DK175978B1 - Anvendelse af AICA-ribosid eller AICA-ribotid til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af hjerteanfald eller salgtilfælde i patienter, som lider af atherosklerose - Google Patents

Description

DK 175978 B1

Opfindelsen angår anvendelse af AICA-ribosid eller AICA-ribotid til fremstilling af et farmaceutisk præparat, som er egnet til behandling af hjerteanfald eller slagtilfælde i patienter, som lider af atherosklerose.

5 Adenosin, 9-P.-D-ribofuranosyladenin, det vil sige nucleosidet af purinadenin, tilhører klassen af biokemiske stoffer, der betegnes purinnucleosider og er et biokemisk nøglemolekyle til celleregulering som beskrevet af Fox og Kelly,

Annual Reviews of Biochemistry, Vol. 47, s. 635, 1978. Det vekselvirker med en lang række celletyper og er ansvarlig for en lang række biologiske effek-10 ter. For eksempel er adenosin en potent vasodilator, en inhibitor for immuncellefunktionen og kan på visse niveauer forøge aktiveringen af mastceller, er en inhibitor for granulocytproduktion af oxygenfrie radikaler, er anti-arrhytmisk, og er en hæmmende neurotransmitter. I betragtning af dets brede spektrum af biologisk aktivitet, har betragtelig indsats været rettet mod at 15 etablere praktiske terapeutiske anvendelser for adenosin og dets analoge.

Idet adenosin menes at virke på celleplasmamembranniveauet ved at binde til receptorer, der er forankrede i membranen, har det hidtidige arbejde omfattet forsøg på at forøge de ekstracellulære niveauer af adenosin ved indgift 20 af dette i blodstrømmen. Uheldigvis er adenosin toxisk ved koncentrationer^ der skal indgives til en patient for at opretholde et effektivt ekstracellulært terapeutisk niveau, og indgivelse af adenosin alene er derfor af begrænset terapeutisk anvendelse. Adenosinreceptorer er endvidere genstand for negativ feedback-regulering efter eksponering for adenosin, hvilket omfatter ned-25 regulering af receptorerne.

Andre måder til at opnå effekten af et højt lokalt ekstracellulært niveau af adenosin eksisterer og er ligeledes blevet undersøgt. De omfatter: a) interferenser i optagelsen af adenosin ved hjælp af reagenser, som specifikt bloke-30 rer adenosintransport som beskrevet af Paterson et al., Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 255, s. 402, 1975, b) fortlindring af adeno- DK 175978 B1 2 sinnedbrydningen som beskrevet af Carson og Seegmiller, The Journal of Clinical Investigation, Vol. 57, s. 274, 1976, og c) anvendelsen af adeno-sinanaloge, der er indrettet til at binde til adenosin-celle-plasmamembranreceptorer.

Γ 5

Der er et stort repertoire af kemikalier, som kan hæmme den cellulære optagelse af adenosin. Nogle gør det så specifikt, at de i det væsentlige er kom-petitive inhibitorer for adenosinoptagelsen, og andre hæmmer uspecifikt.

10 P-nitrobenzylthioguanosin forekommer at være en kompetitiv inhibitor, medens dipyridamol og en række andre kemikalier, hvilket omfatter colchicin, phenethylalkohol og papaverin hæmmer optagelsen uspecifikt.

Ekstracellulære niveauer af adenosin kan forøges ved anvendelsen af kemi-15 kalier, der hæmmer enzymatisk nedbrydning af adenosin. Tidligere arbejder har fokuseret på identifikationen af adenosindeaminase-inhibitorer, som deltager i konverteringen af adenosin til inosin. Adenosindeaminaseaktiviteten hæmmes af coformycin, 2'-deoxycoformycin og erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenin, hydrochlorid.

20

Et antal adenosinreceptor-agonister og -antagonister er blevet fremstillet med strukturmodifikationer i purinringen, ændringer i substituenter, der er vedhæftet til purinringen, og modifikationer eller ændringer i det site, hvor carbon-hydratdelen bindes. Halogenerede adenosinderivater forekommer at have 25 været de mest lovende som agonister eller antagonister, og som beskrevet af Wolff et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 252, s. 681, 1977, udviser de biologiske effekter i forsøgssystemer, som er sammenlignelige med effekterne, der skyldes adenosin.

30 Skønt alle tre ovenfor diskuterede teknikker har fordele i forhold til anvendelsen af adenosin alene, har de adskillige ulemper, hvoraf den væsentligste DK 175978 B1 3 ulempe er, at de bygger på kemikalier, som har ugunstige terapeutiske bivirkninger, især pga. det faktum, at de skal indgives i doser, som er toxiske, og at de påvirker de fleste celletyper ikke-selektivt. Som beskrevet i Purine Metabolism in Man, De Baryn, Simmonds og Muller, Plenum Press, New 5 York, 1984, bærer de fleste celler i kroppen receptorer for adenosin. Som følge heraf kan anvendelsen af teknikker, som forøger adenosinniveaueme alment overalt i kroppen, forårsage uønskede dramatiske åendringer i den normale cellulære fysiologi.

10 Med hensyn til "post-iskæmisk myokardialt væv" og adenosin er det bemærket hos J.L. Swain, J.J. Hines, R.L. Sabina og E.W. Holmes, Circulation Research 51, 102-105, 1982, og hos Holmes et al., US Patentskrift Nr. 4 575 498, der er meddelt 11. marts 1986, at adenosinkoncentrationer og blodstrømning ikke ændredes hos iskæmiske hundehjerter, der er eksponeret for 15 purinnucleosidet, 5-amino-4-imidazolcarboxamidribosid, AICA-ribosid. De bemærker ligeledes, at udtømning af purinnucleotid-reserver, især adeno-sintriphosphat (ATP), er blevet postuleret at spille en rolle i sådan en dysfunktion efter f.eks. et iskæmisk tilfælde, og de kræver at have demonstreret en forøget nucleotidsyntese og parallel genopfyldning af ATP-reserver ved 20 behandling af post-iskæmisk myokardium med det purin-analoge AICA-ribosid, idet de bemærker, at fyldningen af ATP-reserverne i teorien skulle muliggøre forbedringen af det ødelagte væv.

