JPS63502161A - ヒトｔ−細胞リンパ球指向性ウイルスタイプ３の複製を抑制するプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＴ−４リンパ干、′ロ　ウィルスタイプ■の　卸　るブースミド 一発」ＬΩ」Ｌ屡− シス及びトランス配置に作用するウィルス調整因子によるウィルス遺伝子の転写 ・の活性化の現象、は、ＤＮＡ騰写活写活性化遺伝子ヒトのレトロウィルスにお いて発見されており、特にウィルス遺伝子の発現に関係している。

ヒトＴ−細胞リンパ球指向性ウィルスタイプＤＩ（ＨＴＬＶ−■）及びそれに関 連するウィルスは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びそれに関連した状態 の病原体と推定されている。　ＨＴＬＶ−ＤＩの転写活性化遺伝子（ＴＡＴ−Ｉ ［［）は、機能的なマツピング研究により特徴づけられているように、三つのエ キソンからなる。ＨＴＬＶ−Ｉ［１及び転写活性化遺伝子に関する、他の記載に ついては、Ａｒｙａ　ｅｔ　ａｌ＋５ｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ、２２９．　ｐｐ、 　６９７７３（１９８５）及び５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ 　’νｏ１．２２９．　ｐｐ、　７４−７７　（１９８５）を参照されたい。

ＴＡＴ−ＩＩＩの最初のエキソンは、非コードであり、５゛ＬＴＲから２８７塩 基対にわたる。第二のエキソンは、５ｏｒ（短い転写解読）枠とエンベロープ遺 伝子の間にあり、７２のアミノ酸がエンコードされており、転写活性化に必須で ある。第三のエキソンは、１４個だけのアミノ酸をエソコードしてあり、エンベ ロープ遺伝子の範囲内に位置しているが、異なる転写解読枠にある。

ＨＴＬＶ−１［及びその関連ウィルスのゲラ４構造の広範な研究により、ゲノム の範囲内に少なくとも五つの転写解読枠、即ち：　、■、ｔ＋Ｌ１　、　ｓｏｒ 、　ｅｎｖ及び３’ｏｌｆが確認されている。本出願は、ＨＴＬＶ−ＩＩ［の複 写において、新しく発見された第６の転写解読枠、　ＴＡＴ　−ＩＩＩの意義を 開示するものである。本発明の意義の一部はこの新しく確認された遺伝子の生成 物がウィルスの発現に絶対的に要求されるものであるということにある。さらに 、本発明のプラスミド中のＴＡＴ−Ｉ［Ｉコード配列の、欠失は、ウィルスを生 成できないか、または異常に低い量で発現する結果となる。従って、これらのプ ラスミドは、ＡＩＤＳ及びそれに関連する障害の処置への有効な治療学的アプロ ーチに使用本発明は、ＴＡＴ−Ｉ［［遺伝子中に修飾箇所を含むプラスミドクロ ーン構造からなる。これらの構造は、完全な長ジョンしたときに細胞変性効果を 及ぼすプラスミドクローンから誘導される。本発明のクローンｐＨＸ８２ｇＰｊ は、ｐＨＸＢ２Δ５ａｔ−Ｓｓｔを製造するために、ＴＡＴ−ＩＩの主なコード 領域を除去するという修飾が施されるか、またはｐＨＸＢ２Δ５ａｌ−Ｒ１を製 造するために、ＴＡＴ−Ｉ［１のスプライス受容体配列を除去するという修飾が 施される。

１皿文豆豆 第１図は、プラスミドｐ）ＩＸＢ２　Δ５ａｌ−Ｓｓｔ及びｐ　）Ｉ　Ｘ　Ｂ’ ２　Δ５ａｌ−ＲＩの構造を説明する。

第２図は、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ［プラスミドでトランスフェクションされたＨ ９細胞中でのＴＡＴ活性の相補性を示す。

Ｕの量　なｆ−日 ＨＴＬＶ−１［［ブースミドＨＸＢ２Δ５ａｔ−５ｓｔ　びＨＸＢ２Ａ」エト上 Ｌｑｊ１１ 完全な長さのヒトＴ−細胞リンパ球指向性ウィルスタイプＩ［［（ＨＴＬＶ−Ｉ ［［）プロウィルスＤＮＡを含むＸｂａ　Ｉないし１（ｐａｌの１１．５ｋｂの 断片をλＨＸＢ２と命名された）ＩＴＬＶ−Ｉ［［ファージクローンから公知方 法により取り出す。このファージクローンは良く知られており、広く使用されて いるＨＴＬＶ−ｎ［ファージクローンであり、Ｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉ ｅｎｃｅ。

