JPS63500494A - 酵母細胞から外来遺伝子生成物の発現を増進させるための培地および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「肝炎ワクチンの発酵製造法」 背景 本発明は、一般にＢ型肝炎表面抗原（ＨＢａＡｇ）を発現する酵母菌株の増殖方 法ならびに培地に関し、より具体的には、比較的低温且つ遊離アミノ酸レベルが 比較的に高い、好気性の、グルコースを抑えた条件においてＨＢｓＡｇを発現す る酵母菌株の増殖方法ならびに培地に関する。 Ｂ型肝炎ウィルスは、現在Ｂ型肝炎として知られる疾患の原因となるものである が、この疾患は以前は「血清肝炎Ｊとして知られていたものである。血液中にＢ 型肝炎ウィルスを持続的に保持している人は、　２００，０００．０００Å以上 に及ぶものと推定される。このウィルスによる感染は、急性肝疾患の主な原因の 一つである。Ｂ型肝炎ウィルスの保有者は、肝硬変や肝細胞癌にかかる危険性が 高い。 ヒトＢ型肝炎ウィルスは、保有者の血清中に見られ且つ臨床的なり型肝炎感染の 病因であるゾーン粒子（Ｄａｎｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）と同一のものであるとみ なされている。ゾーン粒子は、４２ナノメートルの膜組織であり、脂質、　ＤＮ Ａ、および少なくとも４つのタンパク質、すなわちＢ型肝炎表面抗原（ｔｌＢｓ Ａｇ）、Ｂ型肝炎核抗原（ＨＢｃＡｇ）、　Ｂ型肝炎ｅ抗原（）ＩＢｅＡｇ）お よびＤＮＡポリメラーゼを含む、保有者の血清中にはさらに２２ナノメートルの 脂質粒子が含まれ、この粒子はＨＢｓＡｇを含むが、　ＤＮＡ、　ＨＢｃＡｇ、 　ｌｌＢｅＡｇあるいはＤＮＡポリメラーゼは含んでいない、現在用いられてい るＢ型肝炎ワクチンは、ヒト血漿から採取した２２ナノメートルの粒子を使用し ている。 Ｂ型肝炎ワクチンの製造に用いるヒト血漿の抗原濃度は、約４００１１ｇ／謹ｌ である。全血清濃度は約６０　ｗａｇ／　ｌであるので。 １５０倍の精製だけで済む。−ａｍｐｌｅｒ等、「現代のワクチンに対する考え 方Ｊ　（Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、　 Ｃｈａｎｏｃｋ等編集＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 ｐｐ、　２５１−２５６　（１９８４）　、　シかしながら、出発材料がヒト血 漿である限り、血漿から得られるＢ型肝炎ワクチンの供給には限りがあり、また 感染性のウィルスを含めて全ての有害な汚染物質がワクチンに含まれることがな いように厳重に注意せねばならない。 Ｂ型肝炎ワクチンを得る別の方法としては１．培養した悪性細胞を、特に肝癌細 胞をＢ型肝炎ウィルスに感染させる方法がある。！！ＢｓＡｇは、溶解した肝癌 細胞調製物から採取する＊　Ｋｎｏｗ−Ｎｅｗ等９国際特許出願番号ＰＣＴ／υ ５８１１００７７８．この方法はヒト血漿を必要としないが、ワクチンに癌細胞 生成物を使用することは好ましくないこと、感染性を避けるために厳重な注意を 必要とすること、また哺乳類の細胞培養に伴う困難から、この方法の有用性には 限りがある。 １（ＢｓＡｇの遺伝子を含む組換型プラスミドでトランスフエフシランしたサル の腎細胞は、溶解または分泌によってＨＢｓＡｇを遊離することが報告されてい る＊　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ等、欧州特許出願番号７３．６５６．　Ｌかしながら、 癌細胞の生成物の使用に伴う問題を解消したことを除いて、サルの腎線維芽細胞 からのＢ型肝炎ワクチンの製造も、肝癌細胞からのＢ型肝炎ワクチンの生産と同 じ欠点がある。 従来のワクチン製造に伴う問題に鑑みて、　Ｂ型肝炎ウィルスの他の成分とは分 離してＨＢｓＡｇを調製する方法を得ることが望ましい、ｍ換え技法を用いて微 生物中でＨＢｓＡｇを産生することにより、このような分離製造を実現すること ができる。 ＨＢｓＡｇ産生に組換え技法を適用する一つの方法としては、′■ＢｓＡｇをコ ードづけする遺伝子を細菌プラスミドに挿入し、さらにいくつかの大腸菌宿主生 体中で増幅および発現させることが考えられるφＲｕｔｔｅｒ等、欧州特許出願 番号０２０，２５３．　、　Ｌかし、この技法は、　ＨＢｓＡｇが大腸菌内で容 易に劣化するために収量が少ないこと、また大腸菌の増殖がＨＢｓＡｇによって 抑制されることが報告されている。　Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ等、欧州特許出願番 号１０５゜０４９、ある種の細菌細胞の成分、たとえばリポ多糖類は、ヒトに対 して強い毒性があり、且つ精製上の問題をもたらすことが報告されており、さら に、原核生物（すなわち核をもっていない生物群に属するもの）である細菌は、 真核生物（すなわち核を有する生物群に属するもの）の遺伝子の効果的な翻訳が 行えないことが報告されている。その理由は、細菌がイントロンのスプライシン グアウト、あるいは前駆体タンパク質のタンパク質分解性切断等のある種のプロ セスを実施できないこと、細菌がタンパク質の免疫原性に重要な翻訳後の修飾で あるタンパク質のグリコジル基化、リン酸化またはメチル化を行うことができな いこと、細菌が真核生物中における遺伝子生成物の分泌に重要ないわゆるシグナ ルペプチドを認識できないこと、さらにコドン優位（すなわち、それによってタ ンパク質のアミノ酸成分をコードづけする特定の核酸配列が発現される能力）が 原核生物と真植生物とでは異なる可能性があることとされている。 Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等、欧州特許出願番号１０５，１４１　。 微生物中でＨＢｓＡｇを発現する別の方法であり、且つ宿主として大腸菌を用い ることに対する反対理由の殆どを克服するのは、酵母発現系を用いる方法である 。このような発現系は一般に、細菌と酵母の双方において複製を行うことができ る配列を有するプラスミドである細菌−酵母シャトルベクターを使用する、　Ｒ ｕｔｔｅｒ等、欧州特許出願番号０７２＋３１８＋　Ｈｉｔｚｅｎｍａｎ等、欧 州特許出願番号０７３＋６５７＋　Ｃａｂｅｚｏｎ等、欧州特許出願番号１０６ ，８２８．