PL152604B1

PL152604B1 - Rhizobia which symbiotically fixes nitrogen in non-legumes, a material for treating seeds of a non legume seed, a non-legume seed, a non-legume plant and a method for producing Rhizobia transconjugants.

Info

Publication number: PL152604B1
Application number: PL1986263336A
Authority: PL
Priority date: 1985-12-30
Filing date: 1986-12-30
Publication date: 1991-01-31
Also published as: IL81103A0; EP0237683A1; ZA869710B; WO1987004182A1; AU603560B2; NZ218832A; PH26705A; FI873751A0; AU6844487A; PT84037A; PT84037B; IL81103A; CN86107988A; DK609885D0; IE863387L; JPS63501924A; PL263336A1; IN169283B; PL155858B1; FI873751A

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 152 604 POLSKA

Patent dodatkowy do patentu n--Zgłoszono: 86 12 30 (P. 263336)

Pierwszeństwo: 85 12 30 Dania

URZĄD

Zgłoszenie ogłoszono: 88 01 07

Opis patentowy opublikowano: 1991 08 30

Int. Cl.5 A01N 63/00 C12N 15/00 tnutfO j Ł tl lit

PATENTOWY

RP

Twórcy wynalazku: Sven-Erik Nielsen, Grete M. Soerensen

Uprawniony z patentu: Nielsen Sven-Erik, Hinnerup (Dania);

** Soerensen Grete Moerch, Hinnerup (Dania)

Zaprawa nasienna

Przedmiotem wynalazku jest zaprawa nasienna do nasion niemotylkowych, przeznaczona do zaprawiania nasion stosowanych w uprawie roślin niemotylkowych zasadniczo bez użycia azotowego nawozu sztucznego. Rośliny te i słoma pozostała po zbiorze mają wysoką zawartość białka, suchej masy i azotu.

Podstawowym aspektem metabolizmu roślin jest wykorzystanie azotanów lub innych nieorganicznych związków azotu w syntezie związków organicznych, takich jak aminokwasy, białka, chlorofil, witaminy, hormony i alkaloidy, które są niezbędne dla wzrostu i rozwoju rośliny. Chociaż rośliny absorbują azotany i inne związki azotowe z gleby, ostatecznym źródłem azotu jest wolny azot cząsteczkowy (N2) z atmosfery. Jednakże wolny azot cząsteczkowy musi zostać związany i przekształcony w postać, która może być wykorzystana przez roślinę.

Biologiczne wiązanie azotu cząsteczkowego (zwane częściej biologicznym wiązaniem azotu) jest skomplikowanym procesem obejmującym stopniową redukcję wolnego azotu do amoniaku poprzez serię produktów pośrednich, przy czym redukcja ta zachodzi dzięki wiążącym azot drobnoustrojom współżyjącym symbiotycznie z pewnymi roślinami naczyniowymi. Najważniejszym rodzajem symbiotycznych bakterii wiążących azot jest Rhizobium, występujące w licznych gatunkach, z których każdy współżyje symbiotycznie z jednym, lub kilkoma ściśle pokrewnymi gatunkami roślin motylkowych, takich jak groch, fasola, koniczyna, itp. W wyniku tego rośliny motylkowe, w przeciwieństwie do roślin, które nie wiążą azotu, nie wymagają do wzrostu azotowych nawozów sztucznych, a nawet mogą wzbogacić glebę w azot. Z uwagi na ekonomiczne znaczenie wielu roślin motylkowych dostępne są kultury bakteryjne do inokulowania nasion roślin motylkowych. Oprócz tego ujawniono nasiona roślin motylkowych powleczone zaprawą zawierającą zdolny do życia Rhizobium (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3 499 748 i 4 149 869).

Symbiotyczne wiązanie azotu wymaga bakterii z rodzaju Rhizobium specyficznej wobec określonej rośliny motylkowej jako gospodarza, zakażającej korzenie rośliny motylkowejgospodarza. Po zakażeniu powstają na korzeniach brodawki, w których ta bakteria żyje w stanie

152 604 endosymbiotycznym w postaci zwanej bakterioidem, spełniając unikalną funkcję wiązania azotu w ścisłej współpracy z rośliną motylkową-gospodarzem, tak więc bakterioid zachowuje się prawie jak organelle. Rhizobium na ogół nie wiąże azotu z rośliny. Przegląd różnych aspektów biologicznego wiązania azotu w roślinach motylkowych podano w „Plant Gene Research-Genes Involved in Microbe Plant Interactions D. P. S. Verma, T. H. Hohn, Springer-Verlag, Nowy Jork, 1984, rozdziały 3, 4 i 5.

Każdy z procesów zakażania, wywoływania, powstawania brodawek i wiązania azotu powoduje skomplikowane oddziaływanie wzajemne między Rhizobium i rośliną motylkowągospodarzem. Jeśli ma zaistnieć początkowe zakażenie, Rhizobium i roślina motylkowa muszą rozpoznać się wzajemnie. Uważa się, że to bardzo specyficzne rozpoznanie wymaga oddziaływania między lektyną rośliny motylkowej-gospodarza (glikoproteina znajdowana na włośnikach korzenia) i polisacharydami na powierzchni komórki bakteryjnej. Po specyficznym rozpoznaniu i przywarciu Rhizobium do korzenia określonej rośliny motylkowej-gospodarza zachodzi zakażenie gospodarza w sposób niepatogenny, kontrolowany przez odpowiedź gospodarza na wnikające Rhizobium. Ogólnie, Rhizobium wnika do rośliny motylkowej przez włośniki korzeniowe. Na inwazję bakteryjną wpływa utworzona przez roślinę-gospodarza, kanalikowata struktura zwana nicią infekcyjną, która ogarnia komórki wewnętrzne kory korzenia. Rhizobium zostaje uwolnione z nici infekcyjnej, lecz pozostaje zamknięte w osłonce błoniastej pochodzącej od gospodarza, zwanej błoną peribakterioidalną, tak więc bakterioidy zostają ograniczone do zewnątrzkomórkowych komór. Przerwanie tej sekwencji przypadków może prowadzić do zakażenia patogennego dla gospodarza.

Po zakażeniu rośliny motylkowej-gospodarza przez Rhizobium, powstawanie brodawek zachodzi tylko w odpowiedzi na złożone oddziaływanie wzajemne przypadków, w których roślina strączkowa wpływa na ekspresję genów Rhizobium, a z kolei Rhizobium wpływa na aktywność genów rośliny motylkowej wymaganych do wywołania powstawania brodawek. Komórki w tkance brodawki są w wysokim stopniu zorganizowane w układach specyficznych dla rośliny. Bakterie znajdują się na ogół w błonach peribakteroidalnych, które wyłączają bakterie ze stref epidermalnych i merystemalnych. Biochemiczne znaczenie organizacji i morfologii brodawki polega na tym, że rozwiązuje ona problemy dyfuzji pod względem wnikania tlenu i składników pokarmowych do bakterioidu i wydalania amoniaku przez roślinę-gospodarza. Cechą charakterystyczną brodawek skutecznie działających, tj. brodawek, które rzeczywiście wiążą azot, jest obecność leghemoglobiny, białka wiążącego tlen, które jest związane z oddychaniem w brodawce (wysokie stężenie tego białka ułatwia dyfuzję tlenu do domen bakterioidu) oraz z ochroną nitrogenozy (enzym zasadniczy w szlaku metabolicznym wiązania azotu) przed zatruciem przez nadmiar tlenu. Leghemoglobina jest oczywiście prawdziwym produktem symbiotycznym, gdyż białka globinowe kodowane są przez geny rośliny, a do syntezy hemu przyczynia się bakteria.

Ostatecznie, symbiotyczne wiązanie azotu zachodzące w brodawce, jest wynikiem łącznego dążenia. Bakterioidy zawierają układ do wiązania azotu, a roślina motylkowa jako partner asymiluje amoniak wytworzony w postaci organicznej, który zostaje następnie użyty do odżywiania całej rośliny i bakterioidu, tak więc roślina dostarcza odpowiedniego otoczenia i źródła energii umożliwiającego bakterioidowi wiązanie azotu. Jeśli roślina-gospodarz i bakteria zostaną źle dobrane, zakażenie będzie nieskuteczne i cały proces powstawania brodawek i symbiotycznego wiązania azotu nie zajdzie. Ponadto, pomyślne powstanie brodawek nie oznacza koniecznie zachodzenia wiązania azotu, ponieważ powstała brodawka może być defektywna.

Rodzaj bakterii, nie będących bakteriami Rhizobium, zwany Frankia jest symbiotycznym wobec niektórych naczyniowych roślin niemotylkowych, takich jak Alnus (olsza), Casuarina (rzewnia), Ceanothus, Eleagnus, Myrica i Psychotria (tropikalna roślina drzewiasta). Doniesienie na podstawie danych dotyczących kojarzenia in vitro Rhizobium i układu - hodowli komórek tytoniu, wskazuje, że niektóre rośliny niemotylkowe mogą dostarczyć czynników, które Rhizobium może użytkować [Gibson i wsp., Planta 128,233-239 (1976)], tym niemniej nie wskazano lub nie obserwowano specyficznego rozpoznawania, symbiotycznej zależności lub specyficznego oddziaływania. Jedyny znany przykład, poza rzędem strączkowych, stabilnej symbiozy między rośliną nasienną niemotylkową a Rhizobium, odnosi się do Parasponia, tropikalnej dużej rodziny Malayan (wiązowate). Występujące w naturze szczepy Rhizobium wyizolowane w Australii wywo152 604 łują, jak stwierdzono, powstawanie brodawek i wiązania azotu w Parasponia [Trinick, New Phytol., 85, 37-45 i 86, 17-26 (1980), Trinick, Current Perspectives in Nitrogen Fixation, wyd. Gibson i wsp., Elsevier Press, 1981, str. 480, Trinick i wsp., Arch. Microbiol. 108,159-166 (1976), patrz również Bender i wsp., Plant Science 38, 138-140 (1983)].

Nieoczekiwanie okazało się, że powstawanie wiążących azot brodawek, tworzących się pod działaniem bakterii z rodzaju Rhizobium, można wywołać dzięki zastosowaniu nowego sposobu uprawy roślin niemotylkowych. Niezbędnym środkiem technicznym stosowanym w tym sposobie jest zaprawa nasienna według wynalazku.

Zgodna z wynalazkiem zaprawa nasienna do nasion roślin niemotylkowych, zwłaszcza roślin należących do rodziny Poaceae, takich jak pszenica, korzystnie szczep Anja, Kraka lub Vuka, jęczmień, korzystnie szczepu Hasso, Cerise, Karvy lub Igri, sorgo, korzystnie szczepu Safra, Dabar lub Feterita i ryż, albo roślin należących do rodziny Cruciferae, takich jak kapusta i rzepak, albo roślin należących do rodziny Myrtaceae, takich jak eukaliptus, zawiera substancje aktywne i znane środki pomocnicze, a cechą tej zaprawy jest to, że jako substancje aktywne zawiera wodnoalkoholowe niezdenaturowane ekstrakty pochodzące z co najmniej trzech różnych roślin motylkowych będących gospodarzami Rhizobia macierzystych względem transformanta Rhizobium symbiotycznie wiążącego azot w roślinie niemotylkowej.

Tak więc do wytworzenia zaprawy nasiennej według wynalazku stosuje się nie zdenaturowane ekstrakty z roślin motylkowych, co najmniej trzech, przy czym są to rośliny, których symbiotyczne Rhizobia mogą służyć do wytworzenia takiego transformanta Rhizobium, który będzie miał zdolność życia w symbiozie z rośliną niemotylkową, z wszelkimi tego korzystnymi konsekwencjami, to znaczy z wytworzeniem brodawek i wiązaniem azotu za ich pośrednictwem.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „transformant Rhizobium¹* oznacza Rhizobium zawierające wprowadzony DNA, który można wytworzyć dowolną metodą obejmującą, ale nie ograniczoną do transformacji (to jest zakażenia plazmidowym DNA), transfekcji (to jest zakażenia wolnym DNA, fagowym DNA lub wirusowym DNA), lub koniugacji (to jest przeniesienia kopiowanego plazmidu z jednej bakterii do innej). Transformanty bakteryjne otrzymane w wyniku koniugacji są podzbiorem transformantów stosowanych w zaprawie według wynalazku i określa się je mianem transkoniugantów.

