CN113151082B - 一株多功能土壤细菌及应用 - Google Patents

一株多功能土壤细菌及应用 Download PDF

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Abstract

一株多功能土壤细菌及应用，涉及农业生物防治领域，尤其涉及一株多功能土壤细菌及应用。是要解决现有土传病害的防治方法和秸秆处理方法严重污染环境，对人们身体健康带来巨大隐患的问题。细菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2020年12月1日，保藏编号为CGMCC No.21275。该菌株能够防治蔬菜根结线虫病、大豆根腐病和大豆孢囊线虫病。还能够对秸秆中的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维进行降解。本发明用于蔬菜根结线虫病、大豆根腐病和大豆孢囊线虫病的生物防治领域，还用于秸秆降解领域。

Description

一株多功能土壤细菌及应用
技术领域
本发明涉及农业病害生物防治领域和秸秆降解领域，尤其涉及一株多功能土壤细菌及其应用。
背景技术
土传病害主要发生在作物根部，因其隐蔽性，一旦发生很难根除，严重发生时具有毁灭性，尤其寄主植物的连续种植，随着连作年限的增加，土传病害尤为严重。在生产实践中主要采用化学药剂防治土传病害，虽然化学防治效果较好，但是频繁使用容易产生抗药性，施用剂量逐渐加大，使得防治成本提高，随之给生态环境带来负面影响，农药残留威胁着人类健康。随着人们环境保护意识的加强和食品安全的日益重视，绿色食品越来越受到关注。剧毒化学农药的禁用，高毒农药正在退出市场，目前，急需安全、高效的生物药剂防治土传病害。
另外，作物秸秆的处理问题成为目前的研究热点。秸秆的焚烧对环境产生严重的污染，也是对秸秆中营养物质的浪费。因此急需一种既环保又废物利用的方法解决秸秆处理的难题。
发明内容
本发明是要解决现有土传病害的防治方法和秸秆处理方法严重污染环境，对人们身体健康带来巨大隐患的问题，而提供一株多功能土壤细菌及其应用。
本发明提供一株多功能土壤细菌，为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年12月1日，保藏编号为CGMCC No.21275。
本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1在LB培养基上菌落呈乳白色、不透明，菌落边缘规则、扁平圆形、粘稠、表面粗糙，菌落中央凹陷。细胞呈直杆状，芽孢呈椭圆形。
本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1在pH为5-9的范围内生长良好，在偏酸性条件下生长情况好于偏碱性条件，且pH为7时生长最好。培养温度为10-40℃，最佳生长温度为30℃，盐离子浓度为0.85％和5％时该菌生长良好。
本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1革兰氏染色呈阳性，甲基红呈阴性，为兼性厌氧菌，可利用蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖和麦芽糖，不能利用木糖、阿拉伯糖、甘露醇和肌醇，不能分解硫氨基产生硫化氢，能分解酪蛋白、淀粉、纤维和明胶， V-P试验、M.R试验、柠檬酸盐、吲哚、硝酸盐还原酶试验均呈阳性。
本发明贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1通过16S rDNA序列比对分析，与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的16S rDNA序列的同源性为99.93％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化特征和分子鉴定结果确定，本发明的菌株IGAHB1属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌种。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1在设施条件下防治蔬菜根结线虫病的应用。
进一步的，所述设施条件下为温室或大棚条件。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的应用剂量为5％～10％(v/v)。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1在温室和田间条件下对大豆根腐病防治的应用。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的应用剂量为5％～10％(v/v)。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1在大豆孢囊线虫病防治中的应用。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1在秸秆降解中的应用。
进一步的，所述秸秆为玉米秸秆。
进一步的，所述降解的物质为酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维。
本发明的有益效果：
本发明的贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1具有高效防治设施蔬菜根结线虫病和大豆根腐病的能力。该菌株在温室条件下，对番茄感病品种根上南方根结线虫病(Meloidogyneincognita)防效为54.28％-71.71％；该菌株在温室条件下，对大豆根腐病(Fusariumoxysporum)平均防效为57.60％，田间条件下，对大豆根腐病平均防效为45.13％。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1还对大豆孢囊线虫病具有较好的防治效果。对灭菌土中大豆孢囊线虫病的平均防治效果为81.76％，对自然土中大豆孢囊线虫病的防治效果为62.79％。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1还能够对玉米秸秆中的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)进行降解。
本发明用于蔬菜根结线虫病、大豆根腐病和大豆孢囊线虫病的生物防治，还可用于秸秆的降解。
附图说明
图1为本发明构建的贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的系统发育树。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
