JPH07106141B2

JPH07106141B2 - 酵母細胞から外来遺伝子生成物の発現を増進させるための培地および方法

Info

Publication number: JPH07106141B2
Application number: JP61504703A
Authority: JP
Inventors: シーフィーシュコ，ジョン
Original assignee: アムジエン
Priority date: 1985-08-15
Filing date: 1986-08-15
Publication date: 1995-11-15
Anticipated expiration: 2010-11-15
Also published as: EP0233937A1; EP0233937B1; JPS63500494A; WO1987001129A1; DE3687523D1; ATE84568T1; DE3687523T2; EP0233937A4; CA1288075C

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、一般に、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）を発現
する酵母菌株の増殖方法ならびに培地に関し、具体的に
は、比較的低温で、かつ遊離アミノ酸レベルが比較的に
高い、グルコースを抑えた好気性の条件にてHBsAgを発
現する酵母菌株の増殖方法ならびに培地に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕

Ｂ型肝炎ウイルスは、現在「Ｂ型肝炎」として知られる
疾患の原因となるものでありこの疾患は以前は『血清肝
炎』として知られていた。血液中にＢ型肝炎ウイルスを
持続的に保持している人は、２億人以上に及ぶものと推
定される。

このウイルスによる感染は、急性肝疾患の主な原因の一
つである。Ｂ型肝炎ウイルスの保有者は、肝硬変や肝細
胞癌にかかる危険性が高い。

ヒトＢ型肝炎ウイルスは、保有者の血清中に認められ、
かつ臨床的なＢ型肝炎感染の病因であるデーン粒子（Da
ne particle）と同一のものであるとみなされている。
デーン粒子は、42ナノメートルの膜組織であり、脂質、
DNA、および少なくとも４つのタンパク質、すなわちＢ
型肝炎表面抗原（HBsAg）、Ｂ型肝炎核抗原（HBcAg）、
Ｂ型肝炎ｅ抗原（HBeAg）およびDNAポリメラーゼを含
む。保有者の血清中にはさらに22ナノメートルの脂質粒
子が含まれており、この粒子はHBsAgを含むが、DNA、HB
cAg、HBeAgあるいはDNAポリメラーゼは含んでいない。
現在用いられているＢ型肝炎ワクチンは、ヒト血漿から
採取した22ナノメートルの粒子を使用している。

Ｂ型肝炎ワクチンの製造に用いるヒト血漿の抗原濃度
は、約400μg/mlである。全血清濃度は約60mg/である
ので、150倍の精製だけで済む。Wapler等、『現代のワ
クチンに対する考え方』（Moden Approaches to Vaccin
es）、Chanock等編集、Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Harbor、New York,pp.251−256（198
4）。しかしながら、出発材料がヒト血漿である限り、
血漿から得られるＢ型肝炎ワクチンの供給には限りがあ
り、また感染性のウイルスを含めて全ての有害な汚染物
質がワクチンに含まれることがないように厳重に注意せ
ねばならない。

Ｂ型肝炎ワクチンを得る他の方法としては、培養した悪
性細胞、特に、肝癌細胞をＢ型肝炎ウイルスに感染させ
る方法がある。HBsAgは、溶解した肝癌細胞調製物から
採取する。Knowles等、国際特許出願第PCT/US81/00778
号。この方法は、ヒト血漿を必要としないが、ワクチン
に癌細胞生成物を使用することは好ましくないこと、感
染性を避けるために厳重な注意を必要とすること、ま
た、哺乳類の細胞培養に伴う困難から、この方法の有用
性には限りがある。

HBsAgの遺伝子を含む組換プラスミドで形質変換したサ
ルの腎細胞は、溶解または分泌によってHBsAgを遊離す
ることが報告されている。Levinson等、欧州特許出願第
73,656号。しかしながら、癌細胞の生成物の使用に伴う
問題を解消したことを除いて、サルの腎線維芽細胞から
のＢ型肝炎ワクチンの製造も、肝癌細胞からのＢ型肝炎
ワクチンの生産と同じ欠点がある。

従来のワクチン製造に伴う問題に鑑みて、Ｂ型肝炎ウイ
ルスの他の成分とは分離してHBsAgを調製する方法を得
ることが望ましい。組換法を用いて微生物中でHBsAgを
産生することにより、このような分離製造を実現するこ
とができる。

HBsAg産生に組換法を適用する一つの方法として、HBsAg
をコードする遺伝子を細菌プラスミドに挿入し、さらに
いくつかの大腸菌宿主生体中で増幅および発現させるこ
とが考えられる。Rutter等、欧州特許出願第020,251
号。しかし、この方法は、HBsAgが大腸菌内で容易に分
解するために収量が少ないこと、また大腸菌の増殖がHB
sAgによって阻害されることが報告されている。Miyanoh
ara等，欧州特許出願第105,049号。ある種の細菌細胞の
成分、例えば、リポ多糖類は、ヒトに対して強い毒性が
あり、かつ精製上の問題をもたらすことが報告されてお
り、さらに、原核生物（すなわち、核をもっていない生
物群に属するもの）である細菌は、真核生物（すなわ
ち、核を有する生物群に属するもの）の遺伝子の効果的
な翻訳が行えないことが報告されている。その理由は、
細菌がイントロンのスプライシングアウト、または前駆
体タンパク質のタンパク質分解性切断等の特定のプロセ
スを実施できないこと、細菌がタンパク質の免疫原性に
重要な翻訳後の修飾であるタンパク質のグリコシル化、
リン酸化またはメチル化を行わないこと、細菌が真核生
物中における遺伝子産物の分泌に重要ないわゆるシグナ
ルペプチドを認識しないこと、さらにコドン優位（すな
わち、それによってタンパク質のアミノ酸成分をコード
する特定の核酸配列が発現される能力）が原核生物と真
核生物とでは異なる可能性があることとされている。Ho
fschneider等、欧州特許出願第105,141号。

