JPS63501924A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

新規微生物 １、発明の分野　７ ２、　発明の背景　７ ２．１　生物学的窒素の同定　７ ２．１．１　共生に関係するマメ科植物の遺伝子　１１２、１．２　共生に関係 するりゾビウム遺伝子　１１２、１．３　生物学的窒素の固定および非マメ科　 １２植物 ３、発明の要約　１３ ３．１　定義　１４ ４、

【図面の簡単な説明】

５、　発明の詳細な説明　１５ ５．１　リゾビア形質転換体　１６ ５、１．１　リゾビア形質転換体の同定のための　１７栄養培地 ５、１．２　リゾビアトランス接合体を生成する　２まための交互系統培養法 ５、１．３　リゾビア形質転換体を生成する別の　２４方法 ５．２　非マメ科植物の種子の被膜および被覆さ　２５れた種子 ５、２．１　非７２メ科植物の種子の被膜　２５５、２．２　非マメ科植物の種 子を被覆する方法　２８５．３　非マメ科植物における共生的窒素の固定　２９ の確立 ５．４　根粒化された非マメ科植物　２９５、４．１　根粒の特性　３０ ６、実施例：リゾビア形質転換体の生成のための　３０材料および方法および非 マメ科植物の根粒化６．１　交互する系統培養法　３２ ６、１．１　親リゾビアの分離　３４ ６、１．２　栄養寒天培地　３４ ６、１．３　マメ科植物の抽出物　３６６、１．４　リゾビアトランス接合体の 分離　３７６．２　非マメ科植物の種子の調製　３９６．３　リゾビアＩ？２ト ランス接合体による非７　３９メ科植物の感染 ６、３．１　実験室の研究　３９ ６、３．２　フィールドの研究　４１ ６．４　根粒化非マメ科植物の乾燥塊、窒素含量　４２および蛋白質含量の分析 のプロトコル ７、実施例：コムギを根粒化するりゾビウム・ト４３リチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ ｍ　ｔｒｉｔｉｃｉ）７．１　リゾビウム・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔ ｒｉｔｉｃｉ）　４４の調製 ７．２　リゾビウム・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｔｉｃｉ）　４５ によるコムギの根粒化 ７、２．１　実験室の研究　４５ ７、２．２　フィールドの研究　４６ ７．３　根粒化コムギの乾燥塊、窒素含量および　４６蛋白質含量の分析 ７、３．１　実験室の研究の結果　４６７、３．２　フィールドの研究の結果　 ４８８、実施例：オオムギを根粒化するりゾビウム・　４８ホルデイ（Ｒｈｉｚ ｏｂｉｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ）８．１　リゾビウム・ホルデイ　４９ の調製 ８、１．１　リゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　４９ｈｏｒｄｅｉ） の特性づけ ８．２　リゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ）　５１に よるオオムギの根粒化 ８．２．１　実験室の研究　５１ ８．３　根粒化オオムギの乾燥塊、窒素含量およ　５２び蛋白質含量の分析 ８、３．１　実験室の研究の結果　５２８．４　根粒化オオムギにおける”Ｎの 濃縮　５３８．５　根粒の形態学　５５ ８．６　再分離したオオムギのバクテロイドの抗　５６生物質抵抗性 ９、実施例：モロコシを根粒化するりゾビウム・　５７ソルギ（Ｒｈｉｚｏｂｉ ｕｍ　ｓｏｒｇｈｉ）９．１　リゾビウム・ソルボ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｏ ｒｇｈｉ）　５７の調製 ９．２　リゾビウム・ソルボ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｏｒｇｈｉ）　５８によ るモロコシの根粒化 ９、２．１　実験室の研究　５８ ９、２．２　フィールドの研究　５９ ９．３　根粒化モロコシの乾燥塊、窒素含量およ　５９び蛋白質含量の分析 ９、３．１　実験室の研究の結果　６０９、３．２　フィールドの研究の結果　 ６０１０、実施例：イネを根粒化するりゾビウム・オリ　６１ザエ（Ｒｈｉｚｏ ｂｉｕｍ　ｏｒｙｚａｅ）１０．１　リゾビウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ ｍ　ｏｒｙｚａｅ）　６１の８周製 １０．２　リゾビウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｒｙｚａｃ）　６３ によるイネの根粒化 １０゜２．１　フィールドの研究　６３１０．３　根粒化イネの蛋白質および窒 素含量の分　６３析 １０．３．１　フィールドの研究　６３１１、実施例ニューカリのための窒素肥 料としての　６４リゾビウム １１．１　リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ｅｕｌの調製　６４１１．２　リ ゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ｅｕｌによるユーカ　６５りの処理 １２、実施例ニアプラナ属を根粒化するりゾビウム　６６（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ）Ｒ１ １２，１リゾビウム（Ｒｂｉｚｏｂｉｕｍ）Ｒ１の調製　６６１２．２　リゾビ ウム（Ｒｈ　ｉｚｏｂｉｕｍ）　Ｒ１によるセイヨ　６６ウアブラの処理 １３、根粒化非マメ科植物の合計の窒素の分析　６７１３．１　材料および方法 　６７ １３．２　コムギおよびオオムギ　６７１３．３　モロコシおよびイネ　７３ １３．４　セイヨウアブラナ　７４ １４、微生物の受託　７６ １、　黄１引ｑ分互 本発明は、リゾビウム形質転換体（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ ｎｔ）に対して特異的な物質で被覆した種子から成長した非マメ科植物（ｎｏｎ −１ｅｇｕｍｅ　ｐｌａｎｔ）を感染し、根粒化（ｎｏｄｕｌａｔｅ）　シおよ び前記植物において窒素を固定するりゾビウム形質転換体を開示する。根粒化非 マメ科植物は窒素肥料を使用しないで成長させることができる；植物および収穫 後残留する茎は、それらの非根粒化相手よりも高い蛋白質含量、乾燥材料含量お よび窒素含量を有する。 本発明は、特定の実施例によって説明し、これらの実施例において、リゾビウム トランス接合体（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒａｎｓｃｏｎ−ｊｕｇａｎｔ）を使 用してイネ科植物（イネ族）、例えば、コムギ、オオムギ、モロコシ、イネおよ びアブラナ属（アブラナ族）、例えば、セイヨウアブラナを根粒化する。ユーカ リ　（フトモモ族）において窒素を固定するりゾビウムトランス接合体を、また 、実施例において例示する。 ２・　主更■宵景 植物の代謝の本質的な面は、植物の成長および発育にとって必須である有機化合 物、例えば、アミノ酸、蛋白質、クロロフィル、ビタミン、ホルモンおよびアル カロイドの合成における硝酸塩および他の無機窒素化合物の使用である。植物は 硝酸塩および他の窒素化合物を土壌から吸収するが、窒素の究極の源は大気中の 遊離二窒素（Ｎ２）である；しかしながら、遊離二窒素は、それ自体、固定され 、そして植物によって利用されうる形態に転化されなくてはならない。 ２．１　生　・１、の古 生物学的二窒素の固定（より普通には生物学的窒素の固定と呼ぶ）は、１系列の 中間体を経る遊離窒素のアンモニアへの段階的還元を含む複雑なプロセスである ；それは窒素を固定する微生物によって達成され、微生物のある族はある種の維 管束植物と共生的に生きている。窒素を共性的に固定するバクテリアの最も重要 な属は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）であり、これは多数の種を有し、そ の各々はマメ科植物（例えば、エントウ、マメ、クローバ−など）の１つまたは 数種の密接に関連する種と共生的である。結局、マメ科植物は、窒素を固定でき ない他の植物と異なり、成長のために窒素の肥料を必要としない；事実、マメ科 植物は土壌の窒素含量を濃縮することができる。多くのマメ科植物の経済的重要 性にかんがみて、バクテリアの培養物はマメ科植物の種子の接種に利用できる； さらに、生存できるリゾビア（ｒｈｉｚｏｂｉａ）を含有するマメ科植物の種子 の被膜は開示された（米国特許第３，４９９．７４８号および米国特許第４，１ ４９，８６９号）。 共性的窒素の固定は次を包含する：特定のマメ科植物に対して特異的であるリゾ ビウムバクテリウムは、マメ科植物の宿主の根を感染する。その後、根粒は根の 上に発生し、根の中でリゾビアは白兵生状態で生きており、これはバクメロイド として知られており、バクテロイドは独特の機能、例えば、窒素の固定、をマメ 科植物の宿主と密接に協動してなす；バクテロイドはほとんど細胞器官のように 挙動する。興味あることには、リゾビアは一般に植物外で窒素を固定しない。マ メ科植物における生物学的窒素の固定の種々の面の概観については、次の文献を 参照：３．４および５章、”Ｐｌａｎｔ　ＧｅｎｅＲｅｓｅａｃｈ−Ｇｅｎｅｓ 　Ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉ ｏｎｓ″。 Ｄ、Ｐ、Ｓ、Ｖｅｒｍａ、　Ｔ、Ｈ，Ｈｏｈｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ ａｇ、　Ｎ、Ｙ、＋　１９８４゜感染、根粒化および窒素の固定の各々は、リゾ ビウムおよびその特定のマメ科植物宿主の間の複雑な相互作用を含む。 初期の感染を起こさせるため、リゾビウムおよびマメ科植物は互いに「認識」シ なくてはならない。この特定の認識は、マメ科植物宿主のレクチン（根毛上に存 在する糖蛋白質）とバクテリア表面上の多糖類との間の相互作用を含むと信じら れる；この相互作用は非常に特異的な「ロック・アンド・キー（ｌｏｃｋ　ａｎ ｄ　ｋｅｙ）Ｊ型の機構と見なすことができ、その特異的は抗体−抗原の相互作 用と比較されてきており、その相互作用な存在しないと、感染は起こることがで きない。特異的認識およびリゾビウムの特定のマメ科植物宿主への取付き後、宿 主の感染は侵略性リゾビアに対する宿主に応答により制御される非病原的方法で 進行する。一般に、リゾビアは根毛を経てマメ科植物に入り、そしてバクテリア の侵入は感染糸（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｔｈｒｅａｄ）と呼ばれる宿主植物によ り形成される管状構造によって仲介され、感染糸は根の皮層の内部細胞に侵入す る。リゾビアは感染糸から解放されるば、ペリバクテロイド膜（ｐｅｒｉｂａｃ ｔｅｒｏｉｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる宿主誘導膜のエンベロープ内に囲 まれたままである；こうしてバクテロイドは細胞外隔室に制限される。事象のこ の繊細な順序の破壊は、宿主に対して病原的である感染に導くことがあるであろ う。 リゾビウムによるマメ科植物宿主の感染後、引続く根粒化は事象の複雑な作用に 応答してのみ起こり、この事象においてマメ科植物はりゾビウム遺伝子の発現に 影響を及ぼし、そしてリゾビウムは、次に、根粒化に要求されるマメ科植物遺伝 子の活性に影響を及ぼす。根粒組織中の細胞は植物特異的配置を有するゾーンに おいて高度に有機化されている；バクテリアは日常ペリバクテロイド膜中に存在 し、この膜はバクテリアを表皮および分裂組織のゾーンから排除する。根粒の有 機化および形態は、バクテロイドのための酸素および栄養の摂取および宿主植物 のためのアンモニアの排出を提供するために、拡散の問題が解決されなくてはな らないということにおいて、生化学的に意味をもつ。効果的な根の根粒、実際に 窒素を固定する根粒、の明確な特徴はレグヘモグロビンの存在であり、このレグ ヘモグロビンは根粒の呼吸およびニトロゲナーゼ（窒素の固定の通路において必 須な酵素）の過剰の酸素による阻害に対する保護に関係すると思われる酸素結合 性蛋白質（すなわち、この蛋白質の高い濃度はバクテロイド領域中への酸素の拡 散を促進する）である。レグヘモグロビンは明らかに真に共生的な生成物であり 一グロビン蛋白質は植物遺伝子により解読され、そしてヘム合或はバクテリアに より寄与される。 究極的には、根粒中において起こる共生的窒素の固定はジヨイント・エンデバ− （ｊｏｉｎｔ　ｅｎｄｅａｖｅｒ）である。バクテロイドは窒素の固定のための 機構を含有し、そしてマメ科植物の相手は生成したアンモニアを有機の形態に同 化し、次いでこの有機の形態は完全植物およびバクテロイドの栄養のために使用 される；マメ科植物の相手はバクテロイドに窒素を固定できるようにさせる適当 な環境およびエネルギー減を提供する。この全体のプロセスでは多くがうま（行 かないことがある：宿主植物のバクテリアが「不一致」である場合、感染は成功 せず、こうして根粒化および共生的窒素の固定の全体のプロセスは起こらないで あろう。その上、首尾よい根粒化は、生ずる根粒が欠陥をもつことがあるので、 窒素の固定が必然的に起こるであろうことを意味しない。 ２、１．１　丑　に矢１　るマメ２有　Ｊ凶ヱ宿主遺伝子生成物の２つの主要な 群、レグヘモグロビン類およびノヅリン（ｎｏｄｕｌｉｎ）　Ｈｌは共性的窒素 の固定の間に特異的に誘導される。根粒中のレグヘモグロビンの構造および一機 能は比較的明らかであるが、ノブリン類についてはほとんど知られていない。興 味あることには、最近の論文に報告されているところによると、レグヘモグロビ ン植物遺伝子ＤＮ１９８５、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　４：２８５ −２９２）。 ２、１．２　丑　に　、　るリソ゛ビウム゛　云数年前、根粒化のために必要な りゾビウムの遺伝子（且土丈）が大きいプラスミド（共生プラスミドと呼ばれる ）上に位置し、このプラスミドは、また、窒素の固定（ｎｉｆ）遺伝子それら自 体を有することが発見された。それ以来、リゾビアバクテリアの多くは、異なる 宿主特異性を有する他の種のりゾビウムをそのリゾビウムの中に転移することに よって、新しいマメ科植物の相手を認識することを誘発されうろことが発見され た。１つのりゾビウムから他のりゾビウムへのりゾビウム共生プラスミドの転移 が宿主範囲を非マメ科植物に拡張しうるという指示は存在しない。興味あること には、リゾビアの共生プラスミドを」鉦ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｉｅｆａｃ ｉｅｎｓ（クラウン・ガルス（ｃｒｏｗｎ　ｇａｌｌｓ）と呼ばれる腫れた植物 成長を起こすバクテリア）の中に導入すると、マメ科植物中に根の根粒を生成゛ る能力が一匂工劇狙旦麹工暉叫に付与される；しかしながら、根粒は窒素を固定 しないということにおいて欠陥をもつ（Ｈｏｏｙｋａａｓ、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ　Ｉｎｔ ｅｒａｃｔｉｏｎ”＋　Ａ、　Ｐｕｈｌｅｒ　Ｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ ａｇ、　ＮＹ。 １９８３、　ｐｐ、２２９−２３９）。 数年にわたって、マメ科植物におけるリゾビアバクテリアの根粒化の効率はある 種の植物の浸出物への暴露によって増加されるということを種々の証拠が示した ；多分、この暴露はｎｏｄ遺伝子の発現を刺激する。すべてのマメ科植物の根の 浸出物はこの作用を生成するが、種々の非マメ科植物からの浸出物は示さない。 ２、１．３　生血Ｙ旬２１の古−およびジ・マメ！１゛フランキア（Ｆｒａｎｋ ｉａ　）と呼ぶバクテリアの非リゾビウム遺伝子はある脈管の非マメ科植物、例 えば、Ａｉｎｕｓ（ハンノキ）、Ｃａ５ａｒｉｎａ　［カッソワリー・ツリー（ ｃａｓｓｏｗａｒｙ　ｔｒｅｅ）コＣｅａｎｏｔｈｕｓ＋　Ｅｌｅａｇｎｕｓ、 　Ｍｙｒｉｅａ（ギンバイ力）およびＰｓｙｃｈｏｔｒｉａ（熱帯産の樹木）と 共生的である。