用量 −反応作用を示しているグラフである。マストセルを培地のみ（対照）、まＩ； は１１１０若しくは２０μＭリバビリンの培地で６日間培養し、洗浄してＡ２３ １８７でチャレンジ（ロ）し、正味のβ−へキソサミニダーゼ放出を定量した。

全ての濃度に於ける被検リバビリン処理細胞は、Ａ２３１８７で抗原投与しても β−へキソサミニダーゼを有意に少ない量しか放出しなかった。対照群とリバビ リン暴露細胞との間には、伝達物質量および自然放出に差はなかった。３つの実 験に於ける測定値の平均＋／−漂準誤差をグラフに表している。

第６図は、イノシン濃度に対する、生理食塩水中ＡＩＣＡリボシド（０）および 生理食塩水（ロ）に於ける効果を比較したものである。

発明の詳細な説明 アデノシンの輸送に対する、プリンヌクレオシド類のＡＩＣＡリボシドまたはリ バビリンの作用は、いずれかの分子の有効濃度が１０μＭ−１００μＭであるイ ンビトロまたはインビボのいずれかで説明することができる。インビトロに於い てＡＩＣＡリボシドまＩ；はリバビリンを細胞に運ぶ場合は、これらを水溶液に 溶解し、直接培養培地に加える。これらの分子を患者に適用するＩ；めには、プ リンヌクレオシドが体内の酵素若しくは胃内の低いｐＨによって容易に減成され ないことから最も頻繁に経口投与できるであろうと考えられる。この薬物が静脈 投与できず、または局所的な、直接的筋肉内注射若しくは吸入によっても投与で きないと考える優先的理由はない。

活性化エネルギー必要性の標的細胞と接触すると、プリンヌクレオシドＡＩＣＡ リボシドまたはりバビリンは、促進された拡散輸送系を経由して原形質膜によっ て細胞内輸送され、そこでこれらはアデノシン・キナーゼによりリン酸化されて プリンヌクレオチド・−リン酸になる。後者の化学物質は、改めて（ｄｅ　ｎｏ ｖｏ）プリンヌクレオシド類を合成する上での中間生成物、三リン酸塩にするこ とができる。

アデノシン量、更にＡＩＣＡリボシドまたはりバビリン剋理の有効性を調節する ため、細胞を浸している水性液を単離し、マツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）らに 開示されているクロマトグラフィー法［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ）、２５４巻、８９５６頁、１９７９］によって培地に存在して いるその量を定量することによって、増加される細胞外輸送の程度をモニターす る。組織培養実験に於いては、ｌ＋ｎＭのデオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙ ｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）を水性液に加え、アデノシンデアミナーゼによるアデノ シンの破壊を妨げる。更に、マツモトら［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ ル・ケミストリー２５４巻、　８９５６、＋９７９］に開示されているように、 細胞内に残るアデノシンを細胞から単離してその量を高圧液体カラムクロマトグ ラフィーによって分析する。

細胞外アデノシンの量は、細胞の増殖環境に存在するＡＩＣＡリボシドまたはリ バビリンの濃度を増減することによって調節することができるので、アデノシン 濃度が低すぎて医薬的に有用でない場合には、投与するＡＩＣＡリボシドまｔ； はリバビリンの量を増加すればアデノシン量を増加することができる。同様に、 アデノシン量が高すぎる場合は、そのプリンヌクレオシドの量を少なくすればそ れを減少させることができる。