微生物中でHBsAgを発現する他の方法であり、かつ宿主
として大腸菌を用いることに対する反対理由の殆どを克
服できるのは、酵母発現系を用いた方法である。このよ
うな発現系は一般に、細菌と酵母の双方において複製を
行うことができる配列を有するプラスミドである、細菌
−酵母シャトルベクターを使用する。Rutter等、欧州特
許出願第072,318号、Hitzenman等、欧州特許出願第073,
657等、Cahezon等、欧州特許出願第106,828号、およびB
itter等、Gene,32,263−274（1984）。酵母は、真核生
物の遺伝子生成物の製造においていくつかの利点があ
る。

まず、酵母は、一般的に安全であると認識されている生
物である。また、酵母は、容易に大量に培養増殖させる
ことができる。大規模な酵母培養技術は十分に確立され
ている。

さらに、酵母細胞は真核生物であるので、グリコシン
化、リン酸化およびメチル化のプロセス機構を有する。
加えて、酵母細胞はHBsAgタンパク質に対する耐性が高
い。Rutter等、前出、Hitzeman等、前出。さらに、酵母
で産生されるHBsAgの免疫原性力は、乾乳類の細胞内で
産生された形態のものよりも低いのではないかという懸
念があるが（Hofchneider等、前出）、酵母から得られ
た粒子のED₅₀（免疫応答を引き出すのに必要な有効量の
計量単位）は112mgであり、これは哺乳類細胞から得た
粒子のED₅₀の98mgよりもわずかに高いだけである。Burn
ette等、『現代のワクチンに対する考え方』（Modern A
pproacheesto Vaccines）、Chanoch等編集、Cold Sprin
g Harbor Labratory,Cold Spring Harbor New York,245
−250（1984）。

酵母中でHBsAgポリペプチドを製造する際に重要な商業
上の考慮要素は、１グラム当たりの費用である。この費
用は、（１）酵母の増殖を促進し、（２）HBsAgポリペ
プチドの産生を促進するか、あるいは一旦産生されたHB
sAgポリペプチドの破壊を防ぐことによって、低減され
る。

酵母増殖法の一つでは、グルコース量を限定した条件下
にて培養を行い、それによって、グルコースを比較的に
低濃度に保持し、増殖速度が一定の値を超えるのを防
ぎ、かつ酸素を比較的に高濃度に維持する。このような
技術を用いることによって、エタノールの形成が最小限
に抑えられる。Fichter等、Advances in Microbial Phy
siology,22,123−183（1981）、Reed等、Yeast Technol
ogy,AVI Publishing Co.,Inc.,Westport,Connectacut
（1973）,pp.53−81。例えば、コンピューターと結合さ
せたバイオリアクター内でのコンピューター制御による
パン酵母の生産においては、バッチ供給培地にグルコー
スを添加する速度の自動制御におけるフィードバックパ
ラメータとして、呼吸比RQ（産生された二酸化炭素モル
数／消費された酸素モル数）ならびにエタノール濃度を
用いることがある。Woehrer等、Biotechnol.Bioeng.,2
3,567−581（1981）。

組換遺伝子生成物の発現において用いられる酵母のタイ
プの一つに、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）がある。例えば、Bitter等,Gene,32,2
63−274（1984）を参照されたい。

組換遺伝子生成物を発現する酵母の培養のための培地成
分には下記のものがある。Spizizenの最少培地中のグル
コース0.2％w/v〔Beggs,Nature,275,104−109（197
8）〕。HBsAg発現用のペプトン２％（w/v）およびグル
コース２％を有するYEPD、すなわち、酵母窒素基質6.7g
/、カザミノ酸5g/およびグルコース20g/〔Rutter
等、欧州特許出願第72,318号〕。HBsAg発現用の30℃のY
NB−ロイシン〔Hitzeman等、欧州特許出願第73,657
号〕。HBsAg発現用の酵母窒素基質0.67％、トリプトフ
ァンを含まないカザミノ酸0.5％およびグルコース２％
〔Valenzuela等,Nature,298,347−350（1982）〕。