Flere andre grupper af forskere har imidlertid publiceret undersøgelser, i hvil-25 ke de er ude af stand til at demonstrere en forøget fyldning af ATP-reserver i iskæmisk væv ved fremgangsmåden af Swain et al., supra. R.M. Mentzer, S.W. Ely, R.D. Lasley, B.K. Lee og R.M. Beme, Fed. Proc. 43, 903, 1984; S.E. Mitsos, S.R. Jolly og B.R. Lucchesi, Pharmacology 31, 121-131, 1985; H.H. Hoffmeister, C. Nienaber, M. Mauser og W.E. Schaper, Basic Research 30 in Cardiology 80, 445-458, 1985; M. Mauser, H.H. Hoffmeister, C. Nienaber og W.E. Schaper, Circul. Res. 56, 220-230, 1985. Hoffmeister et al. demon- DK 175978 B1 4 strerer, at ATP-påfyldning ved hjælp af andre mekanismer ikke forbedrer kardial dysfunktion. Selv Holmes og Swain har dokumenteret, at AICA-ribosid ikke effektivt når til ATP pga. en hæmning af konverteringen af inosinmo-nophosphat, IMP, til adenosinmonophosphat, AMP. R.L. Sabina, K.H.

5 Kernstine, R.L Boyd, E.W. Holmes og J.L. Swain, J. Biol. Chem. 257.10178, 1982; T.M. Amidon, S. Brazzamano og J.L. Swain, Circ. Suppl. 72, 357, 1985; J.L. Swain, J.J. Hines, R.L. Sabina, O.L. Harburg og E.W. Holmes, J.

Clin. Invest. 74, 1422-1427, 1984. Amidon et al., supra, bemærker, at "Disse resultater indikerer, at adenylsuccinat-synthetase og/eller lyase-aktiviteter er 10 begrænsende i isolerede hjerter og foreslår, at indgreb, der er indrettet til at forløbe uden om IMP i AN-syntesen, adeninnucleotid-syntesen, vil kunne være mere fordelagtige til at forøge AN-reservestørrelsen". Swain et al., supra, J. Biol. Chem., demonstrerer ligeledes, at AICA-ribosid ikke ændrer ATP-niveaueme hos ikke-iskæmisk myokardium.

15

Mens Mitsos et al., supra, hævdede, at deres studier demonstrerede, at AICA-ribosid, som var indsprøjtet intrakoronart i høje doser, beskyttede iskæ-miske hjerter globalt mod den mekaniske dysfunktion, der er forbundet med et iskæmisk anfald viste Hoffmeister et al., Basic Res. Cardiol. 80, 445-458, 20 1985, ved at producere en reversibel iskæmi hos hunde ved koronararte- rieokklusion, at AICA-ribosidtilsætning ikke forbedrede den post-iskæmiske funktion, men i virkeligheden gjorde den værre. Swain et al., supra, J. Clin.

Invest., bekræfter de skadelige effekter af høje doser af AICA-ribosid på muskelkontraktilitet. Forslaget, at indgivelse af AICA-ribosid skulle være gun-25 stig for patienter efter et iskæmisk anfald til genopfyldning af ATP-reserver, forekommer derfor ikke at være gyldigt.

Fra den foregående diskussion må det påskønnes, at en teknik, som vil kunne forøge ekstracellulære niveauer af adenosin eller adenosinanaloge på 30 specifikke tidspunkter under et patologisk anfald, som vil kunne forøge mængden af disse forbindelser uden komplekse bivirkninger, og som vil kun DK 175978 B1 5 ne tillade de forøgede adenosinniveauer at være selektivt rettet mod celler, der vil kunne få størst nytte af dem, vil være af betragtelig terapeutisk nytte.

Sådan en teknik ville f.eks. især være nyttig til forhindring af eller som svar på et iskæmisk anfald såsom hjerteanfald eller -slag eller andre anfald, der 5 involverer en uønsket begrænset eller formindsket blodstrømning såsom ar-teriosklerose, idet adenosin er en vasodilator og forhindrer produktionen af superoxidradikaler. Sådan en teknik ville ligeledes være nyttig i den profylaktiske eller bekræftende behandling af patologiske tilstande, der involverer forøget cellulær excitation såsom inflammation pga. f.eks. granulocytaktive-10 ring ved hjælp af et komplement stammende fra blodkontakt med kunstige membraner, således som det forekommer med hjertelungemaskiner.

Et andet område af medicinsk vigtighed er behandlingen af allergisygdomme, som kan opnås ved enten at forhindre mastceller i at blive aktiveret eller ved 15 at interferere med mediatoreme for allergiske respons, som sekreteres af mastcelleme. Mastcelleaktivering kan nedreguleres ved hjælp af immuhtera-pi, allergiskud, eller ved mastcellestabilisatorer såsom natriumcromalyn, cor-ticosteroider og aminophyllin. Der er ligeledes terapeutiske midler, som interfererer med produkterne af mastcelleme såsom antihistaminer og adrenerge 20 stoffer. Virkningsmekanismen af mastcellestabilisering er ikke klart forstået. I tilfældet af aminophyllin er det muligt, at det virker som en adenosinreceptor-antagonist. Stoffer såsom natriumcromalyn og corticosteroiderne er imidlertid ikke helt forstået.

25 Nye fremgangsmåder beskrives til forøgelse af adenosinfrigørelsen især under netto-ATP-katabolisme, det vil sige under en tidsperiode af aftagende eller aftaget forhold mellem ATP-syntese og ATP-nedbrydning i celler eller cellulære rum.

30 Fremgangsmåder til at forstærke adenosinfrigørelsen udnytter indgivelse af forbindelser, som menes at ændre en eller flere af de biokemiske reaktions- DK 175978 B1 6 veje for adenosinmetabolismen, således at nettoresultatet er en forøget ek-stracellulær koncentration af adenosin, hvilket er et resultat af en eller flere processer omfattende forstærkende intracellulær produktion og/eller frigørelse af adenosin. Den forbindelse, der er nyttig ifølge opfindelsen er AICA-5 ribosid. Forbindelsen optages af cellerne og menes at blive konverteret til dens monophosphatform og i mindre udstrækning til dens triphosphatform.