ＡＩＣＡリボシドまたはリバビリンによる治療は、様々の疾病にかかった患者を 救うのではないかと考えられる。例えば、アレルギー特に喘息、枯草熱、慢性じ ん麻疹、色素じん麻疹および湿疹に罹患した個体は、プリンヌクレオシド治療を 施すことによってその恩恵を被ることを期待できる。テキストブック・オブ・イ ムノロジー（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に於いてベナセ ラ（Ｂ、Ｂｅｎａｃｅｒｒａ）およびウナニュー（Ａ、Ｕｎａｎｕｅ）が論じて いるように［ウィリアムス・アンド・ウィリアムス、ボルナモア／ロンドン、１ ９７９１、アレルギー反応を抑制するための重要事項は、マストセルによる薬学 的な活性物質の放出を妨げることである。マストセルは、ヒ・スタミンなどの物 質を含有する多くの顆粒を有する巨大な好塩基性染色細胞であり、このヒスタミ ンなどは、アレルギーの反応時にはマストセルによって遊離され、これらはアレ ルギー反応を支持する上で必要なものである。マストセルに存在するこれらの薬 学的な活性物質を、「脱顆粒」と名付ける。従って、脱顆粒反応を妨げる化学物 質は、アレルギー反応の苛酷さを減少させる有用な作用を示す。上記のように、 ＡＩＣＡリボシドまたはリバビリンの分子はマストセルの脱顆粒反応を妨げるの で、アレルギーを有する患者に、これらＡＩＣＡ！Ｊボシドまたはリバビリンを 用いた効果的な治療を行うことができる。

マストセルの活性化は、アナフィラキシ−（過敏Ｍ）の遅速反応物質であるプロ スタグランジンおよびロイコトリエン（前形成しない伝達物質）などの放出の原 因となる。

更に、自己免疫疾患に罹患している患者をブリンヌクレオシドのいずれかで治療 すれば、安堵感を与えられるかもしれない。自己免疫疾患は、ヒトに於いて自然 に発症し、これは、個体自身の組織に対する免疫反応に関連している。自己免疫 反応が発症するためには、異なる免疫細胞が相互作用してこの反応を補助するこ とが必要である。従って、細胞−細胞間の相互作用に於ける要件に干渉する化学 物質は、この疾患の原因を妨害すると期待できる。自己免疫反応が発現するため に必要な免疫細胞型は、Ｔ−リンパ球である。アデノシンはＴ−リンパ球に対し て毒性を示すことが知られているので、ＡＩＣＡリボシドまたはりバビリンは、 この免疫細胞の数を少なくするか、または増加を阻害するので、これを投与する ことは自己免疫患者に対して相当に有効な治療となると期待できる。更に、アデ ノシンは酸素遊離ラジカルの顆粒球産生をも阻害する。

アレルギーおよび自己免疫疾患に加え、ＡＩＣＡリボシドまたはリバビリンは、 特定の器官に血液が不十分にしか流動しないことに基づく疾患またはこのことに より悪化する疾患を治療する上にも使用することができる。例えば、狭心症、一 過性脳虚血発作または片頭痛は、プリンヌクレオシドのいずれかを投与すること によって治療することができる。このことは、アデノシンが血管平滑筋の収縮を 減退させることによる強力な血管拡張作用を示すと知られていることから予期で きる。

血管拡張作用を示すことに加え、ＡＩＣＡリボシドまたはリバビリンは、２次的 なメカニズムにより副血行路を増加させる。しばしば、顆粒球は、限定された血 流領域に於いて毛細血管に付着する。

両方の薬物とも顆粒球を追い出す原因となり、このことが通常の血流が復活する 上での一助となる。従って、ＡＩＣＡリボシドまたはリバビリンの平滑筋細胞に よる取り込み、次いでそれに続くアデノシンの放出は、血管拡張および／まｌ； は顆粒球の除去の原因となるものである。

限定された血流に関連する他の疾患は、心筋不整脈である。限定された血流は不 整脈の発病を引き起こすが、正確な原因は知られていない。しかし、酸素ラジカ ルによる脂質の過酸化が不整脈源であることは知られている。これは顆粒球によ って分泌されるので、ＡＩＣＡリボシドまたはリバビリンにより顆粒球活性化を 阻害すれば、不整脈が制御されると期待できる。更に、顆粒球は動脈硬化の領域 に高度に集中する。これらの活性化を抑制することは、不整脈に於ける他の伝達 物質の放出を減少させる。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらは本発明を限定するものでは ない。更に、当業者にとって自明であるような変動型は、本発明の範囲内に属す るものと解釈できるであろう。