Termin „macierzysty Rhizobium** użyty w niniejszym opisie oznacza gatunek macierzysty, który poddaje się koniugacji w celu wytworzenia transkoniugantów Rhizobium, jak również gatunek Rhizobium, z którego można wyodrębnić plazmidy lub sekwencje DNA i użyć do transformowania Rhizobium w celu wytworzenia transformantów Rhizobium.

Korzystne sposoby wytwarzania transformantów przedstawiono w próbach biologicznych.

Zaprawa według wynalazku znajduje zastosowanie w sposobie uprawiania roślin niemotylkowych polegającego na tym, że zaprawione zaprawą nasiona wysiewa się i na glebę, w której wysiano nasiona lub na wyrosłe z nasion rośliny, działa się transformantem Rhizobium otrzymanym z macierzystych Rhizobia będących partnerami co najmniej trzech różnych roślin motylkowych gospodarzy użytych do wytworzenia zaprawy nasiennej, a następnie hoduje się rośliny wyrosłe z nasion bez użycia lub zasadniczo bez użycia nawozu azotowego. Alternatywnie transformantem Rhizobium działa się na nasiona przed ich wysianiem.

Dzięki sposobowi uprawiania roślin niemotylkowych z wykorzystaniem zaprawy nasiennej według wynalazku rośliny niemotylkowe z brodawkami można uprawiać bez użycia azotowego nawozu sztucznego i mają one taką samą lub wyższą zawartość białka, suchej masy i azotu niż ich odpowiedniki bez brodawek, nawożone z dodatkiem azotowego nawozu sztucznego. Słoma pozostała po zbiorze roślin niemotylkowych z brodawkami ma również wyższą zawartość azotu.

Ekstrakt z rośliny motylkowej można wytworzyć z każdej części rośliny motylkowej gospodarza, w tym, ale bez ograniczenia do nich, z pędów, łodyg, korzeni lub nasion, a korzystnie z części zielonych, rośliny. Ekstrakty z rośliny motylkowej można wytworzyć przez podzielenie części rośliny na drobne cząstki, zhomogenizowanie tego materiału w wodnym roztworze etanolu o pil 7,2 i odwirowanie nierozpuszczalnego materiału. Supernatant można dializować wobec wody destylowanej aż do przejaśnienia, po czym można go ponownie odwirować. Proces prowadzi się w temperaturze 4°C w celu zminimalizowania rozkładu substancji roślinnych.

152 604

Tak więc stosowanym w zaprawie według wynalazku ekstraktem rośliny motylkowej jest wodno-alkoholowy roztwór substancji wyekstrahowanych z tej rośliny. Co najmniej trzy takie ekstrakty łączy się ze sobą w wodzie tak, by powstał roztwór zawierający do 10% takiej mieszaniny ekstraktów. W ten sposób wytwarza się gotową zaprawę nasienną według wynalazku, która może także zawierać niewielką ilość siarczanu wapniowego, np. 0,1-2%.

Przykładowo substancję aktywną zaprawy według wynalazku mogą stanowić mieszaniny ekstraktów uzyskanych przez ekstrakcję 80% wodnym roztworem etanolu rozdrobnionych części fasoli, koniczyny białej i Leucaena leucocephala (drzewo tropikalne z rodziny Fabaceae, liście), fasoli, grochu i Leucaena 1, łubinu, lucerny i Leucaena 1, koniczyny czerwonej, lucerny i Leucaena 1, fasoli, koniczyny czerwonej i Leucaena 1, lub grochu, lucerny i Leucaena 1. Skład mieszaniny ekstraktów dobiera się w zależności od gatunku rośliny niemotylkowej, której nasiona traktuje się zaprawą nasienną.

Istnieje także możliwość stosowania zamiast ekstraktów jako takich ich frakcji chromatograficznych lub kryształów wykrystalizowanych z tych frakcji, a także wyodrębnionych z tych frakcji białek roślinnych. Ekstrakt z rośliny motylkowej można frakcjonować chromatograficznie metodą stanowiącą modyfikację metody Allena i wsp., Biochem. J., 131, 155 -162 (1973), Allena i wsp., FEBS Letters 50(3), 362 - 364 (luty 1975), Gordona i wsp., FEBS Letters 24 (2), 193 - 196 (sierpień 1972), Peomansa i wsp., Planta 156, 568 - 572 (1982) i Trowbridge'a, J. Biol. Chem., 249,6004 - 6012 (1974).

Zaprawę według wynalazku stosuje się w takiej ilości, by na 100 kg nasion podziałać 5 litrami ekstraktów.

Jak wspomniano powyżej, w sposobie uprawy roślin niemotylkowych z użyciem zaprawy według wynalazku na rośliny lub glebę, w której one wzrastają działa się odpowiednim transformantem Rhizobium. Istnieje możliwość wprowadzenia takiego transformanta bezpośrednio do zaprawy, to jest wysiewania do gleby nasion roślin motylkowych potraktowanych jednocześnie zaprawą i transformantem.

Nasiona roślin niemotylkowych można powlekać różnymi metodami, w tym, ale bez ograniczenia do nich, przez zanurzenie i wysuszenie na powietrzu, oprysk, kapsułkowanie (np. w otoczkach polimerycznych), zanurzenie i suszenie bębnowe itp. Gdy transformant Rhizobium jest zawarty w zaprawie, powinno się użyć metod, które zapewnią żywotność bakterii. Można w tym celu stosować mieszaniny zaprawowe zawierające materiał żelowy w celu utrzymania wilgotności na wysokim poziomie, względnie nasiona można powlekać sproszkowanymi łuskami nasiennymi zawierającymi środki grzybobójcze. W każdym przypadku metoda powinna być tak dobrana, żeby substancje aktywne w zaprawie nie z.ostały zdenaturowane lub zniszczone.

Korzystnie nasiona roślin niemotylkowych powleka się przez trzykrotne zanurzenie w zaprawie i wysuszenie. Dwa zanurzenia powodują słabą penetrację transformantów Rhizobium (gdy działa się nimi na nasiona równocześnie z traktowaniem zaprawą), podczas gdy cztery zanurzenia nie polepszają penetracji.

Nasiona roślin niemotylkowych potraktowane zaprawą nasienną, która nie zawiera transformantów Rhizobium, można nawodnić zawiesiną transformanta Rhizobium. Alternatywnie, siewkę lub roślinę można nawodnić odpowiednią objętością zawiesiny bakteryjnej. Gdy zaprawa nasienna zawiera transformant Rhizobium wymagane jest tylko sadzenie i nawodnienie.

W początkowej fazie rozwoju roślin może być pożądane dodanie nieazotowego nawozu sztucznego, zależnie od typu rośliny, warunków w glebie lub terenie itp. W doświadczeniach laboratoryjnych stwierdzono, że dodanie 2 mM azotu przy wysiewie nasion jest wystarczające do zasilenia początkowego wzrostu rośliny, bez uszkodzenia lub „wyłączenia* transkoniugantów Rhizobium. Zabieg taki symuluje naturalne warunki, ponieważ większość gleb, nawet bez nawozu, zawiera pewną ilość azotu (nie więcej niż 2 mM) tak, że dodawanie azotu w warunkach polnych nie jest wymagane.

Rośliny niemotylkowe wyrosłe z nasion zaprawionych zaprawą według wynalazku, w których transformanty Rhizobium wywołały powstanie brodawek, mają zawartość azotu i suchej masy równą lub wyższą niż ich odpowiedniki bez brodawek nawożone azotowym nawozem sztucznym. Rośliny z brodawkami mają wyższą zawartość azotu i suchej masy, niż ich odpowiedniki bez brodawek, których nie nawożono. Analizy składu aminokwasowego roślin z brodawkami ujawniają, że w większości przypadków udział każdego aminokwasu pozostaje taki sam, ale zwiększona

152 604 5 jest ich całkowita zawartość na roślinę. Tym niemniej, w niektórych przypadkach można zaobserwować wyższy udział tryptofanu i leucyny.

Słoma pozostająca po zbiorze pewnych gatunków roślin niemotylkowych wykazuje zawartość białka od około 6 do około 9%. Jest to uderzający kontrast z zawartością białka od 1,5 do 2% normalnie znajdowaną w słomie odpowiedników bez brodawek. Korzystnie można zastosować tę słomę o wysokiej zawartości białka jako źródło białka, np. w mieszankach pokarmowych dla zwierząt, tak hodowlanych jak i domowych.

Tak więc sposób uprawy z użyciem zaprawy według wynalazku, prowadzący . do powstania brodawek i wiązania azotu w roślinach niemotylkowych, prawie eliminuje stosowanie kosztownego azotowego nawozu sztucznego, a ponadto polepsza jakość gleby.

Morfologia brodawek utworzonych przez transformanty Rhizobium u roślin niemotylkowych potraktowanych zaprawą według wynalazku jest zupełnie normalna, jeśli chodzi o wygląd, ale mniejsze brodawki są w wyższej proporcji. Okazuje się, że Rhizobium wnika do korzenia przez nić infekcyjną i bakterioidy utrzymywane są w zamkniętych komorach. Obserwuje się czerwoną barwę w brodawce, co może być zależne od leghemoglobiny lub ściśle spokrewnionego białka. Mikroskopia elektronowa brodawki ujawnia, że wiązki naczyniowe znajdowane w korze są zlokalizowane na obwodzie, podczas gdy wiązki naczyniowe korzeni bocznych są centralnie zlokalizowane. Większość komórek w centralnej części jest wypełniona bakterioidami.

Poniżej opisano procedurę przeprowadzonych prób biologicznych i przedstawiono ich wyniki świadczące o korzystnym działaniu zaprawy nasiennej według wynalazku.

W każdej próbie do wytworzenia transkoniugantów Rhizobium użyto metody hodowli w naprzemiennych rzędach. Nasiona roślin niemotylkowych powlekano przez zanurzenie nasion w ekstraktach z roślin motylkowych specyficznych wobec określonego transkoniuganta Rhizobium użytego do wywoływania powstawania brodawek w roślinach niemotylkowych. Powleczone nasiona roślin niemotylkowych zakażano transkoniugantami Rhizobium przez wysianie zaprawionych nasion, pozostawienie ich do wykiełkowania i nawodnienie siewek zawiesiną transkoniugantów Rhizobium. Brodawki wiążące azot rozwijały się w ciągu 8-12 tygodni.

W próbach prowadzono badania laboratoryjne, w których rośliny niemotylkowe były podzielone na trzy grupy, traktowane jak następuje: .(a) pierwszą grupę traktowano transkoniugantem Rhizobium bez azotowego nawozu sztucznego ( + R-N), (b) drugą grupę traktowano azotowym nawozem sztucznym bez transkoniuganta Rhizobium (-R + N), oraz (c) trzeciej grupy nie traktowano ani transkoniugantem Rhizobium, ani azotowym nawozem sztucznym (-R-N). W różnych okresach wzrostu pobierano próbki roślin i oznaczano w przeliczeniu na 1 roślinę całkowitą zawartość organicznie związanego azotu, ilość suchej masy i (w niektórych doświadczeniach) zawartość białka i jego skład aminokwasowy. W pewnych próbach prowadzono badania połowę. Jeśli tego inaczej nie wskazano, materiałów i metod opisanych poniżej użyto w każdej próbie.