Ｖｏｌ、２２６．　ｐｐ、１１６５−１１７１　（１９８４）に記載されており 、完全な長さの挿へされたＨＴＬＶ−ＩｌｌのプロウィルスＩＩＮＡを含む。

ファージクローンλＨＸＢ２は本発明の好ましいクローンであり、他のクローン 、例えばλ）ＩＸＢ３は本発明の構成を損なうことなく使用されうる。従って、 Ｘｂａ　ＩないしＨｐａ　Ｉ断片を含むクローンは、本発明の範囲内に含まれる 。

その後、λＨＸＢ２から得られるＸｂａ　ＩないしＨｐａｌ断片は、公知の方法 により、プラスミドｐＳＰ６５ｇｐｔのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲ１部位に挿入さ れる。ｐＳＰ６５ｇｐｔは、良く知られたプラスミドベクターであり、そして本 発明の好ましいプラスミドベクターである。他のベクターは特許を請求する発明 の全体を変えることなく、使用されうる。

ＸｂａＩないしＨｐａＩ断片のプラスミドベクターｐＳＰ６５ｇｐ　ｔへの挿入 により、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＸＧＰＴ遺伝子と同じ転写オリエンテーション（ｏｒｉ ｅｎｔａｔｉｏｎ）にあるウィルス挿入体を含むクローンｐＨＸ８２ｇ１）ｔが 形成されることになる。そして、ｐＨＸＢ２ｇｐｔは、本発明のプラスミドであ る１ｌｌＨＸＢ２　ＡＳａｌ−３ｓｔ及びｐＨＸＢ２　ＡＳａｌ−Ｒ１（７）構 成に使用される。ｐ）ｌＸＢ２ｇｐｔからヌクレオチド５３６７ないし５５８０ を除去することにより、開始メチオニンを含むＴＡＴ−Ｉ［［の最初のコードエ キソン（エキソン２）の全体を欠いたプラスミドであるｐＨＸＢ２Δ５ａ１−Ｓ ｓｔが構成される。この構造体は、ｐＨＸＢ２ｇｐｔから、５ｓｔｌの部分的な 制限消化及びそれに続（ＳａｌＩによる完全な消化、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ による最終補修、及びＴ４　ＤＮＡリガーゼによるリクロジャー（ｒｅｃｌｏｓ ｕｒｅ）により生産される。

ｐＨＸＢ２ｇｐｔからヌクレオチド５３２３ないし５３６７を除去することによ り、完全なＴＡＴ−ＩＩＩメツセンジャーＲＮＡの生産に使用されるスプライス 受容体配列を欠いたプラスミドであるｐＨＸＢ２Δ５ａｌ−Ｒ１が構成される。

このプラスミドにおいて、完全なＴＡＴ−Ｉ［［コード配列が乱されることはな い。この構造体は、ｐ）ＩＸＢ２ｇｐｔから、Ｅ、ｃｏＲＩの部分的な制限消化 、それに続（Ｓａｉｌによる完全な消化、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼの フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片による修復及びＴ４ＤＮＡ　リガーゼによるリク ロジャー（ｒｅｃｌｏｓｕｒｅ）により生産される。

１呈■ 一実コ施−例」−、インディケータ−としてｐｃＤ１２ｃＡＴを用いた、一連の ＤＥＡＥ−媒介　コートランスフェクション実験におがＨＴＬＶ−ｍ　ＬＴＲ’ ｓに結合した遺伝子をどの程度まで転写活性化、できるかが評価された。このタ イプの実験のさらに詳細な記載は、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｄ、　Ｃｅ１１ ．＋　Ｖｏｌ、３３．　ｐｐ。

７４１−７４８　（１９８３）　を参照されたい。トランスフェクションの４８ 時間後に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性を 、アセチル化代謝物に転化された細胞変性性Ｉ４０−標識クロラムフェニコール の量として調べ、総量に対する％として表した。第１図に示すように、Ｈ９細胞 のｐＨχＢ２ｇｐｔ　＋　ｐｃＤ１２ｃＡＴによるトランスフェクションを行っ た場合、ＣＡＴ活性（１８，２％）が、ｐｃＤＩ２ｃＡＴ単独で（０，０３％） またはｐｃＤ１２ｃＡＴ　＋　ｐＳＰ６５ｇｐｔで（０，５％）トランスフェク ションした場合に比べて著しく増加しており、生物学的に機能性のＴＡＴ　−Ｉ ＩＩ遺伝子を含むｐＨＸＢｇｐｔに適合する。ｐｃＤ１２ｃＡＴのｐＨＸＢ２Δ ５ａｌ−５ｓｔまたはｐｉ（ＸＢ２　Δ５ａｌ−ＲＩによるコートランスフェク ションは、それぞれ０．３２％及び０．４６％の値を与える。