实施例1：本实施例贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年12月1日，保藏编号为CGMCC No.21275。
本实施例贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的获取方法为：称取5g大豆根围土壤，加入带玻璃珠的100ml无菌水中，25℃，200rpm/min，震荡摇匀40min，取土壤悬液1ml进行10-1-10-5系列浓度梯度稀释，涂布于PDA平板培养基，于28℃倒置培养3天，挑取单个菌落，通过平板对峙实验筛选对大豆根腐病有拮抗作用的菌株IGAHB1。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂20g，加水至1000mL。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的理化特征和分子鉴定
(1)贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的形态特征：
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1在LB培养基上菌落呈乳白色、不透明，菌落边缘规则、扁平圆形、粘稠、表面粗糙，菌落中央凹陷。细胞呈直杆状，芽孢呈椭圆形。
(2)贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的生长条件和理化特征
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1在pH为5-9的范围内生长良好，在偏酸性条件下生长情况好于偏碱性条件，且pH为7时生长最好。培养温度为10-40℃，最佳生长温度为30℃，盐离子浓度为0.85％和5％时该菌生长良好。
表1 pH、温度和盐浓度对菌株IGAHB1生长的影响
Figure BDA0003031413240000031
注：“++”：生长良好；“+”：生长得较差；“-”：不生长。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1革兰氏染色呈阳性，甲基红呈阴性，为兼性厌氧菌，可利用蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖和麦芽糖，不能利用木糖、阿拉伯糖、甘露醇和肌醇，不能分解硫氨基产生硫化氢，能分解酪蛋白、淀粉、纤维和明胶，V-P试验、M.R试验、柠檬酸盐、吲哚、硝酸盐还原酶试验均呈阳性。
表2菌株IGAHB1的生理生化特征
Figure BDA0003031413240000041
+：生长或阳性；-：未生长或阴性。
(3)分子鉴定：
1)模板制备
IGAHB1菌体溶于50μITaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.D304)中变性后离心取上清作为模板(Template DNA)。
反应条件：80℃，15min。
2)16s rDNA PCR扩增
使用2×
Figure BDA0003031413240000042
High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix I(TransGen Biotech，Code No： AS131)，进行PCR扩增目的片段。
表3 PCR反应体系
Figure BDA0003031413240000051
反应条件为：94℃预变性5min；95℃l0 sec，55℃20sec，72℃1.5min，循环数为35；最后72℃延伸10min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
阴性对照使用3μl的16S-free H2O替代模板DNA；
阳性对照使用3μl的某已知菌株16S rDNA替代模板DNA。
3)16s rDNA测序
以27F和1492R为引物，使用ABI公司DNA测序仪(型号：3730XL)进行测序。
27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'
将上述测序结果输入Genebank中，利用BLAST功能组件将测得的基因序列与Genebank数据库中16S rDNA序列进行同源性比较。
选取BLAST结果中得分较高的菌的16S rDNA序列，使用MEGA5.2.1软件根据Neighbor-Joining进行系统进化树分析，结果如图1所示，从图1可以看出菌株IGAHB1 与Bacillus velezensis strain CBMB205的相似度99.93％，与Bacillus velezensisstrain FZB42 的相似度99.86％。可以看出与芽孢杆菌属(Bacillus)的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)遗传距离最近，可以初步判断菌株IGAHB1隶属于芽孢杆菌属。
参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，结合生理生化特征和16SrDNA测序，鉴定该菌株IGAHB1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，16S rDNA序列的同源性为99.93％。结合形态特征、生理生化特征及同源性分析鉴定，进一步将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)IGAHB1。
实施例3：菌株IGAHB1对番茄根结线虫病的防治效果
菌株IGAHB1的培养：
采用LB培养基：牛肉浸膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，加水至1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。
挑取纯化后的土壤细菌单菌落接种到LB培养液中，28℃恒温摇床上200rpm/min培养48h后备用，细菌浓度约为1×109cfu/ml。
盆栽试验在光照16h、温度22-28℃的智能温室进行。番茄感病品种中疏4号出苗1个月后分别接种南方根结线虫(M.incognita)卵悬液1000个卵/株和2000个卵/株，北方根结线虫(M.hapla)卵悬液2000个卵/株，同时每盆浇灌50mL生防细菌的10倍稀释液，每盆栽装有灭菌干沙土(V:V＝2:1)500g，空白对照组为只接种线虫卵然后浇同体积的清水。每个处理接种10盆，即重复10次，40天扣盆调查每株根内卵量，并计算防治效果，每个试验完全重复三次。