Metoda hodowli transkoniugantów w naprzemiennych rzędach obejmowała następujące stadia. Dwa różne gatunki Rhizobium (generacja macierzysta) rozprowadzano w naprzemiennych rzędach (oddalonych o 3 mm) na podłożu z . agarem odżywczym, zawierającym oprócz składników pokarmowych niezbędnych do wzrostu niezdenaturowany ekstrakt z danej rośliny motylkowejgospodarza specyficznego wobec danego macierzystego Rhizobium. Pó inkubacji w temperaturze wzrostu poniżej 32°C, np. 18-30°C, każdy macierzysty Rhizobium stworzył kolonie o barwie charakterystycznej dla tego gatunku. Transkoniuganty Rhizobium (transkoniuganty Fi) tworzyły się między naprzemiennymi rzędami zabarwionych kolonii macierzystych. Transkoniuganty Fi Rhizobium, w przeciwieństwie do swoich organizmów macierzystych, tworzyły kolonie o barwie mlecznobiałej i nie wywoływały powstawania brodawek w roślinach. Po inkubacji w temperaturze powyżej 32°C na podłożu agarowym wszystkie gatunki Rhizobium rozprowadzane na płytce tworzyły kolonie o barwie czerwonej, jednak po obniżeniu temperatury do wartości poniżej 32°C (np. korzystnie 18-30°C), charakterystyczna barwa każdej kolonii pojawiła się znowu.

Transkoniuganty Fi Rhizobium izolowano z kolonii o barwie mlecznobiałej i hodowano, jak powyżej, w naprzemiennych rzędach odległych o 3 mm, z trzecim macierzystym gatunkiem Rhizobium, na agarowym podłożu odżywczym, zawierającym, oprócz niezdenaturowanych ekstraktów z roślin motylkowych użytych do wytworzenia kolonii o barwie mlecznobiałej, trzeci niezdenaturo6

152 604 wany ekstrakt z rośliny motylkowej-gospodarza specyficznego wobec trzeciego macierzystego gatunku Rhizobium. Transkoniuganty F2 Rhizobium tworzyły się między naprzemiennymi rzędami kolonii o barwie mlecznobiałej utworzonych przez transkoniuganta Fi Rhizobium a zabarwionymi koloniami utworzonymi przez trzeci macierzysty Rhizobium. Kolonie transkoniuganta F2 Rhizobium identyfikowano na podstawie ich śnieżnobiałej barwy. Te transkoniuganty F2 były zdolne do zakażenia, wywoływania powstawania brodawek w roślinach niemotylkowych i wiązania azotu w roślinach niemotylkowych potraktowanych zaprawą według wynalazku.

Gatunki z rodzaju Rhizobium stosowane w charakterze generacji macierzystej izolowano albo z próbek gleby, albo z brodawek roślin motylkowych o zaawansowanym stadium rozwoju.

Izolowanie macierzystego Rhizobium z gleby przeprowadzono przez umieszczenie nasion rośliny motylkowej-gospodarza, w której pod wpływem Rhizobium powstały brodawki, w próbkach gleby. Rośliny zbierano po 3-4 tygodniach, albo po 10-12 tygodniach, jeśli rosły powoli. Brodawki odłączano od korzeni rośliny motylkowej wraz z około 1 cm tkanki korzeniowej otaczającej brodawkę, wyjaławiono przez zanurzenie w 3% HgCk i przemywano 80% etanolem. Następnie wycinano brodawkę z tkanki korzeniowej i rozdrabniano w moździerzu w jałowych warunkach. Zmacerowany materiał nanoszono na agarowe podłoże odżywcze. Kolonie oczyszczano przez prowadzenie subkultury na podłożu o tym samym składzie do dwukrotnego utworzenia pojedyńczych kolonii. Rhizobia izolowane z oczyszczonych pojedyńczych kolonii rozprowadzono w naprzemiennych rzędach na agarowym podłożu odżywczym.

Agarowe podłoże odżywcze otrzymywano przez dodanie do wody destylowanej w ilości 100ml KH2PO4 (0,15g), K2HPO4 (0,15g), KNO3 (2,50g), (NH4)2SO4 (0,135g), MgSO4-7H2O (0,25g), mannitu (10,00g), agaru (12,00g), roztworu nr 1 (l,00ml) i ekstraktu drożdżowego (5,00 ml). Roztwór nr 1 zawierał MnCk · 4H2O (500 mg), H3BO3 (300 mg), ZnSO · 2H2O (200 mg), NaMoO4 · 2H2O (20 mg), CUSO4 · 5H2O (2 mg) i CaCk · 6H2O (2 mg). Następnie dodawano wodę destylowaną do końcowej objętości 100 ml.

Podłoże agarowe wyjałowiono w ciągu 20 minut przy 2 X 10⁵ Pa w autoklawie i oziębiono do temperatury 55-60°C, przy której dodawano po 1 ml każdego z roztworów nr 2, nr 3 i nr 4,20 rfil każdego z niezdenaturowanych ekstraktów z rośliny motylkowej otrzymanych z rośliny motylkowejgospodarza specyficznego wobec danego macierzystego Rhizobium, który miał być hodowany na podłożu, oraz po 15 mg L-alominy, L-seryny i L-tryptofanu. W celu uniknięcia zdenaturowania białek w ekstraktach z roślin motylkowych, podłoża o ostatecznym składzie nie należy wyjaławiać w autoklawie.

Roztwory nr nr 2 - 4 miały skład podany poniżej. Każdy z nich otrzymywano z zastosowaniem wody destylowanej.

Roztwór nr 2

Kwas nikotynowy	50 mg
Chlorowodorek tioaminy	50 mg
Chlorowodorek pirydoksyny	50 mg
Mioinozyt	50 mg
Biotyna	50 mg
Jałowa woda destylowana	100 ml
Roztwór nr 3
Jodek potasowy	75 mg
Jałowa woda destylowana	100 ml
Roztwór nr 4
CaCl2-H2O	15g
Jałowa woda destylowana	100 ml

Ekstrakty z danej rośliny motylkowej, stosowane w podłożu agarowym i do zaprawy nasiennej do nasion roślin niemotylkowych otrzymywano następująco. Całą roślinę lub wybrane części rośliny, np. czyste przemyte korzenie, wyjałowione nasiona lub części powietrza, względnie, korzystnie, młode pędy, podzielono na drobne cząstki, rozdrobniono w moździerzu z 80% etanolem w rzadką zhomogenizowaną pastę, do której dodano równą ilość buforu o pH 7,2, zawierającego K2HPO4 (0,430 g), NaH₂PO4 (1,469 g), NaCl (7,200 g) i jałową wodę destylowaną do końcowej objętości 1000 ml.

152 604

Ί

Mieszaninę zhomogenizowanego ekstraktu z rośliny i buforu odstawiono na 48 godzin w temperaturze 4°C i osad odwirowywano przy 5000 X g w ciągu 30 minut. Następnie supernatant dializowano wobec wody destylowanej w temperaturze 4°C w ciągu około 48 godzin. W ciągu tego czasu wodę zmieniano 5 do 6 razy, aż do otrzymania klarownego, bezbarwnego płynu, to jest ekstraktu. Ekstrakty przechowywano w temperaturze 4°C.

Gdy dwa macierzyste szczepy Rhizobium hodowano w temperaturze poniżej 32°C w naprzemiennych rzędach odległych o 3 . mm na agarowym podłożu odżywczym zawierającym ekstrakty z odpowiednich roślin motylkowych jak powyżej opisano, macierzyste Rhizobia tworzyły kolonie o charakterystycznym zabarwieniu. Tym niemniej między rzędami zabarwionych kolonii macierzystych rozwijały się dwa typy kolonii: (a) kolonie o zabarwieniu będącym mieszaniną barw macierzystych kolonii, oraz (b) kolonie o barwie mlecznobiałej transkoniuganta Fi Rhizobium. Proporcja między zabarwionymi koloniami a koloniami o barwie mlecznobiałej transkoniuganta Fi była różna, ale średnio mieściła się w zakresie od około 100:3 (kolonie o mieszanym zabarwieniu: kolonie o barwie mlecznobiałej). Kolonie o mieszanym zabarwieniu wywoływały powstawanie brodawek u obydwu gatunków roślin motylkowych-gospodarzy, ale tylko w jednej generacji, to jest Rhizobia z kolonii o mieszanym zabarwieniu wywoływały powstawanie brodawek w roślinach motylkowych-gospodarzy będących partnerami obydwu macierzystych Rhizobia, lecz Rhizobium odzyskany z brodawek każdej rośliny motylkowej-gospodarza może wywoływać powstawanie brodawek znowu w tej tylko określonej roślinie motylkowej-gospodarza. W przeciwieństwie do tego transkoniugant Fi z kolonii o barwie mlecznobiałej nie wywołuje powstawania brodawek w żadnej roślinie.

Ponieważ trudne było przeniesienie pojedyńczej kolonii hybrydowej na nowe podłoże bez zanieczyszczenia jej jedną lub większą ilością zabarwionych kolonii, przeprowadzono biologiczne oczyszczanie raz lub większą ilość razy przez przeniesienie kolonii o barwie mlecznobiałej na inne podłoże agarowe (o tym samym składzie) aż do otrzymania, na ogół po 10 - 12 tygodniach, czystej hodowli transkoniuganta Fi o stabilnym i jednolitym mlecznobiałym zabarwieniu.

Czystą kulturę transkoniuganta Fi tworzącego kolonie o zabarwieniu mlecznobiałym poddawano następnie hodowli w temperaturze poniżej 32°C w naprzemiennych rzędach odległych o 3 mm z innym gatunkiem Rhizobium na podłożu agarowym o tym samym składzie co użyte dla transkoniuganta Fi, które zawierało dodatkowo trzeci ekstrakt z rośliny motylkowej otrzymany z rośliny motylkowej-gospodarza specyficznego wobec trzeciego macierzystego gatunku Rhizobium. Transkoniugant Fi tworzył charakterystyczne dla niego kolonie o barwie mlecznobiałej, podczas gdy macierzysty Rhizobium tworzył kolonie o charakterystycznej dla niego barwie. Dwa typy kolonii rozwinęły się między rzędami kolonii o barwie mlecznobiałej a koloniami zabarwionymi. Kolonie o barwie śnieżnobiałej zawierały transkoniuganty F2 Rhizobium, które mogą wywoływać powstawanie brodawek wiążących azot u roślin niemotylkowych. Kolonie o barwie śnieżnobiałej transkoniuganta Fi oczyszczano i wyodrębniano, jak to opisano w odniesieniu do kolonii o barwie mlecznobiałej i stosowano do wywoływania powstawania brodawek w roślinach niemotylkowych.

Po wywołaniu powstawania brodawek· u roślin niemotylkowych bakterioidy transkoniuganta F2 Rhizobium można izolować z brodawki i hodować na podłożu agarowym. Jeśli podłoże agarowe ma ten sam skład, co podłoże użyte do wytworzenia transkoniuganta (to jest podłoże agarowe zawiera trzy ekstrakty z rośliny motylkowej otrzymane z rośliny motylkowej-gospodarza specyficznego wobec każdego macierzystego Rhizobium użytego do wytworzenia transkoniuganta F2 (z dodatkiem ekstraktu z jego rośliny niemotylkowej-gospodarza, to transkoniuganty F2 izolowane z brodawki rośliny niemotylkowej będą tworzyć kolonie o barwie szarawej.

Nasiona roślin niemotylkowych zaprawiano zaprawą nasienną według wynalazku przez trzykrotne moczenie w temperaturze 20°C, każdorazowo w ciągu 3 godzin, w wodnym roztworze zawierającym 0,3% siarczanu wapniowego i do 10% równoobjętościowej mieszaniny trzech ekstraktów z roślin motylkowych, otrzymanych jak opisano powyżej, tych samych, które zastosowano do wytworzenia danego transkoniuganta F2 Rhizobium. Po każdym moczeniu nasiona suszono na powietrzu w temperaturze 40°C w ciągu 12 godzin.