ａ、　ＴＡＴ　−Ｉ［欠損ゲノムの生産性ウィルス複製能力を調べるために、ｐ Ｈ）’Ｂ２Δ５ａｌ−５ｓｔ　、　ｐＨＸＢ２ΔＳａ＋、、−Ｒ１゜ｐＨＸＢ２ ｇｐｔ及びｐＳＰ６５ｇｐｔの構造体を、プロトプラスト融合によりＨ９細胞に 導入する。この技術は、真核細胞におけるトランスフェクション及び遺伝子の安 定な発現に使用される。実験においては、）ＩＴＬＶ−ｍ　ｐｉ５（ｇａｇ関連 タンパク質）を発現する細胞の頻度をプロトプラスト融合によって評価する。ｐ ＨＸＢ２ｇｐｔでトランスフェクションしてから１週間後、Ｈ９細胞の１〜１５ ％がＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｐｉ５を発現し、細胞外で発芽したピリオンが６１１Ｌ ？２された。発現した細胞の％は、最初の２週間以内に８０〜９０％に増加し、 実験期間を通して高レベルに維持された。これとは対照的に、ｐＨＸＢ２　Δ５ ａｌ−５ｓｔでトランスフェクションした後には、ウィルスまたはｐ１５発現細 胞は検出されなかった。この結果は、ＴＡＴ−１遺伝子がＨＴＬＶ−Ｉ［１の生 産に決定的であることを示している。これらの細胞から製造され、ＨＴＬＶ−■ 配列のためにプローブされたサザーンプロットは、線状化された未挿入のプラス ミドＤＮＡ　（１７ｋｂバンド）及び挿入されたＨＴＬＶ−Ｉ［１配列（高い関 連分子マススメア（ｍａｓｓ　ｓｍｅａｒ）　＞　２３ｋｂ）　の存在を示−し た。このことは、）１９／ｐＨＸＢ２Δ５ａｌ−３ｓｔカルチヤーがウィルスを 生産できないことが、このＤＮＡを細胞に導入できないためではないことを示唆 する。

ス」Ｌ男」−、クローンｐ）ｌＸＢ２　Δ５ａｌ−Ｒ１のトランスフェクション により、三つのケースのうち二つにおいて、ウィルスの発現が起こった。これら の場合、トランスフェクション後、２週間で、ｐｉ５の低レベルの発現率が実証 された（細胞の２％未満）。電子顕微鏡写真に、細胞外のみの粒子の少数と、典 型的なピリオンと比較して異常な形態を示す粒子多数が示された。これらの異常 な粒子は真の欠陥粒子または単に退化したピリオンを表しうる。トランスフェク ションから°２ないし８週間後、ｐｉ５を発現する細胞の割合は約３０％にまで 増加し、それに続く数週間の間に１０〜２０％で高平部に達する。

これらの結果は、二つのことを示唆している。第１は、分子クローンｐＨＸＢ２ Δ５ａｌ−Ｒｒが、ＨＴＬＶ−Ｉ［［ウィルスを生産しうるが、親のｐＨＸＢ２ ｇｐｔのプラスミドに比べて著しく減少したレベルであることである（前者でト ランスフェクションされたカルチャーは１０分の１の粒子を含むとみなされる） 。従って、ｐ）ＩＸＢΔ５ａｌ−Ｒ１クローンは、ＴＡＴ　−■を発生するため に使用されている通常のスプライス受容体を欠いているが、完全なＴＡＴ−Ｉ［ １のｍＲＮＡを生産するためのゲノムの５′領域のスプライス受容体部位を代わ りに使用することができると信じられる。

第２は、ｐＨＸＢ２Δ５ａｌ−ＲＩでトランスフェクションされたカルチャー中 のＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ　ｐ１５陽性細胞の頻度が、１００％に近づくまでには増加 しなかったことである。細胞あたり２０ないし６０のＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ　ＲＮＡ 転写物程度に少ない頻度の細胞の発現を、その場で検出しうる技術を用いて、カ ルチャー■及びＩＩ（８週間）００％及び２５％及びカルチャーＩＩｌ［（４週 間）の２０％がウィルスＩ’ｌＮＡ　を発現したことが調べられた。これらの結 果は、免疫蛍光値と比較することができ、ｐＨＸＢ２Δ５ａｌ−Ｒ１から発生し たウィルスが培養によって有効に蔓延するためにはあまりにも低い量でしか、検 出または生産されないことを示している。