タバコ細胞の培養系およびリゾビアの生体外関連から誘導された データに基づく報告は、ある非マメ科植物がリゾビアによって利用されうる因子 を提供できることを示している（Ｇｉｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　１８７６＋　 Ｐｌａｎｔａ１２８：２３３−２３９）　；　Ｌかしながら、特定の認識、共生 的関係または特定の相互作用は示されていす、また観察されていなかった。事実 、非マメ科植物の種子植物とりゾビウムとの間の安定な共生の、マメ科植物目外 の、唯一の既知の実施例は、バラスボニア（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ）、熱帯産の 大きいＭａｌａｙａｎ（エルム）族のそれである；オーストラリアで分離された 自然に産出するりゾビウム株はパラスポニアにおいて根粒化しがっ窒素を固定す ることがわかった（Ｔｒｉｎｉｃｋ、　１９８０＋　Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌ、　 ８５：３７−４５および８６：１７−２６；Ｔｒｉｎｉｃｋ、　１９８１＋　Ｃ ｕｒｒｅｎｔ　Ｐｅｒｓｐｅｃ−ｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘ ａｔｉｏｎ＋　Ｇｉｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　ｋＪＡ、ＥｌｓｅｖｉｅｒＰｒｅ ｓｓ＋　ｐ、４８０；Ｔｒｉｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７６＋Δｒｃｈ、　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１０８：１５９−１６６；又、参照、Ｂｅｎｄｅｒｌ　 ｅｔ　ａｌ、＋　１９８５．　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ３８：１３８−１４ ０）。 ３・　主皿皇翌ｍ 非マメ科植物において窒素を共性的に固定できるリゾビウム形質転換体を記載す る。より詳しくは、本発明のりゾビウム形質転換体は、（ａ）リゾビウム形質転 換体に対して特異的な蛋白質混合物で被覆された種子から誘導された非マメ科植 物の根に感染することができ、（ｂ）これらの非マメ科植物を根粒化することが でき、および（ｃ）根粒中で窒素を固定し、こうしてこれらの非マメ科植物にお ける植物成長および発育を促進するために窒素肥料を使用するための必要性を排 除することができる。種々のリゾピア種および本発明の形質転換体の同定におい て有用な栄養培地を記載する。 一部分において、本発明のりゾビウム形質転換体による非マメ科植物における共 生的窒素の固定の確立を可能とする、被覆された非マメ科植物の種子を、また、 記載する。これらの種子は、マメ科植物抽出物、マメ科植物抽出物のクロマトグ ラフィーの分画、リゾビウム形質転換体に対して特異的な結晶または精製された 蛋白質からなる。種子の被膜は、また、１成分としてリゾビウム形質転換体自体 を含むことができる。 リゾビウム形質転換体を生成し、非マメ科植物の種子を被覆し、そしてリゾビウ ム形質転換体と非マメ科植物との間の共生を確立するための方法を記載する。 ３．１．定−萩 ここで使用するとき、用語「リゾビウム形質転換体」は、ある数の方法、例えば 、形質転換（すなわち、プラスミドＤＮＡによる感染）、トランスフェクション （すなわち、遊離のＩ）　Ｎ　Ａ　、ファージＤＮＡ、またはウィルスのＤＮＡ ）、または接合（すなわち、１つのバクテリアから他のバクテリアへのレプリカ プラスミドの転移）（これらに限定されない）のいずれかによって生成すること ができる、導入されたＤＮＡを含有するりゾビウムと定義される；接合から生ず るバクテリアの形質転換体は、本発明の形質転換体のサブセットであり、そして トランス接合体と特定的に呼ぶことができる。 用語「親すヅビ」は、接合して本発明のりゾビうムトランス接合体を生成する視 程、ならびにプラスミドまたはＤＮＡ配列をそれから分離できかつリゾビアを形 質転換して本発明のりゾビウム形質転換体を生成できるリゾビウム種として定義 される。 ４、　回訓ｊ」１１履直哩 第１図は、植えた後の種々の時間において収穫したコムギ植物の乾物含ｔ　（Ａ ）および窒素含量（Ｂ）を表わすグラフである。コムギの３つの群が表わされて いる：リゾビウムトランス接合体によって根粒化されたコムギ（→−Ｒ−Ｎ）； 窒素肥料で栄養を与えられたが、リゾビウムトランス接合体で処理されていない コムギ（−Ｒ−１−Ｎ）；およびリゾビウムトランス接合体で根粒化されず、か つ窒素肥料で処理されていないコムギ（−Ｒ−Ｎ）。 第２図は、播種後の種々の時間において収穫したオオムギ植物の乾物含量（Ａ） および窒素含量（Ｂ）を表わすグラフである。オオムギの３つの群が表わされて いる；リゾビウムトランス接合体によって根粒化されたオオムギ（＋Ｒ−Ｎ）； 窒素肥料で栄養を与えられたが、リゾビウムトランス接合体で処理されていない オオムギ（−Ｒ＋Ｎ）；およびリゾビウムトランス接合体で根粒化されず、かつ 窒素肥料で処理されていないオオムギ（−Ｒ−Ｎ）。 ５、　溌割！ＢＬ阻方４１児 本発明は、非マメ科植物において根粒化および窒素を固定するリゾビア形質転換 体に関する。根粒化非マメ科植物は、窒素の不存在下に成長することができ、そ して窒素肥料の添加によっ゛ζ栄養を与えられた非根粒化相手と、同一あるいは それより高い蛋白質含量、乾燥材料含量および窒素含量を有することができる。 根粒化非マメ科植物を収穫後残る茎は、また、蛋白質含量が高い。 さらに詳しくは、本発明のリゾビア形質転換体は、特定の形質転換体に対して特 異的の物質で被覆した種子から成長した非マメ科植物を根粒化することができる 。本発明は、リゾビア形質転換体、リゾビア形質転換体を生成する方法、非マメ 科植物の種子を被覆するために使用する物質、被覆された種子それら自体、リゾ ビア形質転換体で非マメ科植物を根粒化する方法、および高い蛋白質含量を有す る得られた根粒化非マメ科植物に関する。 説明を明瞭とするため、本発明は次の順序で下のさらに分割した節において説明 する：　（ａ）リゾビウム形質転換体、（ｂ）非マメ科植物の種子の被膜、（ｃ ）非マメ科植物における共生的窒素の固定の確立、および（ｄ）根粒化された非 マメ科植物。 ５．１．ユｙ旦ヱ渡ｌ五且淋 本発明のリゾビア形質転換体の生成および同定は、リゾビアの各異なる種が、栄 養培地上でそのマメ科植物宿主の外部で増殖させるとき、特定の色を有するコロ ニーを生成するという初期の発見に基づき、ただし栄養培地は、バクテリアの成 長に必要な栄養に加えて、リゾビウム種の特異的相手であるマメ科植物宿主から 誘轟された変性されない抽出物を含有する。コロニーの色は特定のりゾビウム種 を同定するための手段として利用することができる。事実、各種に対して特異的 な各マメ科植物宿主の非変性抽出物の混合物を含有する栄養培地上で培養するこ とができる；各種はその特徴的な色を有するコロニーを形成するであろう。 本発明は、また、非マメ科植物において感染し、根粒化しそして窒素を固定する ことのできるリゾビア形質転換体が、形質転換体の親リゾビアのマメ科植物宿主 相手の抽出物を含有する栄養培地上で純白のコロニーを形成すること、および非 マメ科植物の根の根粒から分離されたおよび、非マメ科植物宿主の抽出物をさら に含有する、上で定義した培地上で培養した形質転換体のバクチロイドが、灰色 がかった色のコロニーを形成するであろうという、追加の発見に基づく。こうし て、栄養培地は、本発明の形質転換体を同定する比較的複雑でない手段を提供す る。栄養培地を下の細分割節において説明する。 べきであり、このような栄養物質は、次のものを包含するが、これらに限定され ない：よく知られた炭素、窒素および塩類の源ならびにＢ一群のビタミン類およ び必須アミノ酸、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリンおよびＬ−）リブトファン ・これらは個々のアミノ酸、トリペプチドまたはオリゴペプチドなどの形態で存 在することができる。マメ科植物の抽出物の成分は、リゾピア種の同定に有用で あるが、リゾビアの栄養のためには必要ではない；すなわち、リゾビウムをその マメ科植物宿主抽出物を含有しない栄養培地あるいは変性したマメ科植物宿主抽 出物を含有する栄養培地（例えば、マメ科植物抽出物の添加の培地をオートクレ ーブ処理すると、抽出物は変性する）の上で成長させると、コロニーは形成する であろっが、各リゾビウム種のコロニーは透明である。下表■は、平板上にずじ をつけられた各種のマメ科植物宿主相手の抽出物を含有する栄養培地上で成長し た種々のリゾピア種によって形成した、特徴あるコロニーの色を記載する。３２ ℃以上の温度で本発明の実施例において使用する培地のインキュベーションは、 この培地上で増殖するリゾビアのコロニーによって赤色が形成することを注意す べきである；これは可逆的色の変化であり、各コロニーの特徴ある色は、温度が 低下すると、例えば、１８℃〜３０　”Ｃのある温度に低下すると、もどるであ ろう。さらに、栄養培地は、システィンおよびフェニルアラニンの添加により、 変更して、その種について特徴ある色の異なる色調を有するコロニーを生成する ことができる。 表Ｉ 宿主特異的マメ科植物相手の抽出物を含有する栄養培地−ヒで一贈覇↓犬遺方ｊ ユヅｌ奥スＰニー釦１−−一一マメ科植物 リゾビウム　責土柑王　コロニゴ亀 カシア属（Ｍｉｍｏａ　Ａｃａｃｉａ）、　褐色レウカエナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ ）　） Ｒ，９匹ｎｉｃｕｍ　Ｇｌｙｃｉｎ　（ダイス）　赤みがかったオレンジ Ｒ，■エリｉｎｏｓａｒｕｍ　Ｌａ５ｔｈｙｒｕ　（エントウ）　黄金黄色Ｒ， 助凪Ｌｕｐｉｎｕｓ（ハウチワマメ）　淡黄色Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ　Ｍｅｌｉ ｌｏｔｕｓ（スィートクロ　黄色がかったーバー）　褐色 Ｒ，蝕且蚊旦　Ｒｈａｓｅｏｌｕｓ　（マメ）　暗褐色Ｒ，ｔｒｉｆｏｌｉ　Ｔ ｒｉｆｏｌｉｕｍ（クローバ−）　淡褐色＊コロニーを３２℃以下（例えば、１ ８℃〜３０℃）の温度において、節６．１．に詳述する、培地上でインキュベー ションする。 栄養培地において使用するマメ科植物抽出物は、マメ科植物宿主相手のいずれの 部分から生成することもでき、これらの部分は次のものを包含するが、これらに 限定されない：シュート、茎、根または種子；若いシュートの抽出物は、最も速 いコロニーの反応を生ずるように思われる。マメ科植物抽出物は、植物の部分を 微細な粒子に分割し、エタノール中においてｐＨ約７．２の緩衝液とともにマセ レーションした物質をホモジナイゼーションし、そして不溶性物質を遠心によっ て沈殿させてることによって調製することができる。上澄みを蒸留水に対して透 明になるまで透析し、次いでそれを再び遠心することができる。全体のプロセス は４℃において実施して、植物結合の分解を最小にする。 マメ科植物抽出物は、次の文献の変法である方法に従ってクロマトグラフィーに よって分画することができる：Δｌ１ｅｎｅｔ　ａｌ、、１９７３．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｊ、１３１：　１５５−１６２；Ａｌｌ　ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１９７５＋ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　５０（３）：３６１ −３６４；Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。 Ａｕｇｕｓｔ　１９７２．ＦＥＢ、−Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４（２）：　１９３− １９６；Ｐｅｏｍａｎｓ　ｅｔａｌ、、Ｐｌａｎｔ　ａ　１５６：　５６８　５ ７２；およびＴｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、　１９７４．Ｊ、ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、２４９：　６００４　６９２１゜簡単に述べると、これは、次のよう な、ガラクトースＭ　Ｎ４　ＣＨ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４Ｂ 　（ファーマシア、スエーデン）およびＤＥＡＥ−５２（ワットマン）のカラム を使用する抽出物のクロマトグラフィーの分離を含む：（ａ）抽出物を、まず、 ガラクトース誘導ｃＨ−セファロース４Ｂカラムに適用する。結合しない物質を 緩衝液にょるカラムの洗浄により除去しかつ保存し、そして５ｍｌの分画を集め 、これらの分画を波長２８０ｎｍにおける吸収によって分光光度測定にアッセイ する；溶離液中に有意の吸収が検出されなくなるまで、洗浄を続ける。２８０ｎ ｍにおいて吸収を示す分画をプールし、そしてＤＥＡＥ　−５２のクロマトグラ フィーのための保存する。ガラクトース誘導セファロース４Ｂのカラムのベッド へ結合する物質を、４％のグルコースをカラムに添加することによって溶離する ；溶離液は５−分画で集め、これらの分画を、また、２８０ｎｍにおける吸収に よってアッセイする；（ｂ）ガラクトース誘導セファロース４Ｂに結合しない物 質を含有する分画をＤＥＡＥ　−５２カラムに適用し、これを、まず、ｐＨ７， ２で、次いでｐＨ９，２で溶離する；５ｍｌの分画を集め、２８０ｎｍにおける 吸収をアッセイする。ｐ）１７．２におけるピーク吸収値を含む分画をプールし 、そしてｐ）１９．２におけるピーク吸収値を含む分画をプールする。特定のマ メ科植物宿主のこれらの３つの分画（すなわち、グルコースを使用して溶離され た分画およびｐＨ７，２およびｐＨ９，２において溶離された分画）は、−緒に し、そして前述の栄養培地において全体の抽出物の代わりに使用することができ る。事実、３つの分画の活性成分は結晶化し、そして保存することができる。マ メ科植物宿主から誘導されるこれらの結晶は、マメ科植物宿主抽出物の代わりに 、本発明のリゾビア形質転換体を同定するために使用する栄養培地中の１成分と して使用することができる。 本発明のいかなる理論または説明にも拘束されたくないが、クロマトグラフィー の分画は、多分、蛋白質、および可能ならば糖蛋白質を含有する。誘導化セファ ローズ４Ｂに対する親和性は、蛋白質の少なくとも１種がレクチンであることを 示唆している。これは意味がありうる。なぜなら、マメ科植物のレクチン類はり ゾビウム相手の初期の認識において重要と考えられるからである。いったんこれ らの蛋白質のアミノ酸配列が決定されると、これらの蛋白質は、化学的合成法あ るいは、蛋白質の発現に原核または真核生物の宿主−ベクターの発現系を使用す る、組換えＤＮＡ技術によってつくることができる。真核生物の宿主−ベクター 系における蛋白質の発現は、真核生物が天然に産出する蛋白質にいっそ・う類似 する方法で調製を処理することができるので、好まし７い。蛋白質がレクチンで ある場合、これはことに重要であろう。さらに、同定された蛋白質はマメ科植物 宿主以外の源から分離することができる。この理論によって、抽出物中に存在す る他の因子、例えば、炭水化物、アルカロイドなどが抽出物の活性に存意な因子 である可能性は排除されない。 前述の栄養培地は本発明の形質転換体を同定するために便利なアッセイを提供す るが、形質転換体のＤＮＡの主要な特性づけは実施されなかった。非マメ科植物 において窒素を共性的に固定する本発明のリゾビア形質転換体は、トランス接合 体の親リゾビア中に含有されないプラスミド類を有するように思われる。本発明 のいかなる理論または説明に拘束されたくないが、これらのプラスミド類がリゾ ビウム形質転換体の新規な宿主範囲のための原因となるＤＮＡ配列を含有するこ とができることを注意することは重要である。 