Zakażenie roślin niemotylkowych transkoniugantami F2 Rhizobium prowadzono przez wysianie powleczonych nasion . roślin niemotylkowych i nawodnienie siewek po wykiełkowaniu zawiesiną transkoniuganta F2 Rhizobium. W niżej opisanych konkretnych próbach prowadzono

152 604 badania laboratoryjne i połowę, w których siewki po wykiełkowaniu traktowano albo (a) transkoniugantem F2 Rhizobium, bez nieorganicznego azotowego nawozu sztucznego ( + R-N), albo (b) nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym lecz bez transkoniuganta F2 Rhizobium (-R + N), albo (a) ani transkoniugantem F2 Rhizobium, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym (-R-N). Oznaczono zawartość azotu na roślinę, suchą masę i w niektórych przypadkach skład aminokwasowy powstałych roślin. W badaniach laboratoryjnych powleczone nasiona roślin niemotylkowych wysiewano w 1-litrowych pojemnikach (Jydsk Papir Vaerk, Arhus) wypełnionych 3 mm warstwą materiału klinkierowego „Fibo“ (R). Wysiewano 4 do 5 nasion w 1 pojemniku. Materiał klinkierowy „Fibo“ stanowi ziarnisty materiał porowaty z wypalanej gliny o średnicy około 3 mm, którego normalnie używa się jako materiału izolacyjnego.

Gdy wykielkowane rośliny wyrastały kilka cm ponad powierzchnię materiału klinkierowego, siewki w każdym pojemniku nawadniano jak następuje: (a) grupę + R-N nawadniano 50 ml zawiesiny transkoniuganta F2 Rhizobium, a następnie rośliny nawadniano raz na tydzień 50 - 80 ml na pojemnik nieazotowego nawozu sztucznego, (b) grupy -R + N nie traktowano transkoniugantem F2 Rhizobium, lecz zamiast tego nawadniano nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, a następnie rośliny nawadniano raz na tydzień 50 - 80 ml na pojemnik tego samego nieorganicznego azotowego nawozu sztucznego, oraz (c) grupę -R-N nawadniano 50 - 80 ml na pojemnika nieazotowego nawozu sztucznego. Skład nieorganicznego azotowego nawozu sztucznego i nieazotowego nawozu sztucznego zdefiniowano w tabeli 1.

Tabela 1

Roztwory macierzyste	Nawóz sztuczny (ml roztworu macierzystego/litr objętości końcowej)
Azotowy	Nieazotowy
NH4NOs(l,0 M)	20	0
CaSO4-2H2O (0,012 M)	65	65
KH2PO4 (0,10 M)	20	20
MgSO4-7H2O (0,20 M)	15	15
Fe(EDTA):
FeSO4-7H2O (2,490 g)	10	10
Na2 EDTA (3,716 g)
Objętości końcowe 1 litr
MnCls-4H2O (107,1 mg/1)	10	10
H3BO3 (142,2 mg/1)	10	10
ZnSOą· 7H2O (110,7 mg/1)	10	10
CuSO4-5H2O (8,0 mg/1)	10	10
Na2MoO4 · 2H2O (11,1 mg/1)	10	10

Zawiesinę transkoniugantów F2 Rhizobium, których użyto do nawadniania siewek wytwarzano przez hodowlę transkoniuganta F2 w 300 ml butli zawierającej 200 ml podłoża odżywczego zawierającego KH2PO4 (1,0 g), K2HPO4 (1,0 g), MgSO2-7H2O (0,36 g), CaSO4-2H2O (0,17 g), FeCb · 6H2O (0,005 g), KNO (0,7 g), ekstrakt drożdżowy (1,0 g), mannit (3,0 g) i wodę destylowaną do objętości końcowej 1000 ml.

Bakterie hodowano w temperaturze 28°C przez dwa do trzech dni do 'osiągnięcia gęstości bakterii w hodowli mierzonej spektrofotometrycznie jako CD620 wynoszącej 0,8, co wskazuje, że bakterie znajdowały się w logarytmicznej fazie wzrostu i hodowla nie osiągnęła fazy stacjonarnej. Następnie komórki osadzono przez odwirowanie przy 5000 X g w ciągu 30 minut i przemyto przez ponowne zawieszenie w jałowej wodzie. Przemywanie powtarzano raz lub dwa razy w celu usunięcia z komórek bakteryjnych wszystkich związków azotowych. Końcowy osad komórek zawieszono ponownie w 1,8 litra jałowej wody. Tej końcowej zawiesiny bakteryjnej użyto do nawadniania siewek roślin niemotylkowych.

W badaniach polowych zaprawione nasiona roślin niemotylkowych wysiewano do gleby, która nigdy nie była uprawiana. Grunt czyszczono i dzielono na poletka o szerokości 9,15 m i długości 27,45 m. Nasiona wysiewano tylko na naprzemiennych poletkach (nie dosiany grunt pozostawał między poletkami na których wysiano nasiona) w celu zapobieżenia ługowywaniu chemikalii z jednego poletka oraz wnikaniu ich i zanieczyszczaniu innego poletka. Na poletku

152 604 9 nasiona wysiewano w 6 rzędach. Każdy rząd był oddzielony od innych (152,4 cm) i nasiona w każdym rzędzie wysiewano w odległości 20,32 cm.

Każde poletko zawierało jedną z następujących grup: (a) grupę + R-N traktowaną transkoniugantem F2 Rhizobium i nawadnianą wyżej zdefiniowanym nieazotowym nawozem sztucznym, (b) grupę -R + N nie traktowaną transkoniugantem F2 Rhizobium, ale nawadnianą wyżej zdefiniowanym nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, oraz (c) grupę -R-N nie traktowaną ani transkoniugantem F2 Rhizobium, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, a zamiast tego nawadnianą nieazotowym nawozem sztucznym.

Do zakażenia grupy + R-N transkoniugantem F2 Rhizobium stosowano następujący sposób: hodowlę transkoniuganta F2 .wprowadzano 10,16 cm poniżej poziomu, na którym każde nasiono zostało zasiane. Siew i wprowadzanie do gleby przeprowadzono za pomocą maszyny z 1364litrowym zbiornikiem zawierającym zawiesinę transkoniuganta F2 Rhizobium, otrzymaną jak uprzednio opisano, w znacznie większej skali (to jest transkoniugant F2 Rhizobium hodowano do fazy logarytmicznej w zbiorniku o objętości 45,46 m³ i rozcieńczano do CD62o 0,8). Około 1,5 ml /nasiono hodowli transkoniuganta F2 Rhizobium wprowadzano do głębiej położonej warstwy gleby. Następnie nasiona i siewki nawadniano w podany sposób.

Okresowo rośliny w niektórych pojemnikach przerywano, pozostawiając po 3 rośliny w pojemniku i zerwane rośliny poddawano analizie metodą Kjeldahla, oznaczając całkowitą zawartość organicznie związanego azotu i ilość suchej masy w pojemniku tj. na 3 rośliny. Do tego celu pobierano napowietrzne części roślin, suszono w ciągu 48 godzin w temperaturze 80°C, ważono, kruszono i rozdrabniano w moździerzu. Próbki zmacerowanego materiału pobierano do analizy metodą Kjeldahla, którą prowadzono w zwykły sposób. Każdą analizę Kjeldahla powtarzano 4-6 razy. Wyniki rejestrowano jako wartość wagową azotu i wartość wagową suchej masy na roślinę. We wszystkich przypadkach rośliny, na których pod wpływem Rhizobium powstały brodawki, miały wyższą zawartość suchej masy i azotu niż rośliny nawożone azotem albo grupa nie potraktowana.

W badaniach polowych okresowo zbierano pewną ilość roślin i oznaczano zawartość białka na roślinę, najpierw oznaczając zawartość azotu na roślinę za pomocą analizy Kjeldahla, a następnie mnożąc procent azotu przez współczynnik 6,25. W pewnych badaniach oznaczono skład aminokwasowy białka. We wszystkich przypadkach rośliny niemotylkowe, na których pod wpływem Rhizobium powstały brodawki miały wyższą zawartość białka, niż rośliny potraktowane nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i rośliny potraktowane nieazotowym nawozem sztucznym.

Poniżej przedstawiono konkretne próby biologiczne i ich wyniki.

Próba A. Powstawanie brodawek na pszenicy.

Rhizobium tritici wywołujący powstawanie brodawek na pszenicy wytworzono przez skrzyżowanie R. phaseoli z R. cowpea leucaena w celu wytworzenia transkoniuganta Fi, który następnie skrzyżowano z R. trifoli. Tak wytworzonego Rhizobium tritici użyto do wywołania powstawania brodawek na 4 szczepach pszenicy: Anja, Kraka, Vuka i Williams.

Do wytworzenia R. tritici użyto następujących macierzystych Rhizobia w celu wytworzenia kolonii o barwie mlecznobiałej transkoniuganta Fi: (a) R. phaseoli, izolowany z fasoli, odmiana hodowlana Prospektor, rosnącej w próbie gleby znalezionej blisko Aarhus, MS-1 i (b) R. cowpea leukaena izolowany z tropikalnego drzewa Leucaena leucocephala (należącego do rodziny Fabaceae), Papua, Nowa Gwinea.

Macierzyste Rhizobia hodowano w naprzemiennych rzędach na podłożu agarowym opisanym uprzednio. Ekstrakty z roślin motylkowych, stosowane w podłożu, wytworzono odpowiednio, z napowietrznych części fasoli i z liści Leukaena leucocephala. Kolonie tworzone przez R. phaseoli miały charakterystyczną ciemnobrunatną barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. cowpea leucaena miały charakterystyczną barwę szarawobrunatną.

Transkoniugant Fi Rhizobium otrzymany z kolonii o barwie mlecznobiałej oczyszczono i hodowano w naprzemiennych rzędach, jak opisano, ze szczepem R. trifoli, który izolowano z koniczyny łąkowej, rosnącej w próbce gleby znalezionej w pobliżu Randers. Ekstrakty z roślin motylkowych, stosowane w podłożu wytworzono z powietrznych części fasoli, liści leucaena leucocephala i powietrznych części koniczyny łąkowej. Kolonie tworzone przez transkoniugant Fi

152 604 miały mlecznobiałą barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. trifoli miały charakterystyczną jasnobrunatną barwę.

Transkoniugant Fi Rhizobium otrzymany z kolonii o barwie śnieżnobiałej wytworzonych między rzędami, nazwany w niniejszym opisie Rhizobium tritici, oczyszczono i wyizolowano w opisany sposób. Trwało to około 20 tygodni. Następnie użyto transkoniuganta F2 do wywoływania powstawania brodawek na pszenicy.

Rhizobium tritici użyto do wywołania powstawania brodawek na czterech szczepach pszenicy: Anja, Kraka, Vuka i Williams. Nasiona pszenicy potraktowano przez trzykrotne zanurzenie w roztworze wodnym uprzednio opisanym, zawierającym 0,3% siarczanu wapniowego i do około 10% ekstraktów z roślin motylkowych, których użyto do wytworzenia R. tritici. Tak więc trzy ekstrakty z roślin motylkowych użyte do powlekania nasion otrzymano z napowietrznych części fasoli, liści leucaena leucocephala i powietrznych części koniczyny łąkowej. Po każdym zanurzeniu nasiona wysuszono na powietrzu i wysiano, jak poniżej opisano.