HBsAg発現用のグルコース２％、酵母窒素基質アミノ酸
0.7％およびYPD2％（ポリペプトン２％、酵母エキス１
％およびグルコース２％％）、またはYPDのみ、もしく
は30℃のBurkHoldr最少培地〔Miyanohara等、欧州特許
出願第105,149号〕。キシルロースからエタノールを生
産するための大気温度（約24℃）の酵母エキス8.5g/
〔Gong等、米国特許第4,490,468号〕。HBsAg発現用の酵
母エキス１％、ペプトン２％、およびグルコース２％
〔Valenzuela等、Biotechnology,3,317−320（198
5）〕。ならびにグルコアミラーゼ発現用の酵母最少塩
培地にグルコース２％または加水分解したコーンスター
チ10％（平均ポリマーサイズが13から17グルコース分子
のもの）または連続的にグルコースを供給したもの〔In
nis等、Science,228,21−26（1985）〕。このような培
地は、酵母のバッチ増殖に使用され、一般的には細胞濃
度が低下し、そしてHBsAgの発現レベルが低下しがちで
ある。例えば、浸盪機フラスコ中のYMS培地で増殖させ
た細胞のHBsAgの収量は、通常は、僅か50〜200ng/0Dml
に過ぎない。

酵母中で外来ポリペプチドを発現するための望ましい培
地とならびに望ましい一連の培養条件を確定すべきであ
ると思われる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、外来遺伝子生成物を発現することができる酵
母を培養するための培地を提供する。さらに、この培地
には、約20g/から約160g/の濃度の平衡遊離アミノ
酸が含まれる。

さらに、本発明は、外来遺伝子生成物を発現することが
できる酵母の増殖方法をも提供する。この方法におい
て、約20g/から約160g/の濃度の遊離アミノ酸を含
む平衡培地中に酵母が導入される。この酵母は、約25℃
の温度で培養される。

本発明による他の方法は、外来遺伝子生成物を発現する
ことができる酵母の発酵法を提供する。酵母は、約25℃
の温度で培養され、炭素源が零に近似する濃度に維持さ
れ、かつエタノールが蓄積しないよう栄養溶液が供給さ
れる。

S.cereivisiaeをグルコース中で高い細胞濃度にまで効
率よく増殖させるには、これまで２つの基本的な問題、
すなわち、（１）生物の増殖収量（酵母の乾燥重量量グ
ラム数／グルコースのグラム数）が低いこと、（２）文
献にしばしば報告されている30〜80g酵母乾燥重量／
の値よりも、到達する最大細胞濃度が一般に低いこと、
があった。

基質グルコースと、細胞生成物および二酸化炭素との間
の炭素収支を判断することを試みるべく、標準発酵操作
においてグルコースの形で発酵槽に加えられる全炭素を
測定する研究を行った。

〔実施例〕

実施例１ S.cerevisiaeの発酵によるＢ型肝炎表面抗原の製造に通
常に用いる『標準』操作を実施した。このような操作で
は、細胞を最初はグルコース5g/を含む増菌培値でバ
ッチ式に増殖させる。８時間にわたって増殖させた後
に、濃縮グルコース、カザミノ酸、酵母窒素基質および
ビタミンおよび無機質を用いて連続供給を開始した。そ
の後、供給量は８時間毎に連続的に増加させた。

標準操作（176−３と称する）においてバッチ培地は、
グルコース6g/、KH₂PO2g/、（NH₄）₂PO₄2g/、カ
ザミノ酸2g/、酵母窒素基質2g/、MgSO₄2g/、チア
ミン（１％溶液）0.3ml/、微量金属溶液Ａ〔FeCl₃・6
H₂O27g/、ZnCl₂・4H₂O2.0g/、CaCl₂・6H₂O2.0g/
、NaMoO₄・2H₂O20g/、CaCl₂・2H₂O1.0g/、CaSO₄
・5H₂O1.9g/、H₃BO0.5g/、および濃塩酸100ml/〕
1ml/、ビタミン溶液Ａ〔リボフラビン0.42g/、パン
トテン酸5.4g/、ナイアシン6.1g/、ピリドキシン1.
g/、ビオチン0.06g/、および葉酸0.04g/〕1ml/
を含む。標準操作での供給培地は、グルコース400g/
、KH₂PO5g/、（NH₄）₂PO5g/、カザミノ酸100g/
、酵母窒素基質12g/、MgSO₄5g/、チアミン（１％
溶液）0.3ml/、微量金属溶液A1ml/、およびビタミ
ン溶液A1ml/を含む。

操作176−３において、質量分析器を用いて発酵層から
の排気ガスをの二酸化炭素と酸素についてモニターし、
これらの値を４時間ごとに記録した。このデータを第１
図にグラフで示す。これに加えて、４時間ごとに試料を
採取して遠心分離機にかけ、さらに後で分析を行うよう
に培養液の上清を凍結させた。

培養ブロスのグルコース分析によると、発酵過程の終
始、グルコースは限定されている。すなわち、その濃度
は100mg/を下回ることが示された。従って、グルコー
スと二酸化炭素および細胞との炭素収支を調べ、全ての
グルコースが計算されたかを確かめた。発酵の全経過時
間にわたる収支は、第１図生の二酸化炭素データをグラ
フを用いて積分することによって得た。この積分による
と、発酵過程において11.15モルの二酸化炭素が生成し
たことが分かった。発酵の終了時には、総計1630gのグ
ルコースが消費され、177gの酵母が生産されていた酵母
の炭素を50％と想定すると、その内訳は下記のようにな
る。