本発明のリゾビア形質転換体を生成する方法を、下に詳述する。 ５、１．２．　リゾビアトランス接合体を生成するための交互糸層」１１法−一 一一一 本発明のりゾビウムトランス接合体を生成する交互系統培養法は、次を包含する ：２つの異なるリゾピア種（親の世代）で固体栄養培地上に交互する列でずじを つけ、栄養培地は、バクテリアの増殖に必須な栄養物質に加えて、次のいずれか を含有する；　（ａ）各リゾピア種のマメ科植物宿主相手の非変性抽出物の混合 物、（ｂ）上の節５．１゜１．に記載したような各マメ科植物宿主から得られた ３つのクロマトグラフィーの分画、（ｃ）各マメ科植物宿主のクロマトグラフィ ーの分画から得られた結晶、または（ｄ）それに関連する蛋白質（糖蛋白質を含 む）。以後、これらの成分をマメ科植物抽出物、クロマトグラフィーの分画、結 晶または蛋白質と呼ぶ。各親すゾビウム種は、そのすしに沿って特徴ある色を有 するコロニーを形成するであろう。リゾビアトランス接合体（ここでリゾビアＦ ｌ　トランス接合体と呼ぶ）は、親コロニーの交互する列の間に生成される。リ ゾビアＦｌ　）ランス接合体は、それらの親、と異なり、乳白色にコロニーを形 成し、そしていかなる植物も根粒化することができない。 リゾビアＦ、）ランス接合体を乳白色コロニーから分離し、そして固体の栄養培 地上で第３親リゾビウム種と一緒に交互する列で培養し、ここで栄養培地は、リ ゾビアＦ＋）ランス接合体の生成に使用したマメ科植物抽出物、クロマトグラフ ィーの分画、結晶または蛋白質に加えて、第３の親すゾビウム種のマメ科植物宿 主相手から誘導した第３の非変性マメ科植物抽出物、クロマトグラフィーの分画 、結晶または蛋白質を含有する。リゾビアＦｚ　）ランス接合体は、リゾビアＦ 。 トランス接合体によって形成する乳白色コロニーおよび第３親リゾビウムによっ て形成する着色コロニーの交互する列の間に生成される。リゾビアＦｚ　）ラン ス接合体のコロニーは、それらの純白色のコロニーによって同定され、そしてこ こに記載するようにして処理されかつまかれた種子から成長した非マメ科植物を 感染し、根粒化しそしてその植物において窒素を固定することができる。 上で生成したリゾビアＦ、Ｉ−ランス接合体およびリゾビアＦＺ　）ランス接合 体の同定および選択は、使用する特殊化された培地のために可能となる。各交雑 （ｃｒｏｓｓ）を実施するとき、２種類のコロニーが親の列の間で発生する：　 （ａ）親のコロニーの色の混合物からなる色を有するコロニーおよび（ｂ）乳白 色リゾビアＦ＋　トランス接合体または純白色のリゾビアＦ”　）ランス接合体 のコロニー。混合した色のコロニーは安定でないリゾビアからなる；これらのリ ゾビアは両者の親リゾビウムのマメ科植物宿主相手を根粒化することができるが 、１世代においてのみである。換言すると、各マメ科植物宿主の根粒から回収し たバクテロイドはその特定のマメ科植物宿主を再び根粒化できるのみである。乳 白色コロニーのリゾビアＦ、）ランス接合体は安定であるが、いずれの植物をも 根粒化することができない。驚くべきことには、純白色のコロニーのリゾビアＦ ２　トランス接合体は、非マメ科植物において根粒化かしかつ窒素を固定するで きる安定なリゾビアである。 Ｆ２　トランス接合体を生成するために使用する親リゾビアは、リゾビアの第３ 種、他のＦ、）ランス接合体または可能ならば他のＦ２　）ランス接合体からな ることができる。第３親が他のＦｌ　トランス接合体を含む場合、栄養培地は少 なくともマメ科植物抽出物、クロマトグラフィーの分画、結晶または蛋白質を含 有するであろう；すなわち、２つのＦｌ）ランス接合体の各々を生成するために 使用した２つの親リゾビアの各々のためのマメ科植物宿主相手のそれら。第３親 がＦ２トランス接合体を含む場合、栄養培地は少なくとも５つの宿主マメ科植物 抽出物、クロマトグラフィーの分画、結晶または蛋白質を含有するであろう；す なわち、Ｆ、）ランス接合体を生成するために使用した２つの親リゾビアの各々 についてのマメ科植物宿主相手ならびにＦ２　）ランス接合体を生成するために 使用した３つの親リゾビアの各々のためのマメ科植物宿主相手のそれら。 親コロニーの交互する列はトランス接合体を生成するための便利なアプローチで ある；しかしながら、接種のいかなるパターンまたは方法を使用して、接合が起 こるように互いに近接して親コロニーを成長させることもできる。円形、楕円形 、波形またほら線形のパターンを使用できる。事実、ある数の異なる親のしすを 平板上につけて、同−平板上にある数の異なるトランス接合体を生成することが できる。 ５、１−３−　」１転換体血止爪ｊ玉別皇方五。 交互する系統培養法はリゾビアＦ２形質転換体を生成する便利な方法であるが、 本発明はこの方法に限定されない。事実、接合に加えて、リゾビウムの増大した 宿主範囲の特異的の原因となる適当なプラスミドを使用する形質転換は、本発明 の範囲内に包含されると考えられる。さらに、組換えＤＮＡ技術、例えば、適当 な配列によるリゾビアの感染のためのファージまたは他のベクターを使用する技 術、は本発明の範囲内に包含されると考えられる。 例えば、リゾビアのための得に有用な系は、リゾビアを形質転換するための方法 において使用できるＴｎ５）ランスボゾンである。共生プラスミド（盈り旦プラ スミド）はｎｉｆ遺伝子を含有する標１ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーシ ョンによって同定することができる。このｌプラスミドの転移は、次のようにし て達成できる：　Ｔ　ｎ　５を使用して（ａ）マーカー遺伝子を土工ｌプラスミ ド中に組み込むこと、すなわち、抗生物質抵抗性の遺伝子を１Ｌｍ中にトランス 接合体Ｔｎ５を使用して、共与体および受容体のバクテリアの培養および獲得し た抵抗にもつづくハイブッリドの選択により組込むこと、（ｂ）ｓｌニブラスミ ドまたはその蛋白質をＥ、ｃｏｌｉ中でクローニングし、そしてリゾビアをプラ スミドそれ自体で形質転換すること、（ｃ）プラスミドを輸送遺伝子でマーカー 遺伝子（例えば、抗生物質抵抗性）、例えばｐＶＷＳＪＩまたばＴｎ５−Ｍｏｂ と一緒に組換えることおよび（ｄ）その組み込んだ遺伝子をもツブラスミドを含 有するバクテリアを受容体のバクテリウムと、同時に輸送を促進するための補助 バクテリウムと一緒に、ハイブリダイゼーションすること。 ５゜２．非ヱｌ丑請　の重　の−および波工）しさ」灯」鷺」１三り本発明のリ ゾビア形質転換体の間の共生を達成するために、非マメ科植物の種子をリゾビウ ム形質転換体に対して特異的な物質で処理または被覆すべきである。このような 被膜はリゾビウム形質転換体それ自体を含むか、あるいは排除することができる 。被膜中のりゾビウム形質転換体の存在または不存在は、後に成長する植物にお いて共生を達成するために使用する方法に影響を与えるだけである。 ５、２．１．　訓１ノＪＩＪＬＪかλ臣ヂ曵植改。 種子の被膜は、次の成分を包含するが、これらに限定されず、リゾビウム形質転 換体を組込むかあるいは排除することができる＝　（ａ）リゾビウム形質転換体 の各親に対する相手であるマメ科植物宿主相手の各々から誘導された抽出物の混 合物、（ｂ）リゾビウム形質転換体の各親に対する相手であるマメ科植物宿主相 手の各々からＦｆｆｉされたクロマトグラフィーの分画、（ｃ）マメ科植物抽出 物および／またはそのクロマトグラフィーの分画から誘導された化粧または（ｄ ）それに関連する蛋白質。前述のように、蛋白質は化学的合成法−または組換え Ｄ　Ｎ　Ａ技術によって生成することができるか、あるいは別の源からの分離す ることができる。 本発明のいかなる理論または説明にも拘束されたくないが、前述のこれらの種子 は次の因子を含有できるが、これらに限定されない：レクチン類、フラボン類な ど、これらは非マメ科植物とリゾビア形質転換体との間の共生を達成するとき重 要であることがある。最近、リゾビウムのノブリンの遺伝子の発現は、正常の根 毛のカーリンダに関係し、それゆえ、共生体／宿主の認識に関係および根粒化に 関係し、マメ科植物の根の浸出物により誘導されると報告された（Ｒｏｓｓｅｎ 　ｅｔ　ａｌ、＋１９８５、ＥＭＢＯ４（１３八）：　３３６９−３３７３）。 非常に最近、マメ科植物の根から分泌されるフラボン類と呼ばれる化合物の群は 、リゾビウムにおける根粒化遺伝子の発現を誘導すると報告された（参照、Ｒｅ ｄｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ　３２３：６３２−６３５ ）。フラボン類は種々の植物の花および刃において通常生成され、マメ科植物の みがフラボン類を分泌し、あるいは根の中にフラボン類を含有する。Ｒｅｄｍｏ ｎｄ　ｅｔ　ａｌ、の報告に従うと、エンド、マメ、ダイス、アルファルファお よびクローバ−からの根の浸出物はりゾビウム・トリフオリ　（以後、Ｒ，ｔｒ ｉｆｏｌｉ）中の」ｏｄ　Ａの発現を誘発したが、Ｌ非マメ科植物からの根の浸 出物は誘発しなかった。リゾビウムの刺激は共、生の観点から非マメ科植物特″ ″均ではなかった；すなわち、ｎｏｄ　Ａの発現は異なるマメ科植物のある数の 浸出物に応答してリゾビウム中において誘発された。したがって、フラボン類は りゾビウムとマメ科植物との間の早期のシグナルの１つであることがあり、その 後第２以上の宿主特異的認識が起こって（例えば、レクチン−多糖類の認識系） その特定の宿主−共生体の相互関係を確立する。多分、フラボンの誘発系は早期 の事象であり、この事象はマメ科植物抽出物で処理した非マメ科植物の種子を本 発明のＦ２リゾビウム形質転換体で感染されるようにさせる。多分、マメ科植物 抽出物中に存在するフラボン類は、摂取または発芽前の間に非マメ科植物の種子 におり取り上げられ、若い実生の根に移送され、そして浸出するとき、リゾビウ ム形質転換体を吸引する。 本発明における種子中に含有されるマメ科植物抽出物からの他の因子は、非マメ 科植物宿主Ｆｚ　トランス接合体の感染の確立において重要であることがある。 例えば、種子の被膜は、リゾビアとそれらのマメ科植物宿主相手との間の特異的 認識相互作用において関係すると信じられるレクチン類を含有することできる。 最近の報告は特定の形態のレクチン、トリフォリン（Ｔｒｉｆｏｌ　ｉｎ）　Ａ を記載しており、これはクローバ−の根の浸出物から分離することができ、る。 そしてＲ，ｔｒｉｆｏｌｉへ特異的に結合する（Ｔｒｕｃｈｅｔ　ｅｔ　ａｌ、 、１９８６＋Ｐｈｙｓｉｏ１．Ｐ１ａｎｔ６６　：５７５−５８２）。興味ある ことには、レクチンを含有するマメ科植物の根の浸出物は、突然変異のリゾビア のそれらのマメ科植物宿主を認識しかつ根粒化する能力を回復した（参照、Ｈａ ｌｂｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、７４ ：８４−８９および１９８５゜Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、７７：６２１−６ ２５）　、　１または２種以上のレクチン類は本発明の種子の被膜中に存在する 可能性が非常にあり、これらはリゾビア形質転換体とその非マメ科植物相手との 間の特異的認識を越させることができる。 ５、２．２．　非１１Ｊｉ■痕閃１Ｌ匂１ろ一方一汰非マメ科植物の種子は種々 の方法で被覆することができ、これらの方法は次のものを包含するが、これらに 限定されない：浸漬および空気乾燥、噴霧、カプセル化（例えば、ポリマー中） 、浸漬およびドラム乾燥など。選択する方法は使用すべき被膜に依存するであろ う。リゾビア形質転換体が被覆混合物中に含まれる場合、バクテリアの生存能力 を確保する方法または成分を使用すべきである；これらは次のものを包含するが 、これらに限定されない；湿気のレベルを高く保持するためのゲル物質ヲ含有ス ル被覆混合物；あるいは、種子は殺菌剤を含有する種子の皮の粉砕物で被覆する ことができる。いずれの場そしてにおいても、この方法は被膜中の活性成分が変 性または破壊されないように達成すべきである。 本発明の実施例において、非マメ科植物の種子はマメ科植物抽出物中に浸清し、 ぞ１．て空気乾燥した；好ましくは３回実施した。２回の浸漬はリゾビア形質転 換体の劣った浸透を生じたが、これに対して４回の浸漬は浸透を改良するように 思われなかった。 ５．３．　−非ヱノー科范−物−顛お−リークー共−小的１翻１Φ個芙Ｊυ宜− 立ある数の方法を使用Ｉ７てリゾビア形質転換体による非マメ科植物の感染を確 保することができる；選択する方法は、一部分、使用する非マメ科植物の種子の 被膜の性質に依存する。 例えば、リゾビウム形質転換体を含有しない被覆混合物で前述のように処理した 非マメ科植物の種子は、リゾビラＪ、形質転換体の懸濁液で水をやることができ る。こうして、種子、実生または植物は適当な体積のバクテリアの懸濁液で水を やることができる。種子被膜はりゾビウム形質転換体を含有する場合、植えるこ とおよび水をやることのみが要求されるだけである。 植物の種類、土壌の状態または地形などに依存して非窒素肥料を添加することが 望ましいことがある。事実、種子を最初にまくとき２ミリモルの窒素の添加は、 リゾビアトランス接合体を損傷または「切り離す（ｓｈｕｔｔｉｎｇ　ｏｆｆ） Ｊすることなく、植物の初期の成長を増加するために十分であることがわかった 。大抵の土壌（肥料を施してない場合でさえ）はある是の窒素（その２ミリモル より多くない）を含有するので、これは天然の条件を密接にまねる：畑における 窒素の添加は不必要である。 ５．４．１貼υ片カー住友屏１ノ１月責勺一本発明のリゾビアによって根粒化さ れる非マメ科植物は、窒素の肥料を施された根粒化されない相手に等しいか、あ るいはそれより大きい窒素含量および乾燥物質含量を有する；根粒化された植物 は、それらの肥料を与えられていない非根粒化相手よりも、高い窒素含量および 乾燥物質含量を有する。 根粒化植物の゛アミノ酸分析は、大抵の場合において、各アミノ酸の比率は同一 にとどまるが、植物当りの合計の濃度は増加することを立証した。しかしながら 、ある場合において、トリプトファンおよびロイシンのより高いレベルが観測さ れた。 興味あることには、根粒化非マメｆで１植物種のあるものの収穫後に残留する茎 （ｓｔｒａｗ）は、約６％〜・約９％の蛋白質含量を絶えず有した；これは根粒 化されなでいない相手の茎中に通常存在する蛋白質含量と顕著な対照をなす。こ の高い蛋白質の茎は、蛋白質源として、例えば、飼育場の動物および家畜の両者 のための動物試料混合物における蛋白質源として、有利に使用できる。 非マメ科植物において根粒化しかつ窒素を固定するりゾビウム形質転換体は、高 価な窒素肥料の使用を減少することができ、そして究極的は土壌を改良すること ができる。 ５．４．１．　１拉息立敗 本発明のリゾビア形質転換体によって形成される非マメ科植物の根粒の形態は概 観が非常に正常であるが、より小さい根粒が大きい比率で形成する。リゾビアは 感染糸を経て根に入るように思われ、そしてバクテロイドは隔室中に維持される よ・うである。事実、赤みがかった色が根粒において観察され、そしてそれはレ グヘモグロビンまたはそれに密接に関係する蛋白質であろう。根粒の電子顕微鏡 検査は、外皮中に存在する脈管束が周辺に位置し、これに対して横の根の脈管束 がバクテロイドで充填されていることを明らかにする。 ６、実施例：リゾビア形質転換体の生成のための材料およａ坊法およ−びＪ［η Ｌ秤碌胞９皿七ｍ以下の実施例は、イネ族（ｇｒａｓｓ　ｆａｍｉｌｙ）　（Ｐ ｏａｃｅａｅ）に属する次の非マメ科植物の本発明のりゾビウム形質転換体によ る根粒化を説明する：コムギ、オオムギ、モロコシおよびイネ。 さらに、アブラナ族（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の構成員、イネ族の範囲外の植物の族 （すなわち、Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ族）を、また、本発明のりゾビウム形質転換 体で根粒化する。興味あることには、イネ族の範囲外の他の植物、ユーカリ（Ｅ ｕｃａｌｙｐｔｕｓ）　（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ族の構成員）について陽性の作用 が観測された。