Cztery do pięciu nasion pszenicy Anja, Kraka lub Vuka (powleczonych) wysiewano do l-litrowych pojemników wypełnionych materiałem klinkierowym „Fibo“ i pozostawiono do wykiełkowania. Każdy z trzech typów pszenicy podzielono na następujące trzy grupy: (a) + R-N, siewki w tej grupie nawadniano 50 ml zawiesiny R. tritici otrzymanej jak uprzednio opisano, a następnie nawadniano co tydzień nieazotowym nawozem sztucznym, (b) -R + N, siewki w tej grupie nie zostały potraktowane R. tritici, lecz nawadniano je nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, oraz (c) -R-N, siewek w tej grupie nie potraktowano ani R. tritici, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, a zamiast tego nawadniano je nieazotowym nawozem sztucznym uprzednio opisanym. Na roślinach potraktowanych R. tritici rozwinęły się brodawki korzeniowe w ciągu 8 do 10 tygodni. Rośliny w każdym pojemniku przerzedzono do trzech roślin i w każdej grupie użyto dziesięciu pojemników do analizy suchej masy i zawartości azotu.

W badaniach polowych powleczone nasiona pszenicy wysiano w sposób opisany uprzednio. Nasiona z grupy (a) + R-N potraktowano zawiesiną R. tritici i nawodniono nieazotowym nawozem sztucznym, z grupy (b) -R + N nie potraktowano R. tritici, lecz nawodniono nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i z grupy (c) -R-N nie potraktowano ani R. tritici, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, a nawodniono nieazotowym nawozem sztucznym. Analiza suchej masy, zawartości azotu i zawartości białka w pszenicy bez brodawek.

Pszenicę zebrano z pojemników po 56, 70, 87, 100 i 118 dniach po zasianiu. Suchą masę na roślinę i zawartość azotu na roślinę (analiza Kjeldahla) analizowano jak uprzednio opisano.

Wyniki przedstawiono na fig. 1, na której suchą masę na roślinę (A) i zawartość azotu na roślinę (B) przedstawiono w zależności od liczby dni po zasianiu.

W celu ułatwienia zrozumienia fig. 1 pomocna będzie następująca informacja podana w tablicy 2 i 3 dotycząca średniej wagi suchej masy i średniej zawartości azotu w trzech typach pszenicy.

Tabela 2

Pszenica	Sucha masa (g/100 nasion)	Zawartość azotu (mg/nasiono)
Anja	4,403	1,103
Kraka	3,611	0,869
Vuka	4,052	0,819

Wyniki przedstawione na fig. 1 wykazują, że w czasie wzrostu pszenica potraktowana Rhizobium miała wyższą zawartość azotu i suchej masy, niż pszenica nawożona azotem, a po zakończeniu doświadczenia sucha masa w roślinach +R-N była prawie o 40% wyższa niż w roślinach -R + N, przy czym obydwie te grupy wykazywały wyższą wagę niż pszenica -R-N nie potraktowana.

Pszenicę w badaniach polowych zebrano po jednym sezonie wzrostu i zawartość białka na roślinę zanalizowano jak opisano uprzednio. Wyniki przedstawione w tabeli 4, jasno wykazują, że rośliny potraktowane R. tritici (+R-N) miały wyższą zawartość białka niż zarówno grupa potraktowana nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym (-R+N), jak i grupa potraktowana nieazotowym nawozem sztucznym (-R-N).

152 604

Tabela 3

Grupa roślin	Liczba zebranych roślin
Dni po zasianiu
56	70	87	100	118
Doświadczenie pierwsze
+ R-N	33	30	21	23	25
-R + N	24	30	20	21	20
-R-N	24	26	22	26	35
Doświadczenie drugie
+ R-N	11	10	7	8	8
-R + N	8	10	7	7	7
-R-N	8	9	7	9	12

Tabela 4

Grupa roślin	Zawartość białka w nasionach/roślinę
+ R-N	22-28
—R + N	12-14
—R—N	brak danych*

* brak danych - te nie potraktowane rośliny obumarły po 8 tygodniach

Próba B. Powstawanie brodawek na jęczmieniu.

Rhizobium hordei wywołujący powstawanie brodawek na jęczmieniu wytworzono najpierw przez skrzyżowanie R. phoseoli z R. leguminosarum w celu wytworzenia transkoniuganta Fi, który następnie skrzyżowano z R. cowpea leucaena. Tak wytworzonego Rhizobium hordei użyto do wywołania powstawania brodawek na czterech odmianach jęczmienia: Hasso, Cerise, Harry i Igri.

Do wytworzenia R. hordei użyto następujących macierzystych Rhizobia w celu wytwarzania kolonii o barwie mlecznobiałej transkoniuganta Fi (a) R. phaseoli, izolowany z fasoli, odmiana hodowlana Prospector, rosnącej na próbce gleby znalezionej blisko Aarhus i (b) R. leguminosarum izolowany z groszku ogrodowego.

Macierzysty Rhizobia hodowano w naprzemiennych rzędach na podłożu agarowym opisanym uprzednio. Ekstrakty z roślin motylkowych, stosowane w podłożu, wytworzono, odpowiednio, z części powietrznych fasoli i groszku ogrodowego. Kolonie tworzone przez R. phoseoli miały charakterystyczną ciemnobrunatną barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. leguminosarum miały charakterystyczną barwę złoto-żółtą.

Transkoniugant Fi otrzymany z kolonii o barwie mlecznobiałej oczyszczono i hodowano w naprzemiennych rzędach, jak opisano, ze szczepem R. cowpea leucaena, który wyizolowano z tropikalnego drzewa Leucaena leucocephala. Ekstrakty użyte w podłożu, z roślin motylkowych, wytworzono odpowiednio z powietrznych części fasoli, groszku ogrodowego i z liści Leucaena leucocephala. Kolonie wytworzone przez transkoniugant Fi miały mlecznobiałą barwę, podczas gdy kolonie wytworzone przez R. cowpea leucaena miały charakterystyczną szarawo-brunatną barwę.

Transkoniugant F2 otrzymany z kolonii o barwie śnieżnobiałej wytworzonych między rzędami, nazwany w niniejszym opisie Rhizobium hordei, oczyszczono i wyizolowano jak opisano.

Plazmidowy DNA z trzech szczepów macierzystych transkoniuganta Fi i transkoniuganta F2 (R. hordei) wyodrębniono stosując modyfikację metody Hirscha · i wsp. [J. Sm. Microbiol., 120,403 - 412 (1980)], która obejmuje wywołanie lizy Rhizobium przez całoroczną inkubację w temperaturze 4°C w 40% siarczanie sodowo-dodecylowym (SDS) i wyodrębnienie plazmidowego DNA za pomocą elektroforezy w 0,7% żelu agarowym. Wyniki tej analizy ujawniły, że R. hordei miał dodatkowe plazmidy o · niskiej masie cząsteczkowej, których nie obserwowano w trzech macierzystych Rhizobia lub transkoniugancie Fi.

152 604

Rhizobium hordei użyto do wywołania powstawania brodawek na czterech odmianach jęczmienia: Masso, Cerise, Igri i Harry. Nasiona jęczmienia potraktowano przez trzykrotne zanurzenie w roztworze wodnym zawierającym 0,3% siarczanu wapniowego i do około 10% ekstraktów z roślin motylkowych, których użyto do wytworzenia R. hordei, to jest ekstrakty z roślin motylkowych użyte do powlekania nasion otrzymano z powietrznych części fasoli, groszku ogrodowego i liści Leucaena leucocephala. Po każdym zanurzeniu nasiona suszono na powietrzu i wysiano.

Do 1 - litrowego pojemnika wypełnionego materiałem klinkierowym „Fibo“ - wysiewano 4-5 nasion i pozostawiono je -do wykiełkowania. Każdy z trzech typów jęczmienia podzielono na następujące trzy grupy: (a) + R-N, siewki tej grupy nawadniano 50 ml zawiesiny R. hordei otrzymanej jak uprzednio opisano, a następnie nawadniano co tydzień nieazotowym nawozem sztucznym, (b) -R + N, siewki tej grupy nie zostały potraktowane R. hordei, ale nawadniano je nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, oraz (c) -R-N, siewek tej grupy nie potraktowano ani R. hordei, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, a zamiast tego nawadniano je nieazotowym nawozem sztucznym. Na roślinach potraktowanych R. hordei rozwinęły się brodawki korzeniowe w ciągu 8 do 10 tygodni. Rośliny w każdym pojemniku przerzedzono do trzech roślin i w każdej grupie użyto dziesięciu pojemników do analizy suchej masy i zawartości azotu.

Rośliny zebrano z pojemników po 59, 71, 85, 108 i 128 dniach po zasianiu. Suchą masę i zawartość azotu w przeliczeniu na roślinę (analiza Kjeldahla) analizowano jak uprzednio opisano.

Wyniki przedstawiono na fig. 2, w której suchą masę na roślinę (A) i zawartość azotu na roślinę (B) przedstawiono w zależności od liczby dni po zasianiu.

W celu ułatwienia zrozumienia fig. 2 pomocne będą informacje dotyczące średniej wagi suchej masy i średniej zawartości azotu w każdym typie jęczmienia podane w tabelach 5 i 6.

Tabela 5

Jęczmień	Sucha masa (g/100 nasion)	Zawartość azotu (mg/nasiono)
Hasso	3,922	0,732
Ceriso	4,217	0,792
Igri	3,932	0,775
Harry	5,068	0,826

Tabela 6

Grupa roślin	Liczba zebranych roślin
Dni po zasianiu
59	71	85	108	128
Doświadczenie pierwsze
+ R-N	23	23	27	31	37
-R + N	17	14	30	23	40
-R-N	14	18	28	20	32
Doświadczenie drugie
+ R-N	8	8	9	10	12
-R + N	6	5	10	8	13
-R-N	5	6	9	7	11

Wyniki przedstawione na fig. 2 wskazują, że w czasie wzrostu rośliny potraktowane Rhizobium miały wyższą zawartość azotu i suchej masy niż rośliny nawożone azotem, a po zakończeniu eksperymentu sucha masa w roślinach + R-N była prawie o 18 - 22% wyższa, niż w roślinach -R + N, przy czym obydwie te grupy wykazywały wyższą wagę niż jęczmień -R-N potraktowany nieazotowym nawozem sztucznym.

Następnie jęczmień inkubowano w obecności atmosferycznego ¹⁵N, po czym części rośliny zbadano pod kątem zawartości 1®Ν, traktując je jako wskaźnik wiązania azotu. Jęczmień (roślinę) w wieku 95 dni, z małymi brodawkami, umieszczono w komorze w ten sposób, że korzenie inkubowano w obecności atmosferycznego 1*N w ciągu 23 godzin. Atmosfera w komorze korze152 604 13 niowej zawierała 80% N2 (w czym 1®N stanowił 12,85%) i 20% O2. Po okresie inkubacji próbki analizowano pod względem zawartości 1^SN i całkowitej zawartości azotu w roślinie, którą oznaczono metodą Kjeldahla. Wyniki przedstawiono w tabeli 7.

Tabela 7

Części rośliny	Zawartość azotu w częściach jęczmienia z brodawkami
Sucha masa (8)	Zawartość (mg/g)	Zawartość azotu całkowita (mg)
Korzenie	0,448	8,9	3,99
Pędy	1,017	7,5	7,63
Cała roślina	1,465	7,93	11,62
Części rośliny	^Zawartoś^{ć 1S}N w częściach j^zmtema z ^brodaw^kamⁱ
Liczba próbek		^ZawartoŚ^{ć 15n}*
Korzenie	4		0,450 ±0,011
Pędy	3		0,392 ± 0,003

* Zawarto^ ^1δΝ w powietrzu atmosferycznym wynosi około 0,3⁷°%.

Dane w tabeli 7 wykazują, że tak korzeń, jak i pędy j'ęczmienia z brodawkami zawierają znacznie więcej 1^SN niż atmosfera. Wyniki te . wskazują, że w jęczmieniu z brodawkami zachodzi wiązanie azotu.