グルコース1630g→二酸化炭素491g＋酵母177g または、炭素を基にすれば、 C652g→C134g＋C88.5g 換言すると、652−（134＋88.5）＝429gの炭素、ないし
はグルコース66％が計算されていない。培養液上清のビ
ウレットタンパク質検定（Biuret protein assay）を行
ったところ、培養液上清には微量のタンパク質しか存在
しないことが判明したので、細胞外の分泌タンパク質は
炭素欠乏域として除外した。グルコースは、２つの経路
のいずれかで、酵母によって代謝されている。酸化経路
によるグルコースの完全酸化では、下記の反応（１）：（１）C₆H₁₂O₆→6CO₂＋6H₂O＋細胞の際に大量のエネルギー（ATP16〜28モル／グルコース
１モル）が発生し、さらにRQ（呼吸比＝生成した二酸化
炭素のモル数／消費された酸素のモル数）が1.0〜1.2で
あることが特徴である。一方、発酵経路を経る部分酸化
では、下記の反応（２）：（２）C₆H₁₂O₆→2C₂H₅OH＋2CO₂＋細胞に従って低いエネルギー収量（ATP2モル／グルコース１
モル）しか発生せず、RQ＞＞1.0である。

第１図のRQデータを見ると、RQの値が一貫して3.0を上
回っていることがわかる。従って、実質的な発酵代謝が
生じていたわけである。これはブロス中のエタノール濃
度を測定することによって検証した。操作176.3のエタ
ノール、グルコース、二酸化炭素、およびOD₆₀₀の軌跡
を第２図に示す。発酵の終了時には、73g/のエタノー
ルが培養液中に蓄積し、これは総計381gの炭素に相当し
た。この値を下記の炭素収支（３）：（３）グルコース→CO₂＋酵母＋エタノールに適用すると、 C652g→C134g＋C88.5g＋C381g となり、炭素回収率は92％という結果となる。残りの炭
素欠損分は、ほとんど排気中へのエタノールの喪失また
は測定誤差によるものと考えられる。

酸化経路から発酵経路へのこの移行の効果は、さらに第
Ｉ表ならびに第３図に示すように、操作176−３の酵母
増殖データ（酵母乾量g/グルコース量ｇ）にも見ること
ができる。前述の図においては、OD₆₀₀（600nmにおける
光学密度）をＡで示し、二酸化炭素のパーセンテージは
Ｂとし、グルコースの濃度（g/）はＣとし、さらにエ
タノールの濃度（g/）はＤで示した。

グルコースの酸化的代謝は、ATP16〜28モル／グルコー
ス１モルを提供するが、一方、発酵において後に優位と
なる発酵代謝は約1/10のエネルギー、すなわちATP2モル
／グルコース１モルしか提供しないので、経時的に増殖
収量の低下が予測される。

このように、呼吸比、増殖収量およびエタノール濃度の
データを調べると、S.cerevisiaeの供給バッチ増殖にお
けるグルコースからエタノールへの実質的な発酵代謝が
示唆される。この型の代謝の結果、グルコースからのエ
ネルギー収量が低く、よって酵母細胞の収量が低い。順
次産生されるエタノールは結果として、最大比増殖速度
の低下をひき起こす。エタノール合は、既知の酵母の非
競合的増殖阻害因子であり、下記の式（４）に従う。

（４）μ_mi＝μ_ｍ（K_i）／（ｉ＋K_i）式中、μ_miは、濃度ｉで阻害定数K_iを持つ増殖阻害因子
が存在する場合に生じる、低減した最大比増殖速度であ
る。S.cerevisiaeの増殖に影響を及ぼすエタノールのKi
値は、約25gエタノール／であると報告されている。
従って、エタノールが生成すればするほど、グルコース
の添加量を次第に増したとしても、最大比増殖速度はさ
らに減少する。酵母の最大比増殖速度は、グルコースの
添加速度よりも低いので、酵母細胞に唯一残された道
は、さらに多くのエタノールを産生することである。

酵母によるグルコースのエタノールへの部分酸化は、
（１）溶解酸素濃度が低い、（２）グルコースが過剰で
ある、または（３）比増殖速度が高すぎること、の三つ
の条件のいずれの下でも起こる。実施例１では、（１）
酸素は十分であり、（２）グルコース濃度は零に近似す
るよう維持する一方で、（３）細胞の最大比増殖速度を
大幅に上回る速度でグルコースを添加したので、細胞の
増殖速度はその最高値に維持された。この点に鑑み、実
施例２では、培養物の比増殖速度をより低レベルに維持
し、（１）より高いグルコースからの細胞の増殖収量、
および（２）阻害作用を示す濃度のエタノールが形成さ
れないことから、より高い最終細胞濃度が提供される実
験を説明する。

実施例２培地組成および供給速度の一研究において、菌株SC RH2
18/pGPD−１のHBsAg発現細胞〔この構築については、Bi
tter等、Gene,32,263−274（1984）に記載されている〕
は、30℃、pH4.5にて、一つの操作（193−２と称する）
では、最少培地上で増殖され、他の操作（実施例１に記
載した176−３と称する操作）では、酸加水分解したカ
ザミノ酸を補った増菌培地上で増殖した。その結果を、
第４図に示す。図中、最少培地で増殖された細胞のOD
₆₀₀のグラフをＭで示し、また増菌培地（操作176−３に
て使用したもの）で増殖した細胞のOD₆₀₀のグラフはＲ
で示す。

