DK174934B1 - Fremgangsmåde til screening af purinnucleosidforbindelser - Google Patents

Description

i DK 174934 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til screening af purinnucleosidforbindelser eller analog heraf for deres evne til at øge den cellulære syntese Og frigivelse af adenosin.

5 Adenosin tilhører Jclassen af biokemiske stoffer, der kaldes purinnucleosider og er et vigtigt biokemisk celleregulerende molekyle, som beskrevet af Fox og Kelly i Annual Reviews of Biochemistry, Vol. 47, side 635, 1978, hvilket indvirker på en lang række celletyper og I® er ansvarligt for utallige biologiske virkninger. Adenosin er f.eks. en potent vasodilator, inhibitor for immuncellefunktion, aktivitor for mastcelledegranulering, en inhibitor for granulocytaktivering, og en formodet hæmmende neurotransmitter. I betragtning af adenosins 15 brede biologiske aktivtitetsspektrum har betydelige kræfter været, og er stadig, rettet mod etablering af praktiske, terapeutiske anvendelser af molekylet og — _ _----------------dets—analoge-.----------------------------

Eftersom man mener at adenosin eller lignende 20 purinnucleosider virker på niveau med celleplasmamem-branen, ved at binde til receptorer, der er fæstnet i membranen, har tidligere arbejde været fokuseret på øgning af molekylets ekstracellulære koncentrationer.

Uheldigvis er adenosin eller dets analoge toksiske ved 25 de koncentrationer som skal administreres til en patient til opretholdelse af en virkningsfuld ekstracel-lulær terapeutisk koncentration, og derfor har administreringen af adenosin alene kun ringe terapeutisk anvendelse. Som følge deraf har man søgt efter andre måder til opretholdelse af lokalt høje ekstracellulære adenosinkoncentrationer. De 3 mest benyttede er: a) forstyrrelse af adenosinoptagelse med reagenser der specifikt blokerer adenosintransport som beskrevet af L· -- - — — - - -- 2 DK 174934 B1

Paterson et al., Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 255, side 402, 1975; b) hindring af ade-nosinmetabolismen, der igen stiller cellulær adenosin til rådighed for ekstracellulær transport og anvendelse 5 uden for cellen som beskrevet af Carson og Seegmiller i The Journal of Clinical Investigation, vol. 57, side 274, 1976, og c) anvendelsen af adenoslnanaloge fremstillet til at vende til adenosincelleplasmamembranre-ceptorer med lavere dissociationskonstanter end adeno-10 sin.

Der findes en lang række af kemiske stoffer, som inhiberer den cellulære optagelse af adenosin. Nogle gør det specifikt, og er i det væsentlige kompetitive inhibitorer for adenosinoptagelse, og andre inhiberer 15 ikke-specifikt. Theophyllin virker som en kompetitive inhibitor, medens dipyridamol, og en lang række andre kemiske stoffer, herunder colchicin, phenethylalkohol og papaverin inhiberer optagelse ikke-specifikt.

Fremgangsmåder til øgning af de ekstracellulære 20 adenosinkoncentrationer ved ændring af adenosinmetabo-lisme er hovedsageligt baseret på anvendelsen af kemiske stoffer som inhiberer enzymatisk nedbrydning af adenosin. Det meste af dette arbejde har været fokuseret på identificering af inhibitorer for adenosindeaminase, 25 som omdanner adenosin til inosin. Adenosindeaminase in-hiberes af coformycin, 2,-deoxyco-formycin eller eryth-ro 9-(2-hydroxy-3-nonyl)adeninhydrochlorid.

Der er fremstillet en del adenoslnanaloge, som har strukturmodifikationer ved purinringen, ændringer i 30 substituentgrupper bundet til purinringen, og modi- I

fikationer ved, eller ændringer i carbonhydratdelens bindingssted. Halogenerede adenosinderivater har vist sig at være yderst lovende og har, som beskrevet af — 3 DK 174934 B1

Wolff et al., 1 the Journal of Biological chemistry,

Vol. 252, side 681, 1977, biologiske virkninger, der svarer til de virkninger, adenosin fremkalder.