−実≦迩」汁」ユニ　ＴＡＴ欠損クローンはＨＴＬＶ−Ｉ［［を有効に生産する ことができないが、これが、機能的なＴＡＴ−Ｉ［［遺伝子またはＴＡＴ−Ｉタ ンパクそれ自体の供給により、補償されうるかどうかを調べるために、補充実験 を行った（第２図参照）　。ｐＨＸＢ２ｇｐｔ単独で、またはｐＨＸＢ２Δ５ａ ｌ−３ｓｔとの組み合わせでトランスフェクションされたＨ９細胞は、トランス フェクションから３ないし４日後に、ＨＴＬＶ−ＩＩＩｐ１５及びウィルス粒子 を発現した。このことは、異なるプラスミドを含むプロトプラストの同時の融合 が、ＤＮＡトランスフェクションそれ自体の効果を変化させないことを示す。ｐ ＨＸＢ２Δ５ａｌ−３ｓｔ単独による、またはｐＣＶ−３（３’　ｏｒｆ　メツ センジャーＲＮＡ　の完全なｃＤＮＡを含むプラスミド）との組み合わせによる トランスフェクションの後では、ＨＴＬＶ−Ｉ１１発現細胞は検出されなかった 。しかしながら、ｐＨＸＢ２　Δ５ａｔ−３ｓｔ　とｐＣＶ−Ｈスプライスされ たＴＡＴ−■遺伝子の完全なｃＤＮＡを含むプラスミド）とのコートランスフエ クションの後では、融合後６日目（０，０１％未満）ないし１４４日目２．８％ ）　ニＨＴＬＶ　−Ｉｎ　ｐ１５陽性細胞が見られ、細胞の発現は、その場で並 行して行われるＲＮＡの研究により確認された。これらの結果は、ウィルス発現 の能力が、ＴＡＴ−Ｉ［［を欠失したゲノムに、非結合機能性ＴＡＴ−Ｉ［１遺 伝子の供給により、瞬時に復活されうろことを示している。

に 国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．ＴＡＴ−ＩＩＩ欠損ゲノムを含有する生物学的に有能なヒトＴ−細胞リンパ 球指向性ウイルスタイプＩＩＩからなることを特徴とするヒトＴ−細胞リンパ球 指向性ウイルスタイプＩＩＩの分子クローン。
2. ２．ヒトＴ−細胞リンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩ分子クローンλＨＸＢ２ から得られたＸｂａＩないしＨｐａＩウイルスＤＮＡ断片を含有することを必須 用件とする組み換え体クローンｐＨＸＢ２ｇｐｔ。
3. ３．さらに、ヌクレオチド配列５３６７−５５８０に相当する主要コード領域が 、該クローンに欠けていることを特徴とする請求の範囲第２項記載の組み換え体 クローン。
4. ４．さらに、ヌクレオチド配列５３２３−５３６７に相当するスプライス受容体 配列が該クローンにないことを特徴とする請求の範囲第２項記載の組み換え体ク ローン。
5. ５．ヒトＴ−細胞リンパ球指向性ウイルスタイプＩＩＩファージクローンｐＨＸ Ｂ２からのＸｂａＩないしＨｐａＩ断片を取り出し、該断片をプラスミドｐＳＰ ６５ｇｐｔのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入して、クローンｐＨＸＢ２ｇ ｐｔを形成し、その後、該クローンｐＨＸＢ２ｇｐｔからＴＡＴ−ＩＩＩアミノ 酸配列を除去することを特徴とする感染性には乏しいが、免疫学的に活性なヒト Ｔ−細胞リンパ球指向性ウイルスクイプＩＩＩの製造方法。
6. ６．さらに、該クローンｐＨＸＢ２ｇｐｔから除去したアミノ酸配列が、ヌクレ オチド配列５３６７−５５８０に相当するＴＡＴ−ＩＩＩ遺伝子のエキソン２を 構成することを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．さらに、該クローンｐＨＸＢ２ｇｐｔから除去したアミノ酸配列が、ヌクレ オチド配列５３２３−５３６７に相当するスプライス受容体配列を構成すること を特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。