最少バッチ培地には、下記の成分が含まれる。グルコー
ス5g/、K₂HPO₄5g/、（NH₄）₂SO₄2g/、1M MgSO₄1m
l/、１％チアミン溶液0.2ml/、微量金属溶液A1ml/
、ビタミン溶液A1ml/、イノシトール0.02g/およ
びDOW（登録商標）P2000（平均分子量約2000のポリプロ
ピレングリコール）の0.17g/。最少供給培地には、下
記の成分、すなわち、グルコース400g/、KH₂PO25g/
、（NH₄）₂SO₄64g/、1M MgSO₄15ml/、１％チアミ
ン溶液0.5ml/、微量金属溶液A0.5ml/、ビタミン溶
液A0.5ml/、およびイノシトール0.05g/が含まれて
いた。

最少培地での増殖では、細胞濃度OD＝24（細胞乾燥重量
26g/）が得られた。24時間経過後に、発酵槽へのグル
コースの添加を止めた。24から32時間経過するまでの間
に、エタノールの濃度は14から9g/まで減少したが、
細胞濃度は増加しなかった。このように、最少培地上で
増殖させた細胞は、第５図からわかるように、培地内に
蓄積したエタノールを細胞の生合成に有効に利用しなか
った。

この菌株は、ディオ−キシック、すなわち、YMS中のグ
ルコースおよびエタノールで二相の増殖を呈するので、
振盪機フラスコ実験を行い、酸加水分解したカザミノ酸
を少量補って培地にて産生されたエタノールの下で増殖
能によって、細胞が高い細胞濃度にまで増殖するかどう
かを調べた。YMS培地は、アミノ酸を含有しない酵母窒
素基質（Difco社、デトロイト、ミシガン州）6.7g/、
カザミノ酸5g/（BBL、BBL Microbiology Systems、Be
cton Dickinson and Co.,コキッイスビル、メリーラン
ド州）、およびグルコース20g/を含んでいる。最少培
地〔100mM（PO₄）^-2,NH₄Cl1g/、NaCl0.5g/、0.002M
MgSO₄、0.0002M CaCl₂およびグルコース5g/〕にカザ
ミノ酸3g/を加えたものを、複数の同一フラスコに入
れて行ったこの実験の結果を第６図に示す。第６図に示
すように、カザミノ酸を培地に加えた場合には、エタノ
ールを用いた増殖の速度がずっと高まる。

温度30℃、pH4.5において、バッチ増殖培地中の濃度5g/
ないしは10g/のカザミノ酸を加えて増殖させた場合
の、時間経過に伴う細胞濃度の変化を第７図に示す。第
７図において、バッチ培地にカザミノ酸10g/を含み、
かつ供給培地にカザミノ酸20g/を含む場合の操作（21
1−６と称する）の結果をＨで示し、バッチ培地にカザ
ミノ酸5g/を含み、かつ供給培地にカザミノ酸10g/
を含む場合の操作（211−５と称する）の結果のグラフ
をＬで示す。操作211−５と211−６のエタノール濃度
は、エタノール2g/を超えることは無かったが、増菌
培地を用いた操作176−３のエタノール濃度は、発酵の
終了時にエタノール70g/を上回った。操作176−３の
時間経過に伴う細胞濃度のプロットを、第７図に線Ｎで
示してある。

操作211−５のバッチ培地は、グルコース2g/、カザミ
ノ酸5g/、KH₂PO₄5g/、（NH₄）₂SO₄2g/、1M MgSO₄
1ml/、１％チアミン0.2ml/、微量金属溶液A1ml/
、ビタミン溶液A1ml/、およびDow（登録商標）P200
0 0.117ml/を含んでいる。操作211−５の供給培地
は、グルコース275g/、カザミノ酸10g/、KH₂PO₄25g
/、（NH₄）₂SO₄50g/、1M MgSO₄15ml/、１％チア
ミン1ml/、微量金属溶液A2.5ml/およびビタミン溶
液A2.5ml/を含んでいる。操作211−６のバッチ培地
は、グルコース2g/、カザミノ酸10g/、KH₂PO₄5g/
、（NH₄）₂SO₄2g/、1M MgSO₄1ml/、１％チアミン
0.2ml/、微量金属溶液A1ml/、ビタミン溶液A1ml/
、およびDow（登録商標）P2000 0.17ml/を含んでい
る。操作211−６の供給培地は、グルコース275g/、カ
ザミノ酸20g/、KH₂PO₄25g/、（NH₄）₂SO₄50g/、1
M MgSO₄15ml/、１％チアミン1ml/、微量金属溶液A
2.5ml/およびビタミン溶液A2.5ml/を含んでいる。

エタノールの毒性蓄積を避けるために、生物の比増殖速
度を一定レベル未満に保持しなければならない。前述の
ように、操作176−３では、エタノールの蓄積が70g/
を超えたために、（１）増殖収量が大幅に低下し（0.12
g細胞乾燥重量／グルコール1gまで）、さらに、（２）
増殖速度および最終細胞濃度が（16g細胞乾燥重量／
まで）阻害された。しかし、操作211−６では、増殖速
度はグルコースの添加速度によって慎重に制御され、さ
らに培地中にエタナールが蓄積しなかったので、（１）
0.34g細胞乾燥重量／グルコース1gまで増殖収量が増加
し、さらに、（２）細胞濃度が（68.2g細胞乾燥重量／
まで）増加した。