结果：番茄感病品种中疏4号接种剂量为1000个卵/株，菌株IGAHB1对南方根结线虫病的平均防治效果是71.71％，当接种剂量为2000个卵/株时，该菌株对南方根结线虫病的防治效果为54.28％；当中疏4号接种北方根结线虫剂量为2000个卵/株时，该菌株的防效为74.42％(表4)。从该结果可以看出，南方根结线虫随着接种剂量的增加，植株根部的发病程度更加严重，菌株IGAHB1对南方根结线虫的防治效果稍有下降。
表4对根结线虫病的防治效果
Figure BDA0003031413240000061
实施例4：菌株IGAHB1对大豆孢囊线虫病的防治效果
试验设灭菌土和田间发病的自然土，灭菌沙土(V:V＝1:1)中接种大豆孢囊线虫3号生理小种2000个卵/株，自然土不接种(平均每100g干土中有14.5个孢囊)，均种植感病品种合丰25，其它方法同实施例3。播种8天后接种，接种后28天调查每株根表雌虫数，并计算防治效果。
结果：试验结果如表5，菌株IGAHB1对灭菌土中大豆孢囊线虫3号生理小种的平均防治效果为81.76％，对自然土中大豆孢囊线虫病的防治效果为62.79％。
表5对大豆孢囊线虫病的防治效果
Figure BDA0003031413240000071
实施例5：菌株IGAHB1对大豆根腐病的防治效果
PDA：马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂20g加水至1000mL。
高粱粒培养基：去皮高粱粒灭菌。
在PDA平板上培养尖孢镰孢菌1周后，将5个直径为1cm的菌蝶放入200g高粱粒培养基中静止培养1周。每盆中加入10g以高粱粒为载体扩繁的尖孢镰孢菌和290g灭菌土充分混匀。用表面用75％酒精消毒的大豆种子播种，每个处理6盆，每盆保苗5株。浇入细菌10倍稀释菌悬液30ml，使土壤中细菌浓度为108cfu·g-1土。只接病原菌浇同体积清水的为空白对照，整个试验重复三次，在光照16h、温度22-28度的智能温室进行。30d调查根腐病发病级数，计算病情指数和防效。
大豆根腐病分级标准：
0＝主根须根健全，无病斑，根瘤多。
1＝主根上有零星病斑，但不连片，须根上无病斑。
2＝主根病斑连片，但小于根部周长的1/4，须根略有发病。
3＝主根病斑大于根部周长的1/4，但小于1/2，须根病斑较多，但不成片。
4＝主根病斑大于周长的1/2，但小于3/4，须根病斑成片，部分须根脱落。
5＝整个根部均有病斑包围，根部腐烂，须根近无。
病情指数＝[∑(级别代表值×本级病株数)/(最高级别代表值×调查总株数)]×100
防效(％)＝[(空白对照病情指数-处理病情指数)/空白对照病情指数]×100％
田间试验是在重茬3年的大豆田进行，采用随机区组试验，小区面积5m×0.67m×3垄＝10.05m2，每排区之间设有1m的田间道。每个处理重复3次。播种密度是30万株/公顷。播种时将生防细菌浇入土壤中，施用量是109cfu/穴。大豆出苗30d调查根腐病发病级数，计算病情指数和防效。
结果：盆栽试验结果显示(表6)，菌株IGAHB1对大豆根腐病病原菌——尖孢镰孢菌的平均防治效果为57.6％，田间小区试验平均防治效果为45.13％。盆栽防效高于田间防效，分析其原因可能是温室的光温条件控制得较好，适合细菌的存活和发挥持效作用，而田间不稳定的土壤温湿度会影响细菌的防治作用。
表6菌株IGAHB1对大豆根腐病的防治效果
Figure BDA0003031413240000081
实施例6：菌株IGAHB1对玉米秸秆的降解效果
105℃烘干玉米秸秆后，每份称取60g秸秆装入自封袋内，然后喷入60ml菌悬液。设三个处理：菌株IGAHB1原液、5倍稀释液和对照组(同体积无菌水)，每处理3次重复，室温(23-24℃)放置45d，测定玉米秸秆中的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量。
结果显示如表7，与对照组相比，菌株IGAHB1原液使玉米秸秆内中性纤维(NDF) 含量下降了0.65％，使酸性纤维(ADF)含量下降了8.54％，对NDF和ADF的降解率分别较对照提高2.34％和9.38％；菌株IGAHB1的5倍稀释液使NDF含量下降了1.69％， ADF下降了10.42％，对NDF和ADF的降解率分别较对照提高6.07％和11.43％。可以看出菌株IGAHB1对玉米秸秆中的中性纤维有一定的降解作用，对酸性纤维的降解作用更明显，并且5倍稀释液的降解效果更好。
表7菌株IGAHB1对玉米秸秆的降解效果
Figure BDA0003031413240000091

Claims (10)

1.一株多功能土壤细菌，其特征在于该细菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)IGAHB1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年12月1日，保藏编号为CGMCCNo.21275。
2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1在设施条件下防治蔬菜根结线虫病的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述设施条件下为温室或大棚条件。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的应用剂量为5％～10％(v/v)。
5.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1在温室和田间条件下对大豆根腐病防治的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1的应用剂量为5％～10％(v/v)。
7.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1在大豆孢囊线虫病防治中的应用。
8.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌IGAHB1在秸秆降解中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述秸秆为玉米秸秆。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述降解的物质为酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维。
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