Skønt alle tre ovennævnte teknikker har fordele 5 i forhold til anvendelse af adenosin alene, har de adskillige ulemper, idet den væsentligste er, at de er afhængige af kemiske stoffer, som har uheldige terapeutiske bivirkninger, hovedsageligt fordi de skal administreres i doser som er toksiske, og fordi de påvirker 10 de fleste celletyper ikke-selektivt. Som beskrevet i Purine Metabolism in Man, (eds. De Baryn, Simmonds and Muller), Plenum Press, New York, 1984, bærer de fleste celler i kroppen receptorer for adenosin. Som følge deraf forårsager anvendelsen af metoder, som øger adeno-15 sinkoncentrationer generelt i kroppen, dramatiske ændringer i normal cellulær fysiologi ud over at kontrollere sygdomme, som har gavn af adenosinbehandling.

__________________Ovennævnte diskussion skal forstås således at en---- -------- metode, som vil øge adenosins eller adenosinanaloges ek-20 stracellulære koncentrationer uden komplekse bivirkninger, og som vil gøre det muligt, at øge de adenosinkon-centrationer rettes selektivt mod de celler, der vil have størst udbytte af dette, vil have en betydelig terapeutisk anvendelse. Derfor vil det være fordelagtigt 2^ at udvikle en fremgangsmåde til screening af forskellige purinnucleosidforbindelser for deres evne til at øge den cellulære syntese og frigivelse af adenosin.

Der beskrives en hidtil ukendt fremgangsmåde til mildnelse af sygdomme baseret på øgning af den ek-stracellulære koncentration af adenosin, eller adenosi-nanaloge, idet der anvendes purinnucleosider, især de ikke-toksiske purinnucleosider, 5-amino-l-0-D-ribofu-ranosyl)imidazol-4-carboxamid (AICA ribosid), og Ι-β-D- 4 DK 174934 B1 ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-carboxamid (ribavirin) og allopurinolribosid (eller allopurinolbase, som i kroppen kan omdannes til ribosidet). Sidstnævnte reagenser administreres til en patient og optages og omdannes til 5 mono- og sommetider triphosphat af celler. Adenosin eller inosin dannes fra adenosintriphosphat under hurtig cellulær energiudnyttelse, såsom under anfald eller under mindsket blodstrømning, ved en serie af intracellu-lære biokemiske reaktioner. Produktionen af inosin er 10 meget større end produktionen af adenosin (omkring 100 til 1). Forbindelserne diffunderer dernæst ud af cellerne og er følgelig tilstede i de nærmeste ekstracellulæ-re omgivelser i høje koncentrationer. Purinnucleosider-ne, såsom AICA ribosid øger produktionen af adenosin.

15 øgningen i adenosinfrigivelse skyldes tildels en reduktion af 5'-nucleotidaseaktivitet. Det fremgår af det efterfølgende diagram, at med reduceret 5’-nucleotidaseaktivitet omdannes IMP ikke så hurtigt til inosin og mere nucleotid omdannes til AMP, som ophobes og omdan-20 nes til adenosin. KM for AMP (1 mM) er ca. 10 gange højere end for IMP ( 1 mM). Eftersom adenosinkoncentra-t tioner ikke ændres væsentligt hos patienten, og ændrin ger kun forekommer i områder med hurtig AMP anvendelse, forårsager behandlingsmetoden ikke generelt adenosin-25 frigivelse.

DK 174934 B1

Hksrjaoelluia^n

—is*£__I

S · Ad»*Ot ylm«thlonln \β,\ j, N^XAdioiilii ! 5 S-Adinolylhomoeytlaln i

HomocyUain -^S. >s'v

Adtnotin «...'*Μ,η,Λ N. \

5|° I9 ATP ADP ^xX

i ,1¾] x 2Q Inetin ---|||- ~~ _* AMP—1 4 IMP J"

IT AOP—*-dADP

Mypotonlhin -1 j j ^

51 Hidtil ukendt « dATP

Jr i_JcUlnsyter 15 ‘1 jo

Urinsyre Cyclisk-AMP

Diagram l. Adenosinmetabolisme.