実施例１　プリンヌクレオチド５−アミノ−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）イ ミダゾール−４−カルボキシアミド（ＡＩＣＡリボシド）によるマストセル脱顆 粒の調節 マストセルの脱顆粒は、喘息などのアレルギー性疾叡において重要な役割を演す る。すなわち、脱顆粒を防止する手段がこの疾患をコントロールする方法を与え る。

マストセルの単離 マストセルからのアデノシンの排出の増強を確かめるため、始めに、１００＋Ｑ 、中にヘパリン５１１＋９およびゼラチン０．１ｇを含有する、Ｃａ−およびＭ ｇ”不含のタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液で胸膜と腹膜の腔を洗浄すること によって２５０ｇのラットから細胞を単離した。

この細胞を、上記緩衝液中、１００ｘＧて遠心することによって１回洗浄した後 、緩衝液＋００ｕＱあたりＤＮアーゼＬＲｇおよびゼラチン０．１９を含有する タイロード緩衝液に再懸濁し、ナイロン製の巻重で濾過し、３−７Ｘ１０’有核 細胞／１の濃度で懸濁した。次いで、ＤＮアーゼおよびゼラチンを含むタイロー ド緩衝液中の２２゜５％（Ｗ／Ｖ）メトリズアミド（ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｏ） からなるクッション２１ａに細胞２ｍ１２を懸濁させることによって、マストセ ルをメトリズアミド勾配で精製し、室温で１５分間、５００ＸＧで遠心した。こ の細胞ベレットを洗浄しく２×）、５−１０ｘｌｏ１１有核細胞／酎で再懸濁し 、４−５１を３−９％（Ｗ／Ｖ）連続メトリズアミド勾配３゜ｍＱ上に重ねｆ二 。室温で１２分間、３５ＸＧで遠心すると、マストセルから赤血球が分離した。

この方法によってマストセルを回収し、常時９０％以上のベレット細胞となるよ うにした。

脱顆粒に及ぼすＡＩＣＡリボンドの作用酸エキソグリコシダーゼ、Ｂ−へキソサ ミニダーゼの放出に反映されるような、カルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７ が誘導する脱顆粒を、ＡＩＣＡリボシドが阻害することを示すことによって、Ａ ＩＣＡリボシドによる脱顆粒の阻害を確かめた。ＡＩＣＡリボシドを含むか、ま たは含まないｌμｇ／ｒＱのＡ　２３１８７を、タイロード緩衝液中、３７℃の ２−ｓｘｔｏ’マストセルに加え、Ｂ−へキソサミニダーゼを放出したマストセ ルの量を測定しｆ二。１００μモルのＡＩＣＡリボシドの存在下では、１７．６ ％のＢ−へキソサミニダーゼが放出されｒこにすぎないが、その不存在下では２ ８．８％が放出された。このように、ＡＩＣＡリボシドはマストセルの脱顆粒を 阻害する。Ｂ−へキソサミニダーゼの放出率測定、ならびに酵素の検定は、シュ ワルツ等［Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ ｎ。

１ｏｇｙ、Ｖｏｌ、１２３．１９７９年ｌＯ月、１４４５頁］の記載のようにし て行なった。

実施例２　リンパ芽球のアデノシン放出のＡＩＣＡリボシドによる増強 アデノシンは、免疫応答のある局面での阻害剤であることが知られている。従っ て、アデノシン濃変を調節する手段は、自己免疫病に苦しんでいる人を有効に治 療することを可能にする（通常、この病気は過剰な免疫細胞反応の結果であるの で）。