Adenosin eller inosin genereres fra adenosintriphosphat under hurtig cellulær energianvendelse såsom under slagtilfældeaktivitet, arytmier eller en tilstand, 10 der resulterer i formindsket blodstrømning, iskæmi, såsom et hjerteslag, hjerteanfald eller angina. Normalt er produktionen af inosin under sådan et anfald større end produktionen af adenosin. I området med lav strømning under f.eks. koronarokklusion er forholdet mellem inosin og adenosin ca. 100:1. En vis procent af inosin og adenosin forlader efterfølgende cellen og er tilstede i 15 det umiddelbare ekstracellelære miljø. Forbindelsen, der er nyttig i de beskrevne fremgangsmåder, og som her søges beskyttet, er vist at forøge den ekstracellulære adenosinkoncentration, og produktionen af inosin er vist at være formindsket. Adenosinniveaueme ændres ikke signifikant overalt i patienten, idet ændringer i adenosinproduktionen kun foregår i områder med og 20 på tidspunkter for netto-ATP-anvendelse, og fordi adenosin hurtigt nedbrydes. Fremgangsmåderne, der er beskrevet, og som søges beskyttet, vil således forårsage en lokalt forøget koncentration af ekstracellulært adenosin i stedet for en systematisk eller generaliseret adenosinforøgelse.

25 Oxidation af lipoprotein med lav massefylde, LDL, er et af de første, hvis ikke det første, trin i processen for aterosklerose, en proces, der menes at involvere inflammation og at skyldes mononukleære celler og/eller granulocytakti-vering. De oxiderede lipider optages af makrofager for at danne aterosklero-seplaquen. Idet adenosin forhindrer produktionen af superoxidradikaler, skul-30 le forbindelserne ifølge opfindelsen, som forstærker adenosinfrigørelsen, dæmpe, forhindre eller ændre udviklingen af aterosklerose.

DK 175978 B1 7

Patienter, som lider af komplementmedieret granulocytaktivering efter eksponering for hjertelungemembraner eller mononukleær celleaktivering, burde ligeledes opleve en lindring ved behandling med forbindelserne, der er nyttige ifølge opfindelsen, idet ATP-katabolisme forventes at foregå under et in-5 flammatorisk respons.

Endvidere vil behandling med forbindelserne ifølge opfindelsen gavne patienter, der lider af forskellige sygdomme, der relateres til mastcelledegranule-ring. AICA-ribosid undertrykker mastcelleaktivering, hvilket omfatter forhin-10 dring af mastcelledegranulering. Formindsket mastcelleaktivitet vil ligeledes gavne patienter med reduceret blodgennemstrømning, fordi stoffer, der frigøres fra mastcelleme, kan forøge beskadigelse under iskæmi gennem processer såsom arytmier eller karspasme.

15 Det forventes, at forbindelser, der er nyttige ifølge opfindelsen, vil kunne ind gives effektivt i mængder på ca. 0,1-500 mg/kg/dag, fortrinsvis ca. 15-200 mg/kg/dag. Dette dosisområde skulle især være egnet for forbindelser, der er nyttige ifølge opfindelsen som profylaktiske midler til at forhindre vævsødelæggelse, der er forbundet med uønsket begrænset eller formindsket blod-20 strømning. Anvendelsen af mindst ca. 0,1 mg/kg/dag AICA-ribosid eller Al-CA-ribotid, fortrinsvis ca. 1,0-500 mg/kg/dag til nævnte profylakse, især ca.

20-100 mg/kg/dag forventes. I tilfældet af behandling af hjernesygdomme såsom hjerteslag, kan en dosis på mere end 200-500 mg/kg/dag være nødvendig pga. blod/hjeme-barrieren. Anvendelsen af hjernerettede pro-drugs 25 kan imidlertid muliggøre en mindre dosis.

Figur 1 viser de metaboliske reaktionsveje for adenosin.

Figur 2 viser in-vitro-effekten af 48 timers præinkubation med AICA-ribosid 30 på adenosinudskillelsen af humane lymfoblaster under ATP-nedbrydning.

DK 175978 B1 8

Figur 3 viser effekten af AICA-ribosidbehandling på koronarvene-adenosinkoncentrationer. Koronarveneblod blev indsamlet i kold 2 N perch-lorsyre på forskellige tidspunkter før og efter koronararterieokklusion. Super-natanter fra disse ekstrakter blev neutraliseret med alamin og freon og vurde-5 ret ved hjælp af "high performance liquid chromatography". Middel-adenosinkoncentrationer +/- standardafvigelser for fem saltvandsbehandlede (·) og seks AICA-ribosidbehandlede hunde (□) er afbildet.

Figur 4 viser in-vivo-effekter af AICA-ribosid på regional myokardial blod-10 strømning under koronararterieokklusion hos hunde. Regional myokardial blodstrømning blev målt ved anvendelse af radiomærkede mikrokugler, der var indgivet i det venstre atrium 5 minutter efter (åben) og 60 minutter efter (færdigudviklet) okklusion. Middelværdierne plus standardafvigelserne er afbildet. Asteriksen (*) identificerer forskelle fra saltvandsbehandlede hunde, 15 der er signifikante med p < 0,01.

Figur 5 viser en sammenligning af effekterne af AICA-ribosidbehandling (#) og kontrolbehandling indeholdende kun saltvand (□) på inosinniveauer hos hunde.

20

Figur 6 viser effekterne af 18 timers præinkubation med AICA-ribosid på ade-nosinudskillelsen af humane lymfoblaster under ATP-nedbrydning.

Figur 7 viser effekter af 3 timers præinkubation og 4 timers inkubation med 25 AICA-ribosid på in-vitro-adenosinudskillelsen af humane lymfoblaster under ATP-nedbrydning.

Figur 1 illustrerer reaktionsvejene, ad hvilke adenosin fremstilles og nedbrydes inde i celler. Adenosin kan transporteres ind i celler eller frigøres fra cel-30 ler. Metabolismen af adenosin kan benytte nogle af disse reaktionsveje: 1, S-adenosylmethioninmethyltransferase; 2, S-adenosylhomocysteinhydrolase; DK 175978 B1 9 3, adenosindeaminase; 4, purinnucleosidphosphorylase; 5 & 6, xanthinoxida- j se; 7, transportmekanisme; 8, adenosinphosphorylase (ikke etableret hos ! mennesker); 9, adenosinkinase; 10, 5'nucleotidase og uspecifik phosphatase; 11, adehylatkinase; 12, nucleosiddiphosphokinase; 13, adenylatcyclase; 5 14, AMP-deaminase og 15, adenylosuccinatsynthetase og adenylosuccinat- lyase.