およびＢｉｔｔｅｒ等、　Ｇｅｎｅ、　３２．２６３−２７４（１９ ８４）　、酵母は真核生物の遺伝子生成物の製造においていくつかの利点がある 。まず、酵母は一般的に安全であると認識されているＧＲＡＳ生物である。また 酵母は容易に大量に培養増殖させることができる。大規模な酵母培養技術は十分 に確立している。さらに、酵母細胞は真核生物であるので、グリコジル基化、リ ン酸化およびメチル化のプロセス機構を有する。加えて、酵母細胞はＨＢｓＡｇ タンパク質に対する耐性が高い＊　Ｒｕｔｔｅｒ等、」、■ｉ　ｔｚｅｍａｎ等 、」、さらに、酵母によって産生されるＨＢｓＡｇの免疫原性力は、哺乳類の細 胞内で産生された形態のものよりも低くなるのではないかという懸念はあるが（ Ｂｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等、　ｆＪｉ　）、酵母から得られた粒子のＨＤｉｏ 　（免疫応答を引き出すのに必要な有効量の計量単位）は１１２■であり、これ は哺乳類細胞から得た粒子のＥＤｓ・の９８ｗよりもわずかに高いだけである。 　Ｂｕｒｎｅｔｔｅ等、ｒ現代のワクチンに対する考え方Ｊ　（Ｍｏｄｅｒｎ　 Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）＋Ｃｈａｎｏｃｋ等編集＋　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　２４５−２５０　（１９８ ４）　ｅ酵母中でＨＢｓＡｇポリペプチドを製造する際に重要な商業上の考慮要 素は、１グラム当たりの費用である。この費用は、（ｌ）酵母の増殖を促進し、 （２）ＨＢｓＡｇポリペプチドの産生を促進するか、一旦産生されたＨＢｓＡｇ ポリペプチドの破壊を防ぐことによって、低減される。 酵母増殖法の一つにおいては、グルコース量を抑えた条件において培養を行い、 それによって、グルコースを比較的に低濃度に保持し、増殖速度が一定の値を超 えるのを防ぎ、さらに酸素を比較的に高濃度に保持する。このような技術を用い ることによって、エタノールの形成を最小限に抑えるｅ　Ｆｉｅｃｈｔｅｒ等、 。 ＾ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐｈｙｓｊｏｌｏｇ　＋　２２ ＋　１２３−ＩＢ３　（１９８１）＋Ｒｅｅｄ等、　Ｙｅａｓｔ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇ　＋　ＡＶＩ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、＋　Ｉｎｃ、、　Ｗｅｓｔ −ｐｏｒＬ　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　（１９７３Ｌ　ｐｐ、　５３−８１　ｅ 例えば、コンピューターと結合させたバイオリアクター内でのコンピューター制 御によるパン酵母の生産においては、バッチ供給培地にグルコースを添加する速 度の自動制御のフィードバックパラメータとして、呼吸比ＲＱ　（産生されたＣ Ｏ！モル／消費したａｔモル）ならびにエタノール濃度を用いることがある。　 ５ｌｏｅｈｒｅｒ等。 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ、＋　２３＋　５６７−５８１　（１９ ８１Ｌ、たとえば、　Ｂｉｔｔｅｒ等、　Ｇｅｎｅ、　３２．２６３−２７４　 （１９８４）を参照されたい。 組換え遺伝子生成物を発現する酵母の培養のための培地成分には下記のものがあ る＊　５ｐｉｚｉｚｅｎの最少培地中のグルコース０．２％−／ｖ　（Ｂｅｇｇ ｓ　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７５．　１０４−１０９　（１９７８））　、　ｌ ｌｌＢｓＡｇ発現用の、ペプトン２％（ｗ／ｖ）およびグルコース２％を有する ＹＥＰＤ、すなわち、酵母窒素塩基６．７　ｇ／　ｌ　、カザミノ酸５　ｇ／ｌ およびグルコース２０　ｇ／　ｊ！　（Ｒｕｔｔｅｒ等、欧州特許出願番号７２ ＋３１８）　ｅ　ＨＢｓＡｇ発現用の３０℃のＹＮＢ−ロイシン（［ｌｉｔｚｅ ｍａｎ等、欧州特許出願番号７３６５７　）　、　ＨＢｓＡｇ発現用の、酵母窒 素塩基０．６７％、トリプトファン遊離カザミノ酸０．５％およびグルコース２ ％（Ｖａｌｅｎｚａｅｌａ等、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９８．３４７−３５０　（ １９８２年）〕。 ＨＢｓＡｇ発現用の、グルコース２％、酵母窒素塩基アミノＭ０．７％およびＹ ＰＤ　２％（ポリペプトン２％、酵母エキス１％およびグルコース２％）１　ま たはＹＰＤのみ、または３０℃のＢｕｒ’ｋＨｏｌｄｒ最少培地（Ｍｉｙａｎｏ ｈａｒａ等、欧州特許出願番号１０５．１４９番〕、キシルロースからエタノー ルを生産するための大気温度（約２４℃）の酵母エキス８．５　ｇ／　Ｉｔ　（ Ｇｏｎｇ等１合等間合衆国特許番号４０．４６８）　、ＨＢｓＡｇ発現用の、酵 母エキス１％、ペプトン２％、およびグルコース２％（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ等 、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　＋　３＋　３１７−３２０　（１９８５）　）　 、ならびにグルコアミラーゼ発現用の、酵母最少塩培地にグルコース２％または 加水分解したコーンスターチ１０％（平均ポリマーサイズが１３から１７グルコ 一ス分子のもの）または連続グルコースを加えたもの（Ｉｎｎｆｓ等、　５ｃｉ ｅｎｃｅ＋　２２８＋２１−２６　（１９８５）　）　、このような培地は、酵 母のバッチ増殖に使用されており、一般的には細胞の濃度は低下し、そしてまず ＨＢｓＡＨの発現レベルは低くなる０例えば、振盪機フラスコ中のＶＭＳ培地で 増殖させた細胞の）ＩＢｓＡＨの収量は、普通には僅か５０〜２００　ｎｇｌｏ ｏ　ｍ　Ａに過ぎない。 酵母中で外来ポリペプチドを発現するための望ましい培地ならびに望ましい一連 の培養条件を確定する必要があると思われる。 ３１坏と１枚 本発明は、外来遺伝子生成物を発現させることができる酵母を培養するための培 地を提供する。さらに、培地には、濃度が約２０　ｇ／　１から約１６０　ｇ／ ４１の間の均衡遊離アミノ酸が含まれる。 本発明はさらに、外来遺伝子生成物を発現させることができる酵母の増殖方法を も提供する。この方法によると、ｔＭ度が約２０ｇ／ｌから約１６０　ｇ／Ｉｔ の間の遊離アミノ酸を含む均衡培地中に酵母を導入する。酵母は約２５℃の温度 で培養する。 本発明に従う別の方法は、外来遺伝子生成物を発現することができる酵母を発酵 させるものである。酵母は約２５℃の温度で培養し、炭素源を零以上ではあるが 可能な限り零に近い濃度に保持し且つエタノールが蓄積しないような仕方で、培 養溶液を供給する。 匣ＷＪ　Ｏ）　ＰＪ　１１　ｆｔ　：藍吸第１図ハ、　ＨＢｓＡｇを発現する酵 母の発酵のための標準的な発酵操作を示す。 第２図は、第１図の操作におけるエタノール濃度、グルコース濃度およびＯＤ、 。。のプロットを示す。 第３図は、第１図の操作における増殖収量データを示す。 第４図は、最少培地および増面培地を用いた細胞増殖のＯＤＤ＠。 のグラフである。 第５図は９時間に対して細胞およびエタノール濃度をプロットしたものである。 第６図は、カザミノ酸を用いた場合と用いない場合の、エタノール上での酵母菌 株の増殖を示す。 第７図は、カザミノ酸の濃度が異なる場合の１時間に対する細胞濃度の比較プロ ットである。 第８図は、カザミノ酸を補給した培地を用いた操作の増殖プロフィールを示す。 第９図は、カザミノ酸を補給した培地を用いた操作の増殖プロフィールを示す。 第１Ｏ図は９本発明に従う培地を用いた操作の増殖プロフィールを示す。 第１１図は１本発明に従い低温においてなされた操作の増殖プロフィールを示す 。 第１２図は１本発明に従い最少培地を用い且つ低温においてなされた操作を示す 。 第１３図は１本発明に従う培地を用い且つ本発明に従う低温においてなされた操 作を示す。 翌豊星畿里 Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　をグルコース中で効果的に増殖させる高い細胞濃 度をうろことには、これまで２つの基本的な問題、すなわち、（１）生物の増殖 収量（グラムで示した酵母乾量／グラムで示したグルコース量）が低いこと、（ ２）文献にしばしば報告されているように、到達した最大細胞濃度は一般に３０ 〜８０ｇ酵母乾量／ｌよりも低いこと、が施った。 基質グルコースと、細胞生成物と二酸化炭素との間の炭素収支を判断するための 標準発酵操作において、グルコースの形で発酵桶に加える全炭素を測定する研究 を行った。 大施斑上 Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　の発酵によるＢ型肝炎表面抗原の製造に通常に用い る「標準ｊ操作を実施した。このような操作では、細胞は最初はグルコース５ｇ ／ｊを含む増面培地でバッチ式に増殖させる。８時間にわたって増殖させた後に 、濃縮グルコース、カザミノ酸、酵母窒素塩基およびビタミンおよび無機質を用 いて連続投与を開始した。その後、投与量は８時間毎に増加させた。 標準操作（１７６−３と呼ぶ）のバッチ培地は、グルコース６ｇ／　Ｉｌ＊　Ｋ ＨｇＰＯ＊　２　ｇ／　ｊ＋　（Ｎｕｎ）ｔＰＯａ　２　ｇ／　１．カザミノ酸 ２ｇ／ｍｌ、酵母窒素塩基’ｌ　ｇ／　ｊ　、　Ｍｇ５Ｏ＊　２　ｇ／　ＩＩ　 ＋　チアミン（１％溶液）　０．３　ｗＩｌ／１．　微量金属溶液Ａ　（ＦｅＣ １ｓ　６１１ｔＯ２７ｇ／　’、ＺｎＣ１ｔ　４１］ｔ０２．Ｏｇ　／　ｌ　、 ＣａＣ１ｍ　・６）１ｔ０２．Ｏｇ／　ｌ、ＮａＭｏ０＊・２１１ｇ０２０　ｇ 　／Ｉｔ、ＣａＣ１ｇ　−２ＨｘＯ１，Ｏｇ／ｊ、Ｃａ５Ｏａ　・５ＯｇＯ１， ９ｇ／　Ｉｔ　、　ＨｓＢ（ｈ　０．５　ｇ／　ｌ　、および濃縮塩酸１００■ Ｉｒ／Ｉｌ）１ｍ　ｊ！　／　ｌ　、ビタミン溶液＾〔リボフラビン０．４２　 ｇ／ｌ　、パントテン酸５．４ｇ／ｊ、ナイアシン６．１ｇ／ｊ、ピリドキシン １．４ｇ／ｊ！、ビオチン０．０６　ｇ　／　１　、および葉酸０．０４　ｇ／ 　ｌ　）　１ａｌｌ／ｌを含む、標準操作の添加培地は、グルコース４００　ｇ ／１１　、　Ｋ）ＩｚＰＯ＊　５　ｇ／　ｌ　、　（Ｎｕｎ）ｔＰＯ＊＋　カザ ミノ酸１００　ｇ／Ｌ酵母窒素塩基１２　ｇ／　ｊ　、　Ｍｇ５０４５　ｇ／　 ｌ　、チアミン（１％溶液）０．３　ｍＪｌ／ｊ、微量金属溶液Ａｌ５ｊ／ｊ、 およびビタミン溶液Ａ１ｍＪ／１を含む。 操作１７６−３において、質量分析器を用いて発酵桶からの排気の００８と０． をモニターし、これらの値を４時間ごとに記録した、このデータを第１図にグラ フで示す、これに加えて、４時間ごとに試料を採取して遠心分離機にかけ、さら に後で分析を行うように培養液の上清を凍結させた。 培養ブロスのグルコース分析によると１発酵過程の終始、グルコースは限定され ていた。すなわちその濃度は１００　ｍｇ／　ｌを下回った。従って、グルコー スと、ＣＯ８および細胞との炭素収支を調べ、全てのグルコースが計量されてい るか調べた０発酵の全体経過時間にわたる収支は、第１図のＣ０８データをグラ フを用いて積分することによって得た。この積分によると１発酵過程において１ １．１５モルのＣＯｏが生成したことが分かうた０発酵の終了時には、総計１６ ３０．のグルコースが消費され＋　１７７　ｇの酵母が得られた。酵母の炭素を ５０％と想定すると、その内訳は下記のようになる。 グルコース１６３０　ｇ　−→ＣＯ□４９１ｇ＋酵母１７７ｇまたは、炭素を基 にして見ると。 Ｃ６５２ｇ　−→Ｃ１３４ｇ＋ＣＢ８．５　ｇ言い換えると、　６５２−（１３ ４＋８８．５）　−４２９ｇの炭素、ないしはグルコース６６％が計量されてい ない、培養液上清のビウレントタンパク質検定（Ｂｉｕｒｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ 　ａｓｓａｙ）を行ったところ、培養液上清には微量のタンパク質しか存在しな いことが判明したので、細胞外の分泌タンパク質は炭素欠乏域として除外した。 グルコースは、２つの仕方のいずれかで、酵母によって代謝される。酸化経路に よるグルコースの完全な酸化では、下記の反応 （１１ＣｈＨｌｔＯｂ　−→６ＣＯｔ　”　６　ＨｔＯ＋　細胞の際に大量の工 ゛ネルギー（ＡＴＰ　１６〜２８モル／グルコース１モル）が発生し、さらにＲ Ｑ　（呼吸比　＝　生成Ｃｏｔのモル数／消費した０２のモル数）が１．０〜１ ．２であることが特徴である。一方１発酵経路を経る部分酸化では、下記の反応 ＋２１　ＣｈＨ，ｔＯｈ　−→２Ｃ＊ＨｓＯＨ＋　２ｃｏ、十　細胞に基づき、 低エネルギー収量（ＡＴＰ　２モル／グルコース１モル）であり、ＲＱ＞＞１． ０である。 第１図のＲＱデータを見ると、　ＲＱＯ値が一貫して３．０を上回っていること がわかる。したがって、相当な発酵代謝が生じていたわけである。これはブロス 中のエタノール濃度を測定することによって検証した。操作１７６．３のエタノ ール、グルコース。 ＣＯ３および００．。。のプロフィールを第２図に示す０発酵の終了時には、７ ３ｇ／ｊ！のエタノールが培養液中に蓄積し、これは総計３８１　ｇの炭素に相 当した。この値を下記の炭素収支（３）　グルコース−→ＣＯ！　十　酵母　＋ 　エタノールに加えると。 炭素６５２ｇ　−→　炭素１３４ｇ＋炭素８８．５　ｇ＋炭素３８１ｇとなり、 炭素回収率は９２％となる。残りの炭素欠損分は、はとんど排気中へのエタノー ルの喪失と測定誤差によるものと考えられる。 酸化経路から発酵経路へのこのトランジシランの効果はさらに、第１表ならびに 第３図に示す操作１７６−３の酵母増殖データ（ｇで示した酵母乾量／ｇで示し たグルコース量）にも見ることができる。前述の図においては、ＯＤ、。。（６ ００ｎｍにおける光学密度）をＡで示し、　Ｃｏ１のパーセンテージはＢとし、 グルコースの濃度（ｇ／ｌ）はＣとし、さらにエタノールの濃度（ｇ／　ｊりは Ｄで示した。 星上表 エタノール　グルコース 扛過薩Ｍ　ｕＬＬＬ　狂亘ル　−ＬＬ６Ｑ−」」ＺヱＬ　皿ＬＸ１　０．３０　 ４　０．５０　０’　０．５０５　０．４０　５　２　０　１ ９　Ｑ、８０　５　３　０　０．４０ １３　１．５０　３　６　０　１．５０１７　２　５　１１　０　０．４０ ２９　７．５０　４．３０　２　０　８．８０３３　９．３０　５　３６　０　 １．７０３７　１２．５０　５　４９　０　９．８０４１　１５　５　４５　０ ．１０　１０．５０４９　１３　５　７３　０．２５　８ グルコースの酸化代謝はＡＴＰ　１６〜２８モル／グルコース１モルを発生する が１発酵において後に優位となる発酵代謝は約１／１０のエネルギーすなわちＡ ＴＰ　２モル／グルコース１モルしか発生しないので２時間の経過に伴って酵母 増殖の収量の低下が予測される。 このように、呼吸比、増殖収量およびエタノール濃度のデータを調べると、Ｓ、 　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの添加バッチ増殖においては。 グルコースからエタノールへの発酵代謝が盛んであることが分かる。この種の代 謝は、グルコースからのエネルギー収量が低く、その結果、酵母細胞の収量も低 い、さらに、産生されたエタノールは、最大比増殖速度を低下させる。エタノー ルは、酵母の非共存性の増殖抑制因子として知られており、下記の式に従う。 （４１／ｊｅｔ−μ、　（［（暴）／（ｉ　＋Ｋ　ｉ　）式中９μｍは、抑制定 数に、の増殖抑制因子が濃度ｉで存在する場合の、低下した最大比増殖速度であ る＊　Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖に影響を及ぼすエタノールのＫ１４Ｉ Ｌは、おおよそエタノール２５ｇ／ｌであると報告されている。したがって、エ タノールの生成量が増せば増すほど、グルコースの添加量を次第に増しても、最 大比増殖速度は低下する。酵母の最大比増殖速度はグルコースの添加速度よりも 低いので、酵母細胞に唯−残された道は、さらに多くのエタノールを産生ずるこ とである。 酵母によるグルコースのエタノールへの部分酸化は、（ｌ）　溶解酸素濃度が低 いこと、Ｇ２）グルコースが過度に存在すること、あるいは（３）　比増殖速度 が高すぎることの３つの条件のいずれが存在すると発生する。実施例１において は、（１）　酸素量は十分にあり、伐）グルコース濃度は零に近いレベルに保持 され、（３）　グルコースの添加速度が細胞の最大比増殖速度を大幅に上回るの で、細胞の増殖速度は最大レベルに保持される。この点に鑑み、実施例２では、 培養物の比増殖速度をもっと低いレベルに保って、（１）グルコースから得られ る細胞の増殖収量をもっと高め、（２）抑制作用を持つエタノールの濃度が生じ ないようにして高い最終細胞濃度を得るようにする実験を説明する。 尖１１重 項地成分および添加速度の一研究において、菌株ＳＣＲＨ２１８／ｐＧＰＤ−１ のＨＢｓＡｇ発現細胞〔この構成については、　Ｂｉｔｔｅｒ等。 釦匣９皿、　２６３−２７４　（１９８４）に記載されている〕は、３０℃。 ｐＨ４，５において、一つの操作（１９３−２と呼ぶ）においては最少培地上で 増殖され、別の操作（１７６−３と呼ぶが、実施例１に記載されている）におい ては、酸加水分解したカザミノ酸を補った増面培地上で増殖された。この結果を 第４図に示す０図において、最少培地で増殖された細胞のＯＤ＆・。のグラフを ガで示し。 また増面培地（操作１７６−３において記載したもの）で増殖されたｍ胞のＯＤ ＆、。のグラフはＲで示す。 最少ハツチ培地には、下記の成分が含まれる。グルコース５ｇ／β、に辻ＰＯ４ ５ｇ／　ｌ、　ＣＮＨ＊）ｚｓＯａ　２　ｇ／ｊ、　１　？Ｉ　Ｍｇ５Ｏｓ１− り１１，１％チアミン溶液　０．２　ｗｌｌｌ／　１１．微量金属溶液ＡＩ　鋼 ｌ／！、ビタミン溶液Ａ　１　＋ｍｊ／　ｊ、イノシトール０．０２　ｔｔ／ｌ およびＤＯ−・Ｐ２Ｏ００（平均分子量約２０００のポリプロピレングリコール ）　０．１７　ｇ／　７４．最少添加培地には、下記の成分、すなわち、グルコ ース４００　ｇ／　ｌ　、ＫＨｔＰＯ＊　２５　ｇ／　ｌ　。 （ＮＨ＃）ｇＳＯａ　６４　ｇ／　ｊ、ＩＭ　Ｍｇ５Ｏ９１５ａｌｌ／　１，１ ％チアミン溶液０．５ｍｊ／Ｊ、微量金属溶液Ａ　Ｏ，５ｗｉｌｌ／　ｌ、　ビ タミン溶液へ〇、５−１７１４およびイノシトール０．０５　ｇ　／　ｊが含ま れていた。 最少培地での増殖では、細胞濃度０Ｏ−２４（細胞乾量２６ｇ／ｌ）が得られた 。２４時間経過後には１発酵槽にグルコースを追加するのを止めた。２４時間経 過時点から３２時間経過時点までの間に、エタノールの濃度はＵｇ／ｌから９ｇ ／Ｊまで低下したが、細胞濃度は増加しなかった。このように、最少培地上で増 殖させた細胞は、第５図かられかるように、培地内に蓄積したエタノールを有効 に細胞生合成に利用しなかった。 この菌株は、ディオキシ−を示す、即ち、　ＶＭＳ中のグルコースおよびエタノ ールによって二段階の増殖を行うので、振盪機フラスコ実験を行い、酸加水分解 したカザミノ酸を少量補った培地中で、産生されたエタノールを用いて細胞を増 殖させることによって、細胞が高い細胞濃度まで増殖するかどうかを調べた。　 ＶＭＳ培地は、アミノ酸を含有しない酵母窒素塩基（Ｄｉｆｃｏ。 Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ　４８２３２）　６．７　ｇ　／　ｌ　＋ 　カザミノ酸５ｇ／ｊ（ＢＢＬ、ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔ ｅｍｓ、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ。 、　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２１０３０）＋およびグルコース２０ ｇ／ｊから成る。最少培地（１００ｓＭ　（ＰＯａ）　−ｔ、　ＮＨａＣｌ　１ 　ｇ　／　ｊ、　ＮａＣ１０，５ｇ　／　ｊ　、　０．００２　Ｍ　ＭｇＳＯ４ ，０，０００２Ｍ　ＣａＣ１ｇおよびグルコース５ｇ／ｊりにカザミノ酸３ｇ／ ｊ！を加えたものを、複数の同一フラスコに入れて行ったこの実験の結果を第６ 図に示す、第６図に示すように、カザミノ酸を培地に加えた場合には、エタノー ルを用いた増殖の速度がずっと高まる。 温度３０℃、　ｐＨ４，５において、バッチ増殖培地中に濃度５ｇ／ｌないしは Ｌｏｇ／ｊ！のカザミノ酸を加えて増殖させた場合の。 時間経過に伴う細胞濃度の変化を第７図に示す、第７図において、バッチ培地に カザミノ酸１０ｇ／ｊ！を含み且つ添加培地にカザミノ酸２０ｇ／ｊを含む場合 の操作（２１１−６と呼ぶ）の結果をＨで示し、バッチ培地にカザミノ酸５ｇ／ ｌを含み且つ添加量”地にカザミノａｌＯｇ／Ｊを含む場合の操作（２１１−５ と呼ぶ）の結果のグラフをＬで示す、操作２１１−５と２１１−６のエタノール 濃度は、エタノール２ｇ／　ｊを超えることは無かったが、増面培地を用いた操 作１７６−３のエタノール濃度は９発酵の終了時にエタノール７０ｇ／ｊを上回 った。操作１７６−３の時間経過に伴う細胞濃度のプロットを、第７図に線Ｎで 示しである。 操作２１１−５のバッチ培地は、グルコース２１／Ｉｔ、カザミノ酸５　ｇ／　 ｌ、　ＫＨｔＰＯａ　５　ｇ／　ｌｌ＊　（ＮＨａ）ｘｓＯａ　２　ｇ／　Ｌ　 ＩＭ　Ｍｇ５Ｏｔ１　ｗａｌｌ／　ｌ、　１　％チア　ミ７０．２　ｍｌ／　Ｊ ！、　１に壷金ｘｉ液Ａ１ｗｊ／ｊ、　ビタミン溶液Ａ１ｍｊ！／Ｊ！およびｎ ｏｗ　・Ｐ２Ｏ０００，１１７ｍ　ｌ／　ｊを含んでいる。操作２１．１−５の 添加培地は、グルコース２７５ｇ／ｆｆｉ、カザミノ酸１０　ｇ７ｉ、　ＫＨ， ＰＯｔ　２５　ｇ／ｊ！、（ＮＨａ）ｔｓＯａ　５０　ｇ　／１．　ＩＭ　Ｍｇ ＳＯ４１５ｗｉｌｌ／　Ｊ、１％チアミン１ｍｌ／１．微量金属溶液Ａ　’１． ５ｗｂｌ／　ｌおよびビタミン溶液Ａ　２．５ｍｊ／　Ｉｔを含んでいる。操作 ２１１−６のバッチ培地は、グルコース２ｇ／Ｉ！、カザミノ酸１０　ｇ／　ｌ 　、　ＫＨｔＰＯａ　５　ｇ／　ｊ、　（ＮＨａ）ｔｓＯ４２ｇ／ｊ！、　ＩＭ 　Ｍｇ５Ｏ＊　１　ｍｌ／　１．１％チアミン０．２ｍＡ／ｊ、微量金属溶液Ａ ｌ５ｉｊ！／Ｉｔ、ビタミン溶液＾１ｍｌ／　ｌおよびＤｏｗ　・Ｐ２Ｏ０００ ，１７ｍ　ｊ！／　ｌを含んでいる。 操作２１１−６の添加培地は、グルコース２７５　ｇ／　ｊ！　、カザミノ酸２ ０　ｇ／　ｊ！　、　ＫＨｔＰＯａ　２５　ｇ／　ｌ　、　（ＮＨオ）ｔｓＯ４ ５０ｇ　／　ｌ。 ＩＭ　Ｍｇ５Ｏ＊　１５　ｗｘｌｒ／　Ｊ、　１％チアミン　ｌ　ｖａ　ｊ／　 ｊ、微量金属溶液Ａ　２．５　ｗｓｌ／　ｌおよびビタミン溶液Ａ　２．５１１ Ｊ／　ｊを含んでいる。 エタノールの毒性蓄積を避けるために、生物の比増殖速度を一定レベル未満に保 持しなければならない、前述のように、操作１７６−３では、エタノールの蓄積 が７０ｇ／Ｊを超えたために。 ＋１１　増殖収量が大幅に低下しく０．１２　ｇ細胞乾量／グルコースＩｇまで ）、さらに、（２）増殖速度および最終細胞濃度が（１６ｇ細胞乾量／ｌまで） 抑制された。しかし、操作２１１−６では、増殖速度はグルコースの添加速度に よって慎重に制御され、さらに培地中にエタノールが蓄積しなかったので、　Ｔ ｘｌ　Ｏ，３４ｇ細胞乾量／グルコース１ｇまで増殖収量が増加し、さらに、（ ２）細胞濃度が（６８，２ｇ細胞乾量／ｊ！まで）増加した。 操作２１！−５および２１１−６では、エタノールの蓄積を避けるために、グル コースを非常にゆっ（りとした速度で発酵槽に添加した０発酵槽の生産性を高め るには、エタノールの蓄積が始まる寸前まで添加速度を高めることが望ましい、 これは、エタノールおよび呼吸比（ＲＱ）をモニターすることによって、経験的 に達成することができる０代替方法としては＋　Ｈｏｅｈｒｅｒ等、届ｅｃｈｎ ｏ１．　Ｂｉｏｅｎ　、２３＋　５６７−５８１　（１９８１）に開示されてい るように、　ＲＱに対するグルコース添加量のコンピューター接続制御を用いる ことができる。 実施例３では、　Ｂｉｔｔｅｒ等、　Ｇｅｎｅ、　３２．２６３−２７４　（１ ９８４）に記載されたように、プラスミドｐＧＰＤ−１を含有するＳ、　ｅｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ（Ｒ１１２１８）　Ｗ株ＳＣＲＨ２１８／ｐＧＰＤ−１が、　２ ００　ｇ乾量／ｌの細胞濃度まで（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｅ　２０　（Ｂａｕｓｃ ｈｅ　＆　Ｌｏｍｂｅ＋　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ＋ＮｅｗＹｏｒｋ）またはベック マン分光光度計（Ｂｅｃｋｓ＋ａｎ　５ｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏ−ｓｅｔｅｒ） で測定してそれぞれ１９０および４６０の０Ｄｉｏｅに等しい〕の増殖、および 高レベルのカザミノ酸が存在する場合に１．８　ｍｇ）ＩＢｓＡｇ　／乾量細胞 １　ｇ　（６００ｎｇ　ＨＢｓＡｇｌｏｏ−＋ｗ　ｊに等しイ）ノ発現レベルを 示した事例について述べる。 叉丘■主 実施例２のカザミノ酸を用いた操作の双方において、　ｔ　−４０時間とｔ−５ ０時間に、意図しない培地のマグネシウムが欠乏し増殖しなくなるｒ不感時間（ ｄｅａｄ　ｔｉｍｅ）　Ｊがあった。　ｌ’１ｇ５Ｏ４を追加するまで培養物は 増殖しなかった。マグネシウムの欠乏が起きたのは、この培地のグルコースの使 用効率をもっと低く計画していた。すなわち、増殖収量を０．１５　ｇ細胞乾量 ／グルコース１ｇとしていたためである。培地が平衡し、かつ実際の増殖収量が もっと大きくなった時、すなわち０．３４　ｇ細胞乾量／グルコース１ｇとなっ た時には、他の栄養素が増殖の限定要因となった。新しい増殖収量を考慮した新 しい培地は、この意図しない栄養素の消耗を避けるためのものである。バッチ培 地の成分を第■表に示す。 星↓去 清浄水　７Ｅ 酸加水分解したカザミノ酸　２０２ｇ ＫＨｇＰＯｎ　１０８　ｇ （ＮＨ４）　＊ＳＯａ　３０　ｇ グルコース　１６　ｇ イノシトール　０．１６　ｇ ＭｇＳＯ４（ＩＭ）　３２　ｓｊ 微量金属溶液Ａ　２４　腸１ Ｄｏ−・Ｐ　２０００泡消剤　１　ｓｊチアミン溶液（１％）　３．２　１１４ ビタミン溶液＾　２４ｍ１ ｐＨを４．５に保つために、必要に応じてＮ）ＩａＯＨ（Ｎｕｓとして３０％ｗ ／ｗ）および！１３ＰＯ４（８５％−ｗ）を添加した。 グルコース、イノシトールおよびＭｇ５Ｏｎを清浄水中で混ぜ合わせ、液量を２ ００　ｍｌに調節し、オートクレーブに入れて１２１℃に約３０分間保つ０次に ９発酵桶に入れた約７．０ｉの清浄水に、微量金属溶液Ａ、　１％チアミン溶液 およびビタミン溶液＾を無菌的に加えて、溶液１ａをつくり、さらにカザミノ酸 。 ＫＨｚＰＯａ、　（ＮＨＪ　ｔｓＯａおよび泡消剤を加える。まず発酵槽を殺菌 し、それから約３０℃まで冷却する０次に溶液１ａを発酵槽に加える。 添加培地の成分を第■表に示す。 第１表 清浄水　量大６　ｌまで グルコース　３２００　ｇ カザミノ酸　６５６ｇ ）［）ＩｇＰＯａ　１７．１　ｇ （ＮＨＪ）　ｇｓＯａ　３０　ｇ ＭｇＳＯ４７）１ｚＯ（Ｉ　Ｍ）　９０　−１ｌチアミン溶液（１％＞　８．６ 　ｍｌ 微量金属溶溶液　４０．５　ｔａｌｌ ビタミン溶液Ａ　４０．５　ａｌｌ イノシトール　０．２ｇ グルコース、イノシトールおよびＭｇ５Ｏａを最大４１までの清浄水中で混ぜ合 わせて溶液１ｂをつくり８さらにオートクレーブに入れて約１２１℃に約３０分 間保つ、カザミノ酸、　ＫＨｇＰＯｔおよび（ＮＨ４）オＳ０４を最大２１まで の清浄水中で混ぜ合わせて溶液１１ｂをつくり、これをオートクレーブに入れて 約１２１℃に約３０分間保つ、溶液ＩｂおよびＩＩｂを室温まで冷却し、それか ら無菌的に混ぜ合わせる０次に、チアミン溶液、微量金属溶液＾およびビタミン 溶液＾を溶液１ｂとＩｌｂの混合液に加える。 この新しい培地を用いて、実施例２のグルコース添加状態のもとで、　ＳＣＲＨ ２１８／ｐＧＰＤ−１を高い細胞濃度まで増殖させた。この培地を用いて行った ２２６−４と呼ぶ操作において。段階的な添加スケジュール、および攪拌９通気 ならびに背圧を制御（発酵ブロスへの十分な酸素移送を行う）した結果、細胞濃 度は６００ｎｍにおいてスベクトロニツタ２０分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉ ｃ　２０ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定したところ１９０を超え ていた。第８図に、操作２２６−４　（３０℃、　ｐｕ　４．５）の細胞濃度を Ａ（ＯＤｉ＊＊）として、ブロス（ＸＩＯ）　Ｉ　Ｊあたりの−ｇ数で示したｌ ＢｓＡｇの濃度をＢとして、さらに比ＨＢｓＡｇ濃度（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ のＲＩＡ　Ａｕ５ｒｉａ＋単位ｎｇ１００　１１Ｊ、　６００　ｎｇ　ＨＢｓＡ ｇｌｏｏ　−ｗｉｇ　＝１．８　ｗａｇ　ＨＢｓＡｇ／乾量細胞１ｇである）を Ｃとして示す。 操作２２６−４のバッチ培地は、グルコース２ｇ／Ｌ　カザミノ酸５　ｇ／　ｊ ！、　ＫＨｚＰＯａ　１３．２　ｇ　／１．　（ＮＨｅ）ｇｓＯａ　１０　ｇ／ 　１１％Ｍｇ５Ｏ＊　８園！、７１１％チアミン０．４■Ｊ／　ｚ、微量金属溶 液Ａ３　ｍｅ／　ｌ、　ビ９　ミ、７溶ＫＬ　Ａ　３　ｖａｌ／　ｌおよびイノ シト−Ｊし０．０２　ｔｅｌを含んでいる。操作２２６−４の添加培地は、グル コース５２８．５　ｇ／　Ｉｔ　、　Ｋ）ｌｔＰＯｅ　２．８６　ｇ　／　ｌ　 、　（ＮＨ，）ｇｓＯａ　０．５０ｇ／　ｌ、ＬＭ　Ｍｇ５Ｏｅ　１５　ｉｓｊ ！／　’、１％チアミン１．４３　ｍｌ／Ｉｔ、微量金属溶液Ａ　７．１４ｍＪ ／　ｌ、ビタミン溶液Ａ　７．１４ｍｊ！／ｌおよびイノシトール０．０３　ｔ ｅｌを含んでいる。 第８図において、　）ｌＢｓＡｇ濃度は、発酵を開始してから約７０時間で３３ 　ｍｇ　ＨＢｓＡｇ／　Ｊのピークに達する（００１２０）、この点に達した後 は、細胞濃度はさらにＯＤ約１９０まで上昇するにもかかわらず、　ＨＢｓＡｇ 　ｔ１度は発酵が終了するまで急激かつ連続的に低下する。 ウェスタンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）によって、この時間間隔に抗 原タンパク質の単位あたり量が低減することが確認され。 したがって、　ＲＩＡ　ＨＢｓＡｇ粒子濃度の低減は、少なくとも部分的にはタ ンパク成分の低減によるものと考えることが出来る。・しかしながら、抗原タン パク質がタンパク分解を受けているのか、ないしは単に抗原タンパク質が細胞に よって合成されておらず９発酵の早期に産生されたものが抗原タンパク質をわず かしかあるいは全く持たない細胞の増殖によって希釈されているのかは、明らか ではない。 タンパク分解は、ゆっ４りと増殖している細胞、あるいは固定相にある細胞、あ るいは最少培地で増殖する細胞、あるいは最適温度を上回る温度で増殖する細胞 においては一般に最高に達する。操作２２６−４の細胞は、はんのわずかのカザ ミノ酸を補った最少培地で増殖させたために、最初のアプローチは、増殖培地の カザミノ酸を増やすことであった。実施例２の操作２１１−５におけるバッチ培 地および添加培地は、カザミノ酸５ｇ／ｌと１０ｇ＃を、それぞれ開始後の約３ ８時間後と５４時間後に注入したことを除くと、　２２６−４で用いた培地と類 僚している。 第９図においてはＯＤｈ＊。をＡとして示した０図に示すように、　２１６−６ と名付けた操作においてカザミノ酸を添加したことによって、　ＨＢｓＡｇを５ ５時間後から７５時間後にわたってｒ安定ｊさせるのに役立った〔標識Ｂの（Ｂ 　ＨＢｓＡｇ／　ｌ　）　Ｘ　１０のプラトー（平らな部分）に注意〕だけでは なく、抗原の単位あたり量（ｎｇｌｏｏ　−−ｊを単位とする）　〔標識Ｃ〕が ３８時間後と５５時間後に劇的に増加した。カザミノ酸によってＨＢｓＡｇのタ ンパク分解喪失が低下したのか、　ＢＢｓＡｇの産生を刺激したのかは別とじて 、最終的にはＢＢｓＡｇ量は増加した。 操作２１６−６のバッチ培地は、グルコース２　ｇ／　’　＋　カザミノ酸５　 ｇ／　ｌ、　ＫＨｇＰＯｔ　１３．２　ｇ　／　ｌ、　ＣＮＨｓ）ｚｓＯａ　１ ０　ｇ／　１．１ＭＭｇＳＯ４４ｍ　１／　１．１％チアミン０．４ｗｂｌ／ｌ 、微量金属溶液Ａ１ｍｆｆ１／Ｃビタミン溶液Ａ１ｍｊ！／Ｊ！、フィルター滅 菌イノシトール０．０４　ｇ／　ｌおよびＤｏｗ　・　Ｐ２Ｏ０００，２ｍｌ／ 　ｌを含んでいる。操作２１６−６の添加培地は、グルコース５２８．５７　ｇ ／　ｌ　、　ＫＨｇＰＯｔ　１．８６　ｇ　／　ｌ　、　（ＮＨａ、）□Ｓｏｐ 　５０　ｇ／　ｌ　、ＩＭ　Ｍｇ５Ｏｅ１５ｓ　１／　１，１％チアミン１．４ ３　輪ｔｔＩ　Ｌ微量金属溶液Ａ２．８６　＠Ｉｌ／　Ｉｌおよびビタミン溶液 ＾　２．８６ｍｊ／　βを含んでいる。 ＨＢｓＡｇ低減の原因として考えられるものは、プラスミド喪失ないしは発酵槽 での培養物の変異であった。この仮説を試験するために３発酵中に４時間から８ 時間ごとに試料を採取し、非選択性ＹＰＧ培地〔酵母エキス（ＢＢＬ＋　Ｃｏｃ ｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄから入手）１０ｔｅｌ、バタトトリブ トン（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）　（ＢＢＬ＋Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ 、　Ｍａｒｙｌａｎｄから入手）２０ｔｅｌ、およびグルコース２０ｇ／ｊりで 平板培養し、それから選択性ＶＭＳ培地で平板培養を再び行った０発酵の試料採 取を行った各時点において、プラスミドの安定性は９０％を上回９た０次に、　 ＨＢｓＡｇが低減している発酵の後期の一時点からランダムに２０個のコロニー を取り出した０次にこれらのコロニーを２０個のフラスコに用意したＶＭＳ培地 に植えつけ９回転振盪機にかけて４８時間にわたって増殖させた。全てのフラス コ内の培養物は１発現レベル１００〜２００　ｎｇ　ＨＢｓＡｇ／　００−　ｗ ｒｌでＨＢｓＡｇを産生した。したがって、培養の不安定性は、　ＨＢｓＡｇ低 減の原因ではないことが確認された。 カザミノ酸のシッント添加によってＨＢｓＡｇのレベルが増加したことから、操 作２４８−４と呼ぶ次の発酵操作では、バッチ培地および添加培地のカザミノ酸 のレベル増加をそれぞれ増加させ。 た〔（バッチ培地：操作２１１−６および操作１７６−３の５ｇ／２に対して２ ０ｇ／ｊとする）（添加培地：操作２１１−６および操作１７６−３のＯｇ／ｊ に対して１１０ｇ／Ｊとする）〕、第１０図に、操作２４Ｂ−４の３０℃、　ｐ ）１４．５　における００．。。のプロフィールをプロントＡとして、　ｗｇ　 ＨＢｓＡｇ／　ｌのプロフィールをプロットＢとして、そしてｎｇ　ｆｌＢｓＡ ｇｌｏＤａｌｌのプロフィールをプロットＣとして示す、　ＨＢｓＡｇの発現レ ベルは５発酵過程を通じて約２００ａｇ　ＨＢｓＡｇｌｏｏ　−ｅｂｌに一定に 保たれていることがわかる。操作２４８−４では、　ＨＢｓＡｇ産生の安定性が 向上することが望まれた。 しかし２００　ｎｇ　ＨＢｓＡｇ　１００−　ｍｌの発現レベルは、操作２１１ −６よりも２〜３倍低かった。 操作２４Ｂ−４のバンチ培地は、グルコース２　ｇ／　ｌ　＋　カザミノ酸２５ ．２５　ｇ／　ｌ　、　ＫＨｔＰＯａ１３．５　ｇ／　１　、　（ＮＨａ、）ｔ ｓＱｎ　３．７５　ｇ／　ｌｌ　。 ＩＭ　Ｍｇ５Ｏｅ　４　ｍｌ／　１．１％チアミン０．４　ｍｌ／１．ｌｘ量金 属熔液Ａ３ｓ＋ｊ！／ｊ、ビタミン溶液Ａ３ｉ＋ｊ！／ｊ！、イノシトール０． ０２　ｇｚｌおよびＤｏｗ　・Ｐ２Ｏ０００，１３ｗｈ　Ａ／　１を含んでいる 、操作２４８−４の添加培地は、グルコース５３２．５　ｇ　／　１２　、カザ ミノ酸２０９．２５　ｇ／Ｉｔ、　ＫＨｌＰＯａ　２．８５　ｇ　／Ｌ　（ＮＨ ４）！Ｓ０４　５　ｇｚｌ、　ＩＭ　Ｍｇ５Ｏａ　１５　ｍ　ｊ／　Ｉｌ、微量 金属溶液Ａ　６．７５　ｖａｔ／　１およびビタミン溶液Ａ　６．７５ｍ＋［／ 　ｊ、イノシトール０．０２　ｇｚｌおよびＤｏｓ　”　Ｐ２Ｏ０００，１３蒙 ｔｔ１　ｉを含んでいる。 実施例３では、カザミノ酸の拍動性および連続性の添加はいずれも、　ＨＢｓＡ ｇ粒子の形成を安定させるのに役立った。但し。 連続添加における安定化は明らかに発現レベルの低減を招いた、タンパク分解酵 素の作用を最少限におさえるために、実施例４では低温増殖を用いた。 去ｍ ２６２−４と名付けた操作では、カザミノ＃（約２５ｇ／ｆｆ１）を加えた増面 培地で菌株ＳＣＲＨ２１８／ｐＧＰＤ−１を増殖し、さらにパンチカザミノ酸（ 約１１０ｇ／ｆ）を加えた増面培地を添加した。（）＜フチ培地および添加培地 は、その他の点については操作２４８−４のものと同様である。）この操作温度 は１発酵開始から２８時間後に１通常に用いる３０℃（ｐ）ｌ　４．５）から２ ５℃に低下させた。この操作の結果を第■表に一覧表にし９かつ第１１図にグラ フで示す図において、　００．。曇のプロットをＡで示し、（ｍｇ／　ｌ’）　 ＸＩＯのプロットをＢで示し、さらにｎｇｌｏｏ　−ｍｌのプロットをＣで示す 。 発現レベルは、　ｔ　−７０時間に４８９　ｎｇｌｏｏ　−ｗＩｌｌのピークに 達した。これは、　ＯＤ単位９６の場合には、ｌあたり）ｌＢｓＡｇが４６゜９ Ｂとなる。はぼｔ−６３時間に、添加培地は枯渇した。しかし、発現レベルと全 ）ＨＢｓＡｇ量は双方とも、この時点から７０時までは上昇を続け、７０時に至 るとＨＢｓＡｇの量は、増殖停止後に誘導されたタンパク分解酵素の作用による ものと思われるが、急激に低減した。 工１表 ２１　３．９０　２０６　８ ２７　１１．６０　１４７　１７ ３１　２２．３０　１６６　３７ ３５　２６　２２３　５Ｂ Ｔ０　９６　４８９　４６９ ２６２−５と名付けた操作で用いた培地は、わずかに５ｇ／ＩｔのＣＡＭを最初 のバッチ培地に加えただけの最少培地に近いものであった。添加培地においては 、硫酸アンモニウムが唯一の窒素源であった。 操作２６２−５のバンチ培地は、グルコース２ｇ／Ｌ　カザミノ酸５ｇ／ｌ、Ｋ １１ｔＰＯｖ　１３．５ｇ／Ｉｔ、（Ｎｌ（ａ）ｉｓ（ｌａｌＯｇ、ｚｌ、ＩＭ 暦ｇｓＯａ　４　ｗｒｌ／　ｌ、　１％チアミン０．４−１／　ｊ、微量金属溶 液Ａ３５Ｊ／ｊ、ビタミン溶液＾３ｍｌ／１．．イノシトール０．０２ｇ／Ｊお よびＤｏｗ　・Ｐ２Ｏ０００，１３ｍ　ｌｌ　ｌを含んでいる。操作２６２−５ の添加培地は、グルコース５３２．５　ｇ／　１　、　ＫＨＨＦＯ２２゜８５　 ｇ／　１．　（Ｎ）ｌ＊）ｔｓＯ４５０ｇ／　Ｉｔ、　ＬＭ　Ｍｇ５０４１５鋼 ２ノ！。 １％チアミン１．４３　ｗＩｌｌ　Ｉｔ、微量金属溶液へ６．７５　ｓ　Ｉｔ／ 　１、ビタミン溶液Ａ　６．７５　ｗｈ　Ｉｔ／　ｊ、イノシトール０．０４　 ｇｚｌを含んでいる。 操作２６２−４と同様に、温度はｔ−２８時間において、３０℃から２５℃へ低 下させた。 操作２６２−５（ｐＨ４，５）の結果を第ｖ表および第１２図に示す０図中、　 ００−・ｅのプロットをＡで示しｌ　（ｍｇ／　Ｉｔ）　Ｘ１０のプロットをＢ で示し＊　ｎｇｌｏｏ　−ｍｌのプロットをＣで示し、さらに（エタノールのｇ ｚｌ）ｘｌＯのプロットをＤで示した。温度を３０℃から２５℃に下げた後９発 現レベルは増加し１発酵が終了するまで増加を続けた。さらに全ＨＢｓＡｇ量も 発酵が終了するまで増加を続け、最大６１．７　ｓｇ　ＨＢｓＡｇ　／　ｊ！に 達した。 ！い５表 ２１　３．２０　１００　３ ２７　８．２０　６８　５ ３１　１６．３０　５１　８ ４６　２７　１４５　３９　７４．６０４８　８３．１０ ７２　８０　３６９　２９５　３．１０７８　３．６０ ８２　１１４　４５５　５１Ｂ ２６０−４と名付けた操作（ｐＨ４，５）では、操作２４８−４で用いたものと ほぼ同じ増面培地および添加培地を用いたが、開始時点から低温２５℃を用いた 。操作２６０−４の結果を第■表および第１３図に示す−０Ｄｈｏ。のプロット はＡで示し、（ｓｇ／　ｌ　）　Ｘ　１０のプロットはＢで示し、さらにｎｇｌ ｏＤ　−ｗ＊１のプロットはＣで示した。 第■表 Ｒ’　１ＩＩｓｌ　（１ｍ）　ＯＤ、ｏｅ　ＮＧ１０Ｄ−ＭＬＭＧ／Ｌ　ＸｌＯ １９，５（１４３３６１３，４０ ２７，５０１１，３０３２０３６，１０３５，５０２２，７０３６０８１，７０ ４８，５０４５５０９２２９ ５３，５０５４４９０２６５ ５９，５０７５４７３３５５ ６８，００８６６３６５４７ ７２，５０１０３５２２５３８ 第１１図および第１２図に時間の経過を示す、しかし、予測しなかった１ＢｓＡ Ｈのわずかな低減が起き、６８．５時間後の５４．７　ｍｇ／ｌから７２．５時 間後の５３．８曽ｇ／　ｌまで低減した。 このように、２５℃の低温は、おそらくタンパク分解酵素の濃度ないしは活性を 低減することによって、　ＨＢｓＡｇの生産を安定させるように見える。カザミ ノ酸を加えた増面培地（６１，７−ｇ／ｌ）と増面しなかった培地（６３，６ｍ ｇ／　Ｊ）の双方において、温度を低下させることによって６０−ｇ／　ｌを上 回るＨＢｓＡｇレベルが得られた。ワクチン２０μｇ　ｌｌＢｓＡｇ　／投与量 では、これらの数字は発酵ブロスが３０００投与量／！を超えることを示す。 以上のように本発明を望ましい実施態様によって説明したが、当業者には変更Ｂ 様ならびに改良が可能であると考えられる、したがって９本発明は請求の範囲に 示す発明の範囲に当てはまる全ての変更態様を含むものである。 ＦＩＧ、３ ０目０２さ０３０４０５０ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、　ｆ３ ＦＩＧ、９ 旦牲那二困工 ＦＩＧ　、　１０ ＦＩＧ、１１ ＦＩＧ、＋２ ユ匹工ｆユ ＦＩＧ、＋３ ＴＩＭＥ　（ＨＲ５，） 国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．外来遺伝子生成物を発現できる酵母を培養するための培地で，濃度が約２０ ｇ／ｌから約１６０ｇ／ｌの間の均衡遊離アミノ酸を有するもの。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の培地で，前述の均衡遊離アミノ酸がカザミノ酸で あるもの。
3. ３．請求の範囲第２項に記載の培地で，均衡遊離アミノ酸の濃度が約１１０ｇ／ ｌであるもの。
4. ４．外因性の遺伝子生成物を発現することが可能な酵母の発酵方法で， 濃度が約２０ｇ／ｌから約１６０ｇ／ｌの間の均衡遊離アミノ酸を有する培地に 酵母を導入し， さらにこの酵母を約２５℃で培養する過程から成るもの。
5. ５．請求の範囲第４項に記載の方法で，前述の導入過程が，培地の炭素源の濃度 を零よりも高いが出来る限り零に近い値に保持する過程から成るもの。
6. ６．請求の範囲第５項に記載の方法で，さらに最低３０％の空気飽和度で酵素に よって培地を飽和させる過程から成るもの。
7. ７．外因性の遺伝子生成物を発現することが可能な酵母の発酵方法で， 炭素源濃度を零より高いが出来る限り零に近い値に保持し且つエタノール濃度を 出来る限り零に近い値に保持した培地において酵母を培養し， さらに培地の温度を約２５℃に保持する過程から成るもの。