操作211−５および211−６では、エタノールの蓄積を避
けるために、グルコースを非常にゆっくりとした速度で
発酵槽に供給した。発酵槽の生産性を高めるには、エタ
ノールの蓄積が始まる寸前まで供給速度を高めることが
望ましい。これは、エタノールおよび呼吸比（RQ）をモ
ニターすることによって、経験的に達成することができ
る。代替方法としては、Woehrer等,Biotechnol.Bioen
g.,23,567−581（1981）に開示されているように、RQに
対するグルコース添加量のコンピューター接続制御を用
いることができる。

実施例３では、Bitter等,Gene,32,263−274（1984）に
記載されたように、プラスミドpGPD−１を含有するS.ce
revisiae（RH 218）菌株SC RH218/pGPD−１が、200g乾
燥重量／の細胞濃度まで〔Spectronic20（Bausche ＆
Lombo社、ロチェスター、ニューヨーク州）またはベッ
クマン分光光度計（Beckman spectrophotometer）で測
定してそれぞれ190および460のOD₆₀₀に等しい〕の増
殖、および高レベルのカザミノ酸が存在する場合に1.8m
g HBsAg/乾燥重量細胞1g（600ng HBsAg/OD−mlに等し
い）の発現レベルを示した事例について述べる。

実施例３実施例２のカザミノ酸を用いた操作の双方において、ｔ
＝40時間とｔ＝50時間に、培地のマグネシウムが欠乏し
て増殖しなくなる『不感時間』があった。MgSO₄を追加
するまで培養物は増殖しなかった。マグネシウムの欠乏
が起きたのは、この培地のグルコースの使用効率のもっ
と低く計画していた、すなわち、増殖収量を0.15g細胞
乾燥重量／グルコース1gとしていたためである。培地が
平行し、かつ実際の増殖収量がもっと大きくなった時、
すなわち0.34g細胞乾燥重量／グルコース1gとなった時
には、他の栄養素が増殖の限定要因となった。新しい増
殖収量を考慮した新しい培地は、この意図しない栄養素
の消耗を避けるためのものである。バッチ培地の組成を
第II表に示す。

pHを4.5に保つために、必要に応じてNH₄OH〔NH₃として3
0％w/w〕およびH₃PO₄（85％w/w）を添加した。

グルコース、イノシトールおよびMgSO₄を清浄水中で混
ぜ合わせ、液量を200mlに調節し、オートクレープに入
れて121℃に約20分間保った。次に、発酵槽に入れた約
7.0の清浄水に、微量金属溶液Ａ、１％チアミン溶液
およびビタミン溶液Ａを無菌的に加えて、溶液Iaを調製
し、さらにカザミノ酸、KH₂PO₄、（NH₄）₂SO₄および泡
消剤を加える。まず発酵槽を殺菌し、それから約30℃ま
で冷却する。次に溶液Iaを発酵槽に加える。供給培地の
組成を第III表に示す。

グルコース、イノシトールおよびMgSO₄を、最大４ま
での清浄水中で混ぜ合わせて溶液Ibを調製し、さらにオ
ートクレーブに入れて約121℃に約30分間保つ。カザミ
ノ酸、KH₂PO₄および（NH₄）₂SO₄を最大２までの清浄
水中で混合して溶液II bを調製し、これをオートクレー
プに入れて約121℃に約30分間保つ。溶液IbおよびII b
を室温まで冷却し、それから無菌的に混合する。次に、
チアミン溶液、微量金属溶液Ａおよびビタミン溶液Ａ
と、溶液IbとII bの混合液に加える。

この新しい培地を用いて、実施例２のグルコース供給状
態の下で、SC RH218/pGPD−１を高い細胞濃度まで増殖
させた。

この培地を用いて行った226−４と称する操作におい
て、段階的な供給スケジュールおよび攪拌、通気ならび
に背圧を制御（発酵ブロスへの十分な酸素移送を行う）
した結果、細胞濃度は600nmにおいてスペクトロニック2
0分光光度計（Spectronic 20 spectrophotometer）で測
定したところ190を超えていた。第８図に、操作226−４
（30℃、pH4.5）の細胞濃度をＡ（OD₆₀₀）として、ブロ
ス（X10）１当たりのmg数で示したHBsAgの濃度をＢと
して、さらに比HBsAg濃度（Abbott Labs社のRIA Ausri
a、単位ng/OD−ml、600ng HBsAg/OD−ml＝1.8mg HBsAg/
乾燥重量細胞1gである）をＣとして示す。

操作226−４のバッチ培地は、グルコース2g/、カザミ
ノ酸5g/、KH₂PO₄13.2g/、（NH₄）₂SO₄10g/、1M M
gSO₄8ml/、１％チアミン0.4ml/、微量金属溶液A3ml
/、ビタミン溶液A3ml/、およびイノシトール0.02g/
を含んでいる。操作226−４の供給培地は、グルコー
ス528.5g/、KH₂PO₄2.86g/、（NH₄）₂SO₄0.50g/、
1M MgSO₄15ml/、１％チアミン1.43ml/、微量金属溶
液A7.14ml/、ビタミン溶液A7.14ml/、およびイノシ
トール0.03g/を含んでいる。