リンパ芽球の単離 ヒト胛臓リンパ芽球セルラインＷｌ−Ｌ２を用いて、ＡＩＣＡリボシドのアデノ シン放出に及ぼす作用を確かめた。このセルラインの由来および性質はバーシュ フィールド等［Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、／Ｖｏ １．１９７，１２８４頁（１９７７）］が記載している。このセルラインを、２ ０％ウシ胎児血清および２βＭグルタミンを追加したＲＰＭＩ　１６４０細胞培 養培地中に維持し、５％二酸化炭素（空気中）の雰囲気下で増殖させた。しかし 、ウシ胎児血清はプリン代謝酵素を含んでいるので、ＡＩＣＡリボシドの作用を 確かめるために、１０％の熱−不活性化し、透析したウシ胎児血清、２ｍＭのグ ルタミン、および１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１β−ピペラジン エタンスルホン酸緩衝液、ｐＨ７，４Ｃカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） ］を追加しｆ二Ｔ（ＰＭＩ　１６４０　培地中でＷ　Ｉ　−Ｌ　２細胞をインキ ュベートした。

アデノシン放出に及ぼすＡＴＣＡリボシドの作用第１図は、ＡＩＣＡリボシドが 、１００−５００μモルの範囲にわたって、リンパ芽球からのアデノシン放出を 増強することを示している。

約１．４ｎモルのアデノシン／１０’　Ｗｌ−２細胞が自発的に排出され、この 数は５００μモルＡＩＣＡリボシドのとき約２．３ｎモルに増加した。

冷却した４、４Ｎ過塩素酸３０μｇを上清に加えるか、まｆこは冷却した０、４ Ｎ過塩素酸３００μａを細胞ベレットに加え、４℃で１０分間、５００ｘＧで遠 心することによって、細胞が上清中に放出したアデノシン量、または細胞中に残 存しているヌクレオシド量を測定した。キーム［Ｋｈｙｍ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、２１．１２４５頁（１９７５）］の記載のように して、得られｒこ上清のそれぞれを、１４．２−）リクロロートリフルオロエト ン［フレオン（Ｆｒｅｏｎ）　ｌ　１３　］溶媒１２．５ｘＱ中にトリーｎ−オ クチルアミン［アラミン（Ａｌａｍｉｎｅ）３３６、ゼネラル・ミルズ（Ｇｅｎ ｅｒａｌ　Ｍｉｌｌｓ）コ２，４ｇを含有する溶液６６０μ１２で中和した。４ ℃で３分間、１５００ｘＧで遠心した後、水相を取り、アデノシンまたはヌクレ オシドについて検定を行なうまで一２０℃で凍結した。アデノシンは、４１モル リン酸カリウム、ｐＨ３，４ニアセトニトリル６０％（９５：　５　ｖ／ｖ）緩 衝液で平衡化したＣ−１８マイクロボンダパツク（ｍｉｃｒｏＢｏｎｄａｐａｋ ）逆相カラムでイソクラティックに評価した。アデノシンは８−１Ｏ分に溶出し 、その同定は、アデノシンデアミナーゼに対する感受性によって、およびアデノ シン標準を含む溶液で確認した。１０肩モルリン酸カリウム、ｐＨ３゜７８で平 衡化し、０．２５モルリン酸カリウム、０．５モルＫＣ（！、ｐＨ３，４５まで の直線勾配で溶離する、ワットマン・パーチンルー１０　［Ｗｈａｔｍａｎ　Ｐ ａｒｔｉｓｉｌ−１０（ＳＡＸ）コカラムの高速液体クロマトグラフィーによっ ても、この細胞ベレットからの抽出試料についてヌクレオシドを分析することが できる。適当な標準の高速液体クロマトグラフィー分析と比較することによって ピークを定量しｆ為実施例３神経芽細胞種細胞におけるアデノシン放出に及ぼす ＡＩＣＡリボシドのインボトロ作用 実施例２に記載の条件下、および培地で神経芽細胞腫セルラインヲ増殖すｔ）り 。培地＋：！ｉ、０．００５ｍＭ−０，５Ｍ（７）ＡＩ　ＣＡリボシドおよびマ イクロモル量のカルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７を追加した。このような 条件下で、細胞は対照細胞の少なくとも２倍以上のアデノシンを分泌する。