Dette diagram viser den vej ved hvilken adenosin -------_ _d annes—oa—ned bryd es—.a f—cellex_,_Adenosin_kan__desuden______ —____ transporteres ind i celler eller frigøres fra celler.

20 2'-deoxyadenosinmetabolismen kan udnytte nogle af disse veje: 1_, S-adenosylmethioninmethyltransferaser; 2, S-adenosylhomocysteinhydrolase; 3, adenosiddeaminase; 4, purinnucleosidphophorylase; 5 & 6, xanthinoxidase; 7, transportmekanismer; 8, adenosinphosphorylase (ikke ^ etableret); 9, adenosinkinase; 10, 5'nucleotidase og ikke-specifik phosphatase; 11, adenylatkinase; 12, nu-cleosiddiphosphokinase; 11, adenylatcyclase.

Det er derfor tydeligt, at purinnucleosider, AI-CA ribosid, ribavirin og allopurinol er et medicinsk gavnligt middel til etablering af en høj lokal ekstra-cellulær koncentration af adenosin uden de toksictets-eller ikke-specifikke optagelsesproblemer, der er forbundet med andre metoder, som regulerer ekstracellulære 1 — 6 DK 174934 B1 adenosinkoncentrationer.

På tegningen viser figurerne følgende.

Fig. 1. In vitro virkning af 5-amino-l-(β-D-ribo-furanosyl) imidazol-4-carboxamid på adenoslnekscretion 5 fra lymfocyter.

Fig. 2. β-hexosaminidase-frigivelse fra kontrol-og rebavirin-behandlede mastceller. Mastceller fra mu-sebenmarv, som dyrkedes 13-7 dage i medier alene (Γ 1 ) eller i 10 M ribavirin ) udsattes for calciumion- !0 ophoren. Procent β-hexosaminidase-frigivelse fra hvilende og stimulerede celler er vist som middelværdier +/- standardafvigelser af to værdier fra 7 forsøg. x = signifikant forskellig fra kontrolceller (p < 0,05). Lignende resultater opnåedes med DNP-BSA antigen stimu-lering af anti-DNP IgE-sensibiliserede mastceller.

Fig. 3. Dosis-reaktionsvirkninger af ribavirin på mastcelle-O-hexosaminidase-frigivelse. Mastceller dyrkedes i medier alene (kontrol) eller il, 10 eller 20 μΜ ribavirin i 6 dage, vaskedes, og udsattes for 20 A23187 (| 1 ) og netto β-hexosaminidase-frigivelse be stemtes. Ribavirin-behandlede celler frigav ved alle testede koncentrationer signifikant mindre β-hexosaminidase, når de var udsat for A23187. Mediato-rindhold og spontan frigivelse var ikke forskellig hos 25 kontrol- og ribavirin-udsatte celler. Middelværdierne +/-standardafvigelser af dobbeltbestemmelser fra 3 forsøg er afbildet grafisk.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til screening af purinnucleosidforbindelser 30 eller analog heraf for deres evne til at øge den cellulære syntese og frigivelse af adenosin, ejendommelig ved, at man a) til dyrkede celler administrerer en første blanding DK 174934 B1 7 ! indeholdende purinnucleosidforbindelsen eller analoge heraf, som skal screenes, b) til nævnte dyrkede celler administrerer en calcium-ionophor eller 2-deoxyglucose, til aktivering af en net- C i.. __1____1__1.1__i__Λ__1 J--- j uw oucuuoiuti WQLUirxxstiiit? , c) bestemmer koncentrationen eller mængden af adenosin frigivet af de dyrkede celler, og d) sammenligner koncentrationen eller mængden med koncentrationen eller mængden af adenosin frigjort fra et 10 eller flere sæt kontrolceller.