各実施例において、交互する系統培養法を用いてリゾビウムトラ ンス接合体を生成した。非マメ科植物の種子は、非マメ科植物の根粒化に使用し た特定のりゾビウムトランス接合体に対して特異的なマメ科植物抽出物中に種子 を浸漬することによって被覆した。被覆した非マメ科植物の種子は、被覆した種 子をまき、種子を発芽させ、実生にリゾビウムトランス接合体の懸濁液で水をや ることによって、リゾビウム形質転換体で感染させた；窒素を固定する根粒は８ 〜１２週で発生した。 実施例において、実験の研究を実施し、ここで非マメ科植物を３つの群に分割し 、次のように処理したー　（ａ）第１群は窒素肥料を用いないでリゾビウムトラ ンス接合体で処理した（＋Ｒ−Ｎ）；　（ｂ）第２群はりゾビウムトランス接合 体をもちいないで窒素肥料で処理した（−Ｒ十Ｎ）；および（ｃ）第３群はりゾ ビウムトランス接合体または窒素肥料のいずれでも処理しなかった（−Ｒ−Ｎ） 。成長の間の或時間において、植物をサンプリングし、そして植物当りの有機窒 素の合計含量、植物当りの乾物の量、およびある実験において、植物当りの蛋白 質含量およびそのアミノ酸の組成を決定した。 ある実施例において、フ”イールドの研究を実施した。各場合において、リゾビ アトランス接合体により根粒化された非マメ科植物は窒素を固定することができ 、そして成長のために窒素肥料を必要としないことが、結果によって立証された 。 事実、多くの場合において、根粒化非マメ科植物（＋Ｒ−Ｎ）は肥料を施した非 根粒化群（−Ｒ＋Ｎ）または未処理群（−Ｒ−Ｎ）のいずれよりも高い窒素含量 および乾燥物質含量を有した。 特記しないかぎり、後述の材料および方法を以下の各実施例において使用した。 ６．１．　六　るスー坪　法 以下の各実施例において使用した交互する系統培養法は、次のものを包含する： ２つの異なるリゾピア種（親の世代）で栄養寒天培地上に交互する列（３−ｍの 間隔）においてすじをつけ、およびこの栄養培地は、成長に必要な栄養物質に加 えて、各親リゾビウムに対して特異的な各マメ科植物宿主の非変性抽出物を含有 する。３２℃以下、例えば、１８“０〜３０℃の成長温度においてインキュベー ションした後、各親リゾビウムはその種に対して特徴ある色を有するコロニーを 形成した；リゾビアトランス接合体（ＦＩ　トランス接合体）は着色した親のコ ロニーの交互する列の間に生成した。リゾビアＦ＋　トランス接合体は、それら の親と異なり、乳白色コロニーを形成し、そして植物を根粒化することができな かった。ここで使用した寒天培地上の３２℃より高い温度におけるインキュベー ションは、平板上にすしで配置されたすべてのリゾピア種による赤色のコロニー の形成を生ずることに注意すべきである；しかしながら、温度を３２°Ｃより低 くする（例えば、好ましくは１８℃〜３０℃）と、各コロニーの特徴ある色は再 び現われるであろう。 リゾビアＦ、）ランス接合体を乳白色コロニーから分離し、そして前述のように 交互する列（３ｍ＋ｍの間隔）において第３リゾビウム親種と一緒に栄養寒天培 地上で培養し、ここで栄養培地は乳白色コロニーの生成に使用した非変性マメ科 植物抽出物に加えて、第３親リゾビウム種に対して特異的なマメ科植物宿主から 誘導された第３非変性マメ科植物抽出物を含有した。リゾビアＦｚ　）ランス接 合体は、リゾビアＦ、！−ランス接合体により形成された乳白色コロニーおよび 第３親リゾビウムにより形成された着色したコロニーの交互する列の間に生成し た。リゾビアＦ２　）ランス接合体のコロニーはそれらの純白色のコロニーによ って同定された；これらのリゾビアＦ２　）ランス接合体は、前述のように処理 しかつ＋１１えた非マメ科植物において感染し、根粒化しかつ窒素を固定するこ とができた。リゾビウムトランス接合体を生成するために使用した材料および方 法を下に詳述する。 ！３．１．１．　凱ユｊ旦ヱΩ況離 親世代として使用したリゾピア種は、土壌の試料から、あるいは発育の進行した 段階にあるマメ科植物の根粒から分離した。 土壌からの親リゾビアの分離は、土壌試料中のリゾビアによって根粒化する宿主 マメ科植物の種子を配置することによって達成した。植物は３〜４週後（通常） または遅く成長する場合１０〜１２週後に収穫した。 マメ科植物の根粒からの親リゾビアの分離は次のようにして達成した：３％のｌ １ｇｃｌ□中に浸漬しそして８０％のエタノール中で洗浄した根粒を取囲む根の 組織のほぼ１■と一緒に、マメ科植物の根から根粒を切り取った。次いで、根粒 を根の組織から切除しそして乳鉢中で無菌条件下に粉砕した。マセレーションし た材料を後述の栄養寒天培地上に広げた。コロニーを、単一のコロニーが２回形 成するまで、同一組成の培地上で二次培養することによって精製した。精製した ｊ■−のコロニーから分離したリゾビアで記載した栄養寒天培地上に交互する列 ですしをつけて、親リゾビアのコロニーの交互する列を培養した。 ６、１．２．　末ｊ」しυ１墳 交互する線でリゾビアを培養するために使用した寒天培地は、次の栄養物質を示 した量で１００ｍ１の蒸留水に添加することによって調製した： ＫＨ２ＰＯ４，０，１５ｇ ＫｚＨＰＯ４０，１５ｇ ＫＮ（ｈ　２．５０　ｇ （ＮＨｔ）　ｚｓｏ　４０　、１３５　ｇＭｇＳｏ　４　・７Ｈｚ０　０．２５ 　ｇマンニトール　１０．００　ｇ 寒天　１２．００　ｇ ？容液阻ｉ　１．００　ｍ！ 酵母抽出物　５．００　ｍ／ 溶液隘１は次の組成を有した： ＭｎＣ１ｚ　・４ＨｚＯ５００ｒｒｇ ＨＪ（ｈ　３００■ Ｚ１１５０４　・２Ｈｚ０　２００　ｍｇＮａＭｏ０４・２Ｈｚ０　２０　ｒＮ ＩＣｕＳＯ４・５Ｈｚ０　２　ｍｇ ＣｏＣｌｚ　・６Ｈｚ０　２　ｍｇ 蒸留水で最終体積を１００ｍ１とする。 次いで、上に定義した寒天培地を２０分間２バールにおいてオートクレーブ処理 し、そして５５℃〜６０℃の温度に冷却し、次いで次のものを添加した：１．Ｏ ｍｌの各溶液隘２、溶液隘３および溶液隘４；培地上で培養すべき各親リゾビア に対して特異的な宿主マメ科植物から誘導した非変性マメ科植物の抽出物の各々 の２０−；および１５■の次のアミノ酸の各々、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリンおよ びＬ−）リプトファン。 マメ科植物抽出物中の蛋白質の変性を回避するために、最終の培地組成物はオー トクレーブ処理すべきではない。 溶液１１！１２、溶液階３および溶液Ｎ１１４は下に示す組成を有した。各々は 無菌の蒸留水を使用して調製した。 釡巌丸１上 ニコチン酸　５０■ チアミンＨＣ１５０■ ピリドキシンＨＣ１５０■ ミオイノシトール　５０■ ビオチン　５０■ 無菌の蒸留水で最終体積を１００ｍ１とする。 薔濱幻（ｌ三− ヨウ化カリウム　７５　ｍｇ 無菌の蒸留水　１００■ 釡腋ＮＱ、４： ＣａＣ１ｚ　・Ｈｚｏ　１５　ｇ 無菌の蒸留水　１００　ｒｒｇ ６、１．３．　マメ盲　の 寒天培地中に使用しかつ非マメ科植物の種子を被覆するだめのマメ科植物抽出物 は、次のようにして調製した。 完全植物、または選択した植物の部分、例えば、きれいな洗浄した根、滅菌した 種子または気中性部分、または、好まＬ、　＜　＋４：、若いシーｊ、・１・を 微細粒子に分割シ２１、乳鉢中において８０％の：ｆタノー）しで４分砕して薄 い１句Ｉｔなペーストにし、この中１８５−等体積のカリウＪ、−ナトリウム塩 の緩衝液、ｐＨ７，２、を添加し２１、−の緩衝液は次の成分からなっていた： に２Ｈ１１０４０，４３０ｇ ＮａｌｌｚＰＯａ　１．４６９　ｇ ＮａＣ］　７．２００　ｇ 無菌の蒸留水で最終体積を１００ｍＺとする。 均質化した植物抽出物と暖；ｊｊ液との混合物を４℃において４８時間放置し、 そしてほぼ５０００Ｘｇにおいて３０分間遠心することによって沈殿させた。次 いで、上澄みを無菌の溶液ウェルに対して４°Ｃにおいて約４８時間透析し、そ の間、透明な無色の液体、すなわち、抽出物が得られるまで、水を５〜６回交換 した。抽出物は４℃において貯蔵した。 ６．１．４．　’）ニイ」−一ン−Ｚ」妾ヨ）イも４２づＹあＷ２つの親すゾビ 了を３２゛Ｃ以下の温度において交互する線（３ｍｍの間隔）で前述のような適 当なマメ科植物抽出物を含有する寒天培地上で培養すると、特徴ある色を有する 親リゾビアが形成した。しかしながら、着色した親のコロニーの列の間に、２つ のタイプのコロニが発生した：　（ａ）親のコロニーの色の混合物である色を有 するコロニーおよび（ｂ）リゾビウムＦｌ’）ランス接合体の乳白色コロニー。 着色したコロニーとＦｌ、　）ランス接合体の乳白色コロニーとの間の比率は多 少変化したが、平均約１００８３（混合した着色したコロニー；乳白色コロニー ）の範囲であった。混合した着色した二２０−’、・−は両者の宿主マメ科植物 種を根粒化しノ、：が、たた１つの世代においてのみであった；すなわち、混合 した着色したコロニーのリゾビｊは両省の親リゾビアのマメ科植物宿主相手を根 粒化したが、各マメ科植物宿主の根粒から回収しまたリゾビアばその特定のマメ 科植物宿主を再び根粒化できるのみであった。対照的に、Ｆ、トランス接合体の 乳白色コロニーはいずれの植物をも根粒化ことができなかった。 単一のハイブリッドコロニーを１または２以」−の着色したコロニーで汚染しな いで新しい培地に移すことが困難であったので、典型的には１０〜１２週後まで 、安定な均一な乳白色コロニーが得られるまで、乳白色コロニーを他の寒天培地 （同一組成をもつ）に移すことによって生物学的清浄化を１または２回収、ヒ実 施した。 次いで、乳白色コロニーを形成したＦｌ　トランス接合体の純粋な培養物を、Ｆ ｌ　）ランス接合体のためＣご使用したのと同一の組成の寒天培地上で他のりゾ ビウム種と一緒に交互する線（３１１の間隔）で培養し、ここで寒天培地は、さ らに、第３親リゾビウムに対して特異的なマメ科植物宿主から誘導した第３マメ 科植物抽出物を含有した。Ｆ、Ｉ−ランス接合体はその特徴ある乳白色コロニー を生成し、これに対して親リゾビウムはその特異的色を有するコロニーを生成し た。乳白色コロニーと着色したコロニーとの間に２つのタイプのコロニーが発生 した二着色したコロニーおよび純白色のコロニー。 純白色のコロニーは、非マメ科植物において窒素固定性根粒を形成できるリゾビ アＦ２　）ランス接合体からなる。Ｆ２　）ランス接合体の純白色のコロニーを 、乳白色コロニーについて説明したように、清浄化しかつ分離し、そして非マメ 科植物を根粒化するために使用した。 非マメ科植物の根粒化後、リゾビアＦ２　トランス接合体のバクテロイドは根粒 から分離し、そして寒天培地中で培養することができる。寒天培地がトランス接 合体の生成に使用した寒天培地と同一の組成を有しくすなわち、寒天培地がＦ２ トランス接合体の生成に使用した各親リゾビウムに対して特異的なマメ科植物宿 主から誘導した３つのマメ科植物抽出物を含有し）およびその非マメ科植物宿主 植物の抽出物を有する場合、非マメ科植物の根粒から分離したＦｔ　）ランス接 合体は灰色がかった色を有するコロニーを形成するであろう。 ６．２．Ｆ７−Ｌ利櫨豆Φ」１五Δ既製３％の硫酸カルシウムおよび１０％まで の３つのマメ科植物抽出物の混合物（節６．１．３．で説明したようにし２て調 製し、リゾビアＦ２　トランス接合体の生成に使用した）を含有する水溶液中で 、種子を各回３時間２０℃において３回浸漬することによって、非マメ科植物の 種子を被覆した。各浸漬後、種子を４０℃において１２時間空気乾燥した。 ６．３ｏ　リゾビアＦＺ　）ランス接合体による非マメ科植吻部速□−−−−− −−、−−−〜−−−−−−−−−−−−−−−−リゾビアＦ２　）ランス接合 体による非マメ科植物の感染は、被覆した非マメ科植物の種子をまき、そし７て 発芽した実生をリゾビアＦ２　１−ランス接合体の懸濁液で水をやることによっ て達成した。以下の実施例において、実験室の研究およびフィールドの研究を実 施し、ここで発芽した実生を（ａ）無機の窒素肥料を使用しないでリゾビアＦ２ 　トランス接合体（→−Ｒ−Ｎ）で処理した；　（ｂ）リゾビアＦＺ　＋−ラン ス接合体を使用しないで無機窒素肥料（−Ｒ＋Ｎ）で処理した；または（ｃ）リ ゾビアＦ、）ランス接合体または無機の窒素肥料のいずれでも処理しなかった（ −Ｒ−Ｎ）、得られる植物の植物当りの窒素含量、乾燥重量およびある場合にお いてアミノ酸の組成を決定した。 使用した材料および方法を下に詳述する。 ６、３．１．　実駿窯Ω研究 実験室の研究において、被覆した非マメ科植物の種子を、３ｎ″Ｆｉｂｏ”（Ｒ ）−クリンカーを充填した１リツトルの容器（Ｊｙｄｓｋ　Ｐａｐｉｒ　Ｖａｅ ｋ、Ａｒｈｕｓ）にまいた：４〜５種子／容器をまいた“Ｆｉｂｏ”クリンカー を空気充填し、これは通常分離材料として使用される直径はぼ３　ｍｍの焼成し た粘土の小石である。 発芽した種子が“Ｆｉｂｏ”クリンカーの表面より上に数センチメートルで成長 したとき、各容器中の実生に次のように水をやった：（ａ）＋Ｒ−Ｎ群はリゾビ アＦ２　）ランス接合体の懸濁液の５０−で水を・やった；その後植物に５０〜 ８０ｍ１／容器の非窒素肥料で毎週１回水をやった。（ｂ）−Ｒ＋Ｎ群はリゾビ アＦ２　トランス接合体で処理しなかったが、その代わり無機の窒素肥料で水を やった；その後植物に５０〜８０ｍ１／容器の同一の無機の窒素肥料で毎週１回 水をや。った；（ｃ）−Ｒ〜Ｎ群は５０〜８０ｍ／／容器の非窒素肥料で水をや った。使用した無機の窒素肥料および非窒素肥料を下に定義する。 肥料 す」β歎」 旭鑞　仝−索一　、！Ｌ″Ｕ孟 ＮＨ−ＮＣｈ　（１，０Ｍ）　２０　０ＣａＳＯ４・２ＨｚＯ（０，０１２Ｍ） 　６５　６５ＭＨｚＰＯ４（０，１０Ｍ）　２０　２０Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ，Ｏ（ ０，２０Ｍ）　１５　１５Ｆｅ　（ＥＤＴ八）： ＦｅＳＯ４−７ＨｚＯ（２，４９０ｇ　）　１０　’１ＯＮａｚＥＤＴＡ　（３ ，７１６ｇ　） 最終体積１２ ＭｎＣ１５・４ＨｚＯ（１０６，１ｍｇ／　ｌ　）　１０　１０）１．８Ｏｆｆ 　（１４２，２■／Ｉり　１０　１０ＺｎＳＯ＜　・７ＨｚＯ（１１０，７ｍｇ ／　Ｉ！　＞　１０　１０ＣｕＳＯ，・５ＨｚＯ（８，０ｍｇ／Ｃ）１０　１Ｏ ＮａｚＭｏＯ＜　４２ＨｚＯ（１１，１ｍｇ／　Ｅ　）　１０　１０実生に水を やるために使用したリゾビアＦ２　トランス接合体の懸濁液は、２００　ｍｌの 次の栄養培地を含有する３００−のフラスコ内でリゾビウムＦｚ　）ランス接合 体を培養することによって生成した： ＫＨｔＰＯ４１，Ｏｇ ＫＪＰｏ、　１．０　ｇ ＭｇＳＯ，・７）１２０　０．３６　ｇＣａＳＯ，−２Ｈｚ０　０．１７　ｇ ＦｅＣ１３’　６Ｈｚ　０．００５　ｇＫＮＯ：ｌ　０．７　ｇ 酵母抽出物　】、Ｏｇ マンニトール　３．０　ｇ 蒸留水で最終体積を１０１００Ｏにした。 ０Ｄ６２０において分光光度測定的に測定した培養物のバクテリア密度が０．８ になり、こうしてバクテリアが対数成長期にありかつ培養物が停止期に入ってし まわなくなるまで、バクテリアを２８℃において２〜３日間増殖させた。次いで 、細胞をほぼ５，０００Ｘｇにおいて３０分間遠心して沈殿させ、そして無菌の 水中に懸濁することによって洗浄した。この洗浄を１回または２回反復して、バ クテリア細胞からすべての窒素化合物を除去した。細胞の最終の沈殿物を１，８ リツトルの無菌の水中に再懸濁した；この最終のバクテリア懸濁液を使用して非 マメ科植物の実生に水をやった。 ６・３・２・　−７〕−ニフヒ」二Φ」贋究−フイールドの研究において、けっ して栽培しなかった土壌に、被覆した非マメ科植物の種子をまいた。土地は清浄 にし、幅３０フィート×長さ９０フィートのストリップに分割し７た。 種子は交互するストリップにおいてのみまいて（すなわち、まかない土地のスト リップは種子をまいたストリップの間に残留した）１つのストリップの中から列 に化学物質が浸出して他のストリップへ入りかつそれを汚染するのを防止しまた 。 １つのストリップ内で、種子は６列でまいた；各列は６０インチで分離し、ぞし ７て各列内の種子ば８インチの間隔でまいた。 各ストリップは次の群の１つを含有した：リゾビウムＦ２トランス接合体で処理 しかつ前に定義した非窒素肥料で水をやった＋Ｒ−Ｎ群、（ｂ）リゾビウムＦ２ 　トランス接合体で処理しなかったが、その代わり前に定義した無機の窒素肥料 で水をやったーＲ＋Ｎ群、および（Ｃ）リゾビウムＦＺ　トランス接合体または 無機の窒素肥料のいずれでも処理せず、その代わり非窒素肥料で水をやったーＲ −Ｎ群。 