Przeprowadzono badanie pewnej ilości dużych . brodawek w mikroskopie elektronowym, co obejmowało badanie ultracienkich przekrojów poprzecznych barwionych octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Układ komórkowy brodawek jęczmienia był taki sam jak układ, o którym doniósł Newcomb [Can. J. Bot., 54,2163 - 2168 (1976)] w odniesieniu do brodawek grochu, to jest wiązki naczyniowe znajdowano w obwodowej korze, podczas gdy centralna część brodawki była zajęta przez komórki roślinne wypełnione bakterioidami. .

Dalsze badania przeprowadzone w mikroskopie świetlnym i mikroskopie -elektronowym (skanningowym i prześwietlającym) dotyczyły powierzchni małych brodawek jęczmienia oraz powierzchni przekrojów poprzecznych dużych brodawek jęczmienia. Obserwowaną morfologię porównano z morfologią uzyskaną dla grochu, koniczyny białej i soi. Małe brodawki jęczmienia były - - widoczne po osiągnięciu przez rośliny około 50 dni wzrostu i powstały na około 75% roślin (obserwacje te dotyczyły również pszenicy). Duże brodawki jęczmienia zaobserwowano po 89 -110 dniach wzrostu. Były one rzadkie, ale wyraźne, miały około 2-4 mm długości, średnica wynosiła 1 2 mm i występowały na głównych korzeniach przy umiejscowieniu około 2 - 6 cm poniżej pozycji starego ziarna. Jedenaście do trzynastu dużych brodawek miało po -przekrojeniu zabarwienie czerwono -brunatne wewnątrz, to jest takie samo zabarwienie jak leghemoglobina w brodawkach roślin motylkowych w wieku 20 - 35 dni. Z pozostałych przekrojonych dwu dużych brodawek, jedna miała barwę białą i wyglądała jak młoda niedojrzała brodawka rośliny motylkowej, a druga miała barwę zieloną tak, jak starzejąca się brodawka rośliny motylkowej. Prawdopodobnie zakażenie jęczmienia następuje w dwóch stadiach. W stadium pierwotnym R. hordei wnika do korzenia, ale nie wywołuje odpowiedzi polegającej na powstawaniu brodawek. W następnym stadium zaczyna się powstawanie brodawek po okresie opóźnienia.

Bakterie wyizolowane z dużych brodawek jęczmienia . zbadano pod względem odporności na antybiotyki. Były one odporne na dwuchlorowodorek spektynomycyny w stężeniu do 400μ/Ηΐ!. Transkoniugant F2 R. hordei pierwotnie użyty ' do zakażenia jęczmienia (to jest inokulant) wykazywał tę samą odporność. Tak inokulant, jak i wyizolowane bakterie tworzyły nieprzeźroczyste kolonie o barwie białej przy wzroście na zwykłym agarze drożdżowo-mannitowym.

Jeden z macierzystych organizmów transkoniuganta F2 R. hordei był. również odporny na dwuchlorowodorek spektynomycyny w tym samym stężeniu. Tym organizmem macierzystym jest R. leguminosarum szczep MA 1, który tworzy nieprzezroczyste jasnożółte kolonie przy wzroście na zwykłym agarze drożdżowo-mannitowym. Gen oporności na spektynomycynę nie przynależy do plazmidu Sym, tak więc transkoniugant F2 R. hordei jest prawdopodobnie hybrydą zawierającą niesymbiotyczny plazmid lub główny chromosom macierzystego organizmu R. leguminosarum

152 604

MAI. Nie wyklucza to jednak możliwości, że transkoniugant Fe R. hordei może również mieć plazmid Sym z MAI.

Próba C. Powstawanie brodawek na sorgu.

Rhizobium sorghi wywołujący powstawanie brodawek na sorgo wytworzono przez skrzyżowanie R. lupini z R. cowpea leucaena w celu wytworzenia transkoniuganta Fi, który następnie skrzyżowano z R. neliloti. Tak wytworzonego R. sorghi użyto do wywołania powstania brodawek na trzech typach sorga: Satra, Dabar i Feterita.

Do wytworzenia R. sorghi użyto następujących macierzystych Rhizobia w celu wytworzenia kolonii o barwie mlecznobiałej transkoniuganta Fi: (a) R. lupini, izolowany z łubinu z centralnej Jutlandii i (b) R. cowpea leucaena, · izolowany z tropikalnego drzewa Leucaena leucouphala (należącego do rodziny Fabaceae), Papua, Nowa Gwinea.

Macierzyste Rhizobia hodowano w naprzemiennych rzędach na podłożu agarowym, opisanym uprzednio. Ekstrakty z roślin motylkowych stosowane w podłożu, wytwarzano odpowiednio z łubinu i z liści Leucaena leucocephala. Kolonie tworzone z łubinu i z liści Leucaena leucocephala. Kolonie tworzone przez R. lupini miały charakterystyczną jasnożółtą barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. cowpea leucaena miały charakterystyczną szarawo-brunatną barwę.

Transkoniugant Fi otrzymany z kolonii o barwie mleczno-białej oczyszczono i hodowano w naprzemiennych rzędach, jak opisano, ze szczepem R. meliloti, który izolowano z lucerny ze Stahr. Ekstrakty z roślin motylkowych stosowane w podłożu wytworzono z łubinu, liści Leucaena leucocephala i lucerny. Kolonie tworzone przez transkoniuganta Fi miały mleczno-białą barwę podczas, gdy kolonie tworzone przez R. meliloti miały charakterystyczną żółtawo-brunatną barwę.

Transkoniugant F2 Rhizobium otrzymany z kolonii o barwie śnieżnobiałej wytworzonych między rzędami, nazwany w niniejszym ' opisie Rhizobium sorghi, oczyszczono i izolowano jak opisano. Transkoniuganta F2 użyto do wywoływania powstawania brodawek na trzech odmianach sorga: Safra, Dabar i Feterita. Nasiona sorga potraktowano przez trzykrotne zanurzenie w roztworze wodnym zawierającym 0,3% siarczanu wapniowego i do około 10% ekstraktów z roślin motylkowych, których użyto do wytworzenia R. sorghi, tj. ekstrakty z roślin motylkowych użyto do powlekania nasion otrzymano z łubinu, liści Leucaena leucocephala i lucerny. Po każdym zanurzeniu nasiona suszono na powietrzu.

Sorgo Safra, Dabar i Feterita, to jest 4 do 5 zaprawionych nasion, wysiewano do 1-litrowego pojemnika wypełnionego materiałem klinkierowym „Fibo“ i pozostawiono do wykiełkowania. Każdy typ sorgo podzielono na następujące trzy grupy: (a) + R-N, siewki z tej grupy nawadniano 50 ml zawiesiny R. sorghi otrzymanej jak uprzednio opisano, a następnie nawadniano co tydzień nieazotowym nawozem sztucznym, (b) -R + N, siewek tej grupy nie potraktowano R. sorghi, ale nawadniano je nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i (c) -R-N, siewek z tej grupy nie potraktowano ani R. sorghi, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym, a zamiast tego nawadniano je nieazotowym nawozem sztucznym. Na roślinach potraktowanych R. sorghi rozwinęły się brodawki korzeniowe w ciągu 10 tygodni. Rośliny w każdym pojemniku przerzedzono do trzech roślin i w każdej grupie użyto dziesięciu pojemników do analizy.

Do badań polowych zaprawione nasiona sorga (szczep Faterita) wysiano w uprzednio opisany sposób. Nasiona z grupy (a) + R-N potraktowano zawiesiną R. sorghi i nawadniano nieazotowym nawozem sztucznym, z grupy (b) -R + N nie potraktowano R. sorghi, lecz nawadniano nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i z grupy (c) -R-N nie potraktowano ani R. sorghi, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i po prostu nawadniano nieazotowym nawozem sztucznym.

Rośliny zebrano po 76 i 152 dniach po zasianiu. Suchą masę na roślinę i zawartość azotu na roślinę (analiza Kjeldahla) analizowano jak uprzednio opisano.

Pomocna jest, zawarta w tabelach 8 i 9 informacja dotycząca średniej wagi suchej masy i średniej zawartości azotu w sorgo.

Tabela 8

Sorgo	Sucha masa (g/100 nasion)	Azot w nasieniu (%)
Safra	3,724	2,32
Dabar	2,944	2,17
Feterita	3,840	1,42

152 604

Tabela 9

Grupa roślin	Całkowita liczba zebranych roślin po 76 i 152 dniach od zasiania
+ R-N	121
-R + N	62,,.
-R-N	70

Sorgo w badaniach polowych zebrano po jednym sezonie wzrostu i . zawartość białka na roślinę oraz skład aminokwasowy zanalizowano jak opisano uprzednio. Wyniki przedstawione w tabeli 10 jasno wykazują, że rośliny potraktowane R. sorghi ( + R-N) miały wyższą zawartość białka niż zarówno grupa potraktowana azotowym nawozem sztucznym (-R + N), jak i grupa nie potraktowana (-R-N).

Analiza składu aminokwasowego wykazuje, że względny skład aminokwasowy roślin potraktowanych Rhizobium jest prawie taki sam jak w przypadku roślin nawożonych azotem, tym niemniej poziom tryptofanu i leucyny jest podwyższony w roślinach potraktowanych Rhizobium.

Tabela 10

Grupa roślin	Zawartość białka w nasionach /roślinę (%)
+ R-N	34-52
-R + N	16
-R-N	4*

* Ponieważ rośliny z grupy -R-N obumarły po 14 tygodniach, nie otrzymano nasion. Zawartość azotu i białka w roślinach oznaczono jak opisano.

Próba D. Powstawanie brodawek na ryżu.

Rhizobium oryzae wywołujący powstawanie brodawek na ryżu wytworzono przez skrzyżowanie R. maliloti z R. cowpea leucaena w celu wytworzenia transkoniuganta Fi, który następnie skrzyżowano z R. trifoli. Tak wytworzonego R. oryzae użyto do wywołania powstania brodawek na ryżu.

Do wytworzenia R. oryzae użyto następujących macierzystych Rhizobia w celu wytworzenia kolonii o barwie mlecznobiałej transkoniuganta Fi: (a) R. meliloti, izolowanego z lucerny znajdowanej w pobliżu Wiktorii i (b) R. cowpea leucaena, izolowany z tropikalnego drzewa Leucaena leucocephala (należącego do rodziny Fabaceae), Papua, Nowa Gwinea.

Macierzyste Rhizobia hodowano w naprzemiennych rzędach na uprzednio opisanym podłożu agarowym. Ekstrakty z roślin motylkowych stosowane w podłożu otrzymano odpowiednio, z lucerny i z liści Leucaena leucocephala. Kolonie tworzone przez R. meliloti miały charakterystyczną żółtawo-brunatną barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. cowpea leucaena miały charakterystyczną szarawo-brunatną barwę.

Transkoniugant Fi otrzymany z kolonii o barwie mleczno-białej oczyszczono i hodowano w naprzemiennych rzędach, jak opisano, ze szczepem R. trifoli, który wyizolowano z koniczyny łąkowej, znajdowanej w Randers. Ekstrakty z roślin motylkowych stosowane w podłożu wytworzono z lucerny, liści Leucaena leucocephala i koniczyny łąkowej. Kolonie tworzone przez transkoniugant Fi miały mlecznobiałą barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. trifoli miały charakterystyczną jasno-brunatną barwę.

Transkoniugant F2 Rhizobium otrzymany z kolonii o barwie śnieżnobiałej wytworzonych między rzędami, nazwany w niniejszym opisie Rhizobium oryzae, oczyszczono i izolowano jak opisano. Transkoniuganta F2 użyto do wywoływania powstawania brodawek na ryżu.

Nasiona ryżu potraktowano przez trzykrotne zanurzenie w roztworze wodnym zawierającym 0,3% siarczanu wapniowego i do około 10% ekstraktów z roślin motylkowych, których użyto do wytworzenia R. oryzae, to jest ekstrakty z roślin motylkowych użyte do zaprawiania nasion otrzymano z lucerny, liści Leucaena leucocephala i koniczyny łąkowej. Po każdym zanurzeniu nasiona suszono na powietrzu.