Virkningen af purinnucleosider, AICA ribosid eller ribavirin, på adenosintransport kan vises enten in vitro eller in vivo, hvor den virkningsfulde koncentration af hvert molekyle er 10 μΜ-ΐ00μΜ. Når de tilføres 15 cellerne in vitro kan AICA ribosid eller ribavirin opløses i en vandig opløsning og sættes direkte til dyrkningsmedierne. Det forventes, at tilførelsen af dis- J____________ semolekyler_til_patienter_o.f.tes_t^v_il_ske„v_ed_oraladml-_____________ nistrering, eftersom purinnucleosiderne ikke uden videre 20 nedbrydes af enzymer i kroppen eller ved udsættelse for den lave pH-værdi, som findes i maven. Der er ingen a priori grund til at tro, at medikamentet ikke også kan administreres intravenøst eller ved direkte intramus-kulær injektion, topisk eller ved inhalation.

25 Ved kontakt med aktiverede energikrævende mål celler transporteres purinnucleosiderne, AICA ribosid eller ribavirin, intracellulært af et plasmamembranbun-det lettet diffusionstransportsystem, hvor de kan phos-phoryleres af adenosinkinase til opnåelse af 30 purinnucleotidmonophosphat. Sidstnævnte kemiske stof kan omdannes til triphosphatet, et mellemprodukt i den hidtil ukendte purinnucleosid-syntese.

Por at regulere mængden af adenosin, og dermed effektiviteten af AICA ribosid- eller ribavirin- 8 DK 174934 B1 behandlingen registreres graden af øget ekstracellulær transport ved isolering af det vandige fluidum, som omgiver cellerne, og bestemmelse af den tilstedeværende mængde i medierne ved chromatografiske teknikker som 5 beskrevet af Matsumoto et al., The Journal of Biologi- 1 cal Chemistry, Vol. 254, side 8956, 1979. I vævskulturforsøgene sattes 1 mmolær deoxycoformycln til det vandige fluidum for at hindre adenosindestruktion ved ade-nosindeaminase. Desuden analyseredes den resterende 10 mængde adenosin i cellerne ved høj tryksvæskekolonne-chromatografi efter isolering fra cellerne som beskrevet af Matsumoto et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 254, side 8956, 1979.

Eftersom mængden af ekstracellulær adenosin kan 15 reguleres ved at øge eller mindske koncentrationen af AICA ribosid eller ribavirin, som findes i det cellulære væsktmiljø, kan mængden af ekstracellulær adenosin øges ved at øge mængden af administreret AICA ribosid eller ribavirin, hvis adenosinkoncentrationen er for 20 lav til at være medicinsk gavnlig. På tilsvarende måde kan mængden af adenosin, hvis den er for stor, reduceres ved at reducere mængden af purinnucleosidet.

Det formodes at AICA ribosid- eller ribavirin-behandling vil gavne patienter, der lider af en lang 25 række sygdomme. F.eks. kan patienter der lider af allergier, især astma, høfeber, kronisk urticaria, urticaria pigmentosa og eksem forvente at have nytte af pu-rinnucleosidbehandling. som omtalt i B. Benacerra og A.

Unanue, Textbook of Immunology (Williams & Williams, Λ 30 Baltimore/London, 1979), er nøglen til undertrykkelse af allergiske reaktioner at hindre frigivelsen af farmakologisk aktive stoffer fra mastceller. Mastceller er store basofile, farvede celler med ekstensive granu- i 9 DK 174934 B1 ler, som indeholder stoffer, såsom histaminer, der frigives af mastcellen under den allergiske reaktion, og som er nødvendige for at understøtte den allergiske : reaktion. Frigivelsen af disse farmakologisk aktive 5 stoffer, som findes 1 masLcellei., kaldes "ueyranule-[ ring". Kemiske stoffer, som hindrer degranulering har således en gavnlig virkning på mindskelse af graden af den allergiske reaktion. Patienter der lider af allergier kan med succes behandles med AICA ribos id eller 10 ribavirin, eftersom disse molekyler hindrer mastcelle-degranulering. Mastcelleaktivering bevirker frigivelsen af prostaglandiner og leukotriener (ikke-preforme mediatorer), såsom langsomt virkende stof ved anaphylaxis.