次の手順を用いて＋Ｒ−Ｎ群をリゾビウムＦｚ　）ランス接合体で感染させツこ ：リゾビウムＦ２　）ランス接合体の培養物を、まいた種子の各々より下の４イ ンチにおいて摂取した。 土壌の摂取は、非常に大きい規模で前述のようにして調製したリゾビアＦｚ　） ランス接合体の懸濁液を含有する３００ガロンのタンクを有する機械によって達 成したくすなわち、リゾビアＦ２　）ランス接合体を１０，０００ガロンのタン ク内で対数期に成長させ、そして０．８のＯ，Ｄ、、□。に希釈した）。はぼ１ ．５ｍＺ／種子のりゾビウムＦ２　）ランス接合体の培養物を下に横たわる土壌 中に摂取した。その後、種子および実生に前述のように水をやった。 ６．４．根粒化非マメ科植物の乾燥塊、窒素含量および蛋ｎ貫含量■分扼凹犬濃 のプロトコル　−−周期的に、実験室の研究における各植物群からの容器の数を ３植物／容器に薄くし、そしてクジェルダール（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）分析のため 取り出し、ここで容器当り（すなわち、３植物当り）の有機窒素の合計含量およ び乾物の量を決定した。この目的で、植物の気中性部分を取り出し、８０℃で４ ８時間乾燥し、秤量し、粉砕し、そして乳鉢中ですりつぶした。マセレーション した物質の試料をクジェルダール分析のため取り出し、この分析を標準法に従っ て実施した。クジェルダール分析は４〜６回反復した。結果を植物当りの窒素の 重量および乾物の重量で記録した。すべての場合において、リゾビウム根粒化植 物は、窒素の肥料を施した群または未処理の群よりも、乾物および窒素の含量は 高かった。 フィールドの研究において、ある数の植物を周期的に収穫し、そして植物当りの 蛋白質含量は、まず、クジェルダール分析を用いて植物の窒素含量をアッセイし 、そして窒素の百分率に６．２５をかけることによって決定した。ある研究にお いて、蛋白質のアミノ酸組成を決定した。すべての場合において、リゾビウム根 粒化植物は、無機の窒素肥料で処理した植物および非窒素肥料で処理した植物の それよりも高い蛋白質含量を有した。 ７、実施例：コムギを根粒化するりゾビウム・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　 ｔｒｉｔｉｃｉ）コムギを根粒化するりゾビウム・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ ｍｔｒｉｔｉｃｉ）を、節６に記載した方法に従い、まず、Ｒ，ｐｈａｓｅｏｌ ｉをＲ，ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｎａと交雑してリゾビアＦ、）ランス接合 体を生成し、次いでこれをＲ，ｔｒｉｆｏｌｉと交雑させたることによって生成 した。このように生成したＲ、　ｔｒｉ　ｔｉｃｉを使用して、４つのタイプの コムギを根粒化した：　Ａｎｊａ、Ｋｒａｙａ、ＶｕｋａおよびＷｉｉｌｉａｍ ｓ６ ７、】、　リゾビラ１、・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｔｉｃｉ）の 調ｆ；Ｉ＋ 不一−−−−−−−−一−□−−−−一−−−一□−−＝−一−−−９−□−一 −−−−−一−−□−Ｒ，ｔｒｉｔｉｃｉの生成のため、次の親リゾビアを使用 してＦｌトランス接合体の乳白色コロニーを生成した：（ａ）アームス（Ａａｒ ｈｕｓ）付近で見出される土壌の試料、ＭＳ−１、中で成長したキドニー・ビー ン・カルチバー（ｋｉｄｎｅｙ　ｂｅａｎ　ｃｕｔｉｖａｒ）、ｔ’ｒｏｓｐｅ ｃｔｏｒ、から分離したＲ、ｐｈａｓｅｏｌｉ　；および（ｂ）ニューギニア、 バブアからの熱帯産の木Ｌｅｕｃａｅｎａ　１ｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ（Ｆａｂ ａｃｅａｅ族に属する）から分離しノたＲ、ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｎａ　 。 親リゾビアを前述の寒天培地上で交互する線で培養した；培地中に使用したマメ 科植物抽出物は、それぞれ、キドニー・ビーンの気中性部分およびＬｅｕｃａｅ ｎａ　１ｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａの葉から誘導した。Ｒ，ｐｈａｓｅｏｌｉによ り形成したコロニーは特徴ある暗褐色の色を有し、これに対してＲ，ｃｏｗｐｅ ａ　１ｅｕｃａｅｎａによって形成したコロニーは特徴ある灰色がかった褐色を 有した。 乳白色コロニーから誘導したりゾビウムＦ＋）ランス接合体を、前述のように、 清浄にしそして、ランダース（Ｒａｎｄｅｒｓ）付近で見出される土壌の試料中 で成長した１／ソド・クローバ−から分離したＲ、ｔｒｉｆｏｌｉの株と一緒に 交互する線で培養した。培地中に使用したマメ科植物抽出物は、キドニー・ビー ンの気中性部分、Ｌｅｕｅａｅｎａ　１ｅｕｃｏｃｅｐｈａＩａの葉およびレッ ド・クローバ−の気中性部分から誘導した。Ｆ、）ランス接合体によって形成し たコロニーは乳白色を有し、これに対してＲ６ｔｒｉｆｏｌ　ｉによって形成し たコロニーは特徴ある淡褐色のコロニーを有した。 すしの間に得られた純白色のコロニーから誘導されるリゾビウムＦ２　）ランス 接合体、ここではりゾビウム・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｈｉｕｍ　ｔｒｉｔｉｃｉ ）と呼ぶ、を前述のように清浄にしそして分離した；これにはほぼ２０週を要し 、次いでＦｚ　）ランス接合体を使用してコムギを根粒化した。 ７．２．　リゾビウム・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｔｉｅｉ）によ 不旦私ｙ了１■Ｈｔｓ−一　−−一 リゾビウム・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｔｉｃｉ）を使用して４つ のタイプの′コムギを根粒化した：　Ａｎｊａ、Ｋｒａｙａ、ＶｕｋａおよびＷ ｉｉｌｉａｍｓ、　３％の硫酸カルシウムおよびホボ１０％までのＲ，ｔｒｉ　 ｔｉｅｉの生成に使用したマメ科植物抽出物を含有する、前述の水溶液中に、コ ムギの種子を３回浸漬することによって種子を処理した；すなわち、種子を被覆 するために使用した３つのマメ科植物抽出物はキドニー・ビーンの気中性部分、 Ｌｅｕｃａｅｎａ　Ｉｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａの葉およびレッド・クローバ−の 気中性部分から誘導した。各浸漬後、種子を後述のように空気乾燥し、そてまい た。 ７、２．１．　聾！少匪究 前述の実験のプロトコルを４つのタイプのコムギについて実施し、た：　Ａｎｊ ａ、Ｋｒａｙａ、ＶｕｋａおよびＷｉｌｌｉａｍｓ　；すなわち、４〜５個の被 覆した種子を“Ｆｉｂｏ”−クリンカーを充填した１リンドルの容器につきまき 、そして発芽させた。３つのタイプのコムギの各々を次の３つの群に分割した： ＋Ｒ−Ｎ、実生に前述のようにして調製したＲ、　ｔｒｉ　ｔｉｃｉの５０ｒｎ ｌの懸濁液で水をやり、次いで非窒素肥料で毎週水をやった；　（ｂ）−Ｒ＋Ｎ 、実生にＲ，ｔｒｉ　ｔｉｃｉを与えなかったが、無機の窒素肥料で水をやった ；および（ｃ）−Ｒ−Ｎ、実生にＲ，ｔｒｉｔｉｅｉ−または無機の窒素肥料の いずれをも与えなかったが、その代わり前述のように非窒素肥料で水をやった。 Ｒ，ｔｒｉｔｉｃｉで処理した植物は８〜１０週で根の根粒を発生した。各容器 内の植物を３植物に薄（し、そして１０容器を各群において乾物および窒素含量 の分析のために使用した。 ７、２．２．　フィールドの呈突 フィールドの研究において、被覆したコムギの種子を節６゜３．２．に記載する ようにまいた。ロフト（ａ）＋Ｒ−Ｎの種子を前述のようにＲ，ｔｒｉｔｉｃｉ の懸濁液で処理し、そして非窒素肥料で処理した；ロット（ｂ）−Ｒ＋Ｈの種子 はＲ，ｔｒｉｔｉｃｉで処理しないが、無機の窒素肥料で水をやった；そしてロ フト（ｃ）−Ｒ−Ｎの種子はＲ，ｔｒｉｔｉｃｉまたは無機の窒素肥料のいずれ でも処理せず、そして単に非窒素肥料で水をやった。 ７．３．根粒化コムギの乾燥塊、窒素含量および蛋白質含屋像ｊ圃り一 節６．４．に記載する分析法を使用して根粒化コムギ植物を特コムギ植物をまい た後５６日、７０日、１００日および１１８日に容器から収穫した。乾燥重量／ 植物および窒素含量／植物（クジェルダール分析）を前述のように分析した。 結果を第１図に示し、ここで乾物／植物（Ａ）および窒素含量／植物（Ｂ）が種 子をまいた後の日数にわたってプロットされている。 図面の理解を促進するため、３つのコムギのタイプについての乾物の平均重量お よび平均の窒素含量についての次の情報は助けになるであろう： 乾物　窒素 コムギ　、Ｌ／」曵」１モ　エＺ腫ヱ Ａｎｊａ　４．４０３　１．１０３ Ｋｒａｋａ　３．６１１　０．８９６ Ｖｕｋａ　４．０５２　０．８１９ 種々の時点に収穫した植物の数は次の通りであった：双旦支に■皇皇歎 種子をまいた後の日数 ＋Ｒ−Ｎ　３３　３０　２１　２３　２５−Ｒ＋Ｎ　２４　３０　２０　２１　 ２Ｏ−Ｒ−Ｎ　２４　２６　２２　２６　３５試鴻ユ ＋Ｒ−Ｎ　１１　１０　７　８　８ −Ｒ＋Ｎ　８　１０　７　７　７ −Ｒ−Ｎ　８　９　７　９　１２ 第１図の結果が立証するように、成長期間の間、リゾビウム処理したコムギ植物 は窒素の肥料を与えられた植物よりも高い窒素含量および乾物を有した；実験の 停止において・＋　Ｒ−Ｎ植物の乾燥含鼠は−Ｒ−（〜Ｎ＋ｉ！物のそれよりも ほとんど４０％高く、そしてこれらのカテゴリーの両者は未処理の−Ｒ−Ｎコム ギ植物よりも高い重量を有した。 ７．３．２．　二？−−イー：＝−ｎ≧−ビー０＋υ［究ｐ−結果フイールドの 研究におけるコムギ植物を成長の１シーズン後に収穫し、そして蛋白質含量／植 物を前述のように分析した。表Ｈに示す結果が明瞭に立証するように、Ｒ，ｔｒ ｉｔｉｃｉで処理した植物（十Ｒ−Ｎ）は無機の窒素肥料で処理した群（−Ｒ＋ Ｎ）または非窒素肥料で処理した群（−Ｒ−Ｎ）のいずれよりも高い蛋白質含量 を有した。 表■ λに曹」迫屓遣Ｉ− 拵吻９−粍　酊瑣倉１／旦劣 ＋Ｒ−Ｎ　２２−２８％ −Ｒ＋Ｎ　１２−１４％ −Ｒ−Ｎ　ＮＤ” 京ＮＤ；データなし；これらの植物は８週後に死んだ。 ８、実施例：オオムギを根粒化するりゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 　ｈｏｒｄｅｉ）オオムギを根粒化するりゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉ ｕｍｈｏｒｄｅｉ）は、節６に記載する方法に従い、まず、Ｒ，ｐｈａｓｅｏｌ ｉをＲ，ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍと交雑してＦｌ　）ランス接合体を生成し 、次いでこれをＲ，ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｎａと交雑さ−１）たる（−と によって生成した。このように生成したリゾビウｌトホルディ（Ｒｈｉｚｏｂｉ ｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ）を使用しζ１，４つのタイプのオオムギを根粒化した：　 Ｈｓｓｏ、Ｃｅｒｉｓｅ］ｒｒｙおよび１ｌｒｉ。 ８．１．Ｊソ連り文芸−−＊、少１−イー（Ｒｂｉｚｏｂｉｕｍ　ｂｏｒｄ−ｅ ｉ）（７）ｇｑ３リゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ） の生成のため、次の親リゾビアを使用してＦｌ　）ランス接合体の乳白色コロニ ーを生成した：（ａ）ア・−ハス（Δａｒｈｕｓ）付近で見出される土壌の試料 、ＭＳ−１、中で成長した４ド二一・ビーン・カルチバー（ｋｉｄｎｅｙ　ｂｅ ａｎ　ｃｕｔｉｖａｒ）　、ＰｒｏＳｐｅｃｔｏｒｓから分離したＲ。 ｐｈａｓｅｏｌｉ　；および（ｂ）ガーデンビーから分離したＲ、　ｌｅｇｕｍ ｉ−親リゾビアを前述の寒天培地上で交互する線で培養した；培地中に使用した ！メ科植物抽出物は１．それぞれ、キドニー。 ビーンの気中性部分およびガーデンピーの気中性部分から誘導した。Ｒ，ｐｈａ ｓｅｏｌ　ｉにより形成したコロニーは特徴ある暗褐色の色を有し、これに対し てＲ，ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍによ−、て形成したコロニーは特徴ある黄金 黄色を有した。 乳白色コロニーから誘導したりゾビウムＦ、トランス接合体を、前述のように、 清浄にしそして、熱帯産の木Ｌｅｕｃａｅｎａｌｅｕｅｏｅｅｐｈａｌａから分 離したＲ、ｃｏｗｐｅａ　Ｉｅｕｃａｅｒ＋ａの株と一諸に交互する線で培養し ７た。培地中に使用したマメ科植物抽出物は、キドニー・ビーンの気中性部分、 ガーデンビーの気中性部分およびＬｅｕｃａｅｎａ　１ｅｕｅｏｃｅｐｈａｌａ の葉から誘導した。Ｆ、　−トランス接合体によっ゛Ｃ形成したコロニーは乳白 色を有し、これに対してＲ，ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｎａによって形成した コロニーは特徴ある灰色がかった褐色のコロニーを有した。 すしの間に得られた純白色のコロニーから誘導されるリゾビウムＦ２　トランス 接合体、ここではりゾビウム・ホルディ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ） と呼ぶ、を前述のように清浄にしそして分離した；これにはほぼ２０週を要し、 次いでＦ２　トランス接合体を使用してオオムギを根粒化した。 ８、１．１．　リゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ）の 特止乏史−−− ３つの親株のプラスミドＤＮＡ、Ｆｌ　）ランス接合体、およびＦｚ　）ランス 接合体（Ｒ，ｈｏｒｄｅｉ）を旧ｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０，Ｊ。 Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１２０：４０３−４１２）の方法の修正法に従 い分離し、この修正法はリゾビアを４℃において４０％のＳＤＳ　（ドデシル硫 酸ナトリウム）中で一夜インキユベーションすることによって溶菌し、植物ＤＮ Ａを分離し、このＤＮＡを０．７％のアガロースゲル中の電気泳動によって分離 することを含んだ。このような分析の結果は、Ｒ，ｈｏｒｄｅｉが３つの親リゾ ビアまたはＦｌ）ランス接合体において観察されない低い分子量の追加のプラス ミドを有することを明らかにした。 ８．２．　リゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ）による オオム渾翌韮豆化−−−−−−−。 リゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ）を使用して４つの タイプのオオムギを根粒化した：　Ｈｓｓｏ、Ｃｅｒｉｓｅ、ＨｒｒｙおよびＩ ｇｒｉ。３％の硫酸カルシウムおよびホボ１０％までのＲ，ｈｏｒｄｅｉの生成 に使用したマメ科植物抽出物を含有する、前述の水溶液中に、オオムギの種子を ３回浸漬することによって種子を処理した；すなわぢ、種子を被覆するために使 用した３つのマメ科植物抽出物はキドニー・ビーンの気中性部分、ガーデンピー の気中性部分および［、ｅｕｃａｓｒ＋ａ　Ｉｅｕｃｏｅｅｐｈａｌａの葉から 誘導した。各浸漬後、種子を後述のように空気乾煙し、そしてまいた。 ８、２．１．　次１ｕか郊え究 前述の実験のプロトコルを４つの夕、イブのオオムギについて実施した：　Ｈｓ ｓｏ、　Ｃｅｒｉｓｅ、　ＨｒｒｙおよびＩｇｒｉ　；すなわち、４〜５個の被 覆した種子を”Ｆｉｂｏ”〜クリンカーを充填した１リツトルの容器につきまき 、そして発芽させた。