152 604

Do badań polowych zaprawione nasiona ryżu wysiano w sposób opisany uprzednio. Nasiona z grupy (a) + R-N potraktowano, jak ' wyżej opisano, zawiesiną R. oryzae i nawadniano nieazotowym nawozem sztucznym, z grupy (b) -R + N nie potraktowano R. oryzae, lecz nawadniano nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i z grupy (c) -R-N nie potraktowano ani R. oryzae, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i po prostu nawadniano nieazotowym nawozem sztucznym.

Rośliny zbierano co 4,5 miesiąca w ciągu 2,5 roku (2 zbiory rocznie) i zawartość białka na · roślinę analizowano jak uprzednio opisano.

Wyniki przedstawione w tabeli 11 jasno wykazują, że ryż potraktowany R. oryzae ( + R-N) miał wyższą zawartość białka niż zarówno grupa potraktowana azotowym nawozem sztucznym (-R + N) jak i grupa nie potraktowana (-R-N).

Tabela 11

Grupa roślin	Zawartość białka/roślinę (%)
+ R-N	12,0-18
-R + N	1,5- 3
-R-N	0,5- 1

Próba E. Działanie zaprawy i Rhizobium na eukaliptus.

Dodatni wpływ Rhizobium jako nawozu azotowego zaobserwowano w przypadku eukaliptusa (rodzina Myrtaceae), gatunku roślinnego nie należącego do rodziny traw. Z 2 badanych gatunków E. globulus odpowiadał bardzo wyraźnie zwiększeniem biomasy, tym niemniej nie zaobserwowano brodawek.

Rhizobium 081324 wykazujący korzystny wpływ w przypadku eukaliptusa wytworzono przez skrzyżowanie R. cowpea leucaena z R. leguminosarum w celu wytworzenia transkoniuganta Fi, który następnie skrzyżowano z R. trifoli. Tak wytworzonego transkoniuganta F2, szczep 081324, użyto do potraktowania 2 gatunków eukaliptusa. Ten szczep Rhizobium nie zakaża jakiejkolwiek: innej rośliny-gospodarza z opisanych w próbach w niniejszym opisie.

Nasiona eukaliptusa potraktowano wstępnie przed kiełkowaniem, jak uprzednio opisano dla zbóż, ekstraktami z roślin motylkowych, z grochu, fasoli, łubinu, koniczyny, lucerny i Leucaena. Potraktowane nasiona wysiano do gruboziarnistego piasku, a nie potraktowane nasiona wysiano jako kontrolne.

Po wykiełkowaniu potraktowane wstępnie siewki nawadniano nieazotowym nawozem sztucznym i zawiesiną jednego z sześciu transkoniugantów F2 Rhizobium (+ R-N). Po wykiełkowaniu jedną grupę nie potraktowanych siewek nawadniano azotowym nawozem sztucznym (-R+N), a inną grupę nieazotowym nawozem sztucznym (-R-N). Po 4 tygodniach siewki potraktowane 5 z 6 szczepów Rhizobium wszystkie obumarły, natomiast potraktowane Rhizobium szczep 081324 przeżyły. Przeniesiono je indywidualnie do 6-litrowych doniczek z glebą i wierzchnią warstwą materiału klinkierowego „Fibo“ w celu utrzymania wilgoci w doniczce i zapobieżenia wzrostowi grzybów. Dno doniczek było perforowane tak, że nadmiar wody mógł wypłynąć, lecz dana ilość nieazotowego nawozu sztucznego była tak doprowadzana, że nie mogło być stojącej wody lub zanieczyszczenia bakteriami. Ogółem było 28 doniczek, w tym 14 + R-N i 14 - -R + N. 14 doniczek +R-N inokulowano ponownie Rhizobium 081324.

Po 4 miesiącach wzrostu eukaliptusy -R + N miały 2 - 3-krotnie więcej biomasy niż rośliny + R-N. Oględziny jednej z roślin + R-N nie ujawniły brodawek, tym niemniej wykrycie małych brodawek jest bardzo trudne gdy korzenie rosną w glebie, ponieważ cząstki gleby przywierają do korzeni i odbarwiają drobne korzenie. Wbrew niemożliwości wykrycia brodawek na tym eukaliptusie + R-N, wyniki wskazują, że zwiększenie biomasy jest zależne od wiązania azotu przez Rhizobium.

Próba F. Rhizobium R1 wywołujący powstawanie brodawek na Brassica.

Roślina z rodzaju Brassica, czyli inna roślina nie należąca do rodziny traw, również odpowiada dodatnio na potraktowanie Rhizobium. Potraktowanie rzepaku (Brassica napus) Rhizobium R1 (010824) wpływa na wzrost rośliny i powstawanie brodawek.

152 604

Rhizobium R1 (010824) wywołujący powstawanie brodawek na rzepaku wytworzono przez skrzyżowanie R, phaseoli z R. cowpea leucocaena w celu wytworzenia transkoniuganta Fi, który następnie skrzyżowano z R. trifoli.

Nasiona rzepaku potraktowano wstępnie przed kiełkowaniem, jak to uprzednio opisano dla zbóż, ekstraktami z roślin motylkowych, - z fasoli, Leucaena i koniczyny. Potraktowane nasiona wysiano do - 2-litrowych pojemników i po wykielkowaniu jedną grupę nawożono normalnie (-R + N), inną grupę nawadniano tylko nieazotowym nawozem sztucznym (-R-N), a trzecią grupę, którą również nawadniano nieazotowym nawozem sztucznym, potraktowano sześcioma różnymi szczepami Rhizobium ( + R-N). Po upływie 3,5 miesiąca rośliny -R-N miały ciągle tylko - trzy pierwsze młode liście, a rośliny + R-N potraktowane trzema szczepami Rhizobium, oznaczonymi R4, R5 i R6, były równie słabe. Tym niemniej jeden z transkoniugantów Rhizobium, a mianowicie szczep R1 lub 010824, był korzystny. Roślina potraktowana R1 010824 miała prawie taką samą wielkość i łuszczyny, co największa roślina -R+N. Widoczne były małe brodawki korzeniowe.

Próba G. Wiązanie azotu w roślinach niemotylkowych z brodawkami.

W celu wykazania, że brodawki powstałe pod wpływem transformantów Rhizobium na roślinach niemotylkowych wyrosłych z nasion potraktowanych zaprawą według wynalazku były aktywne pod względem wiązania azotu, przeprowadzono analizę Kjeldahla zawartości organicznego azotu w roślinach.

Każdą - z badanych roślin niemotylkowych wyrosłych z zaprawionych nasion dzielono na trzy grupy: (a) jedną potraktowano transkoniugantem Rhizobium i nieazotowym nawozem sztucznym (+ R-N), (b) drugą grupę potraktowano azotowym nawozem sztucznym bez transkoniuganta Rhizobium (-R + N) i (c) trzeciej grupy nie potraktowano ani transkoniugantem Rhizobium, ani azotowym nawozem sztucznym. Rośliny z tych grup rosły w warunkach pod innymi względami identycznych w pomieszczeniu do hodowli i zbierano je w pewnych odstępach czasu w okresie wzrostu aż do dojrzenia nasion. Trzy do pięciu roślin rosło w każdym pojemniku i przy zbiorze ich pędy łączono. Z tego materiału pobierano jedną próbkę i analizowano pod ' względem całkowitej zawartości azotu organicznego. Wyniki przedstawione poniżej wykazują, że rośliny niemotylkowe z brodawkami były zdolne do wiązania azotu.

Na 2 odmianach pszenicy, Cornette i Ralle, wywołano powstanie brodawek przy użyciu Rhizobium tritici jak uprzednio opisano w próbie A. Badano zawartość azotu wyrażoną jako mg azotu /górną część rośliny i suchą masę/ górną część rośliny. Wyniki przedstawiono w tabeli 12.

Tabela 12

Dni	Zawartość azotu i suchej masy w pszenicy z brodawkami
mg/roślinę -	+ R-N (n = 4)	Doświadczenie pierwsze -R + N (n = 2)	-R-N (n = 2)
30	DW*	56,05± 28,5	90,89± 26,3	39,69± 6,3
	N**/	1,14± 0,5	2,67± 0,6	0,51± 0
50	DW	120,49± 27,8	257,56± 62,3	82,61±13,6
	N	2,26± 0,3	3,99± 1,4	0,66± 0,3
64	DW	244,78± 21,8	331,99± 5,8	72,21± 8,7
>6	N	3,03± 0,3	5,O1± 0,4	0,44± 0,1
DW	314,38±111,5	400,64± 83,2	117,53±44,6
	N	4,28± 1,3	6,56± 2,1	0,69± 0,2
97	DW	431,47± 68,5	666,71± 60,3	117,0±54,2
	N	5,19± 0,7	7,52± 1,4	0,6± 0,2
115	DW	523,49± 38,6	668,55± 13,4	82,96± 3,2
	N	5,98± 1,2	9,94± '3,5	0,42± 0,1
124	DW	565,11± 23,2	700,77± 79,4	113,^^12,3
	N	8,15± 0,4	11,43± 1,9	0,67± 0

152 604 cd. tabeli 12

Doświadczenie drugie

+ R-N	-R + N	-R-N
(n = 4)	(n = 2)	(n=2)

54	DW N	158,85+ 36,3 3,59+ 0,5	304,91+ 72,3 7,46+ 0,8	90,30+12,4 0,51+ 0,1
71	DW	447,88+ 83,1	705,64+ 37,0	89,54+23,0
	N	6,28+ 1,2	12,48+ 1,9	0,54+ 0,2
80	DW	513,37+120,7	871,57+205,5	117,04+ 2,6
	N	7,61+ 1,1	12,15+ 2,4	0,71+ 0,1
92	DW	903,53+ 25,6 11,81+ 0,45	1128,85+166,4 14,56+ 1,89	131,18+11,8 0,72+ 0,1

^x) DW - Sucha masa ^xxł Azot

Rośliny w doświadczeniu pierwszym rosły w suboptymalnych warunkach, jeśli chodzi o oświetlenie. Wyniki przedstawione w tabeli 11 wskazują, że sucha masa roślin + R-N wynosi około 82% wartości otrzymanej w przypadku roślin -R + N, a zawartość azotu roślin +R-N wynosi około 80% wartości otrzymanej w przypadku roślin -R + N.

Na pięciu odmianach jęczmienia, Jenny, Taarn, Lina, Grith i Triumph wywołano powstanie brodawek przy użyciu Rhizobium hordei jak uprzednio opisano w próbie B. Badano zawartość azotu wyrażoną jako mg azotu /górną część rośliny i suchą masę/ górną część rośliny. Wyniki przedstawiono w tabeli 13.