実施例４　イヌにおけるアデノシンレベルおよび血流増加に及ぼすＡＩＣＡリボ シドのインビボ作用 第２図および第３図は、血液中のアデノシンレベルに及ぼすＡＩＣＡリボシドの 作用を確かめるにめ、およびアデノシンの増加を血流の増加と関連づけるＬめに 行なった第２群の実験結果を示している。雑種のイヌ１３匹をフェノバルビター ルで麻酔した。前左胃静脈にカニユーレを挿入し、血液試料を２Ｎ過塩素酸に取 った。流速１ｍＱ／分に冠状動脈挟挿する前の４５分間の大腿静脈への注入用に 、食塩水ま几は１００ｍＭＡＩＣＡリボシドの食塩水溶液をランダムに選択しｆ 二。挟締の５分館、左前下行冠状動脈の挟挿の１，１０．２０．３０および５０ 分後、ならびに再潅流の１分後に、左前静脈血液を集め、実施例Ｉの記載のよう にしてアデノシンを検定した。

ヘイマン等ｊＨｅｙｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｇ、ＣＪ、Ｄｉｓ、、２０ ．５５（１９７７）ｉの記載のようにして、虚血期間の５および６０分に左肩に 注入した、１５μｍの放射線標識しに球を用いて局所的な心筋層の血液流量を測 定した。虚血期間中、心電図および動脈圧力をモニターした。ＡＴＣＡリボシド 処理したイヌ６匹および食塩水処理したイヌ５匹はこの処置に耐えた。生き残り ｆコ食塩水処理動物の内２匹は線維章縮した。

挟締直前のＡＩＣＡリボシド処理イヌのＡＩＣＡリボンド濃度は５７．４＋／− ４０，２μＭであった。範囲は４．４〜ｌｏｏμＭであった。

第２図は、ＡＩＣＡリボシド濯流によってアデノシンレベルが劇的に増加するこ とを示しており、一方、第３図は、食塩水処理した動物よりＡＩＣＡリボシド処 理した動物の方が、虚血性心筋層への局所的な心筋血液流量が有意に大きいこと を示している。同程度の流量の差異が、心内膜および心外膜で観察され、虚血の ５および６０分の間で変化は存在しなかった。非−虚血性組織の流速が２つの群 の間で極めて類似しているように、ＡＩＣＡリボシドは正常な心筋層への流れを 変えなかった。５および６０分での全身的な動脈圧および心拍数は、２群のイヌ の間で有意の差がないことを示した。

動脈血液のガス含量および全身の静脈顆粒球数は、２つの群の間で有意に異なっ ていることはなかった。

おそらくは、アデノシン放出の増大によって、従って血管拡張および／まｒこは 顆粒球の毛管閉塞の阻害によって、ＡＩＣＡリボシドが虚血性の心筋層への副行 の冠伏流を増強するものと我々は結論づけた。

実施同町５−アミノ−（ｌ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾール−４−カ ルボキシアミドを用いるアンギナの治療心臓疾患治療用のＡＩＣＡリボシドの効 力を示すため、アンギナのイヌのモデルを開発した。これは、イヌ心筋層に栄養 補給を行なう冠状動脈の近接部分のあたりにリングを配置することによって部分 的にふさぐことからなる。このリングは徐々に体液を吸収し、敗退間にわｒこっ てこの動脈をさらに挟挿する。その結果、このイヌを運動させたときには、通常 の心電図およびアンギナと関連した壁張力の変化が示される。ヒトのアンギナを 軽減することが知られている薬物、たとえばニフェジピンでこれらのイヌを処置 し、何の助けにもならないことがねかっｒ二。しかし、次いで同じイヌをＡＩＣ Ａリボシドで処置すると、ドツプラー表示（ｄｏｐｐｌｅｒ　ｒｅａｄｉｎｇｓ ）で測定したとき、冠状動脈を通る血液流量に劇的な、約３０％の増加が存在し た。さらに、壁の厚みを測定すると、虚血領域に少なくとも２倍の心筋層収縮の 増加が見られた。