各タイプのオオムギを次の３つの群に分割した：　＋　Ｒ −Ｎ、実生に前述のようにして調製したＲ、ｈｏｒｄｅｉの５０−の懸濁液で水 をやり、次いで非窒素肥料で毎週水をやった；　（ｂ）−Ｒ十Ｎ、実生にｌ？、 ｈｏｒｄｅｉを与えなかったが、無機の窒素肥料で水をやった；および（Ｃ）− Ｒ−Ｎ、実生にＲ，ｈｏｒｄｅｉまたは無機の窒素肥料のいずれをも与えなかっ たが、その代わり前述のように非窒素肥料で水を・やった。Ｒ，ｈｏｒｄｅｉで 処理した植物は８〜１０週で根の根粒を発生した。各容器内の植物を３植物に薄 くし、そして１０容器を各群において乾物および窒素含量の分析のために使用し た。 ８．３．根粒化オオムギの乾燥塊、窒素含量および蛋白質含量ユ分逝二−−−□ −一〜−□− 節６．４、に記載する分析法を使用して根粒化オオムギ植物を特性づけた。 ８、３．１．　実駁交Ｑ−研突ｑ鞘−果オオムギ植物をまいた後５９日、７１日 、１０８日および１２８Ｅ］に容器から収穫した。乾燥重量／植物および窒素含 ？６／植物（クジェルダール分析）を前述のように分析した。 結果を第２図に示し、ここで乾燥重量／植物（Ａ）および窒素含￥／植物（Ｂ） が種子をまいた後の日数にわたってプロットされている。 図面の理解を促進するため、３一つのオオムギのタイプについての乾燥物質の平 均重量および平均の窒素含量Ｃ４二ついての次の情報は助けになるであろう： 乾物　窒素 オオムギ　豆Ｚ↓μＬ！ヱ　王Ｚ肱ヱ １（ａｓｓｏ　３．９２２　０．７３２Ｃｅｒｉｓｅ　４．２１７　０．７９２ １ｇｒｉ　３．９３２　０．７７５ Ｈａｒｒｙ　５．０６８　０．８２６ 種々の時点に収穫した植物の数は次の通りであった：双畏友友桶立ｐ致 種をまいた後の口数 且國■野　５９　コ上−８５−ユ邸−−−襲旦試一験土 ＋Ｒ−Ｎ　２３　２３　２７　３１　３７−Ｒ＋Ｎ　１７　１４　３０　２３　 ４Ｏ−Ｒ−Ｎ　１４　１８　２８　２０　３２戊験−Ｉ ＋Ｒ−Ｎ　’８　８　９　１０　１２ −Ｒ＋Ｎ　６　５　１０　８　１３ −Ｒ−Ｎ　５　６　９　７　１１ 第２図の結果が立証するように、成長期間の間、リゾビウム処理したオオムギ植 物は窒素の肥料を与えられた植物よりも高い窒素含量および乾物を有した；実験 の停止において、−ｉ−Ｒ−Ｎ植物の乾燥含量は−Ｒ＋Ｎ植物のそれよりもほと んど４０％高く、そしてこれらのカテゴリーの両者は未処理の−Ｒ−Ｎオオムギ 植物よりも高い重量を有した。 オオムギ植物を大気のＩＳＮの存在下にインキュベーションし、次いで植物の部 分を窒素の固定の指示として”Ｎ含量についてアッセイした。より詳しくは、小 さい根粒をもつオオムギ植物（年令９５日）を室内に配置し、こうして根を大気 の１″Ｎの存在下に２３時間インキュベーションした。根の室内の大気は８０％ のＮ　２　（ここで”Ｎは１２．８５Δｔ％であったＡ）および２０％の０２を 含有した。インキュベーション期間後、試料を”Ｎについて分析し、そして植物 の合計の窒素含量をクジェルダール法に従い決定しまた。結果を下表■に示す。 表■ 北上」暖しく在壬ｄ２別ｑ室−１倉旦。 Ｒｏｏ　ｕｓ根　０．４４８　８．９　３．９９シユート　１．０１７　７．５ 　７．６３完全植物　１．４６５　７．９３　１１．６２ｔヒオオムギの。［１ 試且Ω恭　Ａｔ％　”Ｎ” 根　４　０．４５０±０．０１１ シユート　３　０．３９２±０．００３本大気中の１５Ｎ含量は約０．３７０Ａ ｔ％である。 表■のデータが立証するように、根粒化オオムギ植物の根およびシュートの両者 は大気より有意に多いＩ″Ｎを含有する。 これらの結果が示すように、窒素の固定は根粒化オオムギ植物において起こった 。 ８．５．狙ｉΔ豚雌７ 大きい根粒のあるものについて電子顕微鏡検査を実施した：これは酢酸ウラニル およびクエン酸鉛で着色したきわめて薄い断面の検査を含んだ。オオムギの根粒 の細胞の有機化はＮｅｗｃｏｍｂ（１９７６、Ｃａｎ　Ｊ、Ｂｏｔ、５４：２１ ６３　２１８６）により報告されたエントウの根粒についての有機化と同一であ った：すなわち、脈管の束が周辺外皮中に存在し、一方根粒の中央部分はバクテ ロイド充填植物細胞によって満たされていた。 小さいオオムギ根粒の表面および大きいオオムギ根粒の表面および横断面の光学 顕微鏡および電子顕微鏡（走査および透過の両者）の検査を含む他の研究を実施 した。観察された形態をエントウ、ホワイトクローバ−およびタイプの形態と比 較した。小さいオオムギ根粒は、植物が約５０日の成長に到達した時見ることが でき、そして植物のほぼ７５％について形成した（この観察は同様にコムギ植物 について実施した）。 大きいオオムギ根粒は８９〜１１０日の成長において観察された。 大きいオオムギ根粒はまれであったが、明白であった：これらはほぼ長さ４顛お よび直径１〜２１１１１であると測定され、そして主な根の上において古い種子 の位置より約２〜６ｃｍ下の位置に発生した。切除した１３の大きい根粒のうち １１は内側の色が赤褐色であった、すなわち、約２０〜３５日の古いマメ科植物 根粒におけるレグヘモグロビンと同一の色であった。 切除した大きい根粒の残りの１つのうち、１つは白色であり、そして若い未成熟 のマメ科植物根粒として見え、他方は緑であり、ちょうど老衰するマメ科植物の 根粒のようであった。 多分、オオムギの感染は２つの段階で起こる：初期の段階において、Ｒ，ｈｏｒ ｄｅｉは根に入るが、根粒化の応答を引き出さない；次の段階において、根粒の 形成は遅延した期間後に開始する。 ８．６．再分離したオオムギバクテロイドの抗生物質抵抗立−一□□− バクテロイドを大きいオオムギ根粒から再分離し、そシテ抗生物質抵抗性につい て試験した。再分離したバタテロイドは４００Ｊ！ｇ／ｍ／までの濃度において スペクチノマイシンニ塩酸塩に対して抵抗性であった。オオムギ植物を感染する ために本来使用したＲ、ｈｏｒｃ！ｅｉのＦｚ　トランス接合体（すなわち、接 種物）は同一の抵抗性を示す。接種物および再分離物は、通常の醪母−マンニト ール寒天上で成長させるとき、白色の不透明のコロニーを形成した。 Ｒ，ｈｏｒｄｅｉのＦｚ　）ランス接合体の親の１っ１よ、また、同一ミ；度ま でのスペクチノマ・イシンニ塩酸塩に対して抵抗性である。この親はＲ，ｌｅｇ ｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ株ＭＡＬであり、これは通常の酵母−マンニトール寒天上 で成長させるとき、淡黄色の不透明のコロニーを形成する。スペクチノマイシン 砥抗性遺伝子はＳｙｍプラスミドに対して抵抗性ではなく、それゆえ、Ｒ，ｈｏ ｒｄｅｉのＦ２　トランス接合体は、非共生プラスミドまたは親Ｒ，１ｅｇｕｍ ｉｎｏｓａｒｕｍ　ＭＡＮの主要な染色体を含有するハイブリッドであるように 思われる。しかしながら、これはＲ，ｈｏｒｄｅｉのＦ、）ランス接合体が、ま た、ＭＡＩのＳｙｍプラスミドを収容できる可能性を排除しない。 ９、実施例：モロコシを根粒化するりゾビウム・ソルボ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　 ５ｏｒｉ−一一一一一一一一一モロコシを根粒化するりゾビウム・ソルボ（Ｒｈ ｉｚｏｂｉｕｍｓｏｒｇｔｉｉ）を、節６に記載した方法に従い、まず、Ｒ，１ ｕｐｉｎｉをＲ，ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｒｉａと交雑してリゾビアＦｌ　 トランス接合体を生成し、次いでこれをＲ，ｍｅｌｉｌｏｔｉと交雑させること によって生成した。このように生成したＲ、ｓｏｒｇｈｉを使用して、３つのタ イプのモロコシを根粒化した：　５ａｆｒａ、ＤａｂａｒおよびＲ，ｓｏｒｇｈ ｉの生成のため、次の親リゾビアを使用してＦ、）ランス接合体の乳白色コロニ ー攻生成した＝（ａ）中央シュドランド（Ｊｕｔｌａｒ＋＋Ｊ）から分離したｒ ？、１ｕｐｉｎｉ　；および（ｂ）−’−ユーギニ゛ア、パプアからの熱帯産の 木Ｌｃｕｅａｅｎａ　Ｉｅｕｅｏｅｅｐｈａｌａ（Ｆａｂａｃｅａｅ族に属する ）から分離したＲ、ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｎａ。 親リゾビアを前述の寒天培地上で交互する線で培養した；培地中に使用したマメ 科植物抽出物は、それぞれ、ハウチヮワマメおよびＬｅｕｃａｅｎａ　１ｅｕｃ ｏｃｅｐｈａｌａの葉から誘導した。Ｒ。 １ｕｐｉｎｉにより形成したコロニーは特徴ある淡黄色を有し、これに対してＲ ，ｃｏｗｐｅａ　Ｉｅｕｃａｅｎａによって形成したコロニーは特徴ある灰色が かった褐色を有した。 乳白色コロニーから誘導したりゾビウムＦｌ　トランス接合体を、前述のように 、清浄にしそしてスクール（Ｓｔａｈｒ）において見出されるアルファルファか ら分離したＲ、ｍｅｌｉｌｏｔｉの株と・−緒に交互する線で培養した。培地中 に使用し２だマメ科植物抽出物は、ハウチワマメ、Ｌｅｕｃａｅｒ＋ａ　１ｅｕ ｃｏｃｅｐｈａｌａの葉およびアルファルファから誘導した。Ｆ＋）ランス接合 体によって形成したコロニーは乳白色を有し、これに対してＲ，ｍｅｌ　１ｌｏ ｔｉによって形成したコロニーは特徴ある黄色がかった褐色のコビウムＦ２　ト ランス接合体、ここではりゾビウム・ソルボ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｏｒｇｈ ｉ）と呼ぶ、を前述のように清浄にしそして分離した；これにはほぼ２０週を要 し、次いでＦｚ　トランス接合体を使用してモロコシを根粒化した。 ９．２．　リゾビウム・ソルボ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｏｒｇｈｉ）によるモ 旦ユ之仄皿数進−−−□−−− リゾビウム・ソルボ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｏｒｇｈｉ）を使用して３つのタ イプのモロコシを根粒化した：　５ａｆｒａ、ＤａｂａｒおよびＦｅｔｅｒｉａ ＊３％の硫酸カルシウムおよびホボ１０％までのＲ，ｓｏｒｇｈｉの生成に使用 したマメ科植物抽出物を含有する、前述の水溶液中に、モロコシの種子を３回浸 漬することによって種子を処理した：すなわち、種子を被覆するために使用した ３つのマメ科植物抽出物はハウチワマメ、Ｌｅｕｅａｅｎａ　１ｅｕｃｏｃｅｐ ｈａｌａの葉およびアルファルファから誘導した。各浸漬後、種子を後述のよう に空気乾燥し、そしてまいた。 ９、２．１．　夫ｌヱΩ旦究 前述の実験のプロトコルを３つのタイプのモロコシについて実施した：　５ａｆ ｒａ＋ＤａｂａｒおよびＦｅｔｅｒｉａ　；すなわち、４〜５個の被覆した種子 を“Ｆｉｂｏ”−クリンカーを充填した１リツトルの容器につきまき、そして発 芽させた。３つのタイプのモロコシの各々を次の３つの群に分割した：＋Ｒ−Ｎ 、実生に前述のようにして調製したＲ、ｓｏｒｇｈｉの５０−の懸濁液で水をや り、次いで非窒素肥料で毎週水をやった；　（ｂ）　−Ｒ＋Ｎ、実生にＲ，ｓｏ ｒｇｈｉを与えなかったが、無機の窒素肥料で水をやった；および（ｃ）−Ｒ− Ｎ、実生にＲ，ｓｏｒｇｈｉまたは無機の窒素肥料のいずれをも与えなかったが 、その代わり前述のように非窒素肥料で水をやった。Ｒ，ｓｏｒｇｈｉで処理し た植物は１０週で根の根粒を発生した。各容器内の植物を３植物に薄くし、そし て１０容器を各群において乾物および窒素含量の分析のために使用した。 ９、２．２．　７コールドの研Ａ フィールドの研究において、被覆したモロコシの種子を節６、３．２．に記載す るようにまいた。ロフト（ａ）＋Ｒ−Ｎの種子を前述のようにＲ，ｓｏｒｇｈｉ の懸濁液で処理し、そして非窒素肥料で処理した：ロット（ｂ）−Ｒ４〜Ｎの種 子はＲ，ｓｏｒｇｈｉで処理しないが、無機の窒素肥料で水をやった；そしてロ フト（ｃ）−Ｒ−Ｈの種子はＲ，ｓｏｒｇｈｉまたは無機の窒素肥料のいずれで も処理せず、そして単に非窒素肥料で水をやった。 ９．３゜根粒化モロコシの乾燥塊、窒素含量および蛋白質食１■分析−−−−− −−−−一一一一−−−−〜−−−−−−節６．４．に記載する分析法を使用し て根粒化モロコシ植物を特性づけた。 ９、３．１．　尖譲烹」究−ｑ桔−果 モロコシ植物をまいた後’７６〜１５０日に容器から収穫した。 乾燥重量／植物および窒素含量／植物（クジェルダール分析）を前述のように分 析した。 モロコシの乾物の平均重量および平均の窒素ｒＨｆｆｉＬについての次の情報は 助けになるであろう： 乾物 ５ａｆｒａ　３．７２４　２．３２ Ｄａｂａｒ　２．９４４　２．１７ Ｆｅｔｒｅｔｉ　ｔａ　３．８４０　１．４２種々の時点に収穫した植物の数は 次の通りであった：種子をまいた後７６〜１５２日においてフィールドの研究に おけるモロコシ植物を成長の１シーズン後に収穫し、そして蛋白質含量／植物を 前述のように分析した。表■に示す結果が明瞭に立証するように、Ｒ，ｓｏｒｇ ｈｉで処理した植物（→−Ｒ−Ｎ）は無機の窒素肥料で処理した群（−Ｒ＋Ｎ） または非窒素肥料で処理した群（−Ｒ−Ｎ）のいずれよりも高い蛋白質含量を有 した。 アミノ酸組成の分析により、リゾビウム処理した植物の相対的アミノ酸組成は窒 素の肥料を施した植物のそれとほぼ同一であることが立証された；しかしながら 、トリプトファンおよびロイシンはリゾビウム処理植物において増加するように 思われる。 表■ え９−工沁射江４遣１ 拉皇■犀　長１４昼２Ｕ（社）１Ｌ少蛋壬ＬＪＬｔ址十Ｒ−Ｎ　３４〜５２％ −Ｒ＋Ｎ　１６％ −Ｒ’−Ｎ　４％＊ ＊−Ｒ−Ｎ群は１４週後に死んだので、種子は得られなかった。植物の窒素の含 量および蛋白質含量は前述のように決１０、実施例：イネを根粒化するりゾビウ ム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｒ　ｚａｅ）−一一一一□イネを根粒化 するりゾビウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｒｙｚａｅ）を、節６に記 載した方法に従い、まず、Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉをＲ，ｃｏｗｐｅａｌｅｕｃａ ｅｎａと交雑してリゾビアＦＩ　トランス接合体を生成し、次いでこれをＲ，ｔ ｒｉｆｏｉ　と交雑させることによって生成した。 このように生成したＲ、ｏｒｙｚａｅを使用して、イネを根粒化した。 ！０．　１．　リゾビウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｒｙｚａｅ）の 調製−一□ ｐ、ｏｒｙｚａｅの生成のため、次の親リゾビアを使用してＦｌ　）ランス接合 体の乳白色コロニーを生成した：（ａ）ビクトリア付近において見出されるアル ファルファから分離したＲｌｍｅｌｉｌｏｔｉ　；および（ｂ）ニューギニア、 バブアからの熱帯産の木Ｌｅｕｃａｅｒ＋ａ　１ｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ（Ｆａ ｂａｃｅａｅ族に属する）から分離したＲ、ｃｏｗｐｅａ　Ｉｅｕｃａｅｎａ　 。 親リゾビアを前述の寒天培地上で交互する線で培養した：培地中に使用したマメ 科植物抽出物は、それぞれ、アルファルファおよびＬｅｕｃａｅｎａ　１ｅｕｃ ｏｃｅｐｈａｌａの葉から誘導した。Ｒｌｍｅｌｉｌｏｔｉにより形成したコロ ニーは特徴ある淡黄色を有し、これに対してＲ，ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｎ ａによって形成したコロニーは特徴ある灰色がかった褐色を有した。 乳白色コロニーから誘導したりゾビウムＦ＋）ランス接合体を、前述のように、 清浄にしそしてランダース（Ｒａｎｃｌｅｒｓ）において見出されるレッド・ク ローバ−から分離したＲ６ｔｒｉｆｏｌｉの株と一諸に交互する線で培養した。 培地中に使用したマメ科植物抽出物は、アルファルファ、Ｌｅｕｃａｅｎａ　１ ｅｕｃｏ−ｃｅｐｈａｌａの葉およびレッド・クローバ−から誘導した。Ｆ。 トランス接合体によって形成したコロニーは乳白色を有し、これに対してＲ，ｔ ｒｉｆｏｌｉによって形成したコロニーは特徴ある淡褐色のコロニーを有した。 すしの間に得られた純白色のコロニーから誘導されるリゾビウムＦ２　１−ラン ス接合体、ここではりゾビウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｒｙｚａｅ ）と呼ぶ、を前述のように清浄にしそして分離した；これにはほぼ２０週を要し 、次いでＦ２　トランス接合体を使用してイネを根粒化した。 １０、２．　リゾビウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｒｙｚａｅ）によ 々不生ρ皿粒進− リゾビウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｒｙｚａｅ）を使用してイネを 根粒化した。３％の硫酸カルシウムおよびホボ１ｏ％までのＲ，ｏｒｙｚａｅの 生成に使用したマメ科植物抽出物を含有する、前述の水溶液中に、イネの種子を ３回浸漬することによって種子を処理した；すなわぢ、種子を被覆するために使 用した３つのマメ科植物抽出物はアルファルファ、Ｌｅｕｃａｅｎａ　１ｅｕｃ ｏ−ｃｅｐｈａｌａの葉およびレッド・クローバ−から誘導した。各浸漬後、種 子を後述のように空気乾燥し、そしてまいた。 １０、２．１．　ス土二土上■旦究 フィールドの研究において、被覆したイネの種子を節６．３゜２゜に記載するよ うにまいた。ロフト（ａ）＋Ｒ−Ｎの種子を前述のようにＲ，ｏｒｙｚａｅの悲 濁液で処理し、そして非窒素肥料で処理した；ロット（ｂ）−Ｒ＋Ｎの種子はＲ ，ｏｒｙｚａｅで処理しないが、無機の窒素肥料で水をやった；そしてロフト（ ｃ）−Ｒ−Ｎの種子はＲ，ｏｒｙｚａｅまたは無機の窒素肥料のいずれでも処理 せず、そして単に非窒素肥料で水をやった。 １０、３．　皿拉化乙主■蛋亘亘皇よＵ窒素含量■分捉節６．４．に記載する分 析法を使用して根粒化イネ植物を特性づけた。 １０、　３．１．　フィールドの　７の１イネ植物は２．５年の期間にわたって ４．５か月ごとに収穫しえ作物７年）、そして蛋白質含量／植物を前述のように 分析した。 表■に示す結果が明瞭に立証するように、Ｒ，ｏｒｙｚａｅで処理した植物（＋ Ｒ−Ｎ）は無機の窒素肥料で処理した群（−Ｒ＋Ｎ）または非窒素肥料で処理し た群（−Ｒ−Ｎ）のいずれよりも高い蛋白質含量を有した。 表■ 一イネの］印賢含旦 植立Ω塁　狛千虜αζチｌ子Ω韮皇ｌ倉呈＋　Ｒ−Ｎ　１２．０〜５２％ −Ｒ＋　Ｎ　１．５〜３％ −Ｒ−Ｎ　Ｏ，５〜１％ １１、実施例ニューカリのための窒素肥料としてのりゾビウム　−一−−一７− 一−−− 窒素肥料としてのりゾビウムの陽性の作用は、ユーカリ（Ｅｕｃａ　ｌ　ｙｐ　 ｔｕｓ）　（Ｍｙｒ　ｔ、ａｃｅａｅ族）、イネ族の範囲外の植物、を使用して 観察した。処理した２つの種のうちの１つ、Ｅ、　ｇ　１ｕｂｕ　Ｉｕｓ、は増 大したバイオマスにおいて非常に明瞭に応答したが、根粒は観察されなかった。 １１、　１．　リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　ｅｕ　０１ｉ３ｆｉユーカ リへの有益な作用を有するリゾビウム（Ｒｈ　１ｚｏｂ　ｉｕｍ）ｅｕｌは、ま ず、Ｒ，ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｎａをＲ，ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍと 交雑してＦ、）ランス接合体を生成し、次いでこれをＲ，ｍ６１ｉ１ｏｔｉと交 雑した。このように生成したＦ２　）ランス接合体、Ｒｏｅ　ｕ　１　％を使用 してユーカリの２つの種を処理した。このリゾビウム株はここにおける実施例に 記載する他の植物宿主のいずれをも感染しない。 １１、　２．　リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　ｅｕｌによるユーカリの苑 １−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−ユーカリの種 子を、前述のように、エントウ、マメ、ハウチワマメ、アルファルファおよびレ ウカエナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ）のマメ科植物抽出物中で予備発芽させた。処理し た種子は粗大な形態でまき、そして未処理の種子を対照としてまいた。 発芽後、予備処理した実生を非窒素肥料および６つの異なるリゾビウムＦ２　ト ランス接合体の１つの懸濁液で水をやった（＋Ｒ−Ｎ）。発芽後、未処理の１つ の群を窒素肥料で水をやり（−Ｒ＋　Ｎ）そして他の群に非窒素肥料を与えた（ −Ｒ−Ｎ）。４週後、６つのリゾピア株の５つで処理した実生はすべて死んだ； しかしながら、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ｅｕｌで処理したものは生存 した。生きている植物を個々に６す・７トルのポットに移し、これらのボンドは 土壌およびポット中に湿気を保持し７かつ菌類の成長を防止するため“Ｆｉｂｏ ”−クリンカーの上層を含有した。ポットの底は有孔にして過剰の水が流出でき るようにしたが、与えた非窒素肥料の量を調節して、水がよどまずかつバクテリ アの汚染がないようにした。 合計２８のポットが存在した；１４は＋Ｒ−Ｎであり、そして１４は−Ｒ＋Ｎで あった。１４の＋Ｒ−Ｎはリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　ｅｕｌで再接種 した。 ４か月の成長後、＋Ｒ−Ｎユーカリ植物は＋Ｒ−Ｎのバイオマスの２〜３倍を存 した。１つの−Ｒｉ−Ｎ植物の検査は根粒の不存在を示した；根が土壌中で成長 するとき、土の粒子が根に付着し、そして微細な根を変色させるので、小さい根 粒の検出は非常に困難であった。この＋Ｒ−Ｎユーカリ植物において根粒の検出 が不可能であるにもかかわらず、結果はバイオマスの増大がリゾビラＪ、の窒素 の固定によることを示す。 １２、実施例ニアプラナを根粒化するりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉ−ｕｍ）　Ｒ １−一〜−−−−−− アブラナ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）の１つの構成員、イネ族の範囲外の他の植物、 は、また、リゾビウム処理に対して陽性的に応答した。セイヨウアブラナ（Ｂｒ ａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）をリゾビウム（Ｒｈｉｚｏ−ｂｉｕｍ）　Ｒ１で処 理すると、植物は成長し、そして根粒が出現した。 １２、１．　リゾビウム（Ｒｈｉ姪恒」ｍｌ、旦丹製セイヨウアブラナを根粒化 するりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　Ｒ１は、まず、Ｒ，ｐｈａｓｅｏｌ　 ｉをＲ，ｃｏｗｐｅａ　１ｅｕｃａｅｎａと交雑してＦ！トランス接合体を生成 し、次いでこれをＲ，ｔｒｉｆｏｌｉと交雑した。 １２、２．　リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　Ｒ１によるセイヨウアブ立± 東処理−一−−□−一−− セイヨウアブラナの種子を、前述のように、マメ、レウカエナおよびクローバ− のマメ科植物抽出物中で予備発芽させた。処理した種子を２リツトルノ容器にま き、そして発芽後、１つの群は通常に肥料を与え（−Ｒ＋Ｎ）、他の群に非窒素 肥料で水をやり（−Ｒ−Ｎ）そして同様に非窒素肥料で水をやった第３群をリゾ ビアの６つの異なる株で処理した（＋Ｒ−Ｎ）。３．５か月後、−Ｒ−Ｎ植物は なお３枚の最初の若い刃をのみ有し、そしてＲ４，Ｒ５およびＲ６と表示する３ つのリゾピア株で処理した＋ＲＮはまさに劣っていた。しかしながら、リゾビア 形質転換体の１つ、すなわち、株Ｒ１は有益であった。リゾビウム（Ｒｈｉｚｏ ｈｉｕｍ）　Ｒ１で処理した植物は、最大の−Ｒ十Ｎとほとんど同一の大きさお よびさやを有し、そして小さい根の根粒を見ることができた。 １３、　−＋Ｒ２」訣ノ、；Ｊトニ！！２（１刊ＬＬ臣１（Ｄ二Ｗ二ｑλ二蜜し ヌ型コ不し６す野ドＬ本発明のリゾビア形質転換体におって引き出される根粒が 窒素の固定において活性であることを立証するため、植物の有機窒素含量のクジ エルダール分析を行なった。 １３、　１．　材１１３扛よ」知楯人 実験する非マメ科植物の各々を３つの群に分割した：（ａ）１つの群はりゾビウ ムトランス接合体および非窒素肥料で処理した（＋Ｒ−Ｎ）；　（ｂ）第２群は りゾビウムトランス接合体で処理せず、窒素肥料で処理した（−Ｒ十Ｎ）；およ び（ｃ）第３群はりゾビウムトランス接合体または窒素肥料のいずれでも処理し なかった（−Ｒ−Ｎ）。これらの群を、それ以外、同一の成長条件下に成長ハウ ス内で成長させ、そして種子が成熟するまで成長を通じていくつかの時点で収穫 した。３〜５植物を各容器内で成長させ、そして収穫において、それらのシュー トを一緒にした。１つの試料はこの材料から取り、そして合計の有機窒素につい て分析した。下の細分割節において表わす結果が立証するように、根粒化した非 マメ科植物植物は窒素を固定することができた。 Ｉ３．２．　コムギおよびオオムギ コムギの２つの変種、ＣｏｒｎｅｔｔおよびＲａ１ｌｅ、を、節７において前述 したようにＲｈ１ｚｏｂｉｕ＋ｎ　ｔｒｉｔｉｃｉで根粒化した。植物上部当り の窒素含量（■窒素）および植物上部の乾燥重量をアッセイした。結果を下表■ に記載する。 表■ 表■の結果が示すように、＋Ｒ−Ｎ植物の乾燥重量は−Ｒ十Ｎのそれの約８２％ であり、そして＋Ｒ−Ｎ植物の窒素含量は−Ｒ＋Ｎの約８０％であった。 オオムギの５つの変種、Ｊｅｎｎｙ、Ｔａａｒｎ、Ｌｉｎａ、Ｇｒｉｔｈおよび ｉｉｕｍｐｈ、を節８において前述したようにリゾビウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚ ｏｂｉｕｍ　ｈｏｒｄｅｉ）で根粒化した。植物上部当りの窒素含量（■窒素） および植物上部の乾燥重量をアッセイした。結果を下表■に記載する。 表■ ＊　ＤＷ＝乾燥重量 リゾビウムで根粒化したオオムギ植物は、通常の窒素肥料で処理した植物と同じ 大きさおよび乾燥重量に成長する。 ＋’Ｒ−Ｎオオムギは−Ｒ−１−Ｎ植物のそれの約８３％であり、そして−Ｒ− Ｎ植物のそれの２０倍であった。−Ｒ−Ｈにおいてアッセイした窒素は種子から 誘導され、そして成長期間の間増加しない。 明らかなように、窒素肥料の代替物としてのりゾビウムトランス接合体の効果は 、植物の７５％上に存在する小さい根粒の作用のためである。３〜５植物を容器 当りに成長させたので、根を分離しそして根粒化した植物のみを分析することは 不可能であった。植物の１００％の根粒化および大きい根粒の発生はよりいっそ う効率的に機能するであろうことが考えられる。 後に容器内で増殖できるリゾビアの接種物またはバクテリアを窒素源として＋Ｒ −Ｎ根粒化非マメ科植物が使用できる可能性を排除するために、次の実験を実施 した：コムギのＣｏｒｎｅｔｔｅ変種およびオオムギのＴａａｒｎ変種の各々に Ｒ，１ｅｇｕ−ｍｉｎｏｓａｒｕｍ株ＭＡＩで、これらの非マメ科植物の、それ ぞれ、リゾビウムトランス接合体、Ｒ，ｔｒｉｔｉｃｉおよびＲ，ｈｏｒｄｅｉ による接種について記載したのと同一の手順、量および条件を用いて接種した。 Ｒ，ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍを接種した植物に非窒素肥料で水をやり、そし て窒素の蓄積を−Ｒ−Ｎ植物のそれと比較しまた。ＲｏＩｅｇｕｍｉｎｏｓａｒ ｕｍを接種した植物または−Ｒ−Ｎ植物のいずれも窒素を蓄積しなかった。引き 出された結論は、非特異的バクテリアの接種物は、それ自体で、植物に窒素肥料 を供給しないということである。対照的に、それぞれ、Ｒ９ｔｒｉｔｉｃｉまた はＲ，ｈｏｒｄｅｉによる方法に対する応答において生ずる表■および■に示す 窒素の蓄積は、窒素の固定のためであるにちがいない。 １３、　３．　モロコシおよびイネ モロコシの３つの変種、Ｄａｂａｒ、５ａｆａおよびＦｅｔｅｒｉｔａ、を、節 ９に記載するようにして、リゾビウム・ソルボ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｏｒｇｈ ｉ）により根粒化した。植物上部当りの窒素含量（１１１ｇ窒素）および植物上 部の乾燥重量をアッセイした。結果を下表■に記載する。 表）ｌ 狙１冒比到旦ユクｊひ轄ト館ど（ｐ」υ【町址＊ＤＷ−乾燥重量 イネのＭ−２０１株を、節９に記載するようにして、リゾビウム・オリザエ（Ｒ ｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｒｙｚａｅ）により根粒化した。植物上部当りの窒素含量 （ｒｒｇ窒素）および植物上部の乾燥重量をアッセイした。結果を下表■に記載 する。 表■ 本ＤＷ−乾燥重量 結果が示すように、＋　Ｒ−Ｎ植物の乾燥重量の蓄積は−Ｒ十Ｎ植物のそれより 遅れる；しかしながら、実験期間の終りにおいて、＋　Ｒ−Ｎ植物によって蓄積 された乾燥物質は−Ｒ十Ｎ植物のそれに等しく、そしてそれを越えることがある 。 十Ｒ−Ｎ植物および−Ｒ＋Ｎ植物における窒素の蓄積はほぼ同一であるように思 われる。 １３、　４．　土４且象ユブラナ セイヨウアブラナの２つの変種、Ｈａｎｎａおよび７０ｐａＳｓ節１２に記載す るよ・うにして、リゾビウム（Ｒｈｉ、ｚｏｂｉｕｍ）　Ｒ１により根粒化した 。植物上部当りの窒素含量（■窒素）および植物上部の乾燥重量をアッセイした 。結果を下表Ｘに記載する。 表Ｘ ＋　立ヒセイヨウアブラナのＮＡ　およＸ結果が示すように、＋Ｒ−Ｎ植物は− Ｒ＋Ｎ植物が蓄積した乾燥重量のほぼ５０％を蓄積し、そして＋Ｒ−Ｎ植物の窒 素含量は−Ｒ＋Ｎ植物のそのほぼ３０％であった。蓄積は窒素肥料を与えた植物 のそれより低かったが、セイヨウアブラナ植物において観察された小さい根粒は 窒素肥料の不存在下において成長する根粒化セイヨウアブラナ植物の生存を説明 する（＋Ｒ−Ｎについての結果を、乾燥重量または窒素のいずれもが蓄積しない −Ｒ−Ｎについての結果と比較する）。 １４．５葭生上四とと匝 次のりゾビウム株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１Ｐ ａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ 、Ａ、）に受託され、そして次の受託番号を割当てられた： エヅ旦立ム　受託ｉ号 Ｒ，ｔｒｉ　ｔｉｃｉ　５３＋　４０７Ｒ，ｈｏｒｄｅｉ　５３．４０４ Ｒ，ｓｏｒｇｈｉ　５３，４０５ Ｒ，ｏｒｙｚａｅ　５３．４０６ 本発明は受託された微生物によってその範囲を限定されるべきではない。なぜな らば、受託された態様は本発明の１つの面の単一の例示として意図され、そして 機能的に同等であるいかなる微生物をも本発明の範囲内に入るからである。事実 、ここに示しかつ記載したものに加えて本発明の種々の変更は以上の説明および 添付図面から当業者にとって明らかである。こような変更は添付する請求の範囲 内に包含されることを意図する。 国際出題番号ＰＣＴ／ＤＫ８６１００１３７国際出願番号ＰＣＴ／　ＤＫ８６１ ００１３７じ式ＰＣＴ／ＲＯ／１３＋　＋１！’ｌ’ノ年１月）口際出願番号Ｐ ＣＴ／ＤＫ８６１００１３７国際出葬替号ＰＣＴ／ＤＫ８６１００１３７国浮出 ！！！番号ＰＣＴ／ＤＫ８６１００１３７同冷出題番号ＰＣＴ／　ＤＫ８６１０ ０１３７小麦 播種後の日数 ＦＩＧ、　１ 大麦 播種後の日数 ＦＩＧ、２ 手続補正書（方式） 昭和６２年ＩＺ月　２日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 ＰＣＴ／ＤＫ８６１００１３７ ２、発明の名称 新規微生物 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 り名　二エルセン、スベンーエリク（外１名）４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の住所」の 欄 （２）委任状 （３）明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 ＋１１　＋２１　別紙の通り （３）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）請求の範囲の翻訳文の浄 書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （］）特許法第１８４条の５第１項 の規定による書面　１通 （２）明細書の翻訳文　１通 （３）請求の範囲の翻訳文　１通 （４）委任状及びその翻訳文　各１通 （５）証明書及びその翻訳文　各１通 （６）理由書　１通 国際調ｆ＠告 １ＩＩｌｌ＋ｓ−電・ｅ＋−−＾１ｍ・＋ｊｌ・ｅ＋Ｎｏ、：’Ｃτ、”：ＫＥ −、’ＣＣ：〒７１ｍｓ、Ｐ自１１１１Ａ耐＾””””＠１１”ｏＰＣＴ／ＤＫ ８７１００１１７