第８図において、HBsAg濃度は、発酵を開始してから約7
0時間で33mg HBsAg/のピークに達する（OD 120）。こ
の点に達した後は細胞濃度はさらにODが約190まで上昇
するにもかかわらず、HBsAg濃度は発酵が終了するまで
急激かつ連続的に低下する。

ウェスタンブロット（Western blot）によって、この時
間間隔に抗原タンパク質の単位あたり量が低減すること
が確認され、従って、RIA HBsAg粒子濃度の低減は、少
なくとも部分的にはタンパク成分の低減によるものと考
えることができる。しかしながら、抗原タンパク質がタ
ンパク分解を受けるか、ないしは単に抗原タンパク質が
細胞によって合成されておらず、発酵の早期に産生され
たものが抗原タンパク質をわずか、あるいは全く持たな
い細胞の増殖によって希釈されているかは、明らかでは
ない。

タンパク分解は、ゆっくりと増殖している細胞、あるい
は固定相にある細胞、あるいは最少培地で増殖する細
胞、あるいは最適温度を上回る温度で増殖する細胞にお
いては一般に最高に達する。操作226−４の細胞は、ほ
んのわずかのカザミノ酸を補った最少培地で増殖させた
ために、最初のアプローチは、増殖培地のカザミノ酸を
増やすことであった。実施例２の操作211−５における
バッチ培地および供給培地は、カザミノ酸5g/、10g/
を、それぞれ開始後の約38時間後と54時間後に注入し
たことを除くと、226−４で用いた培地と類似してい
る。

第９図においてはOD₆₀₀をＡとして示した。図に示すよ
うに、216−６と命名した操作においてカザミノ酸を添
加したことによって、HBsAgを55から75時間後にわたっ
て『安定』させるのに役立った〔標識Ｂの（mg HBsAg/
）×10のプラトー（平らな部分）に注意〕だけではな
く、抗原の単位当たり量（ng/OD−mlを単位とする）
〔標識Ｃ〕が38時間後と55時間後に劇的に増加した。カ
ザミノ酸によってHBsAgのタンパク分解喪失が低下した
のか、HBsAgの産生を刺激したのかは別として、最終的
にはHBsAg量は増加した。

操作211−６のバッチ培地は、グルコース2g/、カザミ
ノ酸5g/、KH₂PO₄13.2g/、（NH₄）₂SO₄10g/、1M M
gSO₄4ml/、１％チアミン0.4ml/、微量金属溶液A1ml
/、ビタミン溶液A1ml/、フィルター滅菌イノシトー
ル0.04g/およびDow（登録商標）P2000 0.2ml/を含
んでいる。操作216−６の供給培地は、グルコース528.5
7g/、KH₂PO₄1.86g/、（NH₄）₂SO₄50g/、1M MgSO₄
15ml/、１％チアミン1.43ml/、微量金属溶液A2.86m
l/およびビタミン溶液A2.86ml/を含んでいる。

HBsAg低減の原因として考えられるものは、プラスミド
喪失ないしは発酵槽での培養物の変異であった。この仮
説を試験するために、発酵中に４時間から８時間ごとに
試料を採取し、非選択性YPG培地〔酵母エキス（BBL、コ
ッキィスビル、メリーランド州から入手）10g/、バク
トトリプトン（bactotryptone）（コッキィスビル、メ
リーランド州から入手）20g/、およびグルコース20g/
〕で平板培養し、それから選択性YMS培地で平板培養
を再び行った。発酵の試料採取を行った各時点におい
て、プラスミドの安定性は90％を上回った。次に、HBsA
gが低減している発酵の後期の一時点からランダムに20
個のコロニーを取り出した。次に、こけらのコロニーを
20個のフラスコに用意したYMS培地に植えつけ、回転振
盪機にかけて48時間にわたって増殖させた。すべてのフ
ラスコ内の培養物は、発現レベル100〜200ngHBsAg/OD−
mlでHBsAgを産生した。従って、培養の不安定性は、HBs
Ag低減の原因ではないことが確認された。

カザミノ酸のショット添加によってHBsAgのレベルが増
加したことから、操作248−４と称する次の発酵操作で
は、バッチ培地および供給培地のカザミノ酸のレベル増
加をそれぞれ増加させた〔（バッチ培地：操作211−６
および操作176−３の5g/に対して20g/とする）（供
給培地：操作211−６および操作176−３の0g/に対し
て100g/とする）〕。第10図に、操作248−４の30℃、
pH4.5におけるOD₆₀₀のプロファイルをプロットＡとし
て、mg HBsAg/のプロファイルをプロットＢとして、
そして、ng HBsAg/OD−mlのプロファイルをプロットＣ
とし示す。HBsAgの発現レベルは、発酵過程を通じて約2
00ng HBsAg/OD−mlに一定に保たれていることがわか
る。操作248−４では、HBsAg産生の安定性が向上するこ
とが望まれた。しかし、200ng HBsAg/OD−mlの発現レベ
ルは、操作211−６よりも２〜３倍低かった。