実施例６不整脈に及ぼすＡＩＣＡリボシド治療の効果心筋層虚血の結果の１つは 不整脈であり、この不整脈の頻度は血液流量の度合と関係している。従って、こ のＡＩＣＡリボシド処置の不整脈に及ぼす作用を測定した。虚血期間中に記録し ておいた心電図について、早発性心室復極（ＰＶＤ）および心室頻拍（ＶＴＡ・ ７の数を調べた。第１表は、虚血期間中、食塩水処理したイヌが１１２．２のＰ ＶＤおよび１８．２のＶＴＡＣを有し、これに対してＡＩＣＡ処理した動物は３ ７．８のＰＶＤおよび４．７のＶＴＡＣを有していること（ｐ　ｌ／４０．０１ ）を示している。不整脈が多いＡＩＣＡリボシド処理しｆニイヌの１匹（＃３） は、他のＡＩＣＡリボシド処理したイヌと比較すると、かなり低い副行血液流速 およびアデノシン濃度を有していた（しかし、ＡＩＣ，Ａリボシドの血液ｆ！に 変は２７．２ｆｆｉ’あった）。

第１表 処理群　不整脈（回数／時間） 食塩水　ＰＶＤ　ＶＴＡＣ ｌ　１０１　１０ 平均　１１８．２　１８．２ ＡＩＣＡリボシド　ＰＶＤ　ＶＴＡＣ 平均　３７．８　４．．７ 虚血を行わないときには、ＡＩＣＡリボシドまｆこは食塩水注入の前および注入 期間中は、すべてのイヌについて測定可能な静脈アデノシンは認めら机なかり７ ．（＜０．０１μＭ）。食塩水処理し１こ動物では、挟挿の１０分後にアデノシ ンレベルのピークが現れ（０，２２十／−０，０８μＭ）、このピークは６０分 で検出不能なレベルまで低下し几。対照的に、Ａ、［ＣＡリボシド処理しｒニ動 物では、虚血の１分後にアデノシンレベルのピークが現れ（１，７９＋／　−０ ，３５μＭ）、このピークは６０分のところで上昇し１こままであった（０゜１ ８↑／−０，１５）。再潅流すると、食塩水処理した動物では検出可能なアデノ シンの流出はみられなかったが、ＡＩＣＡ処理した動物では有意の増加が見られ た。

実施例７　マストセル脱顆粒に及ぼすリバビリンの影響Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの大 腿骨から得几骨髄をラジン培地及びならし培地のｌ：１混合物中で培養しん。こ れはＣ５７Ｂ１／６Ｊ及びＣ３Ｈマウスの膵臓細胞を、ラジンら（Ｐｒｏｃ、５ ａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｖ　Ｓ　、Ａ　２８ｉ　２２５９−２５６１．１９ ８１）によって記載されている様に、コンカナバリＡの存在下で共培養すること により作成した。１週間の継代及び少なくとも１５日の組織培養の後得られｆニ 細胞は９０％純度のマストセルであり９５％の生存率であった（トリパンブルー 排除により測定）。培養中、リバビリンに晒した細胞を、実験に使用する前に３ 回洗浄しＬ０培地のみで増殖させに並行細胞培養を、薬理学的に操作し１こマス トセルのための対照として使用した。特定の時点で細胞をカウントし、リバビリ ンで処理した細胞の実際の数を培地のみて増殖させた細胞の数と比較することに より細胞増殖を評価した。

β−へキソサミニダーゼを代表的な顆粒関連部調製マストセルメジエータとして 選ん１こ。なぜならこの物質は定量が容易でありその放出はヒスタミンのそれと 殆ど同じであるからである。マウスの骨髄由来のマストセルを２００　Ｘ９て５ 分間遠心分離し、２価カチオンを含んでいないタイロード緩衝液で３回洗浄し、 抗ＤＮＰ（ジニトロフェニルホスフェート）ＩｇＥ（１μｇ／ｌｏ’細胞）で３ ７℃にて３０分間感作し、完全タイロード緩衝液４００μρ中、ＤＮＰ−ＢＳＡ 抗原（＋　７５ｎｇ／３　ｘ　１０５細胞）又はＡ２３１８７（１０ｔｔ９／ｘ ｆｆ／３Ｘ１０’細胞）で１０分間３７℃でチャレンジした。反応混合物を２０ ０　Ｘ９で１０分間遠心分離し、上澄み液とペレットのβ−ヘキソサミニダーゼ 濃度を、シュバルツら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１１２３．１４４５（１９７９））に 記載のバラニトロフェニル−β−Ｄ−ゲルコサミドの加水分解により分析した。

自発的β−へキソサミニダーゼ放出を非チャレンジ細胞により測定し乙。正味（ ネット）の放出されたβ−へキソサミニダーゼのパーセントは以下の如く定義さ れる。

上記式中、［β−ｈ　ｅ　Ｘ　：はβ−へキソサミニダーゼを表わし５ｕｐｅｒ は上澄み液を表わす。反応混合物中に外因性のアデノシンが存在しているときは 、同時に分泌促進物質を添加しｆこ。

Ａ２３＋８７又はＤＮＰ−ＢＳＡ抗原でチャレンジしたマウスの骨髄由来マスト セルは、全細胞β−へキソサミニダーゼ、前調製した顆粒関連メジエータの８− １５％を放出した。マストセル刺激の時点て加えたリバビリン（１０μＮｉ）は β−へキソサミニダーゼ放出に影響を与えない。しかし１０μＭリバビリン中で ３〜７日間インキュベートし、洗浄し、そしてＡ２３１８７でチャレンジし１ニ マストセルは、培地のみで培養した並行細胞と比べてβ−へキソサミニダーゼ放 出の著しい減弱を示した（第４図）。リバビリン添加はマストセルのメジエータ 含量（即ち、全細胞のβ−へキソサミニダーゼ濃度）、および細胞の生存活性に 変化を与えず、β−へキソサミニダーゼの自発放出は２種の細胞群で類似してい た。リバビリン添加と前調製メジエータ放出との間の投与量一応答関係を第５図 に示す。

リバビリンＩμＭで６日間行なった実験では有意にメジエータ放出を阻止したが 、最大の阻止率は１０μＭ及び２０μＭの間で明らかである。

実施例８　イノシン濃度に及ぼすＡＩＣ，Ａリボシド処理の影響アデノシン濃度 の増加は少な（とも一部はイノシン濃度の低下によるということは、実施例４に 記載したようにＡ■ｃＡリボシドで犬を処置し静脈血中のイノシンａ度を分析す ることにより示された。

第６図は６０分間の分析期間においてイノシン濃度が２倍以上減少したことを示 している。

実施例９ 冠血管梗塞サイズに及ぼすＡＩＣＡリボシド処置の影響は、ラットの冠動脈を結 わえることにより血流を制限し、次いで動物に食塩水中のＡＩＣＡリボシドある いは食塩水のみをブラウス（ｂｌｏｕｓｉｎｇ）することにより測定しに。さら に、たえずＡＩＣＡリボシド又は食塩水を、当業者既知のオズモニックミニボン ブを使って潅流することにより動物にたえず接触さけた。３週間後ラットを殺し 、梗塞サイズを、固定した心臓の染色接片をプラニナライジングすることにより 定量しｆこ。その結果、ＡｒＣＡリボシドで処置したう・ノドにおいては、食塩 で処置しｆ二対層群と比へ約２４％の梗塞サイズの減少が見られた。

ハＩＣＡリボ゛シト（七４冬的逃光う賃彦Ｐ門）ＦＩＧ、　１ 刑、１更静厭の了テ゛ノシン漢麿　（μＭ）β−へ天ソアミニグービＲ去（％〕 θ−ヘＹ　７’７．’ユ２−ビ４δＳこ敦（近プ不ン（％）国際調査報告 しｔｎｎｙ＋ｔａ−＾−−−−１−−Ｎ−ＰＣＴ／υ５８６１００７３６＋＊＋ ｕ＋ｖｌｉ°＋’ｎｌ　ＡＤ＠ｌｋｍａ＊　Ｎｏ　ＰＣ丁／ＵＳ８６１００７３ ６ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ Ｌ　Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ａｎ　ａｎｉｍａｌ　ｂｏｄ ｙ　ｆｏｒ　ａｌｌｅｒｇｙ−Ｃｌａｉｍｓ　１−５　ａｎｄ　８−１１Ｘエエ 、Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｆ：ｒａヒｉｎｇ　ａｎ　ａｎｉｉａｌ　ｂｏｄｙ 　ｆｏｒ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄλ５ａａｓｅ−Ｃｌａｚｍｓ　ｌ−４，６ａ ｎｄ　８；ＸＨ，Ａ　ｍｅｅｈｏｄ　ｏｆ　謬ｒｅａヒｉｎｇ　ａｎ　ａｎｉｍ ａｌ　ｂｏｄｙ　ｆｏｒ　ｎ＝ｕｒａｌｄｉｓｅａｓｅ−Ｃ１ａｏｎｓ　ｌ−４ ａｎｄ　８Ｘ　ａｎｄ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．制限された血流に伴うアレルギー、自己免疫、及び神経性疾患または疾患群 を有する動物の治療方法であって、プリンヌクレオシド、５−アミノ−（１−β −Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾールカルボキシアミド又は１−β−Ｄ−リボ フラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミドを、単独である いは該プリンヌクレオシドの効果を増強する物質と共に該動物に投与することか らなる方法。 ２．該ヌクレオシドを０．５モルを超えない濃度で投与する第１項記載の方法。 ３．該プリンヌクレオシドの効果を増強する物質がアデノシンの酵素分解を阻止 する物質である第２項記載の方法。 ４．該物質がエリスロ−９−（２−ヒドロキシル−３−ノニル）アデニン塩酸塩 、コホルマイシン、２′−デオキシコホルマイシン、及びジピリダモールからな る群から選ばれる第３項に記載の方法。 ５．該神経性アレルギーが喘息である第４項記載の方法。 ６．該自己免疫疾患がレッシューナイハンである第４項記載の方法。 ７．制限された血流に伴う疾患が心臓の疾風である第４項記載の方法。 ８．該プリンヌクレオシドを静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、局所投与又は 吸入により投与する第１項記載の方法。 ９．該動物にプリンヌクレオシド、５−アミノ−（１−β−Ｄ−リボフラノシル ）−アミダゾール−４−カルボキシアミド又は１−β−リボフラノシル−１，２ ，４−トリアゾール−３−カルボキシアミドを投与することからなる該動物のア レルギーの治療方法。 １０．５−アミノ−（１−β−Ｄ−リボフラノシル）−アミダゾール−４−カル ボキシアミド又は１−β−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カ ルボキシアミドを０．５モルまでの濃度で投与する第９項記載の方法。 １１．該アレルギーが喘息、慢性じんましん、色素性じんましん、及び慢性湿疹 からなる第１０項記載の方法。 １２．制限された血流に起因する心臓疾患の患者を治療する方法であって、５− アミノ−（１−β−Ｄ−リボフラノシル）−アミダゾール−４−カルボキシアミ ド又は１−β−リボフラノシル−１，２，４−トリァゾール−３−カルボキシア ミドのプリンヌクレオシドを０．５モルを超えない濃度で投与する方法。 １３．該心臓疾患が狭心症である第１２項記載の方法。 １４．患者の不整脈を治療する方法であって、５−アミノ−（１−β−Ｄ−リボ フラノシル）−アミダゾール−４−カルボキシアミド又は１−β−リボフラノシ ル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミドのプリンヌクレオシドを ０．５モルを超えない濃度で投与することからなる方法。