Claims (80)

【特許請求の範囲】
1. １．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体。
2. ２．トランス接合体をさらに含む請求の範囲第１項に記載のリゾビウム形質転換 体。
3. ３．成長に必要な栄養物質に加えて、リゾビウム形質転換体の各親リゾビウム種 の各マメ科植物宿主相手の抽出物を含有する栄養培地上で培養したとき、非マメ 科植物宿主相手との共生に入る前に、純白のコロニーを形成することを特徴とす る請求の範囲第１項に記載のリゾビウム形質転換体。
4. ４．増殖に必要な栄養物質に加えて、リゾビウム形質転換体の各親リゾビウム種 の各マメ科植物宿主相手の抽出物およびリゾビウム形質転換体の非マメ科植物宿 主相手の抽出物を含有する栄養培地上で培養したとき、非マメ科植物宿主相手と の共生に入る前に、灰色のコロニーを形成することを特徴とする請求の範囲第１ 項に記載のリゾビウム形質転換体。
5. ５．イネ（Ｐｏａｅｃｅａｅ）族に属する非マメ科植物において窒素を共生的に 固定する請求の範囲第１項に記載のリゾビウム形質転換体。
6. ６．コムギにおいて窒素を共生的に固定する請求の範囲第５項に記載のリゾビウ ム形質転換体。
7. ７．コムギのＡｎｊａ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第６項に記 載のリゾビウム形質転換体。
8. ８．コムギのＫｒａｋａ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第６項に 記載のリゾビウム形質転換体。
9. ９．コムギのＶｕｋａ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第６項に記 載のリゾビウム形質転換体。
10. １０．オオムギにおいて窒素を共生的に固定する請求の範囲第５項に記載のリゾ ビウム形質転換体。
11. １１．オオムギのＨａｓｓｏ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第５ 項に記載のリゾビウム形質転換体。
12. １２．オオムギのＣｅｒｉｓｅ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第 １０項に記載のリゾビウム形質転換体。
13. １３．オオムギのＨａｒｒｙ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第１ ０項に記載のリゾビウム形質転換体。
14. １４．オオムギのＩｇｒｉ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第１０ 項に記載のリゾビウム形質転換体。
15. １５．モロコシにおいて窒素を共生的に固定する請求の範囲第５項に記載のリゾ ビウム形質転換体。
16. １６．モロコシのＳａｆｒａ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第１ ５項に記載のリゾビウム形質転換体。
17. １７．モロコシのＤａｂａｒ株において窒素を共生的に固定する請求の範囲第１ ５項に記載のリゾビウム形質転換体。
18. １８．モロコシのＦｅｔｅｒｉｔａ株において窒素を共生的に固定する請求の範 囲第１５項に記載のリゾビウム形質転換体。
19. １９．イネにおいて窒素を共生的に固定する請求の範囲第５項に記載のリゾビウ ム形質転換体。
20. ２０．アブラナ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）族に属する非マメ科植物において窒素 を共生的に固定する請求の範囲第１２項に記載のリゾビウム形質転換体。
21. ２１．アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属において窒素を共生的に固定する請求の 範囲第２０項に記載のリゾビウム形質転換体。
22. ２２．セイヨウアブラナにおいて窒素を共生的に固定する請求の範囲第２１項に 記載のリゾビウム形質転換体。
23. ２３．フトモモ（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）族に属する非マメ科植物において窒素を 共生的に固定する請求の範囲第１項に記載のリゾビウム形質転換体。
24. ２４．ユーカリにおいて窒素を共生的に固定する請求の範囲第２３項に記載のリ ゾビウム形質転換体。
25. ２５．ＡＴＣＣに受託され、そして受託番号５３，４０７を割当てられたリゾビ ウム・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｒｉｔｉｃｉ）、その突然変異、組換え 体または遺伝子操作した誘導体。
26. ２６．ＡＴＣＣに受託され、そして受託番号５３，４０４を割当てられたリゾビ ウム・ホルデイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｈｏｒｄｅｉ）、その突然変異、組換え体 または遺伝子操作した誘導体。
27. ２７．ＡＴＣＣに受託され、そして受託番号５３，４０５を割当てられたリゾビ ウム・ソルギ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｏｒｇｈｉ）、その突然変異、組換え体ま たは遺伝子操作した誘導体。
28. ２８．ＡＴＣＣに受託され、そして受託番号５３，４０６を割当てられたリゾビ ウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｏｒｙｚａｅ）、その突然変異、組換え体 または遺伝子操作した誘導体。
29. ２９．ＡＴＣＣに受託され、そして受託番号５３，５６３を割当てられたリゾビ ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）Ｒ１、その突然変異、組換え体または遺伝子操作し た誘導体。
30. ３０．ＡＴＣＣに受託され、そして受託番号５３，４０５を割当てられたリゾビ ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ｅｕｌ、その突然変異、組換え体または遺伝子操作 した誘導体。
31. ３１．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体の各 親リゾビウムのための各マメ科植物宿主相手のマメ科植物抽出物を含んでなるこ とを特徴とする、非マメ科植物の種子を処理するための物質。
32. ３２．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体の各 親リゾビウムのための各マメ科植物宿主相手のマメ科植物抽出物から誘導された クロマトグラフィーの分画を含んでなることを特徴とする、非マメ科植物の種子 を処理するための物質。
33. ３３．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体の各 親リゾビウムのための各マメ科植物宿主相手のマメ科植物抽出物から誘導された 結晶から調製された物質を含んでなることを特徴とする、非マメ科植物の種子を 処理するための物質。
34. ３４．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体をさ らに含むことを特徴とする請求の範囲第３１，３２または３３項に記載の非マメ 科植物の種子を処理するための物質。
35. ３５．請求の範囲第３１，３２または３３項に記載の物質に関係する蛋白質を含 んでなることを特徴とする非マメ科植物の種子を処理するための物質。
36. ３６．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体をさ らに含むことを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の非マメ科植物の種子を処 理するための物質。
37. ３７．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体に対 して特異的である物質で処理された非マメ科植物の種子であって、前記物質は（ ａ）リゾビウム形質転換体の各親リゾビウムのための各マメ科植物宿主相手のマ メ科植物抽出物、（ｂ）各マメ科植物抽出物のクロマトグラフィーの分画、（ｃ ）各マメ科植物抽出物のクロマトグラフィーの分画から誘導された結果、または （ｄ）各マメ科植物抽出物に関係する蛋白質の１種または２種以上を含んでなる ことを特徴とする非マメ科植物の種子。
38. ３８．前記物質が非マメ科植物の種子から成長した非マメ科植物において窒素を 共生的に固定するリゾビウム形質転換体をさらに含むことを特徴とする請求の範 囲第３７項に記載の処理された非マメ科植物の種子。
39. ３９．イネ（Ｐｏａｅｃｅａｅ）族に属する非マメ科植物から誘導された種子か らなる請求の範囲第３７項に記載の非マメ科植物の種子。
40. ４０．コムギの種子からなる請求の範囲第３９項に記載の非マメ科植物の種子。
41. ４１．コムギのＡｎｊａ株からなる請求の範囲第４０項に記載のコムギの種子。
42. ４２．コムギのＫｒａｋａ株からなる請求の範囲第４０項に記載のコムギの種子 。
43. ４３．コムギのＶｕｋａ株からなる請求の範囲第４０項に記載のコムギの種子。
44. ４４．オオムギの種子からなる請求の範囲第３９項に記載の非マメ科植物の種子 。
45. ４５．オオムギのＨａｓｓｏ株からなる請求の範囲第４４項に記載のオオムギの 種子。
46. ４６．オオムギのＣｅｒｉｓｅ株からなる請求の範囲第４４項に記載のオオムギ の種子。
47. ４７．オオムギのＨａｒｒｙ株からなる請求の範囲第４４項に記載のオオムギの 種子。
48. ４８．オオムギのＩｇｒｉ株からなる請求の範囲第４４項に記載のオオムギの種 子。
49. ４９．モロコシの種子からなる請求の範囲第３９項に記載の非マメ科植物の種子 。
50. ５０．モロコシのＳａｆｒａ株からなる請求の範囲第４９項に記載のモロコシの 種子。
51. ５１．モロコシのＤａｂａｒ株からなる請求の範囲第４９項に記載のモロコシの 種子。
52. ５２．モロコシのＦｅｔｅｒｉｔａ株からなる請求の範囲第４９項に記載のモロ コシの種子。
53. ５３．イネの種子からなる請求の範囲第３９項に記載の非マメ科植物の種子。
54. ５４．アブラナ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）族に属する非マメ科植物から誘導され た種子からなる請求の範囲第３７項に記載の非マメ科植物の種子。
55. ５５．アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の種子からなる請求の範囲第５４項に記 載の非マメ科植物の種子。
56. ５６．セイヨウアブラナの種子からなる請求の範囲第５５項に記載のアブラナ（ Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の種子。
57. ５７．フトモモ（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）族に属する非マメ科植物から誘導された 種子からなる請求の範囲第３７項に記載の非マメ科植物の種子。
58. ５８．ユーカリの種子からなる請求の範囲第５７項に記載の非マメ科植物の種子 。
59. ５９．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体によ って根粒化された非マメ科植物。
60. ６０．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビウム形質転換体によ って根粒化された請求の範囲第５９項に記載の非マメ科植物。
61. ６１．イネ（Ｐｏａｅｃｅａｅ）族の構成員からなる請求の範囲第５９項に記載 の非マメ科植物。
62. ６２．コムギ植物からなる請求の範囲第６１項に記載の非マメ科植物。
63. ６３．Ａｎｊａ株からなる請求の範囲第６２項に記載のコムギ植物。
64. ６４．ｋｒａｋａ株からなる請求の範囲第６２項に記載のコムギ植物。
65. ６５．Ｖｕｋａ株からなる請求の範囲第６２項に記載のコムギ植物。
66. ６６．オオムギ植物からなる請求の範囲第６１項に記載の非マメ科植物。
67. ６７．Ｈａｓｓｏ株からなる請求の範囲第６６項に記載のオオムギ植物。
68. ６８．Ｃｅｒｉｓｅ株からなる請求の範囲第６６項に記載のオオムギ植物。
69. ６９．Ｈａｒｒｙ株からなる請求の範囲第６６項に記載のオオムギ植物。
70. ７０．Ｉｇｒｉ株からなる請求の範囲第６６項に記載のオオムギ植物。
71. ７１．モロコシ植物からなる請求の範囲第６１項に記載の非マメ科植物。
72. ７２．Ｓａｆｒａ株からなる請求の範囲第７１項に記載のモロコシ植物。
73. ７３．Ｄａｂａｒ株からなる請求の範囲第７１項に記載のモロコシ植物。
74. ７４．Ｆｅｔｅｒｉｔａ株からなる請求の範囲第７１項に記載のモロコシ植物。
75. ７５．イネ植物からなる請求の範囲第６１項に記載の非マメ科植物。
76. ７６．アブラナ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）族の構成員からなる請求の範囲第５９ 項に記載の非マメ科植物。
77. ７７．アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｏａ）属植物からなる請求の範囲第７６項に記載 の非マメ科植物。
78. ７８．セイヨウアブラナ植物からなる請求の範囲第７７項に記載のアブラナ（Ｂ ｒａｓｓｉｃａ）属植物。
79. ７９．非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉ ａ）Ｆ２トランス接合体を生成する方法であって、（ａ）固体の栄養培地上に交 互する列で第１リゾビウム親および第２リゾビウム親ですじをつけ、前記栄養培 地は、増殖に必須な栄養物質に加えて、（ｉ）各親リゾビウムのマメ科植物宿主 相手の非変性抽出物、または（ｉｉ）各親リゾビウムのマメ科植物宿主相手の非 変性抽出物から誘導されたクロマトグラフィーの分画、または（ｉｉｉ）各親リ ゾビウムのマメ科植物宿主相手の非変性抽出物から誘導されたクロマトグラフィ ーの分画から得られた結晶、または（ｉｖ）前記の抽出物、クロマトグラフィー の分画または結晶に関係する蛋白質を含有し、 （ｂ）リゾビウム親が特異的色を有するコロニーを形成するように、前記リゾビ ウム親を約１８℃〜約３０℃の温度において培養し、 （ｃ）リゾビウム親のコロニーの間において増殖するリゾビアＦ１トランス接合 体の乳白色のコロニーを選択し、（ｄ）さらに第３リゾビウム親のマメ科植物の 抽出物、クロマトグラフィーの分画、結晶または蛋白質を含む、行程（ａ）の栄 養培地上に第３リゾビウム親と一緒に交互する列でリゾビアＦ１トランス接合体 ですじをつけ、そして（ｅ）リゾビウムがコロニーを形成するように、約１８℃ 〜約３０℃の温度においてリゾビアＦ１トランス接合体および第３リゾビウム親 を培養し、 （ｆ）リゾビアＦ１トランス接合体および第３リゾビウム親の間で増殖するリゾ ビアＦ２トランス接合体の純白なコロニーを選択する、 を含んでなることを特徴とする非マメ科植物において窒素を共生的に固定するリ ゾビアＦ２トランス接合体を住成する方法。
80. ８０．前記第３リゾビウム親は第３リゾビウム種、第２リゾビアＦ１トランス接 合体または第２リゾビアＦ２トランス接合体からなる請求の範囲第８１項に記載 の方法。