Tabela 13

Dni	Zawartość azotu i suchej masy w jęczmieniu z brodawkami
mg/roślinę -	Doświadczenie pierwsze i
+ R-N	-R + N	-R-N
(n=10)	(n = 5)	(n = 5)
31	DW	43,85+ 9,2	71,84+ 21,7	19,15+ 5,2
	N	0,99+ 0,2	2,15+ 0,9	0,27+ 0,1
50	DW	121,53+ 28,7	224,95+ 44,5	35,40+ 4,2
		2,56+ 0,5	4,03+ 1,3	0,41+ 0,1
64	DW	198,41+ 50,7	269,92+ 36,8	41,87+ 7,1
	N	2,61+ 0,5	4,05+ 1,1	0,35+ 0,1
76	DW	301,04+ 56,1	296,76+ 76,9	49,58+ 4,8
	N	4,09+ 0,6	5,22+ 2,9	0,61+ 0,3
96	DW	499,23+106,9	506,33+106,5	55,19+15,7
	N	5,34+ 1,4	9,90+ 1,2	0,35+ 0,1
123	DW	535,47+123,7	556,38+124,3	64,10+11,5
	N	5,55+ 1,1	10.34+ 3,7	0,44+ 0,1
			Doświadczenie drugie
		+ R-N	-R + N	-R-N
		(n = 6)	(n—3)	(n = 3)
54	DW	118,89+ 20,6	264,84+ 38,4	49,76+11,8
	N	3,30+ 0,4	7,78+ 0,7	0,45+ 0,1
71	DW	313,06+ 46,1	405,53+120,8	53,49+ 9,9
	N	5,81+ 0,6	7,78+ 0,8	0,41+ 0,1
80	DW	711,29+279,6	617,75+ 94,3	68,42+ 2,6
	N	7,85+ 1,2	10,26+ 2,4	0,53+ 0,1
92	DW	802,30+147,3	837,08+196,4	57,07+19,5
	N	10,08+ 1,6	11,99+ 1,6	0,46+ 0,2

Jęczmień z brodawkami powstałymi pod wpływem Rhizobium rósł do tej samej wielkości i wartości suchej masy, co rośliny traktowane normalnym azotowym nawozem sztucznym. Zawartość azotu w jęczmieniu + R-N wynosiła około 83% wartości otrzymanej w przypadku roślin -R + N i była dwudziestokrotnie wyższa od zawartości azotu w roślinach -R-N. Azot badany w roślinach -R-N pochodził z nasion i jego ilość nie zwiększała się w okresie wzrostu.

152 604

Należy zauważyć, że wpływ transkoniugantów Rhizobium jako substytutu azotowego nawozu • sztucznego jest zależny od działania małych brodawek, obecnych na 75% roślin. Ponieważ hodowano 3-5 roślin /pojemnik nie było możliwe oddzielenie kprzeni i badanie tylko roślin z brodawkami. Należy przyjąć, że powstanie brodawek na 100% roślin i rozwój dużych brodawek będzie działać jeszcze skuteczniej.

W celu wyeliminowania możliwości, że rośliny niemotylkowe z brodawkami -bR-N mogą wykorzystać inokulum Rhizobium, lub bakterie, które mogą później rozmnażać się w pojemnikach, jako źródło azotu, przeprowadzono następujący eksperyment.

Pszenicę, odmiana Cornette i jęczmień, . odmiana Taarn inokulowano R. leguminosarum szczep Ml, stosując to samo postępowanie, ilości i warunki, co opisane w odniesieniu do inokulowania tych roślin niemotylkowych transkoniugantem Rhizobium, odpowiednio, R. tritici lub R. hordei. Rośliny inokulowano R. leguminosarum, nawadniano nieazotowym nawozem sztucznym i akumulację azotu porównywano z akumulacją w roślinach -R-N. Ani rośliny inokulowane R. leguminosarum, ani rośliny -R-N nie akumulowały azotu. Wniosek jest taki, że niespecyficzne inokulum bakteryjne samo z siebie nie dostarcza roślinom nawozu azotowego. W przeciwieństwie do tego, akumulacja azotu widoczna w tabelach 12 i 13 w odpowiedzi na wywołanie powstania brodawek przez, odpowiednio, R. tritici lub R. hordei, musi być zależna od wiązania azotu.

Na odmianach sorgo, Dabar, Safra i Feterita wywołano powstanie brodawek przy użyciu Rhizobium sorghi jak uprzednio opisano w próbie C. Badano zawartość azotu, wyrażoną jako mg azotu/ górną część rośliny i suchą masę/górną część rośliny. Wyniki przedstawiono w tabeli 14.

Tabela 14

Dni	Zawartość azotu i suchej masy w - sorgo z brodawkami
	+ R-N (n = 6)	-R ± N (n = 3)	-R-N (n = 3)
30	DW	38,83± 10,1	49,60± 22,5	25,60± 4,2
	N	0,40± 0,1	1,42± 0,7	0,26± 0
59	DW	102,93± 15,2	329,51+ 87,7	42,84± 8,0
	N	l,00± 0,2	5,93± 2,3	0,31± 0
80	DW	179,84± 62,2	602,34± 44,9	43,77±21,5
	N	2,00± 0,8	9,86± 2,7	0,31± 0
101	DW	439,83± 95,8	576,18± 75,4 '	53,71±12,4
	N	4,40± 0,9	11,02± 0,9	0,31± 0
125	DW	1242,94±391,4	1198,99±596,0	56,76± 7,8
	N	11,65± 2,4	12,44± 6,8	0,27± 0

Na ryżu, szczep M-201 wywołano powstanie brodawek przy użyciu Rhizobium oryzae jak uprzednio opisano w próbie D. Badano zawartość azotu, wyrażoną jako mg azotu /górną część rośliny i suchą masę/ górną część rośliny. Wyniki przedstawiono w tabeli 15.

Tabela 15

Dni	Zawartość azotu i suchej masy w ryżu z brodawkami
mg/roślinę	±R-N	-R±N	-R-N
62	DW	32,28	48,87	23,44
	N	0,32	1,10	0,16
74	DW	48,04	94,73	21,63
	N f	1,15	2,65	0,16
98	DW	107,47	115,40	29,9
	N	2,91	3,45	0,36
128	DW	174,89	130,83	22,16
		5,16	4,33	0,38

Wyniki wskazują, że akumulacja suchej masy w roślinach + R-N początkowo opóźnia się i pozostaje niższa niż' w roślinach -R + N, tym niemniej przy końcu okresu eksperymentalnego akumulacja suchej masy w roślinach + R-N dorównuje i może przekraczać wartość odnoszącą się

152 604 do roślin -R + N. Akumulacja azotu w roślinach +R-N i roślinach -R + N jest mniej więcej taka sama.

Na 2 odmianach rzepaku, Hanna i Topas wywołano powstanie brodawek przy użyciu Rhizobium R1 010824 jak uprzednio opisano w próbie E. Badano zawartość azotu wyrażoną jako mg azotu /górną część rośliny i suchą masę/ górną część rośliny. Wyniki przedstawiono w tabeli 16.

Tabela 16

Dni	Zawartość azotu i suchej masy w rzepaku z brodawkami (n = 4)
mg/roślinę	+ R-N	-R ± N	-R-N
47	DW	67,25± 17,4	344,91± 31,6	9,71± 0,2
	N	0,89± 0,3	6,71± 0,1	0,22± 0,2
59	DW	99,40± 14,3	477,07± 62,8	13,90± 4,5
	N	1,64± 0,4	7,03± 0,2	0,11± 0,1
73	DW	248,56± 24,3	766,47± 72,7	14,92± 9,9
	N	2,00± 0,7	10,25± 1,9	0,10± 0,04
98	DW	424,80± 72,5	704,73±	12,11± 7,9
	N	3,42± 1,1	17,66± 5,1	0,10± 0,05
110	DW	547,37± 22,2	1049,77±388,6	17,86±12,1
	N	5,73± 1,9	24,33± 7,9	0,26± 0,2
129	DW	1013,59±241,81	955,60±330,0	15,39± 6,0
	N	10,24± 0,9	33,21± 8,6	0,16± 0,09
147	DW	2231,55	—	—
	N	16,66	—	—

Wyniki wskazują, że rośliny + R-N akumulowały około 50% suchej masy akumulowanej przez rośliny -R + N, a zawartość azotu w roślinach + R-N wynosiła około 30% zawartości w roślinach -R + N. Chociaż akumulacja była niższa niż w roślinach nawożonych azotem, małe brodawki obserwowane na rzepaku odpowiadają za przeżycie rzepaku z brodawkami w nieobecności azotowego nawozu sztucznego (porównaj wyniki odnoszące się do + R-N z odnoszącymi się do -R-N, gdzie ani sucha masa, ani azot nie był akumulowany).

Stosowane w powyższych próbach szczepy drobnoustrojów zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD i pod następującymi numerami rejestracyjnymi:

Rhizobium Nr rejestracyjny

R. tritici 53407

R. hordci 53404

R. sorghi 53405

R. oryzae 53406

R. Ri (010824) 53563

R. eu (081324) 53562

Poniżej przedstawiono przykłady preparatów zaprawy nasiennej według wynalazku.

Przykład I. Zaprawa nasienna do nasion pszenicy.

Substancję czynną zaprawy stanowi równoobjętościowa mieszanina ekstraktów z trzech roślin niemotylkowych, fasoli, białej koniczyny i Leucaena leucocephala. Ekstrakty wytwarza się ekstrahując rozdrobnione części zielone roślin 80% wodnym roztworem etanolu, w obecności roztworu soli o pH 7,2 (NaCl 7,2 g/litr, NaHsPCU 1,4 g/litr, K2HPO4 0,4 g/1), odsączając substancje stałe i dializując przesącz wobec wody destylowanej. Mieszaninę ekstraktów łączy się z wodą zawierającą siarczan wapniowy i otrzymuje się zaprawę do nasion pszenicy o następującym składzie:

Mieszanina ekstraktów 10% objętościowych wagowych CaSO4 0,18%

Woda reszta

Przykład II. Zaprawa nasienna do nasion jęczmienia.

Zaprawę wytwarza się jak w przykładzie I i o takim samym składzie jak zaprawa z przykładu I, lecz jako substancję czynną zawiera ona równoobjętościową mieszaninę ekstraktów z fasoli, grochu i Leucaena 1.

152 604

Przykład III. Zaprawa nasienna do nasion sorga.

Zaprawę wytwarza się jak w przykładzie I i o takim samym składzie jak zaprawa z przykładu I, lecz jako substancję czynną zawiera ona równoobjętościową mieszaninę ekstraktów z łubinu, lucerny i Leucaena 1.

Przykład IV. Zaprawa nasienna do nasion ryżu.

Zaprawę tę wytwarza się jak w przykładzie I i o takim samym składzie jak zaprawa z przykładu I, lecz jako substancję czynną zawiera ona równoobjętościową mieszaninę ekstraktów z koniczyny czerwonej, lucerny i Leucaena 1.

Przykład V. Zaprawa nasienna do nasion rzepaku.

Zaprawę tę wytwarza się jak w przykładzie I i o takim samym składzie jak zaprawa z przykładu I, lecz jako substancję czynną zawiera ona równoobjętościową mieszaninę ekstraktów z fasoli, lucerny i Leucaena 1.

Przykład VI. Zaprawa nasienna do nasion rzepaku.

Zaprawę tę wytwarza się jak w przykładzie I i o takim samym składzie jak zaprawa z przykładu I, lecz jako substancję czynną zawiera ona równoobjętościową mieszaninę ekstraktów z fasoli, koniczyny czerwonej i Leucaena 1.

Przykład VII. Zaprawa nasienna do nasion eukaliptusa.

Zaprawę tę wytwarza się jak w przykładzie I i o takim samym składzie jak zaprawa z przykładu I, lecz jako substancję czynną zawiera ona równoobjętościową mieszaninę ekstraktów z grochu, lucerny i Leucaena 1.

Claims

Zastrzeżenie patento we

Zaprawa nasienna do nasion roślin niemotylkowych, zwłaszcza roślin należących do rodziny Poaseae, takich jak pszenica, korzystnie szczep Anja, Kraka lub Vuka, jęczmień, korzystnie szczepu Hasso, Cerise, Harvy lub Igri, sorgo, korzystnie szczepu Safra, Dabar lub Feterita i ryż, albo roślin należących do rodziny Cruciferae, takich jak kapusta i rzepak, albo roślin należących do rodziny Myrtaceae, takich jak eukaliptus zawierająca substancje aktywne i znane środki pomocnicze, znamienna tym, że jako substancje aktywne zawiera wodno-alkoholowe niezdenaturowane ekstrakty pochodzące z co najmniej trzech różnych roślin motylkowych będących gospodarzami Rhizobia macierzystych względem transformanta Rhizobium symbiotycznie wiążącego azot w tej roślinie niemotylkowej.

--R-N

Fig 1 _,R-N

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł