PL155858B1 - Method of obtaining transconjugants of rhizobium and seed dressing based thereon - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	OPIS PATENTOWY	155 058
Patent dodatkowy do patentu nr---	Int. Cl.5 C12N 15/87
		A01N 63/00
	Zgłoszono: 86 12 30 /P. 275228/	C12R 1/41
	Pierwszeństwo 85 12 30 Dania
URZĄD		ΟΖΠΕΠ'Ι.ί
PATENTOWY	Zgłoszenie ogłoszono: 88 01 07	OGÓLNA
RP	Opis patentowy oρuililoatnr:1992 07 31

Twórcy wyrnlazku: Sven E. Nielsen, Grete M. Soerensen

Uprawniony z patentu: Nielsen Sv en-Erik, Hinnerup /Dania/;

Soerensen Grete Moerch,

Hinnerup /Dania/

SPOSÓB WYTWARZANIA TRANSKONIUGANTÓW RHIZOBIUM

Przedmiotem wrnlazku jest sposób ytwazania transkoniugantów Riizobium. Transkoniuganty Rhizobitmi używa się do wyywoania powstawania brodawek np. u traw /rodzina ^ooceae/, w tym pszenicy, Jęczmienia, sorgo i ryżu oraz Brassica /rodzina Cruciferae/, takich jak rzepak.

Podstawowym aspektem metabolizmu roślin jest użycie azotziióów lub innych nieorganicznych związków azotu w syntezie związków organicznych, takich jak aminokwasy, białka, chlorofil, witaminy, hormony i alkaloidy, zasadniczych dla wzrostu i rozwoju rośliny. Chociaż rośliny absorbują azotany i inne związki azotowe z gleby, ostatczzyym źródłem azotu jest walny azot cząsteczkowy /N2/ z atmosfery. Tym niemniej walny azot cząsteczkowy musi zostać związany z przekształcony w postać, która może być zużyta przez roślinę.

Biologiczne wiązanie azotu cząsteczkowego /częściej przytaczane jako biologiczne wiązanie azotu/ jest skomplikowanym procesem obejmującym stopniową redukcję wolnego azotu do amoniaku poprzez serie produktów pośrednich, przeprowadzanym przez wiążące azot drobnoustroje pewnych rodzajów wpółżyjących symbiotycznie z pewnymi roślinami naczyniowymi. Najważniejszym rodzajem symbiotycznych bakterii wiążących azot jest Rhizobitmi o licznych gatunkach, z których każdy współżyje. sympatycznie z jeinym, lub kilkoma ściśle pokrewnymi gatunkami roślin motylkowych, takich Jak groch, fasola, koniczyna, itp. V wyaiku tego rośliny motylkowe, w przeciwieństwie do roślin, które nie wiążą azotu, nie ^ymaa^ą do wrostu azotowych nawozów sztucznych, a nawet mogą wzbogacić glebę w azot. Z uwagi na ekonom.czne znaczenie wielu roślin motylkowych dostępne są kultury bakteryjne dp inoku-lowenia nasion roślin matylk-owych. Oprócz tego ujawniono nasiona roślin moOylkraych powleczone zaprawą zawiera jącą zdolny do życia Rhizobitmi /opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3499748 i 4149869/.

155 858

155 858

Symbiotyczne wiązanie azotu wymiga bakterii z rodzaju Rhizobium specyficznej wobec określonej rośliny motylkowej jako gospodarza; zakażającej korzenie rośliny moOylkowej-gospodarza. Następnie powsSają na korzeniach brodawki, w których ta bakteria żyje w stanie endosymhiotyeznym w postaci znanej jako bakterioid, spełniając unikalną funkcję, taką jak wiązanie azotu, w ścisłej współpracy z rośliną motylkową-gospodarzem i bakterioid zachowuje się prawie jak organelle. Interesujące jest, że Rhizobiim na ogół nie wiąże azotu z rośliny. Jeśli chodzi o przegląd różnych aspektów biologicznego wiązania azotu w roślinach motylkowych, patrz: ''Plant Gene Research. - Genes Involved in Microbe Plant Interactions, D.P.S. Verma,

T.H. Hohn, Springer-Verlag, Nowy Jork, 1984, rozdziały 3, 4 i 5.

Każdy z procesów: zakażenie, wpływanie powstawania brodawek, wiązanie azotu powoduje skomplikowane oddziaływanie wzajemne między Rhizobium a jego specyficzną,rośliną mooylkowągospodarzem. Jeśli ma zaistnieć początkowe zakażenie, Rhizobium i roślina motylkowa muszą rozpoznać się wzajemnie. Uraża się, że to bardzo specyficzne rozpoznanie wymaga oddziaływania między lektyną rośliny motylkowej-gospodarza /glikoproteina znajdowana na włośnikach korzenia/ a polisacharydami na powierzchni komórki bakteryjnej. To oddziaływanie można rozpatrywać jako mechanizm bardzo specyficznego typu dziurki i klucza, którego specyficzność można porównać do oddziaływania między antygenem a przeciwciałem, a bez którego zakażenie zajść nie może. Po specyficznym rozpoznaniu i przyrarciu Wiizobium do korzenia określonej rośliny mooylkowej-gospodarza zachodzi zakażenie gospodarza w sposób niepatogenny, kontrolowany przez odpowiedź gospodarza na wnikający Rhizobium. Ogólnie, Rhizobium wnika do rośliny motylkoraj przez włośnik! korzeniowe. Na inwazję bakteryjną wpływa kanalikowata struktura zrana nicią infekcyjną i utworzona przez roślinę gospodarza, która ogarnia komórki wew^trzne kory korzenia. Rhizobium zostaje uwlniony z nici infekcyjnej lecz pozostaje zamnńęty w osłonce błoniastej pochodzącej od gospodarza zranej błoną peribakterioidalną, tak więc bakterioidy zostają ograniczone do zewnątrzkomórkowych komór. Przerwanie tej delikatnej sekwencji przypadków może proradzić do zakażenia patogennego dla gospodarza.

Po zakażeniu rośliny mooylkowej-gospodarza przez Rhizobium, powstaranie brodawek zachodzi tylko w odpowiedzi na złożone oddziaływanie wzajemne przypadków, w których roślina strączkowa wpływa na ekspresję genów Rhizobium, a z kolei Rhizobium wpływa na aktywność genów rośliny ΐό^ΙΖ^^ wnmganych do wywwoania pows tara nia brodawek. Komórki w tkance brodawki są w wysokim stopniu zorganizowane w układach specyficznych dla rośliny. Bakterie są rutynowo znajdowane w błonach peribakterioidalnych, które wyłączają bakterie ze stref epidermalnych i merystemalnych. Organizacja i morfologia brodawki jest biochemicznie znacząca w tym, że problemy dyfuzji muszą być rozwiązane pod względem zapewnenia wnikania tlenu i składników pokarmowych dla bakterioidu, a wychodzenia amoniaku dla rośinny-gospodarza. Cechą charakterystyczną brodawek skutecznie działających, to jest brodawek, które aktualnie wiążą azot, jest obecność leghemoglobiny, białka wiążącego tlen, które, jak się okaziuje, jest związane z oddychaniem, w brodawce /to jest wysokie stężenie tego białka ułatwia dyfuzję tlenu do domen bakterioidu/, oraz z ochroną nitoogenozy /enzym zasadniczy w szlaku metabolicznym wiązania azotu/ przed zatruciem przez nadmiar tlenu. Leghemóklobina jest oczywiście prawdziwym produktem symbiotycznym - białka globinowe kodowane są przez geny rośliny, a do syntezy hemu przyczynia się bakteria.

Ostatecznie, symblotyczne wiązanie azotu, które zachodzi w brodawce, Jest wynikiem łącznego dążenia. Bakterioidy zawierają układ do wiązania azotu i roślina motylkowa jako partner asyó-luje amoniak wrtrarzony w postaci organicznej, który zostanie następnie użyty do odżywianie całej rośliny i bakterioidu, natomiast roślina ta dostarcza odpowiedniego otoczenia i źródła energii umożliwiającego bakterioidowi wiązanie azotu. W całym tym procesie wiele elementów mogło pójść w złym kierunku: jeśli roślirtóigospodarza i bakteria zostaną źle dobrane, zakażenie będzie nieskuteczne i cały proces powstawania brodawek i symhiotycznego wiązania azotu nie zajdzie-. Dalej, pomyślne powianie brodawek nie oznacza koniecznie zachodzenia wiązania azotu, ponieważ powssała brodawka może być defekl^y^wna.

155 858

Podczas symbiotycznego wiązania azotu indukowane specyficznie są dwie główne grupy produktów genowych gospodarza, leghomoglobiny i noduliny. Podczas gdy struktura i funkcja leghemoglobiny w brodawkach jest względnie jasna, niewiele jest wiadomo o nodulinach. Interesujące jest, że w ostatnim artykule doniesiono, że leghemoglobinowe, roślinne sekwencje DNA wykryto w roślinach niemotylkowych, co sugeruje, że geny tych białek wiążących tlen mogą byó bardziej rozpowszechnione, niż pierwotnie myślano [ Hatton i Johnson, Plant Mol. Biol.,

4, 285 - 292 /1985/7.

Kilka lat temu odkryto, że geny Rhizobium niezbędne do powstawania brodawek /nod/ są umiejscowione w dużym plazmidzie /zwanym plazmidem symbiozow^/, który niesie również geny wiązania azotu /nit/. Stwierdzono już, że wiele bakterii z rodzaju Rhizobium można indukować do rozpoznawania nowej rośliny mooylkowej jako partnera przez przeniesienie do tego Rhizobium symbiozowego plazmidu z innego gatunku z rodzaju Rhizobium o odrębnej specyficzności wobec gospodarza. Nie mi obecnie wskazówek, że przeniesienie symbiozowych plazmidów Rhizobium z jednego gatunku z rodzaju Rhizobium do innego może rozszerzyć zakres gospodarzy o rośliny niemotylkowe. Interesujące jest, że przenieśienie symbiozowego plazmidu Rhizobium do Agrobacterium tumefaciens /bakteria, która powoduje nowotworowy rozrost rośliny zwany guzowatością korzeni/ nadaje Agrobacterium zdolność wywlLywnia powstawania brodawek korzeniowych u roślin niemotylkowych, tym niemniej brodawki są defektjwne pod tym względem, że nie wiążą one azotu /Hocyhaas w Mooecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, wyd. A. Puhler, Springer-Verlag, Nowy Jork, 1983, strony 229 - 239,/.

Przez kilka lat ukazywały się różne dowody, że skuteczność bakterii z rodzaju Rh-z^ium w wywoływaniu powstawania brodawek u roślin motylkowych zwiększa się w wyniku ekspozycji na rozmite w/dzzeliny roślinnie. Prawdopodobnie ekspozycja ta stymuluje gen nod. Wyyzieliny korzeni wszystkich roślin motylkowych wykują ten efekt, ale wyzieleny z różnych roślin niemotylkowych nie wywoują tego.

Rodzaj bakterii, nie będących bakteriami Ρά^^ΐ^, zwany Frankia jest symbiotyczny wobec niektórych naczyniowych roślin niemotylkowych, takich jak Alnus /olsza/, Casuarina /rzewnia/, Ceanothus, Bleagrajs, Myyica i Psychotria /tropikalna roślina drzewiasta/. Doniesienie na podstawie danych dotyczących kojarzenia in vitro Rhizobium i układu - hodowli komórek tytoniu, wskazuje, że niektóre rośliny niemotylkowe mogą dostarczyć czynników, które Rhiiob:ium może użytkować Z Gibson i wsp., Planta 128, 233 - 239/ /1976/7, tym niemniej nie wskazano lub nie obserwowano specyficznego rozpoznawania, symbiotśCi.ilj zależności lub specyficznego oddziaływania. I rzeczywiście, jedyny znany przykład, poza rzędem strączkowych, stabilnej symbiozy .między rośliną nasienną niemotylkową a Rhiiobium, odnosi się do Parasponia, tropikalnej dużej rodziny Malayan /wiązowte/. Wytępiujące w naturze szczepy wyizolowane w AiBst^a^l^ii wywoują, jak stwierdzono, powstawanie brodawek i wiązanie azotu w Parasponia /Trinick, NewPhyytl., 85, 37 - 45 i 86, 17 - 26 /1980/, Trinick, Current Persolotives in Nitrogen Fixation, wyi. Gibson i wsp., Bls^ier Press, 1981, str. 480, Trinick i wsp., Arch. Microbiol. 108, 159 - 166 /1976//, patrz również Bender i wsp., Plant Science 38, 138 - 140 /1983/7.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania transkoniigantów F₂ Rhiilbium, które symbiotycznie wiążą azot w roślinach niemotylkowych, zwłaszcza należących do rodziny Poaceae, takich jak pszenica, korzystnie szczepu Anja, Kraka lub Vuka, jęczmień, korzystnie szczepu Hasso, Cerise, Havry lub Igri, sorgo, korzystnie szczepu Safra, Dabar lub Feterita i ryż, albo roślin należących do rodziny Cruciferae, takich jak kapusta i rzepak, albo roślin należących do rodziny Myr^dae, takich jak eukaliptus polega na tym, że rozprowadza się pierwszy maierzysty Rhizobium i drugi mcierzysty Wiizobium w naprzemiennych rzędach na stałym podłożu odżywczym zawierającym oprócz składników odżywczych niezbędnych dla wzrostu nie zderaturowany ekstrakt z rośliny molylkowel-gospod3ric będącego partnerem danego McieΓZłttego Rhizobium, albo frakcje chromaografimie pochodzące z nie zdunaturwanego ekstraktu z rośliny

155 858 notylkowej-gospodgrza będącego partnerem danego mcćerzystego Rhizobium, albo kryształy otrzymane z frakcji chromaograficznych pochodzących z .nie zdenaturowanego ekstraktu z rośliny mooylkowee-gospodarza będącego partnerem danego maacerzystego Rhizobium, albo białka odpowiadające temu ekstraktowi, tya frakcjom chromatografćzzym lub tym krysztaoom, prowadzi się hodowlę maćerzystych Rhizobium w temperaturze od około 18°C do około 30°C tak, że macierzyste Rhizobium tworzą kolonie o charakterystycznej barwie, vwrbiera się kolonię transkoniuganta Rhizobium o barwie mecznobiałej, która rośnie między koloniami maaierzystych

Rhizobium, rozprowadza się transkoniuganty F-j Rhizobium w naprzemiennych rzędach w trzecim macierzystym Rhizobium na podłożu odżywczym z pierwszego etapu, zawierającym dodatkowo ekstrakt z rośliny moj^^Lkow^jj, frakcje chromaograficzne, kryształy albo białko bdpoweadające trzecemu maierzystemu Rhizobium, po czym prowadzi się hodowlę transkoniuganta F^ Rhizobiua i trzeciego maieΓzystegb Rhizobium w temperaturze od około 18°C do około 30°C tak, że Rhizobium tworzą kolonie i wbiera się śnieżnobiałą kolonię transkoniuganta F2 Rhizobium, która rośnie między transkoniig;antem F^ Rl-iizoM-m i trzecim mcierzystym Rhizobium.

Jak użyto w niniejsyym opisie, termin transformant Rhizobium jest zdefiniowany jako Rhizobium zawierający wprowdzony DNA, który można wytworzyć każdą z pewnej ilości metod, obejmujących, ale nie ograniczonych do transforucji /to jest zakażenia plazmidowym DNA/, transfekcji /to jest zakażenia wolnym DNA, fagów™ DNA lub wirusowym DN/, lub koniugacji /to jest przeniesienia kopiowanego plazmidu z jednej bakterii do innej/. Transformanty bakteryjne w^nżtk^,jące z koniugacji są podzbiorem tI^ί^ί^sbrmβr^^ι^e eZ;wI’zanyih sposobem według Wmlazku i określa się je mianem transkoniugantów.

Termin maierzysty Riizobium użyty w zaziejszym opisie zdefinóowany jest jako gatunek maćerzysty, który poddaje się koniugacji w celu wywożenia transkoniugantów Rhizobium, jak również jako gatunek Riizobium, z którego można w^obd^rfϊ'¹iⁿić plazmidy lub sekwencje DNA i użyć do tranfommowania Rhizobium w celu wywożenia tranformnantów Rhizobium sposobem wdług wmlazku.

Fig. 1 jest w^lkres^m przedstawiajązym zaw^artość suchej msy /A/ i zawrtość azotu /b/ w pszenicy zbieranej w różnych okresach od założenia uprawy. Przedstawione są trzy grupy pszenicy: pszenicy, w której transkoniuganty Rhizobium wywoaly powetanie brodawek /+R-n/, pszenica nawożona azotowy™ nawozem sztuczym, której nie pbtrakOewano transkoniugantami Rhizobiim /-R+n/, oraz pszenica, której ani nie potraktowano transkoniugantem Rhizobium /która nie miała brodawek/, ani nie potrą kowano azotwwm nawozem sztucznym /-R-N/.

Fig. 2 jest wkresem przedstaeiajązym zawrtość suchej msy /a/ i zawartość azotu /b/ w jęczmieniu zbieranym w różnych okresach od założenia uprawy. Przedstawione są trzy grupy jęczmienia: jęczmień, w którym transkoniuganty Rhizobium wywioały powstanie brodawek /+R-N/, jęczmień nawożony azotowym nawozem sztucznym, którego nie potrakowano transkoniugantami Rhizobium /+R-N/, oraz jęczmień, którego ani nie potraktowano transkoniugantami Rhizobium /który nie miał brodawk/, ani nie potrakowano azoteeym nawozem sztucznym /-R-n/.

Wynnaazek niniejszy dotyczy sposobu wywarzania tranformnantów Rhizobium, które wwoują powstawnie brodawk i wiążą azot w roślinch niemotylkowch· Rośliny niemotylkowe z brodawkami można uprawiać bez użycia azotowego nawozu sztucznego i mją one taką samą lub Wższą zawartość białka, suchej msy i azotu niż ich odpoweedaiki bez brodawek, nawożone z dodatkiem azotowego nawozu sztucznego. Słoma pozostała po zbiorze roślin niemotylkowch z brodawkami m również w^szą zawrtość azotu.

Bardziej szczegółowo, transfommanty Rhizobiim wtwrzone sposobem wieiług wmlazku są zdolne do wy^ływnia powttawnia brodawek w roślinach niemotylkowch wyrosłych z nasion powleczonych zaprawą nasienną specyficzną pod wglądem określonego trainsformanta.

W celu jasności opisu, wnnlazek Jest dyskutowany w następujących poniżej podrozdziałach w następującym porządku: /a/ transformanty Rhizobium, /b/ zapraw nasienne do nasion roślin ΡθιοΙζΙ^ζ^^^, /c/ ustalenie sympatycznego wiązania azotu w roś lirach zaemotylkowych, oraz /d/ rośliny niemotylkowe z brodawkami.

155 858

Wytwarzanie i identyfikację transfornantów Riizobiimi oparto na odkryciu, że każdy oddzielny gatunek Rhizobium, gdy rośnie poza jego rośliną i^^lkową-gospodarzem, na podłożu odżywczym, wytwarza kolonie o okreś^nym zabarwieniu, zapewnionym pzzez podłoże odżywcze zawierające, oprócz składników odżywczych istotnych do podtrzymania wzrostu bakterii, nie zdenaturowany ekstrakt pochodzący z rośliny mooylkowwj-gospodarza, będącego specyfizzyym partnerem tego gatunku Rhizobium. Zabarwienie kolonii można wykorzystać jako środek do identyfikacji określonego gatunku Rhizobium. I rzeczywiście, różne gatunki Rhizobium można hodować na podłożu odżywczym zawierającym mieszaninę nie zdenaturowanych ekstraktów z każdej rośliny moOylkowej-gosprdarza specyficznego dla każdego gatunku. Każdy gatunek utworzy kolonie o swoim charakterystycztym zabarwieniu.

Wynalazek niniejszy jest również oparty na dalszym odkryciu, że transfommanty Rhizobium, które mogą zakażać, wywływać powstanie brodawek i wiązanie azotu w roślirach niemotylkowych, tworzą kolonie o zabarwieniu śnieżnobiałym na podłożach odżywczych zawierających ekstrakty z roślin moOylkrw''th-gospodarzt będących partnerami rmacerzystych Rhlzobia transfommantu i że bakterioidy transformata wyizolowane z brodawki korzeniowej rośliny niemotylkowej i hodowane na zdefiniwwanym powyżej podłożu, zawierającym dodatkowo ekstrakt z rośliny niemotylkowej-gospodarza, będą tworzyć kolonie o zabarwieniu szarawym· Tak więc podłoża odżywcze dostarczają wględnie nieskomplikowanych środków do identyfikacji tΓansromπlιntów·

Podłoże odżywcze prwi.πnr zawierać składniki pokarmowe niezbędne do wrostu Rhizobium, w tym, ale bez ograniczenia do nich, jakiekolwiek z dobrze znanych źródeł wgla, azotu i soli, jak również witaminy z grupy B i prdstawrwe aminokwsy, takie jak L-alanina, L-seryna i L-tryptofan, które mogą być obecne w postaci pojedynczych aminokwasów, tΓÓjpeptydów lub oligopeptydów, itp. Składnik stanowiący ekstrakt z rośliny moylkowej jest użyteczny do identyfikacji gatunków Rhizobium, lecz nie jest niezbędnym składnikiem odżywczym dla Rhizobium, to jest gdy Rhizobium jest hodowany na podłożu odżywczym, które albo nie zawiera ekstraktu z jego rośliny mooylkowej-gospodarza, albo zawera ekstrakt zdenaturowany /np. wyjaławianie w autoklawie podłoży po dodaniu ekstraktu z rośliny motylkowej będzie denaturzyć ekstrakt/, kolonie będą się tworzyć, ale kolonia każdego gatunku Rhizobium będzie miała wfaźne zabarwienie·

W tablicy 1 poniżej wyszczególniono charakterystyczne barwy kolonii tworzonych przez różne gatunki Rhizobium rosnące na podłożu odżywczym zawierającym ekstrakt z rośliny mooylkowej-gospodarza będącego partnerem każdego z gatunków rozprowadzonych na płytce· Należy zauwżyć, że inkubacja podłoża użytego w przykładach ilustrujących wynlazek w temperaturze powyżej 32°C da w wyniku utworzenia kolonii o barwie czerwonej przez wzystkie Rhizobia dające kolonie, rosnące na podłożu. Jest to odwacalna zmiana barwy, dzięki której charakterystyczna barwa każdej kolonii powróci, gdy obniży się temperatura np. do jakiejś temperatury pomlędz^{y 18} a 50°^C.

Oprócz tego, można zmienić podłoże odżywcze przez dodanie cysteiny i fenyloalaniny z wytworzeniem kolonii o rozmaitych odcieniach charakterystycznej barwy danego gatunku.

Tablica 1

Barwa kolonii różnych gaturków Rhizobiira hodowanych na podłożu odżywczymi zawierającym ekstrakt z rośliny motylkowce-gospodarza będącego specyficznym plztneJem^x

r u	Rhizobiim	ł 1 ___L___	Partner	1 1 1	Barwa kolonii
1	1 1	2	“ Γ“ ł	3
r	R. cowpea	—”—f——— 1 1 1	Vigna /orzech ziemny, mimoza, akacja, leucaena/	i 1 1 1 _	szarawo-bruna t na
1	R. japonicum	i 1 ł	Glycin /soja/	1 1 i	czerwonawo-pomarańczowa
	R. ^gum^os-arum	1 |	^thyrus /groch/	i i	złotożółta
t		--.-4.— --		_1_

155 Θ5Θ

Tablica 1 c.d.

ł“	-------------------------- . 1 _ _	— L .	2	—r-. 1	_______________5____________
	R. lupini		Lupinus /łubin/	1 1 1 ___L_.	jasnożółta	______1
r	------------------------ R· meeUoti		Meeilotus /nostrzyk biały/	Γ 1 ł ł i	żółtawo-brunatna	______
t— - ς.	R. phaseoli	r---	Phaseolus /fasola/	---f-’ ł 1 _ —— —'	c i emioobiuni t na	1
	R. trifoli		Trifoiumi /koniczyna/	1 1 ł	jasnobrunatna	______I

kolonie inkubuje się w temperaturze poniżej 52°C /np. między ¹8 a 3O°C/ na podłożu odżywczym opisanym bardziej szczegóOowo w przykładzie I.

Ekstrakt z rośliny mooylkowej stosowany w podłożu odżywczym można wytworzyć z każdej części rośliny motylkowej gospodarza, w tym, ale bez ograniczenia do nich, z pędów, łodyg, korzeni lub nasion, przy czym ekstrakty z młodych pędów dają w wyniku ^moonienie reakcji barwnej. Ekstrakty z rośliny mooylkowej można wytworzyć przez podzielenie części rośliny na drobne cząstki, zhomogern.zowanie maeriału zmeerownego w etanolu z butanem o pH około 7,2 i osadzenie nierozpuszczalnego maeriału przez odwirowanie. S^i^a^rn^ttant można dializować wobec wody destylowanej aż do przejaśnienia, po czym można go ponowie odwirować. Całkowity proces prowadzi się w temperaturze 4°C w celu zminimalizowania rozkładu substancji roślńnnych.

Ekstrakt z rośliny mooylkowej można fraRconnować chromaoggaficznie metodą stanowiącą modyfikację metod: Allena i wp., Biochem, J., 131, 155 -162 /1973/, Allena i wsp., PEBS Letters 50/3/, 362 - 364 /luty 1975/, Gordona i wsp. PEBS Letters 24 /2/, 193 - 196 /sierpieró 1972/, Peornnsa i wsp. Planta 156, 568 - 572 /1982/ i Trowbridge^a, J. Biol. Chem.,

249, 6004 - 6012 /1974,/. Krótko metoda polega na chromtograficznym rozdziale ekstraktu z zastooowaniem kolumny ze stanowiącą pochodną galaktozy CH-Sepłhrose 4B /Pharmcia, Szwecja/ i DEAE - 52 /to'hhtmn/ jak następuje: /a/ Ekstrakt najpierw nanosi się na kolimnę ze stanowiącą pochodną galaktozy CH Sepharone 4B. Niezwiązane substancje usuwa się i odzyskuje przez przemycie kolumny buforem i zbieranie frakcji 5-mliliroovfch, które bada się spektrofotometrycznie pod względem absorbancji przy 280 nm. Przemy-wnie kontynuuje się aż do zaniku w wycieku znaczącej absorbancji. Frakcje wizujące absorbancje przy 280 nm łączy się i zachowuje do chromacograil na DEoA-52. Substancje, które zawiązały się ze złożem kolumny stanowiącym pochodną galaktozy Sepharose 4b eluuje się przez podanie na kolumnę 4% glukozy. Eluent zbiera się jako 5-mililiroowe frakcje, które również bada się pod względem absorbancji przy 280 nm. /b/ Frakcje zawierające substancje, które nie związały się ze stanowiącą pochodną galaktozy Sepharose 4B nanosi się na kolumnę DEAAe52, którą eluuje się najpierw przy pH 7,2, a następnie 9,2, zbiera się 5-mililiaoowe frakcje i bada pod względem absorbancji przy 280 nm. Frakcje stanowiące pik absorbancji przy pH 7,2 zbiera się i frakcje stanowiące pik absorbancji przy pH 9,2 również zbiera się. Te trzy rodzaje frakcji z określonej rośliny motylkowej - gospodarza, to jest frakcje eluowane glukozą, eluowane przy pH 7,2 i przy pH 9,2/ można połączyć i użyć zam^^t całkowitego ekstraktu w powyżej opisanych podłożach odżywczych. I rzeczywiście, składnik czynny z tych trzech rodzajów frakcji można wykrystalioować i przechowywać. Tych kryształów pochodzących z rośliny mooylkoiwj-gospodarza można użyć zamiast ekstraktu z rośliny motylkowej-gospodarza Jako składnika podłoży odżywczych do identyfikacji traniOommantóo Rhlzobium.

Chociaż nie czujemy się związani żadną teorią, frakcje chromtograficznj prawdopodobnie zawierają białko, a możliwe, że glikoproteiny. Powinowactwo ze stanowiącą pochodną galaktozy Sepharose 4b sugeruje, że prawdopodobnie co najmniej jedno z białek jest lektyną. Może to być ważne, ponieważ uwża się, że lektyny roślin mooylkowych są wżne przy poczettowym

155 858 rozpoznawaniu partnerów stanowiących Rhizobium. Z chwilą ustalenia sekwencji aminokwasów tych białek można je będzie wytworzyć metodami syntezy chemicznej lub technikami rekombinantowego DNA, stosując prokariotyczny lub eukariotyczny układ ekspresyjny gospodarz-wektor w celu ekspresji białek. Ekspresja białek w eukariotyzzyym układzie ekspresyjnym gospodarzwektor może być korzystna, ponieważ organizm eukariotyczny może przetwarzać białko w sposób bardziej podobny do białek występujących w naturze. Może to być specjalnie ważne, jeśli białkiem jest lektyna. Oprócz tego, zidentyfikowane białka można wyodrębnić ze źródeł innych, niż roślina mooylkow-gospodarz. Teoria ta nie wyklucza moożiwości, że w ekstrakcie mogą być zarar^-te inne czynniki, takie jak węglowodany, alkaloidy, hormony itp. i że mogą one być ważne jeśli chodzi o aktywność ekstraktu.

Chociaż powyżej opisane podłoża odżywcze umeOżiwiają dogodne badania w celu identyfikacji tranfoommantów, podjęto wstępną charakteryzację DNA transformania. Transformanty Rhizobium stebiotycznie wiążące azot w roślinach niemotylkowych mją, jak się okazuje, plazmidy, których nie ma w ImayeΓztsttch Rtu.zobia transkoniuganta. Interesujące jest to, że te plazmidy mogą zawierać sekwencje DNA odpowieelzialne za nowy zakres gospodarzy ϊήμ^μζ.^ Rhizobium

Metoda hodowli w naprzemiennych rzędach w celu wytwarzania transkoniigantów Rhizobium obejmuje co następuje. Dwa różne gatunki Rhizobium /generacja maćerzysta/ rozprowadza się w naprzemiennych rzędach na stałm podłożu odżywczym zawierającym oprócz składników pokarmowych istotnych dla wzrostu bakterii albo /a/ mesiαnizę nie idezaturoiaztyh ekstraktów z roślin motylkow^h-gospodarzy będących partnerami każdego z gatunków Rhizobium, /b/ trzy rodzaje frakcji chromtograficznych otrzymanych z każdej rośliny moOyliowii-gospodarza jak opisano powyżej, /c/ kryształy otrzymane z frakcji chromatograficznych z każdej rośliny moy!kowej-gospodarza, albo /d/ białka, /w tym glikopiO-teiny/ odpowwadające im. W dalszej części niniejszego opisu te składniki będą przytaczane jako ekstrakt z rośliny moylkowej, frakcje yhromtograSiczzi, kryształy lub białka. Każdy Imaieritstt gatunek Rhizobium tworzy kolonie o charakterystycznej barwie wzdłuż linii rozprowadzenia. Transkoniuganty Rhizobium /w niniejsyym opisie nazywane transkoniugantami Fj Rhizobium/ tworzą się między naprzemiennymi rzędami kolonii macierzystych. Transkoniuganty Fj Rhizobium, w przeciwieństwie do swoich orgazm mów mcyeritstyyh, tworzą kolonie o barwie m.ecznooiałej, nie wywoiuJą powstawania brodawek w żadnych roślirach.

Transkoniuganty Fj Rhizobium izoluje się z kolonii o barwie mleczno^a^j i prowadzi się ich hodowlę w naprzemiennych rzędach z trzecmm MCieritstye gatunkiem Rhizobium na stałym podłożu odżywczym iawίerajątye w dodatku do ekstraktów z roślin moOylioiych, kryształów lub białek użytych do wyprodukowania transkoniuganta Fj, trzeci nie idenatuΓOiazt ekstrakt z rośliny mooylkowsj, frakcje chΓO!mtograficzze, kryształy lub białka pochodzące z rośliny moOylioiej-gkspodarzα będącego partnerem trzeciego macerzystego gatunku Rhizobium. Transkoniuganty F₂ Rhlzobiim tworzą się między naprzemiennymi rzędami kolonii o barwie mlecznobiałej utworzonych przez transkoniugant Fj Rhizobium i zabarwionych kolonii utworzonych przez trzeci macerzysty Rhiioiiιm. Kolonie transkoniuganta F₂ Rhizobium identyfikuje się na podstawie śnieżnobiałego zabarwienia. Są one zdolne do zakażenia, wywikywnia powstawania brodawek i wiązania azotu w roślinach niemotylkowych wyfosłych z nasion pktrakOowαztyh i wysianych jak opisano w niziejitye opisie.

Identyfikacja i selekcja transkoniugantów Fj i F₂ Rhizobium wywarzonych Jak w^aj Jest możliwa z powodu użycia w^Pacjaliz^oiαntch podłoży. Po przeprowadzeniu każdego krzyżowania dwa rodzaje kolonii rozwijają się między rzędami krganZeπlów mαyerzysttyh /a/ kolonie o zabarwieniu stanowiącym mieszaninę barw kolonii mayerztsttyh, oraz /b/ kolonie o barwie mlecznobbałej transkoniugantów Fj lub kolonie o barwie śnieżnobiałej transkoniugantów F_2> Kolonie o zabarwieniu mieszanym zawierają Rto.zobia, które nie są stabilne, mogą one wywoływać powstawanie brodawek w roślinach motylkow'th-gospodaΓzach będących partnerami jednego i drugiego mccerzystego Rhiiobiue, tym niemniej tylko w jednej generacji. Innymi słowami,

155 858 bakterioidy odzyskane z brodawek każdej rośliny mooylkowj-gospodarza mogą wywoływać powtawanie brodawek tylko znowu w tej określonej roślinie mooylkow e-gospodarza. Transkoniuganty Fj z kolonii o barwie mlecznobiałej są stabilne, ale niezdolne do yy^w°oywania powstawania kolonii w żadnej roślinie. Niespodziewanie transkoniuganty F£ z kolonii o barwie śnieżnobiałej stanowią Rhizobium w stabilnej postaci, który może wywoływać powstanie brodawek i symbiotycznie wiązać azot w roślinach niernotylkowych.

W skład maaćerzystych Rhizobium użytych do wyty/wrzenia transkoniugantćw F2 może wchodzić trzeci gatunek Rbizobium, inny transkoniugant Fj i ewentualnie inny transkoniugant F£. Jeśli trzeci organizm macćerzysty obejmuje inny transkoniugant F^, to podłoża odżywcze będą zawera ć co najmniej cztery ekstrakty z rośliny mooylkowej, frakcje chro,maCograficzne, kryształy lub białka, to jest takie, które pochodzą z rośliny mooylkowwj-gospodarza, będącego partnerem każdego z dwóch maaierzystych Rhlzobia użytych do wyte^czania każdego z dwóch trans ko Nugatów F^. Jeśli trzeci organizm maderzysty obejmuje transkoniugant Fg, to podłoża odżywcze będą zawierać co najmniej pięć ekstraktów z rośliny mooylkowwe-gospodarza, frakcje chromatograficzne, kryształy lub białka, to jest takie, które pochodzą z rośliny mooylkowej-gospodarza będącego partneram każdego z dwóch maderzystych Rhizobia użytych do wytworzenia transkoniugat'ta F^, jak również z rośliny mooylkowee-gospodarza będącego partnerem każdego z trzech maierzystych Rhizobia, użytych do wywożenia transkotiugcnta F2.

Zastosowanie naprzemiennych rzędów z macerzystymi koloniami jest dogodnym podejściem do zagadnienia wyważania transkoniugantćw, tya niemniej można użyć jakiegokolwiek wzoru lub metody inokulowania w celu wywebanic wzrostu kolonii maderzystych w bliskości do innych, tak że może zajść koniugacja. Tak więc można użyć jako wzoru okręgów, elips, linii falistych lub spirannych·. Faktycznie na płytkach nożna rozprowadzić pewną ilość organLemóe maćerzystych w celu wywożenia pewnej ilości różnych ti^s^r^i^i^c^rL^ug^ć^r^-^ć^w na tej samej płytce.

Chociaż metoda hodowli w naprzemiennych rzędach jest dogodnym sposobem wywrzania transfoΓecntów F2 Rhizobium, wmlazek niniejszy nie jest do niej ograniczony. I rzeczywiście, oprócz koniugacji, rozważana jest jako będąca w zakresie niniejszego wynnlazku transformacja odpowiednim plazmidem bdpoeiedziatny.e za wrost zakresu specyficzności Rhizobium wobec gospodarzy. Oprócz tego·, rozważane jest jako będące w zakresie niniejszego w/rnlazku użycie technik rekombitcttowego DNA, w tym użycie fagów lub innych wektorów z odpowiednimi sekwencjami do zakażenia Rhizobium.

Np. szczególnie użytecznym w odniesieniu do Rhizbbiue jest układ transpozonu Tn5, którego można użyć w schemcie mjącym na celu transformację Rhizobium. Syrabiozowy plazmid /plaz mid Sym/ można zidentyfikować przez hybrydyzację ze znakowaną sondą DNA zawierającą geny nif. Przeidesienie tego plazmidu Sym można przeprowadzić przez użycie Tn5 do wprowdzenia /a/ genu mrkerowego do plazmidu Sym, np. gen oporności na antybiotyk można wprowadzić do plazmidu Sym używjąc transpozonu Tn5 przez przeprowadzenie koniugacji bakterii dawcy i bakterii biorcy i selekcję hybryd na podstawie nabytej oporności /b/ przez klonowanie plazmidu Sym albo jego części w E.coli i transormmowanie Rhizobium plazmidem, /c/ przez rekombinację plazmidu z genami transporbelyei wspólnie z genem !]eckeroeym /np. oporności na antybiotyk, np. jak w przypaclku p^rwSJI iu^b ^5-^0^ oraz /d/ przez ^hybr^ydyzacj^{ę b}akterii zawierającej ^pl^azmid ^z wprowadzonym genem mrkerowym z bakterią biorcą jednocześnie z bakterią pomooniczą w celu promowania przeniesienia.

V celu ustalenia symbiozy z tΓansOoeelcttami Rhizobium wytworzonymi sposobem według wynalazku, nasiona roślin tieeotylkowyih trzeba trakoować lub powlekać zaprawą nasienną specyficzną pod względem tranfoomnantów Rhizobium. Takie zaprawy mogą zawierać, lub nie zawierać transformaniu Rhizoiiue jako takiego. Obecność lub nieobecność transformania Rhizobiim w zaprawie wpływa tylko na metodę stosowaną do późniejszego ustalenia symbiozy w uprawianej roślinie.

Można użyć pewnej ilości metod do zapewńenia zakażenia roślin tiemotylkoeych przez ti^s^r^^oomanty Rhizbbiue. Wybrana metoda częściowo zależy od charakteru użytej zaprawy nasiennej do nasion roślin nieeotylkoeych.

155 858

Np. nasiona roślin niemotylkowych potraktowane zaprawą nasienną, która nie zawiera transformantów Rhizobium, można nawodnić zawiesiną transformanta Rhizobium. Tak więc nasiona, siewkę lub roślinę można nawodnić odpowiednią objętością zawiesiny bakteryjnej. Gdy zaprawa nasienna zawiera transSornant Rhizobium, wyrmgane jest tylko sadzenie i nawodnienie.

Może być pożądane dodanie nieazotowego nawozu sztucznego, zależnie od typu rośliny, warunków w glebie lub terenie itp. I rzeczywiście, w eksperymentach laboratoryjnych stwierdziliśmy, że dodanie 2 rs azotu przy wrjścoown w^siewie nasion jest wystarcza jące do nasilenia początkowego wzrostu rośliny bez uszkodzenia lub wyłączenia transkoniugantów Rhizobium. To stymuluje ściślej naturalne warunki, ponieważ większość gleb, nawet bez nawozu, zawiera pewną ilość azotu /nie więcej niż 2 mi/ tak, że dodawanie azotu w wrunkach polnych nie jest wymagane.

Rośliny niemotylkowe, w których transforinanty Rhizobium wytworzone sposobem według wynalazku powtanie brodawek, mją zawaatość azotu i suchej msy równą lub wyższą niż ich odpowieddńki bez brodawek nawożone azotowym nawozem sztucznym. Rośliny z brodawkami rają wyższą zawrtolć azotu i suchej rasy, niż ich odpowiedrn.ki bez brodawek, których nie nawożono. Aralizy składu aminokwasowego roślin z brodawkami ujawnają, że w większości przypadków udział każdego aminokwasu pozostaje taki sam, ale zwiększona jest całkowita zawrtolć na rol lnnę. Tym niemnej, w niektórych przypadkach można zaobserwować wyższy udział tiyptofanu i leucyny.

Interesujące jest, co stwierdziliśmy, że słoma pozostająca po zbiorze pewnych gatunków roślin niemotylkowych konsekwennnie wskazuje zawatolć białka od około 6 do około 9%. Jest to uderzający kontrast z zawatością białto od 1,5 do 2% normanie znajdowaną w słomie odpowiedników bez brodawek. Korzystnie można zastosować tę słomę o wyooiej zaiwatości białla jako źródło białka, np. w mieszankach pokarmowych dla zwierząt, tak hodowlanych jak i domowych.

Transformanty Rhizobium, które wywoują powianie brodawek i wiązanie azotu w roślinach niemotylkowych, mogą zmnejszyć użycie kosztownego azotowego nawozu sztucznego i ostatecznie polepszyć glebę.

Moofologia brodawek u roślin niemotylkowych utworzonych przez transf ormanty Rhizobium wytworzone sposobem weiług wyiralazku jest zupełnie normlna, jeśli chodzi o wygląd, ale mnejsze brodawki tworzone są w wyższej propoorci. Okazje się, że Rhizobium wnika do korzenia przez nić infekcyjną i bakterioidy utrzmnywane są w zamkknętych komorach. Faktycznie, obserwuje się czerwonawą barwę w brodawce, co może być zależne od ^gi^raGo^h!^ lub ściśle spokrewnionego hiał^a. murnaKopia eiektronowa brodawki ujawnia, że wiązki naczyniowe zrnjw korze są rlokαlZśiwαne na obwozie, podczas gdy wiązki naczyniowe korzeni bocznych są centralnie zlśialrśowαne. Większość komórek w centralnej części jest ^ynełniora bakteriożdami.

Przykład I. Mater ały i metody do wywarzania transkoniuggantów Rhizobium I wywoływania powtarania brodawek w roHiiach niemotylkowych.

Naatępujące przykłady opisują wywływmie powwtarania brodawek przez transformanty Rhizobium w następujących rolinrach niemotylkowych należących do rodziny traw /Poaceae/: pszenica, jęczmień, sorgo i ryż. Oprócz tego gatunek rośliny z rodzaju B^ssics /rodzina Cruciferae/ nie należący do rodziny traw, również ulega wpływowi transoommantów RhiMbium według tinieOzzego wymJazku, wywoujących powtawade brodawek. Interesujące jest, że pozytywny efekt obserwowano u innej rośliny nie należącej do rodziny traw, eukaliptusa, który należy do rodziny Myy~tacean. V każdym przykładzie do wtwrzenia trans koni igant ów Wiizobium użyto metody hodowK w naprzemiennych rzędach. Nasiona roślin niemotylkowych powlekano przez zanurzanie nasion w ekstraktach z roślin mooylkowych specyficznych wobec określonego transkoniuganta Rhizobium użytego do wywoływnia powtawmia brodawek w rosUrach niemotylkowych.

155 S58

Powleczone nasiona roślin niemotylkowych zakażono transkoniugantami Rhizobium przez walanie powleczonych nasion, pozwlenie im na w^iełkownie i nawodnienie siewek zawiesiną transkoniugantów Rhizobium. Brodawki wiążące azot rozwijały się w ciągu 8-12 tygodni.

W przykładach przedstawiono badania laboratoryjne, w których rośliny niemotylkowe były podzielone na trzy grupy, potraktowane jak następuje: /a/ pierwszą grupę potraktowano transkoniugantem Rhizobium bez azotowego nawozu sztucznego /+R-N/, /b/ drugą grupę potraktowano azotowym nawozem sztucznym bez transkoniuganta Rhizobium /-R+N/, oraz /c/ trzeciej grupy nie potraktcwano ani transkoniugantem Rhizobium, ani azotowym nawozem sztucznym /-R-n/.

V różnych okresach wrc^^-tu pobierano próbki roślin i oznaczano całkowitą zawrtość organicznie związanego azotu na roślinę, ilość suchej masy na roślinę i w niektórych eksperymentach prowadzono badania połowę. Wyrdki dowodzą, że w każdym przypadku rośliny motylkowe z brodawkami, które powtały pod wpływem transkoniugantów Rhizobium, były zdolne do wiązania azotu i nie wyragały do wzrostu azotowego nawozu sztucznego. I rzeczywiście, w wielu przypadkach rośliny niemotylkowe z brodawkami /+R-N/ miały wyższą zawartość azotu i suchej misy niż albo nawożona grupa bez brodawek /-R+N/, albo grupa nie potraktowana /-R-n/.

Jeśli tego inaczej nie wskazano, materiałów i metod opisanych pordżej użyto w każdymi przykładzie, jak następuje.

1. Metoda hodowli w naprzemiennych rzędach

Metoda hodowli w naprzemiennych rzędach, stosowana w każdym z następujących przykładów, obejmuje następujące stadia. Dwa różne gatunki Rhizobium /generacja macerzysta/ rozprowadzano w naprzemiennych rzędach /oddalonych o 3 mm/ na podłożu z agarem odżywczym, zawierającym oprócz składniki pokarmowych niezbędnych do wzrostu nie zdenaturowany ekstrakt z każdej rośliny moOylitwej-aosptdaΓzg specyficznego wobec każdego macierzystego Rhizobium. Po inkubacji w temperaturze wzrostu poniżej 32°C, np. między 18 a 30°C, każdy racierzysty Rhizobium stworzył kolonie o barwie charakterystycznej dla tego gatunku. Trgnsktnluggnty Rhizobium /taanskoniuganty F-/ tworzyły się między naprzemiennymi rzędami zabarwionych kolonii imcierzystych. TΓgnskoniuaaity F^ Rhizobium, w przeciwieństwie do swoich organizmów imacerzystych, tworzyły kolonie o barwie m-ecznoobałej i nie wywoywrały powstawania brodawek w roślirach. Trzeba zaurażyć, że inkubacja w temperaturze powyżej 32°C na podłożu agarowym używanym w ninietzryz opisie daje w wyrn.ku tworzenia kolorni o barwie czerwonej przez wszystkie gatunki Rhizobium rozprowadzane na płytce, tym niemnńej, jeśli obniży się temperatury do wrtości poniżej 32°C /np. korzystnie między 18 a 30°c/, charakterystyczna barwa każdej kolonii pojawi się znowu.

Transkoniu^nty F- Rhizobium izolowano z kolonii o barwie m.e^c^c^nooić^atej i watowano, jak opisano, w naprzemiennych rzędach odległych o 3 mm, z trz^cmi mcierzystym gatunkiem Rhizobium, na agarowym podłożu odżywczym, zawierającym, oprócz nie zdenaturowanych ekstraktów z roślin motylkowych użytych do wytworzenia kolonii o barwie mlecznoo^lej, trzeci nie idengturoogny ekstrakt z rośliny zotylktwej-aospodarig specyficznego wobec trzeciego micierzystego gatunku Rhizobium. TΓgnsktniuaanty F2 Rhizobium tworzyły się między naprzemiennymi rzędami kolonii o barwie mlecznobbałej utworzonych przez transkoniuganta Fi Rhizobium a zabarwionymi koloniami utworzonymi przez trzeci imaierzysty Rhiitbiuz.

Kolonie transkoniuganta F2 Rhizobium zidentyfitowgnt na podstawie ich śnieżnobiałej barwy. Te tΓansktiiuagnty F2 były zdolne do zakażenia, wrootywonig powstawania brodawek w roślniach niemotylkowych i wiązania azotu, które potrą lutowano i hodowano jak opisano. Materiały i metody użyte do w^wrzenia transkoniugantów Rhiiobiuz opisano bardziej szczegółowo poniżej.

1.1. Izolowanie maacerzystych Rhizobia

Gatunki z rodzaju ^^zobi^um stosowane w charakterze g^eniBir^<^,ji imaćerzystej .zoIowno albo z próbek gleby» albo z brodawek rośliny mooylkowj o zaawansowanym stadimu! rozwoju.

155 858

Izolowanie macierzystego Rhizobium z gleby przeprowadzono przez umieszczenie nasion rośliny motylkowej-gospocdarza, w której pod wpływem Rhizobiim powtały brodawki., w próbkach gleby. Rośliny zebrano po 3 - 4 tygodniach /normanie/, albo po 10 - 12 tygodniach, jeśli rosły powooii.

Izolowanie mcćerzystych Rhizobia z brodawek roślin motylkowych przeprowadzono jak następuje. Brodawki odłączono od korzeni rośliny motylkowej waz z około 1 cm tkanki korzeniowej otaczającej brodawkę i wyjaławiano przez zanurzenie w 3% HgJl₂ oraz przemyto 80¼ etanolem. Następnie wycięto brodawkę z tkanki korzeniowej i rozdrobniono w moodzierzu w jałowych warunkach. Zmcerowany maeriał naniesiono na agarowe podłoże odżywcze poniżej opisane. Kolonie oczyszczono przez prowadzenie subkultury na podłożu o tym samym składzie do dwukrotnego utworzenia pojedynczych kolonii. RhLzobia intkuloeant z oczyszczonych pojedynczych kolonii rozprowadzono w naprzemiennych rzędach na agarowym podłożu odżywczym opisanym w odniesieniu do maderzystych kolonii Rhizobia hodowanych w naprzemiennych rzędach.

1.2. Agarowe podłoże odżywcze

Agarowe podłoże odżywcze stosowane do hodowli Rhizobia w naprzemiennych rzędach otryymywano przez dodanie do wody destylowanej w ilości 100 ml następujących składników odżywczych we wskazanych ilościach:

KH₂PO₄ 0,15 g K^PO₄ 0,15 g KNO3 2,50 g /NH4/2SO4 0,135 g MgS04.7H₂0 0,25 g Mannńt 10,00 g Agior 12,00 g Roztwór nr 1 1,00 ml Ekstrakt drożdżowy 5,00 m

Roztwór nr 1 miał następujący skład:

NaC ^.4^0 500 mg H3BO3 300 mg ZnS04.2H20 200 mg NaMoO₄ 20 mg CUSO4.5H2O 2 mg CaC 1₂'· 2 mg

Woda Zestytowaia do końcowej objętości 100 ml.

Nast^ępnie z^defin^towciE powyżej podłoże a^garowe wyjaławiano w ciągu 20 minut prz^{y 2}xlC)5p^a w autoklawie i oziębiono do temperatury między 55 a 60°C, przy której dodano następujące składniki: po 1 ml każdego z roztworu nr 2, nr 3 i nr 40, 20 ml każdego z nie zdenaturowanych ekstraktów z rośliny moylkowaj otrzymanych z rośliny yotylkowee-gospQdarza specyficznego wobec każdego mcierzystego Rhizobium, który mi być hodowany na podłożu, oraz 15 mg każdego z następujących aminokwasów: L-alamina, L-seryna i L-tryptofan. W celu uniknięcia zde^^^wania białek w ekstraktach z-roślin motylkowych, podłoże o ostatezny^m składzie nie powinno być wyjałowione w autoklawie.

Roztwory nr nr 2 - 4 miały skład podany poniżej. Każdy z nich otrymyeciO z zastosowaniem wody destylowanej.

Roztwór nr 2
Kwis nikotynowy	50	mg
Chlorowodorek tćamlny	50	mg
Chlorowodorek pirydoksyny	50	mg
Mioinozyt	50	mg
Biotyna	50	mg
Jaoowa woda destyOowaic do	końcowej objętości	100 m

155 858

Roztwór nr 3
Jodek potasowy	75	mg
Jałowa woda desty0owala	100	ml
Roztwór nr 4
CaCl2«H20	15	g
Jałowa woda destyoowana	100	ml

1.3. Ekstrakt z rośliny motylkowej

Ekstrakty z rośliny motylkowej stosowane w podłożu agarowymi i do zaprawy nasiennej do nasion roślin mooylkowych otrzymano jak opisano poniżej.

Całą roślinę lub wybrane części rośliny np. czyste przemyte korzenie, wyjaławiane nasiona lub części powietrzem, względnie korzystnie, młode pędy podzielono na drobne cząstki, rozdrobniono w mcódzieżu z 80% etanolem, w rzadką zhomogenizowaną pastę, do której dodano równą ilość solnego butanu potasowo-sodowego o pH 7,2, zawierającego następujące składniki:

K₂H^4 0,300 g

NaH₂P0₄ 1,360 g

NaCl 7,000 g

Jałowa woda destyoowana do końcowej objętości 1000 ml.

Mieszaninę zhomogenizowanego ekstraktu z rośliny i buforu odstawiono na 48 godzin w temperaturze 4°C i osad osadzono przez odwirownie przy 5000 x g w ciągu 30 minut. Następnie supernatant dialioowano wobec wody destylowanej w temperaturze 4°C w ciągu około 48 godzin. W ciągu tego czasu wodę zmieniano 5 do 6 razy, aż do otrzymania klarownego, bezbarwnego płynu, to jest; elcstrak-tu. ^Ekstra^kty przec^wywano w -temperaturze 4°C.

1.4. Izolowanie transkoniugantów Rcizobium

Gdy dwa maierzyste szczepy Rhizobium hodowano w temperaturze poniżej 32°C w naprzemiennych rzędach Odległych o 3 mm na agarowym podłożu odżywczym zawierającym ekstrakty z odpowiednich roślin motylkowych jak powyżej opisano, maacerzyste R!hLiobia tworzyły kolonie o charakterystizzyym zabarwieniu. Tym niemniej między rzędami zabarwionych kolonii macerzystych rozwijały się dwa typy kolonii: /a/ kolonie o zabarwieniu będącym mieszaniną barw mmaierzystych kolonii, oraz /b/ kolonie o barwie mlecznooiałej transkoniuganta F, Rhizobium. Proporcja między zabarwionymi koloniami a koloniami o barwie mecznooiałej transkoniuganta F, jest różna, ale średnio mieściła się w zakresie od około 100 : 3 /kolonie o mieszanym zabarwieniu: kolonie o barwie mlecznotiaaej/. Kolonie o mieszanym zabarwieniu powstawania brodawek z obydwu gatunków roślin moOylkooych-gospcciariy, ale tylko w jednej generacji, to jest Rhiioiia z kolonii o mieszanym zabarwieniu wtwtywołt powtawanie brodawek w roślinach 1^1kow'ChcgospodaΓzach będących partnerami obydwu macf^irzystych Rhizobia, lecz Rhiioiium odzyskany z brodawek każdej rośliny moOylkowej-gospodaΓia może wywc>ływać powstawanie brodawek znowu w tej tylko określonej roślinie mooylkowwj-gospodarza. W przeciwieństwie do tego transkoniu gant F, z kolonii o barwie y.ecznobiałej nie wywouje powstawania brodawek w żadnej roślinie.

Ponieważ trudne było podnieśienie pojedynczej kolonii hybrydowej na nowe podłoże bez zanieczyszczenia jej jedną lub większą ilością zabarwionych kolonii, przeprowadzono biologiczne oczyszczanie raz lub większą ilość -razy przez przeniesienie kolonii o barwie mlecznobiałej na inne podłoże agarowe /o tym samym składzie/ aż do otrzymania, typowo po 10 - 12 tygodniach, czystej hodowli transkoniuganta F-, o stabilyym i jednolitym mlecznobiałym zabarwieniu.

Czystą kulturę trarsskoniuganta F-, tworzącego kolonie o zabarwieniu mleczm/białym poddano następnie hodowli w temperaturze poniżej 32°C w naprzemiennych rzędach odległych o 3 mm z innym gatunkiem Rhiitbiuy na podłożu agarowym o tym samym składzie co użyte dla transkon^ganta F,, które zawierało dodatkowo trzeci ekstrakt z rośliny motylkowej otrzymany z rośliny mmoylkowee-gospodarza specyficznego wobec trzeciego maacerzystego gatunku Rhizobium. Transkoniugant F, tworzył charakterystyczne dla niego kolonie o barwie mlecznotiiłej, podczas

155 858 gdy macierzysty Rhizobium tworzył kolonie o charakterystycznej dla niego barwie. Dwa typy kolonii rozwinęły się między rzędami kolonii o barwie mlecznobiiłej a koloniami zabarwionymi. Kolonie o barwie śnieżnobiałej zawierają transkoniuganty F? Rhizobium, które mogą wywoływać powstawanie brodawek wążących azot u roślin niemotylkowych. Kolonie o barwie śnieżnobiałej transkoniuganta Fj oczyszczono i izolowano, jak opisano w odniesieniu do kolonii o barwie mlecznobiałej, użyto do w/y^oł;ywni.a powstawania brodawek w roślinach niemotylkowych.

Po wywooaniu powstawania brodawek u roślin niemotylkowych bakterioidy transkoniuganta Fg Rhizobim można izolować z brodawki i hodować na podłożu agarowym. Jeśli podłoże agarowe ma ten sam skład, co podłoże użyte do wytworzenia transkoniuganta /to jest podłoże agarowe zawńera trzy ekstrakty z rośliny motylkowej otrzymane z rośliny mooylkowej-gospodarza specyficznego wobec każdego macierzystego Rhizobium użytego do wytworzenia transkoniuganta Fg/ z dodatkiem ekstraktu z jego rośliny niemotylkowej-gospodarza, to transkoniuganty F? izolowane z brodawki rośliny niemotylkowej będą tworzyć kolonie o barwie szarawej.

2. Otrzymywanie nasion rośliny niemotylkowej.

Nasiona rośliny niemotylkowej powleczono przez trzykrotne zanurzenie w temperaturze ²0°C, każdorazowo w ciągu 3 ^godzin, w w>^dn^ym roztworze zawierającym 3% siarczan wapniowy i do 10% mieszaninę trzech ekstraktów z roślin mooylkowych, otrzymanych jak opisano w rozdziale 1.3., których użyto do w/tworzenia transkoniuganta F₂ Rhizobium. Po każdym zanurzeniu nasiona wysuszono na powóetrzu w temperaturze 40°C w ciągu 12 godzin.

3. Zateżenie roślin niemotylkowych transkoniugantami Fg Rhizobim

Zakażenie roślin niemotylkowych transkoniugantami Fg Rhizobium przeprowadzono przez wysianie powleczonych nasion roślin niemotylkowych i ^w)ćl^nii^i^i.e siewek po wykiełkowaniu zawiesiną transkoniuganta Fg Rlhizobium. W następujących przykładach prowadzono badanie laboratoryjne i połowę, w których siewki po wykiełkowaniu potrakoowano albo /a/ transkoniugantem Fg Rhizobium, bez nieorganicznego azotowego nawozu sztucznego /+R-N/, /b/ nieor£anizizyn azoowy^m nawozem sztucznym lecz transkoniuganta Fg Rhizobiim /-R+N'/, albo /c/ ani transkoniugantem Fg Rhizobium, ani nieorganicnnym azotawym nawozem sztucznym /-R-U'/. Oznaczono zawartość azotu na roślinę, suchą rasę i w niektórych przypadkach skład aminokwasowy powwtałych roślin.

Użyte maaeriały i metody są bardziej szczegóoowo opisane poniżej.

3.1. Badania laboratoryjne

W badaniach laboratoryjnych powleczone nasiona roślin nie-motylkowych wysiano w 1-l-itrwyzch pojemnikach /jydak Papir Vaerk, Arhus/ wyyełnionych 3 mm maaeriałem kli^kjerowym Fibo/R/. Wyyiano 4 do 5 ziaren na pojemnik. Maaeriał klinkierowy Fibo stanowi ziarnisty materiał porowaty z wypalaniem gliny o średnicy około 3 mm, którego normlnie używa się jako rnaaeriału izolacyjnego.

Gdy wykiełkowane nasiona wyrosną kilka cm ponad powierzchnię rnaaeriału klinkieoowego, siewki w każdym pojemniku nawadnia się jak następuje: /a/ grupę +R-N nawodniono 50 ml zawiesiny trarsskoni uga^a Fg Rhizobium, a następnie rośliny nawidniano raz na tydzień 50 - K) ml na pojemnik nieazotowego nawozu sztucznego, /b/ grupy -R+N nie potrakoowano transkoniugantem Fg Rhizobium, lecz zamiast tego nawadniano nieorganicnnym azooiwymi nawozem sztucznym, a następnie rośliny nawadniano raz na tydzień 50 - 80 ml na pojemnik tego samego nieorganicznego azotowego nawozu sztucznego, oraz /c/ grupę -R-N nawadniano 50 - 80 ml na pojemnik nieazotowego nawozu sztucznego. Nieorganiczny azotowy nawóz sztuczny i nieazotowy nawóz sztuczny, które zastosowano, zostały zdefinoowane w tablicy 2.

155 858

Tablica 2 Nawóz sztuczny

Roztwory macierzyste	ml roztworu nacierzysteggo/itr objętości końcowej
azotow	nieazotow
KH4NQ5 /1,0 m/	20	0
CaS04.2H20 /0,012 m/	65	65
kh2po4 /0,10 m/	20	20
MgS04.7H20 /0,20 I·’/	15	15
	r------------------	-----------------
Fe/SDTA/:
FeS04.7H20 /2,490 g/	10	10
NagEDTA /3,176 g/
Objętość końcowa 1 litr
Mr£C3.4H2Q/lQ7,1 m/l/	10	10
HąBQą /142,2 mggl/	10	10
ZnS04.7H20/110,7 ingA/	10	10
CuS04.5H20/8,0 ragA/	10	10
Na2Mo04.2H20/ll,l ingA/	10	10

r

Zawiesinę transkoniuganta F₂ Rhizobium, których użyto do nawadniania siewek otrzymano przez hodowlę transkoniuganta F? w 300 ml butli zawierającej 200 ml następującego podłoża odżywczego:

KH2PO4	1,0 g
K2^04	1,0 g
MgS04.7H20	0,36 g
CaS04<2H20	0,17 g
FeCl5.6H20	0,005 g
KNQ	0,7 g
Ekstrakt drożdżow	1,0 g
	3,0 g

Woda destyoowana do końcowej objętości 1000 ml.

Bakterie todowano w temperaturze ²8°C przez dwa <io trzec^{h d}ni ^do osⁱągni^ęcj.ó ^gęstości bakterii w hodowli mierzonej spektrofotometrycznie jako QDggQ wynoszącej 0,8, 00 wskazuje, że bakterie znajdowały się w logarytmicznej fazie wzrostu i hodowla nie osiągnęła fazy stacjonarnej. Następnie komórki osadzono przez odwirowanie przy 5000 x g w ciągu 30 minut i przemyto przez ponowne zawieszenie w jałowej wodzie. Przemywnie powtarzano raz lub dwa razy w celu usunięcia z komórek bakteryjnych wzystkich związków azotowych. Końcowy osad komórek zawieszono ponowiie w 1,8 litra jałowej wody. Tej końcowej zawiesiny bakteryjnej użyto do naiwdniania siewek roślin niemotylkowych.

3.2, Badania połowę

W badaniach polowych powleczone nasiona roślin niemotylkowych wsiano do gleby, która nigdy nie była uprawiana. Grunt oczyszczono i podzielono na poletka o szerokości 9,15m i długości 27,45m.

155 858

Nasiona wsiano tylko na naprzemiennych poletkach /to jest nie posiany grunt pozostawał między poletkami na których wsiano nasiona/ w celu zapobieżenia wyługowywniu chemiikaii z jednego poletka oraz wnikanie ich i zanieczyszczaniu innego poletka. Na poletku nasiona wysiano w 6 rzędach. Każdy rząd był oddzielony od innych /152,4 cm/ i nasiona w każdym rzędzie były wysiane w odległości 20_f32 cm.

Każde poletko zaw^iało jedną z następujących grup /a/ grupę +R-N potrakoowano transkoniugantem ?2 Rhizobium i nawadniano pierwotnie zdefiniowanym nieazooowym nawozem sztucznym, /b/ grupy -R+N potrakoowano transkoniugantera F2 Rhizobium, a zamiast tego nawadniano uprzednio zdefinówa^i^y^m nieorganicznym azoornym nawozem sztucznym, oraz /c/ grupę -R-N nie potraktowano ani transkoniugantera F2 Rhizobium, ani nieorganicznym azo^twiy^m nawozem sztucznym, a zamiast tego nawdniano nie^a^i^ctowy^m nawozem sztucznym.

Do zakażenia grupy +R-N transkoniugantem F2 Rhizobiim użyto następującego sposobu: hodowlę transkoniuganta F2 wprowadzano 10,16 cm poniżej poziomu, na którym każde ziarno zostało zasiane. Siew i wrowdzenie do gleby przeprowadzono za pomocą maszyny z 1364 litowym zbiornikiem zawierającym zawiesinę transkoziuganta F₂ Rhizobium, otrzymaną jak uprzednio opisano. W znacznie większej skali /to jest transkoniugant· F₂ Rhizobium hodowano do fazy lo^garytmicznej w tanku o objętości ⁴5»⁴⁶ cm³ i rozcirnczono ^do °g₂₀ ⁰»⁸/. Okoł^{o 1,5} d /ziarno/ hodowwi transkoniuganta F2 Rhizobiim w^rowidzano do głębiej położonej warstwy gleby. Następnie nasiona i siewki nawadniano jak opisano.

4. Protokół analizy suchej misy, zawatości azotu i zawartości białka w roślinach niemotylkowych z brodawkami

Okresowo pewną ilość pojemników z każdej grupy roślin w badaniach laboratoryjnych przesadzano do trzech roślin /pojemnik i pobierano do analizy metodą Kjeldahla, w której oznaczono całkowitą zwrtość organicznie związanego azotu i ilość suchej masy /pojemnik/ to jest na 3 rośliny/. Do tego celu pobierano powietrzne części roślin, suszono w ciągu 48 godzin w temperaturze 80°C, ważono, kruszono i rozdrabniano w moodzieżu. Próbki zmcerowanego mideriału pobierano do analizy metodą Kjeldahla, którą prowadzono w zwykły sposób. Każdą analizę Kjeldahla powtarzano 4-6 razy. Wyyżki zarejesrrwwano jako wartość wgową azotu i wrtość wagową suchej masy na roślinę. wszystkich przypadkach rośliny, na których pod wpływem Rhizobium powstały brodawki miały wyższą zawartość suchej masy i azotu niż rośliny nawżone azotem albo grupa nie potraktowana.

W badaniach potowych okresowo zbierano pewną ilość roślin i oznaczano białka na roślinę najpierw oznaczając zawrtość azotu na roślinę za pomocą analizy Kjeldahla, a następnie miożąc procent azotu przez czynnik 6,25. W pewnych badaniach oznaczano skład am.nokwasowy białka. We wszystkich przypadkach rośliny niemotylkowe na których pod wpływem Rltozobium poiwtały brodawki miały w^szą zawiłość białka, niż rośliny potraktowane nieorganicznym azoOiiym nawozem sztucznym i rośliny potraktowane niid^zoOiιym nawozem sztucznym.

Przykład II. Rhliobiue tritici wy kujący powtawnie brodawek na pszenicy.

Rhizobiim tritici wywoujący powtawanie brodawek na pszenicy wytworzono metodą opisaną w przykładzie I, najpierw przez skrzyżowanie R.ptoseoli z R. crwpia le^aema w celu wytworzenia transkoniuganta F-,, który następnie skrzyżowano z E. trifoli. Tak wytworzonego Rhizobium tritici użyto do wywoania powstawania brodawek na 4 typach pszenicy: An ja, Kraka, Vuka i Williams.

1. WytwiαzaI·n.e Rhiirbiue tritici

Do wywożenia R. tritici użyto następujących macerzystych Rhiirbia w celu wrtiwrzenia kolonii o barwie ιώβοζηοΠβ!^ tΓaitikoniuganta F.j: /a/ R. phaseoli, izolowany z fasoli, odmiana hodowlana Prospektor, rosnącej w próbie gleby znalezionej blisko Aarhos, MS-1 i /b/

R. cowpea leoksend izolowany z tropildlnego drzewa ^^αϋα leucocephala /należącego do rodziny Fabaceae/, Papus, Nowa Gwinea.

Maaierzyste Rhizobia hodowano w naprzemiennych rzędach na podłożu agarowym uprzednio opisanym. Ekstrakty z roślin motylkowych, stosowane w podłożu, wywarzono odpowiednio, z po16

155 858 wietrznych części fasoli i z liści Leukaena leucocephala. Kolonie tworzono przez R.phaseoli miały charakterystyczną ciemnobrurmtną barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R.cowpea leucaena miały charakterystyczną barwę szarawobrunatną.

Transkoniugant Rhizobium otrzymany z kolonii o barwie mlecznobiałej oczyszczano i hodowano w naprzemiennych rzędach, jak opisano, ze szczepem R.trifoli, który izolowano z koniczyny łąkowa.], rosnącej w próbce gleby znalezionej w pobliżu Randers. Ekstrakty z roślin motylkowych, stosowane w podłożu wytworzono z powietrznych części fasoli, liści leucaena leucocep hala i powietrznych części koniczyny łąkowej. Kolonie tworzone przez transkoniugant F·, miały mlecznobiałą barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R.trifoli miały charakterystyczną jasnobrunatną barwę·.

Transkoniugant F-, Rhizobium otrzymany z kolonii o barwie śnieżnobiałej wytworzonych między rzędami, nazwany w niniejzzym opisie Rhizobium tritici, oczyszczono i izolowano jak opisano·. Zabrało to mniej więcej 20 tygodni, a następnie użyto transkoniuganta F2 do wywoływania powstawania brodawek na pszenicy.

2. Wywoojy/anie powstawania brodawek na pszenicy pod wpływem Rhizobium tritici Rhizobium tritici użyto do wywoania powstawania brodawek na czterech typach pszenicy: Anja, Kraka, Vuka i Willimms·. Nasiona pszenicy potraktowano przez trzykrotne zanurzenie w roztworze wodnym uprzednio opisanym, zawierającym 3% siarczanu wapniowego i do około 10% ekstraktów z roślin motylkowych·, których użyto do w/^worzenia R.tritici, to jest trzy ekstrakty z roślin motylkowych użyto do powlekania nasion otrzymano z powietrznych części fasoli, liści Leucaena leucocephala i powietrznych części koniczyny łąkowej·. Po każdym zanurzeniu nasiona wysuszano na powietrzu i wysiano, jak poniżej opisano.

2.1. Badania laboratoryjne

Protokół eksperymentalny uprzednio opisany zastosowano do trzech typów użytej pszenicy: Anja, Kraka i Vuka, to jest 4 do 5 powleczonych nasion wysiewano do 1 litrowych pojemników wypełnionych maeriałem klinkierowyy Fito i pozostawiono do w/kiełkownla. Każdy z trzech typów pszenicy podzielono na następujące trzy grupy: /a/ +R-N, siewki w tej grupie nawadniano 50 m zawiesiny R. tritici otrzymanej jak uprzednio opisano, a następnie nawadniano co tydzień ^Bazoo^ym nawozem sztucznym, /b/ -R+N, siewki w tej grupie nie zostały potraktowane R. tritici, lecz nawadniano Je nieocenionym azotowym nawozem sztucznym, oraz /c/ -R-N, siewek w tej grupie nie potrakoowano ani R. tritici, ani nieogarnionym azotowym nawozem sztucznym, a zamiast tego nawadniano je nieazotowym nawozem sztucznym uprzednio opisanym. Na roślinach potraktowanych R.tritici rozwinęły się brodawki korzeniowe w ciągu 8 do 10 tygodni. Rośliny w każdym pojemniku przerzedzono do trzech roślin i w każdej grupie użyto dziesięciu pojemników do analizy suchej masy i zaiwrtości azotu.

2.2. Badania połowę

W badaniach polowych powleczone nasiona pszenicy w/siano jak opisano w przykładzie I, rozdział 3.2. Nasiona z grupy /a/ +R-N potraktowano, jak opisano, zawiesiną R.tritici i nawadniano tieazoOowym nawozem sztucznym, z grupy /b/ -R+N nie potraktowano R.tritici, lecz nawadniano nieorganicznym azotoiym nawozem sztucznym i z grupy /c/ -R-N nie potraktowano ani R. tritici, ani tieor£rnCoyym azo0ovym nawozem sztuonym i po prostu nawadniano ni«^;azoowy^m nawozem sztucznym.

3. Araliza suchej misy, zaw^tości azotu i zawrtości białka w pszenicy z brodawkami Użyto metod analitycznych opisanych w przykładzie I rozdział 4. w celu scharakteryzowania pszenicy bez brodawek.

3.1. Wyynki badań laboratoryjnych

Pszenicę zebrano z pojemników po 56, 70, 87, 100 i 118 dniach po zasianiu, suchą masę na roślinę i zawartość azotu na roślinę /analiza Kjoldahla/ analirowanr jak uprzednio opisano.

Wy-yniki przedstawiono na fig. 1, w której suchą masę na roślinę /A/ i zawartość azotu na roślinę /b/ przedstawiono w zależności od ilości dni po zasianiu.

155 858

W celu ułatwienia zrozumienia figury pomocna będzie tablica 3 podająca informację doty czącą średniej w^agi suchej msy i średniej zawartości azotu w trzech typach pszenicy.

Tablica 3

] Pszenica	----- 1 1 1 ł	Sucha msa /100 nasion /g/	ł 1 1 ł	Azot/ziarno /mg/	I 1 1 ł ___4
t Anja	i 1 1	4,403	ł 1 1	i, 103	1 I ł
* Kraka	1 1	3,611	ł 1	0,869	1 1
! Vuka	1 i	4,052	1 ł |	0,819	1 1 |
	-------i—		____1____		1

W tablicy 4 przedstawiono liczbę zebranych roślin.

Tablica 4

Liczba zebranych roślin w różnych okresach czasu wynosła:

τ---------------------------[ Ilość zebranych roślin

Grupa roślin	1 ł 1 1 1 I	Dni po posianiu i
56	I ł 1	70	T ł 1 1-	87	ł ł ł .1 .	100	118 }
Doświadczenie pierwsze:		ł 1 1 1		ł ł 1 ł		1 ł 1 ł		ł ł 1 1
+R-N		ł 1	33	ł ł	30	ł 1	21	ł ł	23	25
-R+N		ł t	24	ł ł	30	ł i	20	1 ł	21	20
-R-N		1 1 _ 1	24	1 ł 1	26	ł I ł	22	1 1 .. J	26	35
Doświadczenie drugie:		ł i t 1		1 ł 1 ł		ł ł 1 ł |		ł ł 1 ł
+R-N		ł ł	11	1 ł	10	1 ł	7	ł ł	8	8
-R+N		ł ł	8	1 ł	10	ł ł |	7	ł ł	7	7
-R-N		1 ł ł	8	ł ł I	9	ł 1 ł	7	ł ł ł	9	12

Wyniki przedstawione na fig. 1 wiązują» że w czasie wrostu pszenica potraktowana RlhLzobium miała wrższą zawrtość azotu i suchej msy, niż pszenica nawożona azotem i przy zakończeniu eksperymentu sucha msa w roślinach +R-N była prawie o 40% niż w roślinach

-R+N, a obydwie te kategorie wykazyrały w^zą ragę niż pszenica -R-N- nie potraktowana.

3.2. Wy-yj-ki badań polowych

Pszenicę w badaniach polowych zebrano po jełnjm sezonie wzrostu i zawrtość białka na roślinę analioowano jak opisano uprzednio. Wyyi.ki przedstawione w tablicy 5 Jasno wykazują, że rośliny potraktowane R. tritici /+R-N/ miały wrźszą zawrtość białka niż albo grupa potraktowana nieorganizznym azotowym nawozem sztucznym Z-R+N, albo grupa potraktowana nieazotowm nawozem sztucznym /-R-N/.

Tablica 5

Zawartość białka w nasionach, pszenicy/roślinę w przeliczeniu na suchą msę

Grupa roślin	ł 1	Zawrtość białka w nasionaclh/roślinę !
	+R-N	ł 1 l	22 - 26%
	-R+N	ł I	12 - 14%
	-R-N-	ł ł 1	brak danych

x brak danych - te nie potraktowane rośliny obumirły po 8 tygodniach

155 858

Przykład III. Rhizobium hordei wałujący powstawanie brodawek na jęczmieniu Rhizobium hordei wjywoujący powstawanie brodawek na jęczmieniu wytworzono metodą opisaną w przykładzie I, najpierw przez skrzyżowanie R. phaseoli z R. Ieguminosarum w celu wytworzenia transkoniuganta Pj, który następnie skrzyżowano z R. cowpea leucaena. Tak wytworzo-nego Rhizobium hordei użyto do wywoenia powstawania brodawek na czterech typach jęczmienia: Hasso, Cerise, Harry i Igri.

1, Wytwarzanie Rhizobium hordei

Do wrtwrzania R. hordei użyto następujących maierzystych Rhizobia w celu wytworzenia kolonii o barwie mecznooiałej tΓanskłliugrntα F^ /a/ R. phaseoli, izolowany z fasoli, odmiana hodowlana Prospector, rosnącej na próbce gleby znalezionej blisko Aorhus i /b/

R.Ieguminosarum izolowany z groszku ogrodowego.

Maaierzyste Rhizobia hodowano w naprzemiennych rzędach na podłożu agarowym, uprzednio opisanym. Ekstrakty z roślin motylkowych, stosowane w podłożu, wytworzono, odpowwieinio, z części powietrznych fasoli i groszku ogrodowego. Kolonie tworzone przez R. phaseoli miały charakterystyczną ciemnobrunatną barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R.leguminosam miały charakterystyczną barwę złotożółtą.

Transkoniugant F-, otrzymany z kolonii o barwie mlecznobiałej oczyszczono i hodowano w naprzemiennych rzędach, jak opisano, ze szczepem R. cowpea leucaena, który izooowano z tropikalnego drzewa Leucaena lencocephala. Ekstrakty użyte w podłożu, z roślin motylkowych, wywarzone, odpowiednio, z lapowyetzznych części fasoli, groszku ogrodowego i z liści Leucaena lencoceptola. Kolonie tworzone przez transkoniugant Fj miały Mecznobbałą barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. cowpea leucaena miały charakterystyczną szaΓayobruπatlą barwę.

Transkoniugant Fg otrzymany z kolonii o barwie śnieżnobiałej w^wrzonych między rzędami, nazwany w ninlejzzym opisie Rhlzobi^am hordei, oczyszczono i izolowano jak opisano. Transkoniugant Fg użyto do wywoyiwnia płystrwania brodawek na jęczmieniu.

1.1. Charakterystyka Rhizobiim hordei

Plazmidowy DNA z trzech szczepów Macerzystych transtoniuganta F^ i transkoniuganta Fg /R.hordei/ wyodrębniono stosując mooyyikację metody Hirscha i wsp. /j.Am. Microbiol. ¹²0, 405 - ⁴¹² A9K)/ ^J, ktora otojmuje wywinie liz^{y R}hizł^bium przez iα^łozłczną tokutoację w temperaturze 4°C w 40% siarczanie słdłwo-dłdecyOyiym /SDS/ i wt^:łdębnlenie plazmidowego DNA za pomocą elektroforezy w 0,% żelu agarowym. ^Wydki tej analizy ujawniły, że R.hordei miał dodatkowe plazmidy o niskiej rasie cząsteczkowej, których nie obsewooyanł w trzech racierzystych Rhizobia lub transtoniugancie F^.

2. '.Wywoływane powstawania brodawek na jęczmieniu pod wpływem Rhizobium hordei Rhizobium hordei użyto do wywoenia powstawania brodawek na czterech typach jęczmienia: Hasso, Cerise, Igri i Harry. Nasiona jęczmienia potraktwano przez trzykrotne zanurzenie w roztworze wodnym uprzednio opisanym, zawierającym 3% siarczan wapniowy i do około 10% ekstraktów z roślin motylkowych, których użyto do wtórzenia R.hordei, to jest ekstrakty z roślin motylkowych użyte do powlekania nasion, otrzymano z powietrznych części fasoli, groszku ogrodowego i liści Le^acna lencocephala. Po każdym zanurzeniu nasiona wy^suszono na powietrzu i wysiano jak opisano poniżej'.

2.1. Badania laboratoryjne

Protokół eksperymentalny uprzednio opisany zastosowano do trzech typpów użytego jęczmienia, to jest 4 do 5 powleczonych nasion wysiewano do 1 lirowego pojemnika wypełnionego mteriaeem klilktizływym Fito i pozostawiono do w/kiełkownia. Każdy z trzech typów jęczmienia podzielono na następujące trzy grupy: /a/ +R-N, siewki tej grupy nawadniano 50 M zawiesiny R. hordei otrzymanej jak uprzednio opisano, a następnie nawdniano co tydzień nieazotowm nawozem sztucznym, /b/ -R+N, siewki tej grupy nie zostały potraktowane R. hordei, ale naw^(d^:iano je nieoΓganiZlnyra azotowym nawozem sztucznym, oraz /c/ -R-N, siewek tej grupy nie potraktowano ani R. hordei, ani nieorganicznym rzotyw^rm nawozem sztucznym, a zama^^t

155 858 tego nawadniano je nieazotowym nawozem sztucznym. Na roślinach potraktowanych R. hordei rozwinęły się brodawki korzeniowe w ciągu 8 do 10 tygodni. Rośliny w każdym pojemniku przerzedzono do trzech roślin i w 'każdej grupie użyto dziesięciu pojemników do analizy suchej trasy i zawatości azotu.

3. Arnliza suchej masy, zawrtości azotu i zawartości białka w jęczmieniu z brodawkami Użyto metod analitycznych opisanych w przykładzie I, punkt 4 w celu scharakteryzowania jęczmienia z brodawkami.

3.1. Wyriiki badań laboratoryjnych

Rośliny zebrano z pojemników po 59, 71, 85, 108, 128 dniach po zasianiu. Suchą masę na roślinę i zawartość azotu na roślinę /analiza Kjeldahla/ analizowano jak uprzednio opisano

Wyynki przedstawiono na fig. 2, w której suchą rasę na roślinę /a/ i zawrtość azotu na roślinę /b/ przedstawiono w zależności od ilości dni po zasianiu.

W celu ułatwienia zrozumienia figury pomocna będzie tablica 6 z informacją dotyczącą średniej wagi suchej rasy i średniej zawiłości azotu w każdym typie jęczmienia.

Tablica6

	------1	Sucha rasa /100 nasion /g/	Ί	Azoo/ziarno /mg?/ [
	Jęczmień
	Hasso		3,922		0,732 !
	Cerise		4,217		0,792 j
	Igri		3,932		0,775 !
	Harry		5,068		0,826 J
1____		______		__1

Liczbę zebranych roślin w różnych okresach czasu podano w tablicy 7.

	T a b	lic	a	7
	i 1	Liczba	zebranych roślin
	1 1 1	Dni	.22.	posianiu							- _l
Grupa roślin	1 1 1	59		! 71 1	1 1 1	83	ł 1 1	108	ł 1 t	128
				1’—			•T		---γ--
Dośwwadczenie pierwsze:	1			1 1	1 1		1 ł		1 1
+R-N	t 1	23		! 23	1 1	27	1 ł	31	1 I	37
-R+N	1 1	17		'1 14	1 1	30	1 1	23	ł 1	40
-R-N	1 1 1	14		! 18	1 1 1	28	1 1	20	I 1 1	32
Doświadczenie drugie	i I			1 1	“1· 1 1		— t 1		1 1		“•““1
+R-N	1 t	8		! 8	1 1 1	9	1	10	1 1	12
-R+N	ł 1	6		' 5	ł 1	10	1 1	8	1 1	13
-R-N	I 1 t	5		! 6 1	1 I I	9		7	1 1 t	11

WyD^ki przedstawione na fig. 2 wkazują, że w,czasie wzrostu rośliny potraktowane Rhizobium miały wyższą zawartość azotu i.suchej rasy niż rośliny nawożone azotem i przy zakończeniu eksperymentu sucha rasa w roślinach +R-N była prawie o 18 - 22% wysza, niż w roślinach -R+N, a obydwie te kategorie wykazywały w^szą wgę niż jęczmień -R-N potraktowany nierzogw^ym nawozem sztucznym.

4. Wzbogaaenie jęczmienia z brodawkami w

Jęczmień inkuOowang w obecności atmosferycznego N, a następnie części rośliny bada, 15 no pod względem zawartości N traktując to jako wslkźnik wiązania azotu. Bardziej szczegółowo jęczmień /roślinę/ w wieku 95 dni, z rałymi brodawkami, umieszczono w ten sposób w koić morze, że korzenie inkubowano w obecności atmosferycznego N w ciągu 23 godzin. Atmosfera w komorze korzeniowej zawierała 80% N2 /w czym stanowił 12,85 At %/ i 20% O2. Po okre20

155 858 sie inkubacji próbki analizowano pod względem zawartości N i całkowitej zawartości azotu w roślinie, którą oznaczono metodą Kjeldahla. Vfyniki przedstawiono w tablicy 8 poniżej.

Tablica 8

	-η
	Części rośliny	1 t	Zawartość azotu	w częściach jęczmienia	z brodawkami
	ł 1 ... . . 1	Sucha imasa /g/	1 1 -----U	N i	Całkowity /mg/
	Korżenie	I 1 1	0,448	1 1 |	8,9 '1	3,99
	Pędy	1 1	1,017	ł 1	7,5 !	7,63
	Cała roślina	1 1	1)465	1 1	7,93 !	11,62
		1 1 1	-------------— Zawrtość N w	częściach jęczmienia z	brodawkami
	Części rośliny	1 1 1	Liczba próbek	’ ’ Γ ł 1	At % 15N X
	Korzenie	1 t 1	4	i 1 i	0,450 + 0	,011
	Pędy	1 1 1	3	1 1 1	0,392 + 0	,003	i
	x zawartość 15N	w powietrzu atmosferowym wnosl	około	0,370 At %.

Dane z tablicy 7 Wiązują, że tak korzeń jak i pędy jęczmienia z brodawkami zawierają 15 znacznie więcej N niż atmosfera. Wyniki te wskazują, że w jęczmieniu z brodawkami zachodzi wiązanie azotu.

5. Moofologia brodawek jęczmienia

Przeprowadzono badianie pewnej ilości dużych brodawek w mikroskopie elektonowym, co obejmowło badanie ultracienkich przekrojów poprzecznych barwionych octanem uranylu i cytrynaanem ołowiu. Układ komórkowy brodawek jęczmienia był taki sam Jak układ, o którym doniósł Newcomb [ Can. J. Bot., 54, 2163 - 2168 /1976/_7 w odniesieniu do brodawek grochu, to jest wiązki naczyniowe były znajdowane w obwodowej korze, podczas gdy centralna część brodawki była zajęta przez komórki roślinne wy>ełnione bakterioidami.

Dalsze badania przeprowadzone z użyciem mikroskopu świetlnego i mikroskopu elektronowego /skanńngowego i prześwietlającego/ dotyczyły powierzchni miłych brodawek jęczmienia. Obserwowaną moofologię porównano z moofologią dotyczącą grochu, koniczyny białej i soi. Małe brodawki jęczmienia były widoczne po osiągnięciu przez rośliny około 50 dni wzrostu i powstały na około 75 % roślin /obserwację tę uczyniono również w stosunku do pszenicy/.

Duże brodawki jęczmienia iaobseiiz>iano po 89 - 110 dniach wzrostu. Były one rzadkie, ale wyraźne, mały około 2 - 4 mm długości, średnica wynośla 1 - 2 mm i wstępowały na głównych korzeniach przy umiejscowieniu około 2 - 6 cm poniżej pozycji starego ziarna. Jednocześnie z trzynastu dużych brodawek miało, po przekrojeniu - zabarwienie czerwono-brunatne we^rz, to jest takie samo zabarwienie jak leghemoglobina w brodawkach roślin motylkowych w wieku około 20 - 35 dni. Co do pozostałych przekrojonych dwóch dużych brodawek, jedna rnsała barwę białą i w/g^l.ądała jak młoda niedojrzała brodawka rośliny mooylkowej, a druga Piała barwę zieloną, tak jak starzejąca się brodawka rośliny moOylkoiej. Prawdopodobnie zakażenie jęczmienia następuje w dwóch stadiach. W stadiim pierwotnym R. hordei wnika do korzenia, ale nie wywwouje odpowiedzi polegającej na powstawniu brodawek. W następnym stadiim zaczyna się powstawanie brodawek po okresie opóźnienia.

6. Oporność w^a.izl^zwainch bakterioidów jęczmienia na antybiotyki

Bakterie wyizolowano z dużych brodawek jęczmienia i badano pod względem oporności na antybiotyki. Były one oporne na iwichlorzwodorek spektynomycyny w stężeniu do 400 /ug/ml. Transkoniugant F2 R. hordei pierwotnie użyty do zakażenia jęczmienia /to jest inokulent/ wykazuje tę samą odporność. Tak inokulent jak i w^i.izlowaie bakterie tworzą nieprzezroczyste kolonie o barwie białej przy rnrc^ś(^i.e na zwykłym agarze drożdżowz-maniiZiwym.

155 858

Jeden z mcierzystych organizmów transkoniuganta F? R.hordei jest również oporny na dwuchlorowodorek spektynomycyny w tym samym stężeniu. Tym oi^^anżm^^m maierzystym jest R.leguminosarum szczep MA.1, który tworzy nieprzezroczyste jasnożółte kolonie przy wzroście na zwykłym agarze drożćżoowo-mannitouym. Gen oporności na spektynomycynę nie przynależy do plazmidu Sym, tak więc transkoniugant Fg R.hordei jest, jak się okazuje hybrydą zawierającą niesymbiozowy plazmid lub główny chromosom macerzystego organizmu R. leguminosarim MA1. Nie wyklucza to jednak mo01iwotci, że transkoniugant F^ R. hordei może rówiież mieć plazmid Sym z MA.

Przykład IV. Rhizobium sorghi wywoujący powstawania brodawek na sorgo

Rhlzobi^im sorghi wywoujący powta^nia brodawek na sorgo wytworzono metodą opisaną w przykładzie I, najpierw przez skrzyżo^nie R.lupini z R.cowpea leucaena w celu wywarzenia transkoniuganta Fj, który następnie skrzyżowano z R. meliloti. Tak wywarzonego R.sorghi użyto do wydania powtania brodawek na trzech typach sorgo: Safra, Dabar i Feterita.

1. Wytarzanie Rhizobium sorghi

Do wywożenia R. sorghi użyto następujących maieΓitstych RłhLzobia w celu wytworzenia kolonii o barwie mecznoobiałej transkoniuganta Fj: /a/ R. lupini, izolowany z łubinu znajdowanego w centralnej Jutlandii i /b/ R. cowpea Ι^ποποβ, izolowany z tropikalnego drzewa Leucaeor lluctcphalr /należącego do rodziny Fabaceae/, Papua, Nowa Gwinea.

Maacerzyste hodowano w naprzemiennych rzędach na podłożu agarowym, uprzednio opisanym. Ekstrakty z roślin m^ylkowych, stosowane w podłożu wywarzano odpowiednio z łubinu i z liści Liuccioc leucoceptala. Kolonie tworzone przez R.lupini miały charakterystyczną jasnożółtą barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R.cowpic Ii^uccioc miały charakterystyczną szarawo-brunatną barwę.

Transkoniugant Fj otrzymany z kolonii o barwie m-ecznobbałej oczyszczono i hodowano w naprzemiennych rzędach, Jak opisano, ze szczepem R.meeiloti, który izotooaot z lucerny znajdowanej w Stahr. Ekstrakty z roślin eettlktwych stosowane w podłożu wywarzono z łubinu, liści Leuceror i lucerny, Kolonie tworzone przez transkoniugant Fj miały mLecznobiałą barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. menioti miały charakterystyczną żółta oOtbΓurostoą barwę. Trrnsktniugaot Fg Rhizobium otrzymany z kolonii o barwie śnieżnobiałej wywarzonych między rzędami, nazwany w oioieSztye opisie Rhizobium sorghi, oczyszczono i izolowano jak opisano. Trrnsktoiugrota Fg użyto do wywal/wnia powstawania brodawek na sorgo.

g. Ww^o^enie powstawania brodawek na sorgo pod wpływem Rhizobium sorghi

Rhizobium sorghi użyto do wywoenia powstawania brodawek oc czterech typach sorgo: Safra, Dabar i Feterita. Nasiona sorgo potrakoowano przez trzykrotne zanurzenie w roztworze wodnym uprzednio opisanym zawierającym 3% siarczanu wapniowego i do około 10$ ekstraktów z roślin motylkowych, których użyto do wywożenia R.sorghi, to jest ekstraktu z roślin motylkowych użyto do powlekania nasion, otrzymano z łubinu, liści ΕευοηΓ^ leucocephala i lucerny. Po każdym zanurzeniu nasiona wysuszono na powietrzu i wzysi-mo jak opisano poniżej.

g.1. Badania laboratoryjne

Protokół eksperymentalny uprzednio opisany zastosowano do sorgo: Safra, Dabar i Feterita, to jest U do 5 powleczonych nasion w/siewano do 1 litrowego pojemnika w/pcełnionego ζ^γ^Ιθζ klinkeerowym Fibo i pozostawiono do wykeełtowcnic. Każdy typ sorgo podzielono oc następujące trzy grupy: /1/ +R-N, siewki tej grupy nawadniano 50 ml zawiesiny R.sorg hi otrzymanej jak uprzednio opisano, a następnie nawadniano co tydzień ni^e^;^:^ctowiy^m nawozem sztucznym, /b/ -R+N, siewek tej grupy nie potraktowano R. sorghi, ale nawadniano je nieorganicznym nawozem sztucznym, a zamiast tego nawadniano je nieazoowwym nawozem sztucznym. Na roślinach potraktowanych R. sorghi rozwinęły się brodawki korzeniowe w ciągu 10 tygodni. Rośliny w każdym pojemniku przerzedzono do trzech roślin i w każdej grupie użyto dziesięciu pojemników do analizy.

155 858

2.2. Badania połowę

Do badań polowych powleczone nasiona sorgo /szczep Feterito/ wysiano jak opisano w przykładzie 1, punkt 3.2. Nasiona z grupy /a/ +R-N potraktowano, jak opisano, zaw^iiiną R. sorghi i nawadniano nieazooowym nawozem sztucznym, z grupy /b/ -R+N nie potraktowano R. sorghi, lecz nawadniano nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i z grupy /c/ -R-N nie potraktowano ani R. sorghi, ani nieorganicznym azotowym nawozem sztucznym i po prostu nawadniano nifasazoowy^m nawozem sztucznym.

3. Analiza suchej msy, zawartości azotu i zawaatości białka w sorgo z DrohawKani

Użyto metod analitycznych opisanych w przykładzie I punkt 4, w celu scharakteryzowania sorgo z brodawkami.

3.1. Wyrażki badań laboratoryjnych

Rośliny zebrano po 76 i 152 dniach po zasianiu. Suchą masę na roślinę i zawrtość azotu na roślinę /analiza Kjeldahla/ analćoowano jak uprzednio opisano.

Pomocna jest następująca tablica 9 z informacją dotyczącą średniej wagi suchej msy i średniej zawartości azotu w sorgo:

Tablica 9

i I 1	Sorgo	-------r· 1 1 . . L·.	Sucha msa /100 nasion /g/	-Γ----------—’—----------- J Azot w nasieniu /%/
1 1 1	Saf ra	1 1 |	3,724		i ; 2,32
1	Dabar	1 1	2,944		l 2,17
1 1	Peterita	1 1	3,840		J 1,42
	Liczbę zebranych roślin	w różnych okresach	czasu podano	w tablicy 10
			T a b 1 i	ca 10
Γ	Grupy roślin	’ 1 1 1 1 »	Całkowita liczba wysiania	zebranych roślin po 76 i 152 dniach od	1 1 I 1
						1
	+R-N	1 1		121		1 1 |
	-R+N	ł 1 |		62		1 ł
u-	-R-N	1 1 ------U-		70		ł i

3.2, badań polowych

Sorgo w badaniach polowych zebrano po jednym sezonie wzrostu i zawartość białka na roślinę oraz skład aminokwasowy analćoowano jak uprzednio opisano. Wyyżki przedstawione w tablicy 11 jasno wykazują, że rośliny potraktowane R. sorghi /+R-N/ miały wyższą zawartość białka niż albo grupa pot^i^ltowłana azotowym nawozem sztucznym /-R+N/, albo grupa nie potrakoowrana /-R-N/.

Araliza składu aminokwasowego wykazuje, że względny skład aminokwasowy roślin potraktowanych Rhizobiim jest miej więcej taki sam Jak w przypadku roślin nawożonych azotem, tym niemniej poziom tryptofanu i leucyny wydje się podniesiony w roślinach potraktowanych Rhizobium.

Tablica 11 Zawartość białka w sorgo

	Grupa roślin	1 1	Zawrtość białka w nas ionach^roś linę	|
	+R-N	— — Ί ł 1	34 - 52%
	-R+N	I ł	16%
	-R-N	1 1 1	4%x

Ponieważ rośliny z grupy -R-N obumrły po 14 tygodniach, nie otrzymano nasion. Zawrtość azotu i białka w roślinach oznaczono jak opisano.

155 858

2'

Przykład V. Wiizobium oryzae wałujący powtawunie brodawek na ryżu Rhizobium oryzae wywoujący powstawanie brodawek na ryżu wytworzono metodą opisaną w przykładzie I, najpierw przez skrzyżowanie R. meHloti z R.cowpea leucaena w celu wytworzenia transkoniuganta F·,, który następnie skrzyżowano z R. trifoli. Tak w-twarzonego R. oryzae użyto do wywoania powstania brodawek na ryżu.

1. Wytwarzanie Rhizobium oryzae

Do wytworzenia R. oryzae użyto następujących imacerzystych Rhizobia w celu wytworzenia kolonii o barwie mlecznobiałej transkoniuganta F-: /a/ R.meliloti, izoCwanego z iu cerny znajdowanej w pobliżu Wiktorii i /b/ R. cowpea ieucaena, izolowany z tropikalnego drzewa tnicnna leucocephala /należącego do rodziny Fabaceae/, Papua, Nowa Gwinea.

Maaierzyste Rihizobir hodowano w naprzemiennych rzędach na podłożu agarowym uprzednio opisanym. Ekstrakty z roślin mm^ikow/ch, stosowane w podłożu otrzymano, odpowiednio z lucerny i z liści Leucaena leucocphala. Kolonie tworzone przez R. meHlat! miały chrrak tery styczną żółtawo-brunatną barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R. cowper leucnna miały charakterystyczną szarawobrunatną barwę.

Transkoniugant F^ otrzymany z kolonii o barwie mlecz^^alej oczyszczono i hodowano w naprzemiennych rzędach, jak opisano, ze szczepem R. trifoli, który izolowano z koniczyny łąkowej, znajdowanej w Randers. Ekstrakty z roślin mooylkowych, stosowane w podłożu wytworzono z lucerny, liści Leucarna leucocphala i koniczyny łąkowej. Kolonie tworzone przez transkoniugant Fj miały mecznobiałą barwę, podczas gdy kolonie tworzone przez R.trifoli miały charakterystyczną jasnobrunatną barwę.

Transkoniugant Fg Rhizobium otrzymany z kolonii o barwie śnieżnobiałej wytworzonych między rzędami, nazwany w niniejszmm opisie Rlhizobium oryzae, oczyszczono i izolowano jak opisano. Transkoniuganta Fg użyto do wywoły/wnia powstawania brodawek na ryżu.

2. Wyw'iływinil powstawania brodawek na ryżu pod wpływem Rhizobium oryzae

Nasiona ryżu potrakoowano przez trzykrotne zanurzenie w roztworze wodnym uprzednio opisanym zawierającym 3% siarczan wapniowy i do około 10% ekstraktów z roślin motylkowych których użyto do wytwsrzenia R.oryzn, to jest ekstrakty z roślin motylkowych użyte do po' lękania nasion, otrzymano z lucerny, liści Leucaera leucocphala i koniczyny łąkowej. Po każdym zanurzeniu nasiona wysuszono na powietrzu i wysiano jak opisano poniżej.

2.1. Badania połowę

Do badań polowych powleczone nasiona ryżu wysiano jak opisano w przykładzie I, punkt 3.2. Nasiona z grupy /a/ +n-N potraktowano, jak opisano, zawiesiną R.oryzae i nawadniano nieazoOiwym nawozem sztucznym, z grupy /b -λτ» m. mi-traktowano R^ryzae, lecz naw? niano nieorganicznym azotowym n^awoze^e s^ztucznym i. ^{z grupy} /^{c/ -}R-N “^-.^-.rx;^i;^rak-^(^w^{ano a}ni R.oryzae, ani niełrganicznym azotowym nawozem sztucznym i po prostu nawadniano rr-ν...,— nawozem sztucznym.

3. Araliza zaswrtości białka i azotu w ryżu z brodawkami

Uiyuo metod analitycznych opisanych w przykładzie I punkt 4 w celu schaΓakteryłowa · nia ryżu z brodawkami.

3.1. Wyyżki badań potowych

Rośliny zbierano co 4,5 miesiąca w ciągu 2,5 roku /2 zbiory rocznie/ i zrwirtość białka na roślinę ^ιΙ^ονι^ jak uprzednio opisano.

Wynżki przedstawione w tablicy 12 jasno wyikzują, że ryż potraktowany R. oryzae /+R-N/ miał w/ższą zawartość białka niż albo grupa potraktowana azotowym nawozem sztuczny /-R+n/, albo grupa nie potraktowana /-R-N/.

155 858

Tablica 12 Zawartość białka w ryżu

T--- 1 1	Grupa roślin	1 ł _ . L __	Zaoortość białka/roślinę i
		1
1 1	+R-N	1 1	12,0 - 186
1 1 t	-R+N	1 1	1,5 - 3%
1 1	-R-N	1 1 I	0,5 - 1%
1---		1		----_-----J

Przykład VI. Rhizobium jako nawóz azotowy dla eufesliptusa

Dodatni wpływ Rhizobium jako nawozu azotowego obserwowano w przypadku eutealiptusa /rodzina Myra^^^af^/i gatunku roślirmego nie należącego do rodziny traw. Z 2 badanych gatunków, E. globulus odpowiadał bardzo wyraźnie zwiększeniem biomasy, tym niemniej nie zaobsewrowano brodawek.

1. Wytwwrzanie Rhizobium 081324

Rhizobium 081324 wy-a^zbuący korzystny wpływ w przypadku eulk^JLiptusa wytworzoną metodą opisaną w przykładzie I, najpierw przez skrzyżowanie R. cowpea leucaena z R. leguminosarura w celu wyworzenia transkoniuga.nta F-j, który następnie skrzyżowano z R.trifoli. Tak wytworzonego transkoniuganta F2, szczep 081324 użyto do potraktowała 2 gatunków eukaliptusa. Ten szczep Rhizobium nie zakaża jakiejkolwiek innej rośliny-gospodarza z opisanych w przykładach w niniejzzym opisie.

2. Traktowanie eutełliptusa Rhizobium 081324

Nasiona euk^JLipt^usa prtrakOowrno wtępnie przed kiełkowaniem, jak uprzednio opisano dla zbóż, ekstraktami z roślin motylkowych, z grochu, fasoli, łubinu, koniczyny, lucerny i Leucaena. Potraktowane nasiona wysiano do gruboziarnistego piasku, a nie potraktowane nasiona wysiano jako kontrolę.

Po wytołkowiniu, potraktowane wstępnie siewki nawadniano ureazGow^/^¹ nawozem sztucznym i zawiesiną jednego z sześciu transkoniugantćw Fg Rhizobium /+R-N/. Po wyk-ełkowaniu, jedną grupę nie potraktowanych siewek nawidniano azotowym nawozem sztuczny?. /-R+N/, a inną grupę nieazotofcymi nawozem sztucznym /-R-n/. Po 4 tygodniach siewki potraktowane 5 z 6 szczepów Rhizobitmi wszystkie obumarły, natomiast potraktowane Rhizobium szczep 081324 przeżyły. Przeniesiono je indywidualnie do 6 litowtych doniczek z glebą i wierzchnią warstwą mtoriału łlinkierowego Fibo w celu utrzymania wilgoci w doniczce-i zapobieżenia wzrostowi grzybów. Dno doniczek było perforowane tak, że naa-utar wody mógł wpłynąć, lecz dana ilość nieazotowego nawozu sztucznego «/^ia tak doprowadzana, że nie mogło być stojącej w>dy lub zanieczyszczenia · W całości było 28 doniczek, 14 +R-N i 14 -R+N. 14 doniczek +R-N inokulowano ponownie Rhizobium 081324.

Po 4 mesiącach wii-toi^isu eukaliptusy -R+N miały 2-3 krotnie więcej biomasy niż ro^+ny +R-N. Oględziny jednej z roślin +R-N nie ujawniły brodawek, tymi niemniej młych brodawek jest bardzo trudne gdy korzenie rosną w glebie, ponieważ czas-tk-t gleby przywierają do korzeni i odbarwiają drobne korzenie. Wbrew niemożliwości wykrycia brodawek na tym eukaliptusie +R-N, w^iki wslazują, że zwiększenie biomasy jest zależne od wiązania azotu przez Rhizobium.

Przykład VII. Rhizobium R1 wywołujący powtawanie brodawek na Brassica

Roślina z rodzaju Brassica, czyli inna roślina nie należąca do rodziny traw, również odpowiada dodatnio na potraktowanie Rhizobium. Potraktowanie rzepaku /Brassica napua/ Rhizobium R1 /010824./ wpływa na wzrost rośliny i powstawanie brodawek.

1. Wyyworzanie Rhizobium R1 010824

Rhizobium R1 /010824/ wywiający powstawanie brodawek na rzepaku wytworzono metodą opisaną w przykładzie I, najpierw przez skrzyżowanie R.phaseoli z R.cnwpea laucaena w celu

155 858 wytworzenia transkoniuganta Fj, który następnie skrzyżowano z R.trifoli.

2. Traktowanie rzepaku Rhizobiun R1 010824

Nasiona rzepaku potrakoowano wstępnie przed kiełkowaniem jak to uprzednio opisano dla zbóż, ekstraktami z roślin motylkowych, z fasoli, Leucaena i koniczyny. Potrakoowane nasiona wysiano do 2 lirrovyrch pojemników i po wykiełkowaniu jedną grupę nawożono normalnie /-R+N’/, inną grupę nawadniano tylko nieazoo<3wym nawozem sztucznym /-R-N/, a trzecią grupę, którą również nawadniano nieazoowiym nawozem sztucznym, potrakoowano sześcooma różnymi szczepami Rhizobiun /+R-N/. Po upływie 3,5 miesiąca rośliny -R-N Pały ciągle tylko trzy pierwsze młodociane liście, a rośliny +R-N potraktowane trzema szczepami Rhizobium, oznaczonymi R4, R5 i R6 były równie słabe. Tym niemniej jeden z transkoniugantów Rhizobiun, a PanowOcie szczep R1 lub 013824, był korzystny. Roślina potraktowana R1 010824 miała prawie taką samą wielkość i łuszczyny, co największa roślina -R+N. Widoczne były .małe brodawki korzeniowe.

Przykład VIII. Całkowita zawartość azotu w roślinach niemotylkowych z brodawkami W celu w/tezania, że brodawki powwtałe pod wpływem t^i^i^nfooraBinl^i^w Rhizobiurn według wynalazku na roślinach Pemotylkowych były aktywne pod względem wiązania azotu, przeprowadzono analizę Kjeldahla zawrtości organicznego azotu w roślinach.

1. Maaeriały i metody

Każdą z badanych roślin niemotylkowych dzielono na trzy grupy: /a/ jedną potraktowano transkoniugantem Rhizobiun nieazoowwym nawozem sztucznym /+R-N/, /b/ drugą grupę potraktowano azotowym nawozem sztucznym bez transkoniuganta Rhizobiun /-R+N/ i /cZ trzeciej grupy nie potrakoowano ani transkoniugantem Rhizobiun ani azotooyΓm nawozem sztucznym. Rośliny z tych grup rosły w w runkach. pod innymi względami identycznych w pomieszczeniu do hodowli i zbierano w pewnych odstępach czasu w okresie wrc^^tu aż do dojrzenia nasion. Trzy do pięciu roślin rosło w każdym pojemniku i przy zbiorze ich pędy łączono. Z tego maeriału pobierano jedną próbę i azalirowano pod względem całkowitego azotu organicznego. Wynźki przedstawione poniżej wiązują, że rośliny niemotylkowe z brodawkami były zdolne do wiązania azotu.

2. Pszenica i jęczmień

Na 2 odmianach pszenicy, Cornette i Ralle, wywiano powtanie brodawek przy użyciu Rhizobiuz tritici jak uprzednio opisano w przykładzie II. Badano zawartość azotu wyażozą jako mg azotu/górzą część rośliny i suchą maę/górną część rośliny. Wynżki przedstawiono w tablicy 13, poniżej.

Tablica 13

Dni	Zawrtość azotu i suchej msy	w pszenicy z brodawkami
	mg/ ;		Doświadczenie pierwsze			----j
	rośli- · zę i	+R-N	! -R+N 1 1	1 1 1 _	-R-N
Γ Ί	2 i ___-_____	3	Ί * . _ !_____________ 4 .	1---- 1 ..1	5	----1
	i 1	/z = 4/	! /z = 2/	1 1	/n = 2/
30	DWX J	56,05+28,5	J 90,89+26,3	ł 1	39,69+6,3
	N ! 1	1,14+ 0,5	; 2,67 ±0,6	1 1 |	0,51+0
50	DW !	120,49+27,8	! 257,56*62,3	1 1	82,61+13,6
	n ;	2,26+ 0,3	! 3,99+ 1,4	1 1	0,66+ 0,3
64	DW t	244,78+21,8	! 33K99+ 5,8	1 1 t	72,21+ 8,7
	n i	3,03+ 0,3	! 5,01+ 0,4	1 1	0,4+4+ 0,1
76	DW j	314,38+112,5	• 400,64+83,2	1 ł 1	117,53*44,6
	N !	4,28+ 1,3	! 6,56+ 2,1	1 1	0,69+ 0,2
97	DW [	431,47*68,5	J 666,71+60,3	f 1	117,0+ 54,2
	N i t t	5,19+ 0,7	j 7,52+ 1,4 1	ł I 1 1	0,6+ 0,2

155 858

-i-----ί 2

Tablica 13 - ciąg dalszy ---------------t---------L !

i

115	Dw	523,49+38,6	668.55+113,4	82,96+ 3,2
	N	5,98+ 1,2	9,94+ 3,5	0,42+ 0,1
124	DW	565,11±23,2	700,77+79,4	113,9 +12,3
	N	8,15+ 0,4	11,43+ 1,9	0,877+ 0
		Doświadczenie drugie
		+R-N	-R+N	-R-N
		/n = 4/	/n = 2/	/n = 2/
54	DW	158,85+36,3	304,91+72,3	90,30+12,4
	N	3,59+ 0,5	7,46+ 0,8	0,51+0,1
71	DW	447,88+83,1	705,64+37,0	39,54+23,0
	N	6,28+ 1,2	12,48+ 1,9	0,54+ 0,2
80	Da	513,37+120,7	871,57+205,5	117,04+ 2,6
	N	7,61+ 1,1	12,15+ 2,4	0,71+ 0,1
92	dw	903,53+25,6	1128,85+166,4	131,18±11,8
	N	11,81+ 0,45	14,56± 1,89	0,72+ 0,1
_________J	_____________	—	___________________j

x

DW - sucha masa

Rośliny w doświadczeniu pierwszym rosły w suboptymalnych wirunkach, jeśli chodzi o oświet lenie.

Wyynki przedstawione w tablicy 13 wskazują, ,że sucha misa roślin +R-N w^osi około 82% wartości otrzymanej w przypadku roślin -R+N, a zawrtość azotu roślin +R-N wrnosi około 80% wrtości otrzymanej w przypadku roślin -R+N.

Na pięciu odm.anach jęczmienia, Jenny, Taarn, Lina, Grith i Triuph wywiano poiwtanie brodawek przy użyciu Rhizobium hordei jak uprzednio opisano w przykładzie III. Badano zawartość azotu wyrażoną jako mg azotu/górną część rośliny i suchą imsę/ górną część rośliny. Wyyiki przedstawiono w tablicy 14, poniżej.

				T	a b 1 i c a	14
Dni	i 1 I	Zawrtość	azotu i suchej	msy w jęczmieniu z brodawkami
	1 1	mg/ rośliny_______	1 1	doświadczenie	pieiwsze
	1 1	J 1	+R-N	ί 1 _______1______	-R+N !	-R-N
	1 1 1		1 1	/n = 10 /	Γ 1 1	/n = 5/ }	/n = 5/
1	1 ~ł-	2	ł	3	i ------μ_„.		5

31	J DWX ! N	• 43,85+9,2 ! 0,99+0,2	’ 71,84+21,7 { 2,15+ 0,9	j 19115+5,2 ! 0,27±0,l
50	J DW	J 121,53+28,7	! 224,95+44,5	! 35,40+4,2
	1 i N	! 2,^6+0,5	• 4,03+ 1,3	; 0,4+1+0,1
64	1 DW	! 198,41+50,7	! 269,92+36,8	! 41,87+7,1
	i N	[ 2,671+ 0,5	J 4,05+ 1,1	; 0,35+0,1
76	i DW	! 301,04+56,1	j 296,76+76,9	J 49,58+4,8
	! N	} 4,09+0,6	! 5,22+2,9	! 0,61+0,3
96	• Dw' 1	J 499,23+106,9	J 50(6,33+106,5	J
	1 N	! 5,34+1,4	! 9,90+1,2	! 0,35+0,1
123	; dw	5 535,47+123,7	556,38+124,3	i 64,10+11,5
	! N	j 5.55+ 1,1	J 10,34+ 3,7	! 0,44+ 0,1

J

155 858

Tablica 14 - ciąg dalszy

1	2		3	________ł--- 1 1	4	5
		. - -η	r
					Doświadczenie drugie		I
				+R-N	1 1 1	-R+N	-R-N	—'i
				/n = 6/	i 1	/n = 3/	/n = 3/
54	DW			118,89+20,6	1 1 1	264,84+38,4	49,76+11,8
	N			3,30+ 0,4	1	7,76+ 0,7	0,45+.0,1
71	Da			313,06+46,1	1 I	405,53+120,8	53,49+ 9,9
	N			5,81+ 0,6	1 1	7,78+ 0,8	0,41+ 0,1
80	DA			711,29+279,6	ł 1	617,75+94,3	68,42±2,6
	N			7,85+ 1,2	1 1 1	10,26+ 2,4	O,53±O,l
92	DW			802,30+147,3	1 1	837,08+196,4	57,07+19,5
	N			10,08+ 1,6	t 1	11,99+ 1,6	0,46+0,2

= sucha masa

Jęczmień z brodawkami powstałymi pod wpływem Riizobium rósł do tej samej wielkości i wartości suchej masy, co roś liany traktowane normalnym azotowym nawozem sztucznym. Zawartość azotu w jęczmieniu +R-N w7^nosl około 83% wartości otrzymanej w przypadku roślin -R+N i jest dwuuziestokrotnie wyższa od zawartości azotu w roślinach -R-N. Azot badany w roślinach -R-N pochodzi z nasion i nie zwiększa się w okresie wzrostu.

Należy zauważyć, że w>ływ transkoniugantów Rhizobium jako substytutu azotowego nawozu sztucznego jest zależny od działania miłych brodawek, obecnych na 75% roślin. Ponieważ hodowano 3-5 roślin/pojemnik nie było możliwe oddzielenie korzeni i badanie tylko roślin z brodawkami. Przyjmuje się, że powstanie brodawek na 100% roślin i rozwój dużych brodawek będzie działać jeszcze skuteczniej.

W celu wyeliminowania mooiiwości, że rośliny niemotylkowe z brodawkami +R-N mogą wykorzystać inokulum Rhizobium, lub bakterie, które mogą później rozmnażać się w pojemnikach, jako źródło azotu, przeprowadzono następujący eksperyment. Pszenicę, odmiana Cornette i jęczmień, odmiana Taarn inokulowano R^eguminosarum szczep M1, stosując to samo postępowanie, ilości i warunki, co opisane w odnieśieniu do inokulowania tych roślin niemotylkowych transkoniugantem Rhizobium, odpowiednio, R.tritici lub R.hordei. Rośliny inokulowane R.legumintsaΓum nawadniano nieazooowym nawozem sztucznym i aSumuiację azotu porównano z akumuiacją w roślirach -R-N. Ani rośliny inokulowane R.leguminosarum, ani rośliny -R-N nie skumulowiły azotu. Wniosek jest taki, że niespecyficzne inokulum bakteryjne samo z siebie nie dostarcza roślioom nawozu sztucznego. W przeciwieństwie do tego, akimuiacja azotu widoczna w tablicach 13 i 14 w odpowiedzi na wywianie poiwtania brodawek przez, odpowiednio, R.tritici lub R.hordei, misi być zależna od wiązania azotu.

3. Sorgo i ryż

Na odmianach sorgo, Dabar, Safra i Feterita wywiano powiSanie brodawek przy użyciu Rhizobium sorghi jak uprzednio opisano w przykładzie IV. Badano zawrtość azotu, wyrażoną jako mg/azotu/górną część rośliny i suchą misę/ górną część rośliny. Wynnki przedstawiono w tablicy 15, poniżej.

Tablica 15

Dni	1 -4-	Zaiwrtość azotu i suchej misy w sorgo	z brodawkami
mg/rΌŚlinę J +R-N	T t —-1.	-R+N	1	-R-N
1		______________'_____3_____________	1	4	---1-- 1 _ _ _ L ..	5.
		! /n « 6/	i	/n = 3/	!	/n = 3/
30		DWX [ 38,83+10,1	1 1	49,60+22,5	1 1	25,60+4,2

155 858

Tablica 15 - ciąg dalszy

1	T7:r::::~		----T— 1 ____	5
___________$_____________	________4.........
		N	0,40+0,1	1,42+0,7			0,26+0
59		DW	102,93+15,2	329,51+87,7			42,84+8,0
		N	1,00+0,2	5,93+2,3			0,31+0
80		DW	179,84+62,2	602,34+44,9			43,77+21,5
		N	2,00+0,8	9,86+2,7			0,31+0
101		DW	439,53+95,8	576,18+75,4			53,71+12,4
		N	4,40χ0,9	11,02+0,9			0,31+0
125		DV	1242,94+391,4	1198,99+596,0			56,76+7,8
		H	11,65+2,4	12,44+6,8			0,27+0
X DW L .	— H	sucha rasa

Na ryżu, szczep M-201 wywiano powstanie brodawek przy użyciu Rhizobium oryzae jak uprzednio opisano s przykładzie V. Badano zawartość azotu, syrażoną jak mg azotu/górną część rośliny i suchą rnsę/górną część rośliny. Wyniki przedstasio.no s tablicy 16, poniżej.

Tablica 16

Dni	1 1 1 1 1 1	Zasrtość azotu i suchej	msy	s ryżu Z	brodavkami [
mggroślinę	1 +R-N	f— 1 i - u_	-R+N	1 ! i	-R-N 1
62	1 1	DWX	1 32,28	1 1 |	48,87	--------- 1 1	23,44 J
	1 1	N	1 0,32	1 1	1,10	1 ł	0,16 ł
74	1 1 |	DW	1 48,04	1 >	94,73	ł 1	21,63 1
	1 !	N	! 1.15	1 1	2,65	1 ł 1	0,16 1
98	1 1	dw	1 107,47	i	115,40	1 ł	29,9 !
	1 ł	N	1 2,91	1 t 1	3,45	1 1	0,36 j
128	! 1	DW	1 174,89	1 1	130,83	1 1	22,16 ;
	1 1 i 1	N	1 5,16 1	1 1 1	4,33	1 ł 1	0,38 !

i *DW = sucha rasa

1_______________________________________________________J

Wyyńki wskazują, że akuimlacja suchej masy s roślirach +R-N początkowo opóźnia się i pozostaje niższa niż s roślirach -R+N, tym niemniej przy końcu okresu eksperymentalnego akumulacja suchej rasy s roślinach +R-N dorównuje i może przekraczać wrtość odnoszącą się do roś lin -R+N. Ak^r^mus^c^.ja azotu s roślirach +R-N i roślinach -R+N jest mnej sięcej taka sama.

4. Rzepak

Na 2 odmianach rzepaku, Hanna i Topas sys^ano powstanie brodasek przy użyciu Rhizobium R1 010824 jak uprzednio opisano s przykładzie VII. Badano zasartość azotu skażoną jako mg azotu/ górną część rośliny i suchą msę/ górną część rośliny. Wy^ki przedstawiono s tablicy 17, poniżej.

Tablica 17

Γ		•v
	Dni	|	Zawartość	azotu i suchej msy	w rzepaku	z brodaskami
		1 1 ł	mg/ośn-	1 +R-N 1	1 1	-R+N	- —— 1--- 1 1	-R-N	-----I
		1	nę _	1	1		*		1
I	1	1	2	—τ*“·.......3'·	” “ ~«“ *“ —Γ* ~ 1	4	I	5	t
Γ		T			I		1
	47	i	DW'X	1 67,25+17,4	1 I	344,91+31,6	1 1	9,71+0,2
		1 1	N	1 0,89+0,3	1 I l	6,71+0,1	1 1	0,22+0,2
L		J_		____i_________________	1		1

155 858

Tablica 17 - ciąg dalszy

1	......2__________	3 '	4	L_______5_........
59	Dw	99,40+14,3	477,07+62,8	13,90+4,5
	N	1,64+0,4	7,03+0,2	0,11+0,1
73	Dh'	243,56+24,3	766,47+72,7	14,92+9,9
	N	2,00+0,7	10,25+1,9	0,10+0,04
93	D V	424,80+72,5	704,73+	12,11+7,9
	X	3,42+1,1	17,66+5,1	0,10+0,05
110	Dw	547,37+22,2	1049,77+388,6	17,86+12,1
	N	5,73+1,9	24,33+7,9	0,26+0,2
129	D‘rt	1013,59+241,81	955,60+330,0	15,39+6,0
	N	10,24+0,9	33,21+8,6	0,16+0,09
147	DW	2231,55	ND	ND
	X	16,66	ND	ND
			________________________l

*DW = sucha masa n = 4 rośliny/próbkę

ND = brak danych

Wyyitki wskazują, że rośliny +R-N akunailowiły około 50% suchej msy akumulowanej przez rośliny -R+N, a zawartość azotu w roślirnch +R-.N ^nnoiła około 30% zawartości w roślinach -R+N. Chociaż akumuuacja była niższa niż w roślinach nawożonych azotem, młe brodawki obser wowane na rzepaku odpowiadają za przeżycie rzepaku z brodawkami w nieobecności azotowego na wozu sztucznego /porównaj wyniki odnoszące się do +R-N z odnoszącymi się do -R-N, gdzie ani sucha msa, ani azot nie był akumulowny/.

14. Zdeponowanie drobnoustrojów

Następujące szczepy drobnoustrojów zdeponowano w American Type Culture Collection /ATCC/, Rockkille, MD i nadano im następujące numery rejestracyjne:

Rhizobium	Nr rejestracyjny	Data założenia
R. tritici	53407	1985-12-27
R.hordei	53404	1985-12-27
S.sorghi	53405	1985-12-27
R-oryzae	53406	1985-12-27
R.R^/010824/	53563	1986-12-24
R.eu /081324/	53562	1986-12-24

Zastrzeżenia patentwwe

Claims (2)

1. Sposób wyważania transkoniugantów Fg Rhizobium, które symbiotycznie wiążą azot w roślinach niemotylkowych, zwłaszcza należących do rodziny Poaceae, takich jak: pszenica, korzystnie szczepu Anja, Kraka lub Vuka, jęczmień, korzystnie szczepu Hasso, Cerise, Harry lub Igri, sorgo, korzystnie szczepu Safra, Dabar lub Feterita i ryż, albo roślin należących do rodziny Cruciferae, takich jak kapusta i rzepak, albo roślin należących do rodziny Myrta ceae, takich jak eulkliptus, znamienny tym, że rozprowadza się pierwszy racie rzysty Rhizobium i drugi mcierzysty Rhizobiim w naprzemiennych rzędach, na staym podłożu odżywczym zawierającym oprócz składników odżywczych niezbędnych dla wzrostu nie zdeponowany ekstrakt z rośliny mooylkowej-gospodarza będącego partnerem danego mcierzystego Rhizobium, albo frakcje chromaograficzne pochodzące z nie zdenaturowanego ekstraktu z rośliny motylkowej-gospodarza będącego partnerem danego macerzystego Rhizobium, albo kryształy

155 858 otrzymane z frakcji chroiratograficznych pochodzących z nie zdenaturowanego ekstraktu z rośliny motylkowej-gospodarza będącego partnerem danego macerzystego Rlhizobium, albo białka odpowiadające temu ekstraktowi, tym Ι^'κ^οι chromtograficznyo lub tym krysztaoom, prowadzi się hodowlę maierzystych Rhizobium w temperaturze od około 13°C do około 30°C tak, że nacierzyste Rhizobium tworzą kolonie o charakterystycznej barwie, wybiera się kolonię transkoniuganta Fj Rhizobium o barwie mleczi-woiałej, która rośnie między koloniami macierzystych Rhizobium, rozprowadza się transkoniugaota F^ Rhizobium w naprzemiennych rzędach z trzecim macierzystym Rhizobium .na podłożu odżywczym z pierwszego etapu, zawierającym dodatkowo ekstrakt z rośliny mooylkowej, frakcje chromaograficzne, kryształy albo białko odpowiadające trzetom-iu mcierzystemu Rhizobium., po czym prowadzi się hodowlę transkoniuganta Fj Rhizobium i trzeciego macerzystego Rhizobium w temperaturze od około 13°C do około 30°C tak, że Rhizo bium tworzą kolonie i wciera się śnieżnobiałą kolonię transkoniuganta Fg Rhizobium, która rośnie między transkoniugantem F- Rhizobium i trzecim mcierzystym Rhizobium.

2. Sposób 'wdług zastrz. 1, znamienn· y tym, że jako trzeci mccerzysty Rłhizobium stosuje się trzeci gatunek z rodzaju RihLzobium, drugi transkoniugant F-, Rhizobium lub drugi tr^^nskoniugant Fg Rhizobium.