Som beskrevet i yderligere detaljer nedenfor er effekten af AICA-ribosid på ekstracellulære adenosinkoncentrationer blevet demonstreret både in vitro og 10 in vivo. For at overføre disse molekyler til patienter forventes det, at de kan blive indgivet oralt, idet forbindelserne ifølge opfindelsen ikke let nedbrydes af ekstracellulære enzymer i legemet eller ved eksponering for lavt pH, der er tilstede i maven. Disse lægemidler kan ligeledes indgives intravenøst, ved direkte intramuskulær injektion, subkutant, topisk til huden eller mukøse 15 membraner, rektalt eller ved inhalation. Præparater, der er acceptable til farmaceutisk anvendelse, er velkendte. Pro-drugs kan ligeledes anvendes, det vil sige de lægemidler, som metaboliserer til de aktive former af forbindelserne, som søges beskyttet, når disse pro-drugs introduceres i legemet.

20 Da AICA-ribosidet kan metaboliseres til urinsyre, kan dette stof anvendes sammen med allopurinol eller andre lægemidler, der forhindrer urinsyresyntese.

Forbindelserne kan anvendes til at forøge ekstracellulære koncentrationer af 25 adenosin og derfor til behandling af hjerteanfald eller hjerteslag i patienter, som lider af atherosklerose, ved indgift af forbindelserne ifølge opfindelsen.

Ved kontakt med cellerne menes det, at forbindelserne, der er nyttige ifølge opfindelsen, trænger ind i cellen, hvor de phosphoryleres af adenosinkinase 30 eller i tilfældet af indgivelse af en base, og hvor de kan konverteres til et DK 175978 B1 10 nucleotid ved hjælp af et phosphoribosyltransferaseenzym for at danne et nucleotidmonophosphat og sidenhen ligeledes nucleosidtriphosphatet.

Triphosphatformen kan omfatte en reserve for nedbrydningen til mo-5 nophosphatformen.

Skønt ikke at være begrænset til den følgende foreslåede virkningsmåde, postuleres det, at forbindelserne ifølge opfindelsen eller deres metabolitter hæmmer et eller flere enzymer i de biologiske reaktionsveje for adenosin, 10 hvilket omfatter AMP-deaminase, og således fører ATP mere mod den cellulære produktion af adenosin og adenosinfrigørelse, og mindre mod genoptagelsen af adenosin, og parallelt fører den væk fra den cellulære produktion af inosin og frigørelse af inosin.

15 Forbindelserne, der er nyttige ifølge opfindelsen, kan med andre ord forstærke adenosinfrigørelsen uden direkte at blive metaboliseret til adenosin. AICA-ribosid har biokemiske egenskaber, der er sammenlignelige med egenskaberne for ribavirin og forekommer at forstærke adenosinfrigørelsen ved en lignende mekanisme fremfor en kredsløbsmæssig konvertering til adenosin.

20 Forbindelsen er påvist ikke at virke ved genopfyldning af ATP-reserver.

Figur 1 viser, at adenosin primært metaboliseres ad to reaktionsveje. Først, som vist ved reaktionsvej 3, kan adenosin kataboliseres af enzymet adeno-sindeaminase for at danne inosin. Inosin nedbrydes dernæst for størstede-25 lens vedkommende enten yderligere af enzymerne, der er repræsenteret ved reaktionsvejene 4, 5 og 6 eller føres ud af cellen på tværs af plasmamembranen. Transportmekanismen 7, som muliggør transport af adenosin hen over den cellulære plasmamembran i begge retninger, er vist.

Adenosin kan ligeledes anaboliseres ved hjælp af enzymet adenosinkinase, 30 der er repræsenteret ved 9, til adenosinmonophosphat, AMP, eller til S-adenosylhomocystein ved hjælp af S-adenosylhomocysteinhydrolase, der er i ( DK 175978 B1 11 repræsenteret ved 2 afhængigt af, om homocystein er til rådighed. Den førnævnte reaktion er en energikrævende reaktion. AMP påvirkes dernæst enten af enzymet AMP-deaminase (14) for at danne inosinmonophosphat, IMP, eller anaboliseres yderligere af forskellige enzymatiske reaktioner for at dan-5 ne adenosintriphosphat, ATP, eller cyklisk-AMP. Hæmning af adnosinkinase eller S-adenosylhomocysteinhydrolase kan indirekte føre til en formindskelse i optagelsen af adenosin.

Med henvisning til eksemplerne l-ll på frigørelsen af adenosin er det med 10 resultaterne på figurerne 2, 3 og 6-7 vist, at tilstedeværelsen af AICA-ribosid under ATP-katabolismen forøger cellulær frigørelse af adenosin og parallelt formindsker cellulær frigørelse af inosin, se eksempel III og figur 5, hvilke foreslår, at der er en hæmning af konverteringen af AMP til IMP, eller at der er en hæmning af konverteringen af adenosin til inosin.

15

Cellekulturforsøgene i eksempel I viser, at AICA-ribosid forøger den cellulære frigivelse af adenosin selv i tilstedeværelse af 2-deoxycoformycin, der er en potent inhibitor for enzymet adenosindeaminase. Det forekommer derfor, at forbindelserne ifølge opfindelsen har deres virkning på et sted i adenosin-20 reaktionsvejen, som er forskellig fra eller i sammenhæng med reaktionen, der katalyseres af adenosindeaminase. Forbindelserne menes at hæmme konverteringen af AMP til IMP ved at forstyrre virkningen af enzymet AMP-deaminase.

25 Det er ligeledes muligt, at forbindelsen ifølge opfindelsen hæmmer den enzymatiske konvertering af IMP til inosin ved 5'-nucleotidase, hvorved nedbrydningen af IMP formindskes, hvilket resulterer i en forøgelse i graden af cellulær frigørelse af adenosin. Forbindelsen ifølge opfindelsen kan endvidere direkte eller indirekte hæmme cellulær genoptagelse, phosphorylering eller 30 deaminering af adenosin.

DK 175978 B1 12

Sammenfattende er en mulig reaktionsvej, der muliggør de gavnlige effekter, der ses sammen med forbindelsen, der er nyttige ifølge opfindelsen, indtrængningen i cellen, hvor den bliver phosphoryleret til dens monophosphat-form. Monophosphatformen af forbindelsen, som søges beskyttet, hæmmer 5 AMP-deaminase. Under ATP-katabolisme forøges AMP-reserven mere i behandlede celler end i ikke behandlede celler, fordi AMP ikke længere er i stand til at bevæge sig så let hen til IMP. Delingen af purinmonophosphat resulterer i en højere cellulær frigørelse af adenosin med en ledsagende lavere cellulær frigørelse af inosin. Idet adenosin forekommer at være en na-10 turlig gavnlig mediator under visse patologiske anfald, er forstærkningen af dets frigørelse ved at kanalisere ATP til adenosin i stedet for til inosin en ny og ekstrem vigtig behandlingsfremgangsmåde.

Under et hjerteanfald frigøres normalt adenosin, og det assisterer i oprethol-15 delsen af de iskæmiske kars åbenhed under vasodilation og hæmning af granulocytproduktion af frie radikaler og ledsagende mikrovaskulær tilstopning, som beskrevet nedenfor. Forbindelserne, der er nyttige ifølge opfindelsen, forøger adenosinfrigørelsen og forstærker derfor den normale beskyttelseseffekt af adenosin under sådan et iskæmisk anfald.

20

Medens frigørelsen af adenosin til tider er en gavnlig begivenhed, kan høje adenosinniveauer i områder, hvor dette ikke kræves, være skadelig. Et fortrin ved den beskrevne opfindelse, som søges beskyttet, er, at patienten ikke behandles med adenosin selv, og at forbindelserne, der er nyttige ifølge op-25 findelsen, selektivt forøger adenosinfrigørelsen fra celler, i hvilke der er en netto-ATP-nedbrydning. Det er derfor kun celler i nærheden, som behandles. Behandlingen af patienter med forbindelser, der er nyttige ifølge opfindelsen, muliggør målrettet forøget adenosinfrigørelse, der er specifik for vævet, som undergår netto-ATP-katabolisme, det vil sige væv, som har behov for adeno-30 sinfrigørelse. De systematiske effekter af adenosinindgift undgås. Ydermere frigives adenosin kun på det specifikke tidspunkt, hvor det kræves. Alle syg- DK 175978 B1 13 ! i domme og patologiske tilstande, der er beskrevet her, involverer eller menes at involvere lokal netto-ATP-katabolisme.

Endvidere er celler, der vil respondere gavnligt på adenosin, mere responsi-5 ve, end de ellers ville være, hvis de blev badet kontinuert i højere adenosin· koncentrationer. Da adenosin blot er til rådighed i det øjeblik, hvor det behøves, eksponeres receptorer på overfladerne af cellerne såsom granulocytter og glatte muskelceller ikke kontinuert og har derfor et meget større respons, når deres adenosinreceptorer ikke er blevet nedreguleret af kontinuert ade-10 nosineksponering.

Udover at forårsage vasodilation gennem frigørelse af adenosin, kan forbindelserne ifølge opfindelsen forøge kollateral blodstrømning ved hjælp af en anden mekanisme. Undersøgelser har vist, at i området med begrænset 15 blodstrømning bliver granulocytterne aktiverede, frigiver oxygenfrie radikaler, og sidder efterfølgende fast i og ødelægger mikrovaskulaturen. Lægemidler, der er nyttige ifølge opfindelsen, forhindrer gennem forøget adenosinfrigørel-se granulocytter i at producere frie radikaler, og granulocytter sidder derfor mindre fast i mikrokarene, se eksempel V, hvilket tillader blodstrømning fra 20 kollaterale kar ind i det blokerede område. Optagelsen af opfindelsens forbindelser af muskel-og/eller endotele celler fulgt af efterfølgende frigørelse af adenosin under iskæmi skulle forårsage vasodilation og/eller undertrykkelse af granulytaktivering og hæmme ledsagende tilstopning og ødelæggelse af mikrovaskulaturen, og dermed føre til en reduktion i ødelæggelsen af kardi-25 almusklen.

Som vist i eksemplerne IV og VI er et vigtigt aspekt af opfindelsens forbindelser, at de kan indgives som profylaktiske stoffer. Når lægemidlet er tilstede forud for et iskæmisk anfald, slagtilfældeaktivitet eller andre legemstilstande, 30 imod hvilke behandlingen rettes, kan netto-nedbrydningen af ATP i større udstrækning være rettet mod adenosin fremfor inosin.

14 DK 175978 Bl

Hvis lægemidlet indføres i en patient for at nå et iskæmisk område efter eller under et anfald, som forårsager iskæmien, er der en lille eller ingen evne til at rette ATP-nedbrydningen mod adenosin på det område, fordi mål-ATP-reserveme tømmes relativt hurtigt. Fordi mange af de ødelæggende anfald 5 under iskæmi forekommer hurtigt, skal lægemidlet ligeledes ideelt set være tilstede på så tidligt et tidspunkt som muligt. Med lægemidlet tilstede som et profylaktisk stof, er der ligeledes mulighed for, at processen, som søges at blive afbrudt, kan blive gjort langsommere tidligt nok til at forhindre en permanent beskadigelse. Den forøgede mikrovaskulære blodstrømning fra va-10 sodilation og den formindskede klæbighed af hvide blodlegemer vil kunne opretholde den mikrovaskulære åbenhed, såvel som på en måde hjælpe til ved bortvaskningen af klumper, klumpefremmende materialer eller andre skadelige stoffer fra de proksimale aterosklerotiske områder.

15 Andre faktorer gør det vigtigt at indgive lægemidlet før eller under et iskæmisk anfald. Hvis et lægemiddel indgives efter en blokade, er det mindre i stand til at nå det involverede væv, fordi der er en lille eller ingen blodstrømning til dette område. Se eksempel II og figur 4. Det menes ligeledes, at f.eks. AICA-ribosid metaboliseres til AICA-ribotid, og at dette er den aktive . 20 form af molekylet. Dette er en energikrævende reaktion, der anvender ATP.

Hvis ATP ikke er til rådighed pga. høj metabolisk aktivitet og/eller forøget ATP-destruktion, kan AICA-ribosid eller et lignende lægemiddel ikke tilvejebringes i dets aktive form. Under hurtig ATP-nedbrydning kan inosin i cellen være i væsentlig konkurrence med lægemidlet for at komme ind i cellen, idet 25 begge forbindelser er purinnucleosidanaloge. j i t j

Opfindelsens forbindelser forestilles at være til gavn i kombination med visse andre behandlingsformer, som beskrevet nedenfor. Idet opfindelsens forbindelser, når disse indtages profylaktisk, forøger adenosinfrigørelsen under et 30 akut iskæmisk anfald, vil en patient med hjerteanfald, der undergår sådan en behandling, have en større chance for ikke at dø af en pludselig arytmi før DK 175978 B1 15 ankomsten til et hospital. Endvidere vil det mikrovaskulære leje være beskyttet i den periode, hvor patienten overføres til hospitalet, og før yderligere terapi kan iværksættes.

5 Ofte er et akut iskæmisk anfald stille i nogen tid, og der er en yderligere forsinkelse, før patienten erkender det, der er ved at ske og søger hjælp. Når medicinsk hjælp når frem til patienten, selvfølgelig når en ambulance ankommer, eller når patienten når frem til hospitalet, kan patienten blive givet trombolytisk terapi. Trombolytisk terapi såsom infusionen af vævsplasmino-10 genaktivator, t-PA, streptokinase, urokinase eller antikoagulerende midler såsom heparin eller Coumarin sigter alle mod at åbne en proksimal okklu-sion, således som det forekommer under et hjerteanfald eller hjerteslag. Patienten har løbende behov for at modtage denne behandling inden ca. 4 timer fra et akut iskæmisk anfald. Efter flere timer er der irreversibel skade på væ-15 vet især det mikrovaskulære leje. Hvis patienten profylaktisk indtager AICA-ribosid eller en anden af opfindelsens forbindelser, vil patientens mikrovasku-lære leje være beskyttet længere pga. tilstedeværelsen af forøget adenosin.

Den forøgede adenosinfrigørelse forhindrer superoxidfri radikalproduktion 20 og/eller granulocyttilstopning og beskadigelse af mikrokarrene. Patienten skulle derfor være beskyttet i en længere tidsperiode efter det akutte iskæ-miske anfald. For eksempel vil det stadig 8-16 timer efter en kardiovaskulær okklusion være muligt at igangsætte en af disse trombolytiske terapier for at åbne en proksimal læsion. Igen, åbningen af en proksimal læsion er kun til 25 gavn, hvis mikrokar længere nede ad strømmen er i stand til at blive udskyllet.

Den forbindelse, der er nyttig ifølge opfindelsen, vil ligeledes være til gavn i kombinationer med trombolytiske midler såsom vævsplasminogenaktivatorer såvel som andre midler, som enten er frie radikalrensemidler eller forhindrer j 30 produktionen af frie radikaler. Eksempler på frie radikalrensemidler er supe- ' i roxiddismutase, et protein, som indgives ved infusion efter et iskæmisk an- i DK 175978 B1 16 fald, eller materialer, som har mindre eftervist effektivitet såsom catalase, acetylcystein, dvs. mucomyst, vitamin E, gluthathion og selen. Eksempler på forbindelser, som menes at forhindre fri radikalproduktion er allopurinol ved dets hæmning af xanthinoxidase og eicospentansyre ved dets nedregulering 5 af prostaglandinmetabolitter, og endelig antistoffer mod visse receptorer på aktiverede granulocytter, som forhindrer deres fastklæbning i mikrokar. Den forbindelse, der er nyttig ifølge opfindelsen via forhøjet adenosin, hæmmer det NADPH-oxidase-friradikal-genererende system hos granulocytter og burde derfor ligeledes være nyttige, når de kombineres med stoffer såsom allo-10 purinol, som hæmmer produktionen af frie radikaler fra xanthinoxidase.

Resultaterne fra eksempel VII viser tilsvarende, at AICA-ribosid hæmmer aktivering, dvs. leukotrien-C4-frigørelse, og degranulering, dvs. β-hexo-saminidasefrigørelse, fra mastceller.

Ί5

For at bidrage til forståelsen af opfindelsen følger resultaterne af en række forsøg.

Eksempel I

20 AICA-ribosidforstærkninq af adenosinfriqørelse af Ivmfoblaster

Med hensyn til den forstærkede in vitro frigørelse af adenosin ved hjælp af $ fremgangsmåden, der søges beskyttet, blev en human milt-lymfo-25 blastcellelinie, WI-L2, anvendt til at demonstrere effekten af AICA-ribosid på adenosinfrigørelse. Historien og egenskaberne af cellelinien er blevet beskrevet af Hershfield et al., Science, Vol. 197, s. 1284, 1977. Cellelinien blev holdt i RPMI-1640-celledyrkningssubstrat, der var forsynet med 20% føtal kalveserum og 2 mM glutamin og varierende koncentrationer af AICA-ribosid 30 og dyrket i 48 timer i en atmosfære med 5% CO2 i luft. Føtal kalveserum indeholder puriner og purin-metaboliserende enzymer, og for at etablere effek- DK 175978 B1 17 ten af AICA-ribosid under eksponering for 2-deoxyglucose blev WI-L2-cellerne inkuberet i RPMI-1640-substrat, der var forsynet med 10% varmei-naktiveret og dialyseret føtal okseserum, 2 mM glutamin og 1 μΜ deoxyco-formycin.

5

Katabolisme af cellulære ATP-reserver blev stimuleret ved tilsætning af enten 2-deoxyglucose eller en calciumionophor. På forskellige tidspunkter blev mængden af frigjort adenosin fra cellerne til supematanten eller mængden af nucleotider, der var tilbage i cellerne, bestemt ved at blande 30 μΙ kold 4,4 N 10 perchlorsyre med 300 μΙ supernatant eller ved tilsætning af 300 μΙ kold 0,4 N perchlorsyre til cellerne, der indsamledes som småkugler, og blandingerne blev centrifugeret ved 500 x G i 10 minutter ved 4°C. Hver resulterende supernatant blev neutraliseret med 660 μΙ opløsning indeholdende 2,4 g tri-n-octylamin, Alamin 336 fra General Mills, i 12,5 ml 1,1,2-trichlor-1,2,2-15 trifluorethan-opløsningsmiddel, Freon-113, som beskrevet af Khym, Clinical Chemistry, Vol. 21, s. 1245, 1975. Efter centrifugering ved 1500 x G i 3 minutter ved 4°C fjernedes den vandige fase og blev nedfrosset til -20°C indtil afprøvning for adenosin, inosin eller for nucleotider. Adenosin blev evalueret isokratisk på en C-18 mikroBondapak-omvendt fasekolonne, der var bragt i 20 ligevægt med 4 mM kaliumphosphat, pH 3,4 og 60% acetonitril i vandig buffer (95:5 v/v). Adenosin eluerede ved 8-10 minutter, og dets identitet blev f bekræftet ved dets følsomhed overfor adenosindeaminase og ved at tilsætte små mængder adenosinstandarder. De ekstraherede prøver fra cellekuglen blev analyseret for nucleotider ved "high pressure liquid chromatography" på 25 en Whatman Partisil-10, SAX, kolonne, der var bragt i ligevægt med 10 mM kaliumphosphat, pH 3,78, og elueret med en lineær gradient af 0,25 M kaliumphosphat, 0,5 M KCI, pH 3,45. Kontinuert overvågning blev udført af ab-sorbansen ved 254 og 280 nm. Toppen blev kvantificeret ved sammenligning med "high pressure liquid chromatography’-analyse af passende standarder.

30 DK 175978 B1 18

Figur 2 viser, at 48 timers AICA-ribosid-forbehandling over et område på 100-500 μΜ forstærker adenosinfrigørelsen fra lymfoblaster. Ca. 1,4 nmol adeno-sin/106 WI-L2-celler udskilles uden tilstedeværelsen af lægemidler ifølge opfindelsen, og dette antal forøges til ca. 2,3 nmol for 500 μ M AICA-ribosid. Når 5 cellerne præinkuberes med AICA-ribosid i 18 timer før eksponering for 2-deoxyglucose, forekommer en forøget adenosinfrigørelse, som vist på figur 6. Tre timers præinkubation og fire timers inkubation under 2-deoxy-glucosebehandling med AICA-ribosid, figur 7 resulterer ligeledes i en forøget adenosinfrigørelse. Celler blev dyrket til ca. 0,5 x 106 celler/ml (middel- 10 logfase) på figur 2 og til ca. 1,0 x 106 celler/ml (tidlig stationær fase) på figur 7.

Eksempel II

15 ln-vivo-virkninger af AICA-ribosid på adenosinniveauer og forøget blod-strømning hos hunde

Forsøg blev udført på hunde for at teste for forøgede adenosinniveauer pga. AICA-ribosidbehandling og den ledsagende forøgelse i blodstrømningen som 20 resultat deraf.

Figurerne 3 og 4 viser resultaterne af en anden forsøgsrække, der blev udført for at demonstrere virkningerne af AICA-ribosid på adenosinniveaueme i blod og for at korrelere forøgelsen i adenosin med forøget blodstrømning. Tretten 25 bastardhunde blev bedøvet med phenobarbital. Forreste koronarvene blev ilagt kanyle, og en blodprøve blev indsamlet i 2 N perchlorsyre. Saltvand eller 100 mM AICA-ribosidsaltvand blev tilfældigt udtaget til infusion med en hastighed på 1 ml/min i den femorale vene i 45 minutter før koronararterieok-klusion. Koronært veneblod blev indsamlet og afprøvet for adenosin på en 30 måde, der er lig assayet, der er beskrevet i eksempel I, ved 5 minutter før okklusionen og 1, 10, 20, 30 og 50 minutter efter okklusionen af den venstre DK 175978 B1 19 nedadgående forreste koronararterie, så vel som 1 minut efter gennemskylning. Regional myokardial blodstrømning blev målt med 15 pm radiomærkede kugler, der blev indgivet ved infusion i det venstre atrium 5 og 60 minutter under den iskæmiske periode, som beskrevet af Heymann et al., Prog. C.V.

5 Dis. 20, 55, 1977. Elektrokardiogrammet og arterietrykket blev overvåget under den iskæmiske periode. Seks AICA-ribosidbehandlede og 5 saltvandsbehandlede hunde overlevede proceduren. To af de overlevende saltvandsbehandlede dyr fibrillerede. Koncentrationen af AICA-ribosid i AICA-ribosidbehandlede hunde umiddelbart før okklusionen var 57,4 +/- 40,2 pM.

10 Området var 4,4-100 μΜ.

Figur 3 viser, at adenosinniveauerne i blod, der udtages fra et iskæmisk område, forøges dramatisk i AICA-ribosidgennemskyllede hunde. Før iskæmi havde ingen af hundene måleligt venøst adenosin, dvs. < 0,01 pM, før og 15 under AICA-ribosid eller saltvandsinfusionen. De saltvandsbehandlede dyr havde et top-adenosinniveau 10 minutter efter okklusionen på 0,22 +/- 0,08 pM, som faldt til et ikke-detekterbart niveau efter 60 minutter. I modsætning hertil havde AICA-ribosidbehandlede dyr et top-adenosinniveau 1 minut efter iskæmi på 1,79 +/- 0,35 pM, som forblev forhøjede 60 minutter efter, dvs.

20 0,18 +/- 0,15) Gennemskylning resulterede ikke i en detekterbar adenosinud- vaskning hos saltvandsbehandlede dyr men i en signifikant stigning hos AICA-ribosidbehandlede dyr. Blod fra det højre atrium, dvs. udtagning af sy- i stemblod, havde intet detekterbart adenosin hos saltvands- og AICA-ribosidbehandlede hunde.

25

Figur 4 viser, at regional myokardial blodstrømning til det iskæmiske myokar-dium var signifikant større hos AICA-ribosid- end hos saltvandsbehandlede dyr. En tilsvarende grad af forskel i strømning blev set i endokardiet og epi-kardiet, og der var ingen ændringer mellem 5 og 60 minutters iskæmi. AICA-30 ribosid ændrede ikke strømningen til normalt myokardium, idet strømningshastighederne i det ikke-iskæmiske væv er bemærkelsesværdigt ens mellem DK 175978 B1 20 de to grupper. Systemarterielt tryk og hjertehastighed ved 5 og 60 minutter viste ingen signifikante forskelle mellem de to grupper af hunde. Arterielt blodgasindhold og systemvenøse granulocyttællinger var ikke signifikant forskellige mellem de to grupper. AICA-ribosid menes derfor at forstærke kolla-5 teral koronarstrømning til iskæmisk myokardium, som indikeret ovenfor, ved forøgelse af lokal adenosinfrigørelse, og således vasodilatere kar i det iskæ-miske område og/eller hæmme fri radikalproduktion og efterfølgende kapil-lærødelæggelse og/eller tilstopning.

10 Eksempel III

Virkning af AICA-ribosidbehandlinq på inosinniveauer hos hunde

At forøgelsen i adenosinniveauerne i det mindste delvist skyldes en reduktion 15 i mængden af ATP, som konverteres til inosin, blev vist ved analyse for inosinniveauer i venøst blod hos hunde i eksempel III. Figur 5 viser en mere end to ganges formindskelse i inosinniveaueme over 60 minutters afprøvningsperioden for AICA-ribosidbehandlede hunde. Disse data viser, at forbindelserne ifølge opfindelsen forøger adenosinfrigørelsen ved at redirigere katabolismen 20 af ATP fra det normalt hyppigere forekommende slutprodukt inosin til adeno-sin.

Eksempel IV

25 Virkning af AICA-ribosidbehandlinq på mvokardial infarkt- størrelse

Virkningen af AICA-ribosidbehandling på myokardial infarktstørrelse blev bestemt hos rotter, der blev indgivet en bolus af enten AICA-ribosid i saltvand eller saltvand alene og dernæst ved at inducere begrænset blodstrømning 30 ved at afsnøre den venstre nedadgående forreste koronararterie. Dyrene blev ved infusion kontinuert eksponeret for enten AICA-ribosid i saltvand eller DK 175978 B1 21 saltvand alene ved anvendelse af osmotiske minipumper, der er velkendte for fagmanden. Efter tre uger blev rotterne aflivet, og infarktstørrelsen kvantificeret ved planimetri af de farvede områder af fikserede hjerter. Resultaterne viste, at der for AICA-ribosidbehandlede hjerter er en reduktion af infarktstør-5 reisen på 33% sammenlignet med saltvandsbehandlede kontroller, p < 0,05.

Eksempel V

Virkning af adenosin på qranulocvt/endotelcelleinteraktion 10

Forsøg blev iværksat for at demonstrere, om adenosin reducerer den adhæsive affinitet eller "klisterevnen" af granulocytter over for endothele celler, det vil sige en begivenhed, som burde forøge blodstrømningen i mikrokarrene.

Den målte parameter var brudspændingen mellem de to celletyper.

15

Adenosin mindsker brudspændingen mellem granulocytter og endotelceller, som afgrænser væggene af karrene, med en faktor 2 målt ved en to ganges forøgelse i rullehastigheden af granulocytter i mikrokar, der er eksponeret for adenosin ved overskylning med en 20 μΜ opløsning, og som giver en kon-20 centration på ca. 2 μΜ i karret. Disse forsøg blev udført ved intravital mikroskopoptagelse af granulocytter i mesenterielle mikrokar hos rotter. Rullehastigheden af granulocytter sammenlignet med strømningshastigheden af røde blodlegemer blev beregnet før og efter indgivelse af adenosin.

25 Eksempel VI

Virkning af AICA-ribosid på qranulocvtakkumulerinqen i iskæmisk mvokar-dium 30 AICA-ribosid formindsker akkumuleringen af 111ln-mærkede granulocytter i iskæmisk myokardium. Hos en række hunde, som beskrevet i eksempel III, DK 175978 B1 22 | blev granulocytter fjernet og mærket med 111ln og genindsprøjtet ved infusion. Efter 1 times iskæmi blev dyrene aflivet, og granulocytterne kvantificeret i myokardialt væv ved bestemmelse af indium11’-indholdet i myokardiale biop-sier ved anvendelse af en gamma-tæller. Granulocytindholdet i det iskæ-5 miske endokardium var signifikant mindre hos AICA-ribosidbehandlede hunde, 1,03 +/- 0,21 x 106 celler/g, end hos saltvandsbehandlede dyr, 1,55 +/-0,24 x 106 celler/g. Bestemmelse af kollateral blodstrømning ved hjælp af radiomærkede mikrokugler gav i det væsentlige identiske resultater til de resultater, der er vist i eksempel III, det vil sige blodstrømning hos AICA-10 ribosidbehandlede hunde var signifikant større end hos saltvandsbehandlede dyr.

Claims (9)

23 DK 175978 B1

1. Anvendelse af AICA-ribosid eller AICA-ribotld til fremstilling af et farmaceu- , 5 tisk præparat, som er egnet til behandling af hjerteanfald i patienter, som li der af atherosklerose.

2. Anvendelse af AICA-ribosid eller AICA-ribotid til fremstilling af et farmaceutisk præparat, som er egnet til behandling af slagtilfælde I patienter, som lider 10 af atherosklerose.

3. Anvendelse ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at mængden af det indgivne AICA-ribosid eller AICA-ribotid er fra 15 mg/kg/dag til 200 mg/kg/dag., 15

4. Anvendelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at AICA-ribosidet eller AICA-ribotidet indgives profylaktisk i mængder fra 20 mg/kg/dag til 100 mg/kg/dag.

5. Anvendelse ifølge kravene 1 og 2, kendetegnet ved, at lægemidlet yderligere indeholder en farmaceutisk acceptabel mængde af et trombolytisk stof.

6. Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det trombolytiske stof 25 er valgt blandt vævsplasminogenaktivator, streptokinase, urokinase, heparin og coumarin.

7. Anvendelse ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at lægemidlet yderligere indeholder allopurinol. 30 DK 175978 B1 24

8. Anvendelse ifølge et vikårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at indgivelsen udføres oralt, intramuskulært, topikalt, rektalt eller ved | inhalation.

9. Anvendelse ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at indgivelsen udføres intravenøst.