15 Patienter der lider af autoimmune sygdomme kan desuden opnå lindring, hvis de behandles med det ene eller det andet purinnucleosid. Autoimmune sygdomme fo- _____________r_ekommer_ naturligt_hos_mennesket og ^involverer en im----------------- munreaktion overfor individets eget væv. For at starte 20 en autoimmun reation er det nødvendigt at forskellige immunceller påvirker hinanden for at støtte reaktionen.

Kemiske stoffer som interferer de nødvendige celle-celleinteraktioner kan således forventes at hæmme sygdomsforløbet. En immuncelletype, som er nødvendig for 25 dannelsen af en autoimmun reaktion er T-lymfocyten. Eftersom det er velkendt at adenosin er toksisk overfor T-lymfocyter, må det formodes at administrering af AICA ribosid eller ribavirin vil udslette eller inhiberer denne polulation af immunceller og således være til 30 betydelig terapeutisk nytte for personer der lider af autoimmune sygdomme. Adenosin inhiberer desuden granu-locytproduktion af oxygen frie radikaler.

Foruden allergi og autoimmune sygdomme, skulle det være muligt at benytte AICA ribosid eller ribavirin i 10 DK 174934 B1 til behandling af sygdomme der stammer fra, eller som forværres af insufficient blodstrømning gennem et givet organ. F.eks. kan angina pectoris, transiente iskæmiske angreb eller migrænehovedpiner behandles ved admini-5 strering af det ene eller det andet purinnucleosid.

Dette er at forvente eftersom adenosinen er kendt som et potent vasodilaterende middel, der virker ved at reducere vasculær glat muskelkontraktion.

Udover at virke som et vasodilaterende middel, 10 øger AICA ribosid eller ribavirin collateral blodstrømning ved en anden mekanisme. Granulocyter hæfter sig ofte til mikrovaskulaturer i områder med begrænset blodstrømning. Begge medikamenter kan få granulocyter til at løsne sig, hvorved de hjælper med at reetablere 15 normal blodstrømning. Optagelsen af AICA ribosid eller ribavirin af glatte muskelceller efterfulgt af senere frigivelse af adenosinen skulle således bevirke vasodilation og/eller fjernelse af granulocyter.

En anden sygdom som er knyttet til begrænset 20 blodstrømning er myocardial arrhythmia. Skønt begrænset blodstrømning igangsætter arrhythmia er den præcise årsag ukendt. Man ved imidlertid at lipidperoxidation af oxygengrupper er arrhytmogeniske. Eftersom sidstnævnte secerneres af granulocyter, kan AICA ribosid- el-25 ler ribavirin-inhibering af granulocytaktivering forventes at kontrollere arrhythmia. Granulocyter findes desuden i højere koncentrationer i områder med arterioschlerosis. Undertrykkelse af deres aktivering Λ kan reducere frigivelsen af andre mediatorer for 30 arrhythmia.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende ikke-begrænsende eksempler.

_ j DK 174934 B1 11 EKSEMPEL 1

Regulering af mastcelledeqranulerlnq med purlnnucleoti- det, 5-amlno-l-(β-D-rlbofuranosyl)imidazol-4-carboxa- 5 /»ΤΠ» — 1 J J \

Degranuleringen af mastceller spiller en vigtig i rolle i allergiske sygdomme, såsom astma. Et middel til at hindre degranulering tilvejebringer således en måde, 10 hvorpå sygdommen kan kontrolleres.

Mastcelleisolerinq

Til påvisning af øget ekskretion af adenosin fra 15 mastceller isoleredes cellerne først fra 250 g1s rotter ved udskylning af pleural- og peritonealhulerne med Ca++ “ og Mg++ -fri Tyrode puffer indeholdende 0,1 g ge- _____letlne og 5 mg heparin i 100 ml. Efter vaskninq af„cel-___ __ lerne én gang ved centrifugering ved 100 x g i ovenævn-20 te puffer resuspenderedes de i Tyrodes puffer indeholdende 0,1 g gelatine og l mg DNase pr. 100 ml puffer, filtredes gennem nylonsigtedug og suspenderedes med i en koncentration på 3-7 x 107 celler med cellekerner pr. ml. Dernæst rensedes mastcellerne på metrizamidgra-25 dienter ved at suspendere 2 ml af cellerne på 2-ml ! cushionstrukturer bestående af 22,5% (vægt/vol) metri-zamid i Tyrodes puffer med gelatine og DNase, og centrifugeredes ved 500 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.

De opnåede cellepellets vaskedes 2 gange og resuspende-30 redes med 5-10 x 106 celler med cellekerner pr. ml og 4-5 ml anbragtes på 30 ml af en 3-9% (vægt/vol) kontinuerlig metrizamidgradlent. Centrifugering ved 35 x g i 12 minutter ved stuetemperatur skilte de røde blodlege- i l - DK 174934 B1 12 mer fra mastcellerne. Mastceller opnået ved denne teknik udgør sædvanligvis mere end 90% af de pelleterede celler.

Virkning af AICA ribosld på deqranulerinq 5

Inhibering af degranulering med AICA ribosid påvistes ved at vise at AICA ribosid inhiberer degranulering induceret af calciumionophoren A23187, hvilket kommer til udtryk ved frigivelsen af syreexoglycosida-10 sen, B-hexosaminidase. A23187, 1 yg/ml, med eller uden AICA ribosid sættes til 2-5 x 106 mastceller ved 37 °C i Tyrodes puffer, og mængden af frigivet mastcelle B-hexosaminidase måles. Ved tilstedeværelse af 100 μ molær AICA ribosid frigives kun 17,6% B-hexosaminidase, 15 hvorimod der frigives 28,8% når AICA ribosid ikke er tilstede. AICA ribosid inhiberer således mastcellede-granulering. Den procentvise frigivelse af B-hexosaminidase og fremgangsmåden til måling af enzymet ' gennemførtes som beskrevet af Schwartz et al., Journal 20 of Immunology, Vol. 123, Oktober 1979, side 1445.

EKSEMPEL 2 AICA ribosld forøgelse af adenosinfriqivelse fra lym-25 phoblaster

Adenosin er en kendt inhibitor for visse sider af immunreaktionen. Et middel til regulering af adeno-sinkoncentrationer muliggør således gunstig behandling 30 af patienter, der lider af autoimmune sygdomme, da de sædvanligvis opstår som en følge af overaktive immun-cellereaktioner.

_i 13 DK 174934 B1

Isolering af lymphoblaster

Milt-lymfoblastcellelinien WI-L2 fra mennesker benyttedes til påvisning af virkningen af AICA ribosid ζ vs X Æ J — l-j -Λ- J _ ____ ~ QU9uvoxuj.ii^ivcj.oc· ^cxiciiiiicus luatuLie uy tsy mi— skaber er beskrevet af Hershfield et al., Science, Vol.

197, side 1284, 1977. Cellelinien opbevaredes i RPMI

1640 celledyrkningsmedier suppleret med 20% føtal kalveserum og 2 nM glutamin og dyrkedes i en atmosfære af 10 5% carbondioxid i luft. Da føtal kalveserum indeholder purinmetaboliserende enzymer til frembringelse af virkningen af AICA ribosid inkuberedes WI-L2 celler i RPMI 1640 medium suppleret med 20% varme-inaktivere, dialyseret føtal bovint serum, 2 mM glutamin og 10 mM 15 4-(2-hydroxyethyl)-18-piperazinethansulfonsyrepuffer, pH 7,4 (Calbiochem).

_[_____ _____yirknlnq_af_AICAribos.ld_påadenos.infrXqjLv.else___ _____________ 20 Fig. 1 viser at AICA ribosid, variende fra 100-500 ymolær, øger adenosinfrigivelse fra lymphoblaster.

Ca. 1,4 nanomol adenosin/10^ WI-2 celler ekscre-teres spontant og dette antal øgedes til ca. 2,3 nano-25 mol ved 500 ymolær ACIA ribosid.

Mængden af adenosin frigivet fra cellerne til supernatanten, eller mængden af nucleosider, der er tilbage i cellerne, bestemmes ved at blande 30 μΐ afkølet 4,4 N perchlorsyre til supernatanten eller 300 yl 30 afkølet 0,4N perchlorsyre til de pelleterede celler og centrifugering ved 500 x g i 10 minutter ved 4 °C .

Hver opnået supernatant neutraliseres med 660 yl af en opløsning indeholdende 2,4 g tri-n-octylamin (Alamin i_ DK 174934 B1 14 336) (General Mills) i 12,5 ml 1,1,2-trichlor-trifluor-ethon (Freon-113) opløsningsmiddelblanding som beskrevet af Khym, Clinical Chemistry, Vol. 21, side 1245, 1975. Efter centrifugering ved 1500 x g i 3 minutter 5ved 4 eC fjernes den vandige fase og nedfryses til -20 °C indtil der prøves for adenosin eller for nucleosi-der. Adenosin bestemmes isokratisk på en C-18-mikroBondapak omvendt fasekolonne ækvilibreret med 4 mmolær kaliumphosphat, pH=3,4:acetonitril 60% (95:5 10 vol/vol)-puffer. Adenosin elueres efter 8-10 minutter og dets identitet bekræftedes af dets følsomhed overfor adenosindeaminase og ved opløsning med adenosinstandar-der. De ekstraherede prøver fra de pelleterede celler kan desuden analyseres for nucleosider ved højtryksvæs-15kechromatografi på en Whatman Partisil-10 (SAX)kolonne ækvilibreret med 10 mmolær kaliumphosphat, pH=3,78, og elueret med en linær gradient til en 0,25 molær kaliumphosphat, 0,5 molær KC1, pH=3,45. Kontinuerlig måling gennemførtes ved absorbans ved 254 og 280 nm. Toppe be-20 stemmes kvantitativt ved sammenligning med højtryksvæs-kechromatografianalyser af egnede standarder.

EKSEMPEL 3 25 m vitro virkning af AICA ribosld på adenosinfriglv-else i neuroblastomaceller Ifølge opfindelsen

Neuroblastomacellelinier dyrkedes i medier og under betingelser som beskrevet i eksempel 2. Medierne 30suppleredes med 0,005 mM - 0,5 M AICA ribosid og mikro-molære mængder af calciumionophoren A23187. Under disse betingelser secrenerede cellerne mindst 2 gange mere adenosin end kontrolcellerne.

__i DK 174934 B1 15 EKSEMPEL 4

Virkning af ribavirin på mastcelledeqranulerlnq - Benmarv opnået fra Balb/C musefemurer dyrkedes 1 en 1:1 blanding af Razinmedier og konditionerede medier, fremstillet af co-dyrkede splenocyter fra C57B1/6J og C3H mus i nærværelse af concanavalin A som beskrevet af Razin et al., the Proc. Natl. Acad. Sci.

10 VSA 281 2559-2561, 1981. Efter ugentlig overføring og mindst 15 dage i vævskultur var de opnåede celler 90% rene mastceller og 95% levedygtige, målt med Trypan blå-eksklusion. Celler udsat for ribavirin under dyrkning vaskedes 3 gange før anvendelse i forsøg. Paral-15 leile cellekulturer dyrket i medier alene benyttedes som kontroller for farmakologisk manipulerede mastceller. Cellevæskt måltes ved celletællning på bestemte _;_____ __________ _ tidspunkter og sammenligning af det øjeblikkelige_antal_____ af ribavirin-behandlede celler med antallet af celler 20 dyrket i medier alene.

β-hexosaminidase valgtes som en repræsentativ granule-associeret preformet mastcellemediator, fordi den er let at mængdebestemme, og dens frigivelse næsten er nøjagtig parallel histamins frigivelse. Mastceller 25 fra musebenmarv centrifugeredes ved 200 x g i 5 minutter, vaskedes 3 gange i Tyrodes puffer, der ikke indehold divalente kationer, sensitiseredes i 30 minutter ved 37 °C med anti-DNP (dinitrophynylphosphat) igE (1 pg/10® celler), og udsattes for enten DNP-BSA antigen . ^ (175 ng/ 3 x 105 celler) eller A23187 (10 pg/ml/3 x 105 celler) i 400 μΐ fuldstændig Tyrodes puffer i 10 minutter ved 37 °c. Reaktionsblandinger centrifugeredes ved 200 x g i 10 minutter og supernatant- og pellet-β- 16 DK 174934 B1 hexosaminidase-koncentrationer prøvedes ved hydrolyse af p-nitrophenyl—β-D-glucosamid som beskrevet af Schwartz et al. i J. Immunol 123, 1445 (1979). Spontan β-hexosaminidase-frigivelse bestemtes hos ikke-udsatte 5 celler. Netto %-tallet af frigivet β-hexosaminidase defineres som følger:

Net% β-hex-frigiv. = super, [β-hex]_ -spontan 10 super, [β-hex] + pellet frigivet [β-hex] hvori [β-hex] er β-hexosaminidase og super. er supernatant. Når exogent adenosin var tilstede i reak-15 tionsblandingen tilsattes det samtidigt med det sekretionsstimulerende middel.

Mastceller fra musebenmarv udsat for A23187 eller DNP-BSA antigen frigav 8-15% af den totale celle β-hexosaminidase, en preformet, granule-associeret 20 mediator. Ribavirin (10 μΜ) tilsat samtidigt med mast-cellestimulering påvirker ikke β-hexosaminidase-frigivelse. Mastceller, der var inkuberet i 3-7 dage i 10 μΜ ribarvirin, vasket og udsat for A23187 udviste imidlertid en tydelig svækkelse af β-hexosaminidase-25 frigivelse i sammenligning med tilsvarende celler dyrket i medier alene (fig. 4). Udsættelse for ribavirin ændrede ikke mastcellemediatorindholdet (dvs. total celle β-hexosaminidasekoncentration) og heller ikke cellelevedygtighed, og spontanfrigivelse af β-30 hexosaminidase var ens i de to cellegrupper. Dosisreaktionsforholdet mellem ribavirin-udsættelse og pre-formet mediatorfrigivelse er vist i fig. 5. Til trods for at 1 μΜ ribavirin i 6 dage inhiberer mediatorfrigi- 17 DK 174934 B1 velse væsentligt, ligger maksimal inhibering tydeligt mellem ΙΟμΜ og 20 μΜ.

»

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til screening af purinnucleo-sidforbindelser eller analog heraf for deres evne til at øge den cellulære syntese og frigivelse af adenosin, kendetegnet ved, at man 5 a) til dyrkede celler administrerer en første blanding indeholdende purinnucleosidforbindelsen eller analoge heraf, som skal screenes, b) til nævnte dyrkede celler administrerer en calcium-ionophor eller 2-deoxyglucose, til aktivering af en netto adenosintrisphosphatkatabolisme, c) bestemmer koncentrationen eller mængden af adenosin frigivet af de dyrkede celler, og d) sammenligner koncentrationen eller mængden med koncentrationen eller mængden af adenosin frigjort fra 15 et eller flere sæt kontrolceller.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende tegnet ved, at de dyrkede celler omfatter en neuroblastoma-cellelinie.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende- ! 20 t e g n e t ved, at de dyrkede celler omfatter WI-L2 i menneske milt-lymphoblastcellelinien. « 4 _i DK 174934 B1 * 2.4-. « JS td S 22 u vo C 20·. s r w I.8-· / Di / ^ j - ' ω / 05 / x I.6- · J ω y z y' M / w / o / z I.4·/ ω t - D < I.2- Lol-1-1 | 1 1- I00 200 300 400 500 . AICA-R (MEDIERNES SLUTKONCENTRATION J),Vi) FIG. I o Η ω 40Γ w 30Γ 5 W I I ri KONTROL W ω u_i w Ο ^ RIBAVIRIN W « 5 30- tu Μ ω 20- £ (Λ < ω S 2 £ < Μ 2 S ζ 20 - ο I I '0- ο 33 χ . —3Ε~ι g 5- * * »i É 5- -ti ..1-¾¾--UL_ SPONTAN +A23IB7 x

2 Z 2 FIG. 2 Eh -v- O RIBAVIR FIG. C