操作248−４のバッチ培地は、グルコース2g/、カザミ
ノ酸25.25g/、KH₂PO₄13.5g/、（NH₄）₂SO₄3.75g/
、1M MgSO₄4mla/、１％チアミン0.4ml/、微量金
属溶液A3ml/、ビタミン溶液A3ml/、イノシトール0.
02g/およびDow（登録商標）P2000 0.13ml/を含んで
いる。操作248−４の供給培地は、グルコース532.5g/
、カザミノ酸209.25g/、KH₂PO₄2.85g/、（NH₄）₂
SO₄5g/、1M MgSO₄15mla/、微量金属溶液A6.75ml/
およびビタミン溶液A6.75ml/、イノシトール0.02g/
およびDow（登録商標）P2000 0.13ml/を含んでいる。

実施例３では、カザミノ酸の拍動性および連続性の供給
はいずれも、HBsAg粒子の形成を安定させるのに役立っ
た。ただし、連続供給における安定化は明らかに発現レ
ベルの低減を招いた。タンパク分解酵素の作用を最小限
に抑えるために、実施例４では低温増殖を用いた。

実施例４ 262−４と命名した操作では、カザミノ酸（約25g/）
を加えた増菌培地で菌株SC RH218/pGPD−１を増殖し、
さらにバッチカザミノ酸（約110g/）を加えた増菌培
地を供給した。（バッチ培地および供給培地は、その他
の点については操作248−４のものと同様である。）こ
の操作温度は、発酵開始から28時間後に、通常に用いる
30℃（pH4.5）から25℃に低下させた。この操作の結果
を第IV表に示し、かつ第11図のグラフにおいて、OD₆₀₀
のプロットをＡで示し、（mg/）×10のプロットをＢ
で示し、さらにng/OD−mlのプロットをＣで示す。

発現レベルは、ｔ＝70時間に489ng/OD−mlのピークに達
した。これは、OD単位96の場合には、当たりHBsAgが4
6.9mgとなる。ほぼｔ＝63時間において、供給培地は枯
渇した。しかし、発現レベルと全HBsAg量は双方とも、
この時点から70時までは上昇を続け、70時に至るとHBsA
gの量は、増殖停止後に誘導されたタンパク分解酵素の
作用によるものと思われるが、急激に低減した。

262−５と称する操作で用いた培地は、わずかに5g/の
CAAを最初のバッチ培地に加えただけの最少培地に近い
ものであった。供給培地においては、硫酸アンモニウム
が唯一の窒素源であった。

操作262−５のバッチ培地は、グルコース2g/、カザミ
ノ酸5g/、KH₂PO₄13.5g/、（NH₄）₂SO₄10g/、1M M
gSO₄4mla/、１％チアミン0.4ml/、微量金属溶液A3m
l/、ビタミン溶液A3ml/、イノシトール0.02g/お
よびDow（登録商標）P2000 0.13ml/を含んでいる。操
作262−５の供給培地は、グルコース532.5g/、KH₂PO₄
2.85g/、（NH₄）₂SO₄50g/、1M MgSO₄15mla/、１
％チアミン1.43ml/、微量金属溶液A6.75ml/、ビタ
ミン溶液A6.75ml/、イノシトール0.04g/を含んでい
る。操作262−４と同様に、温度はｔ＝28時間におい
て、30℃から25℃へ低下させた。

操作262−５（pH4.5）の結果を第Ｖ表および第12図に示
す。図中、OD₆₀₀のプロットをＡで示し、（mg/）×10
のプロットをＢで示し、ng/OD−mlのプロットをＣで示
し、さらに（エタノールのg/）×10のプロットをＤで
示した。温度を30℃から25℃に下げた後、発現レベルは
増加し、発酵が終了するまで増加を約めた。さらに全HB
sAg量も発酵が終了するまで増加を続け、最大61.7mg HB
sAg/に達した。

260−４と命名した操作（pH4.5）では、操作248−４で
用いたものとほぼ同じ増菌培地および供給培地を用いた
が、開始時点から低温25℃を用いた。操作260−４の結
果を第VI表及び第13図に示した。OD₆₀₀のプロットはＡ
で示し、（mg/）×10のプロットはＢで示し、さらにn
g/OD−mlのプロットはＣで示した。

第11図および第12図に、時間の経過を示した。しかし、
予測しなかったHBsAgのわずかな低減が生じ、68.5時間
後の54.7mg/から72.5時間後の53.8mg/まで低減し
た。

このように、25℃の低温は、おそらくタンパク分解酵素
の濃度ないしな活性を低減することによって、HBsAgの
生産を安定させるように見える。カザミノ酸を加えた増
菌培地（61.7mg/）と増菌しなかった培地（63.6mg/
）の双方において、温度を低下させることによって60
mg/を上回るHBsAgレベルが得られた。ワクチン20μｇ
のHBsAg/投与量では、これらの数字は発酵ブロスが3000
投与量／を超えることを示す。

このように、本発明を望ましい実施態様によって説明し
たが、当業者からすれば、その態様の変更ならびに改良
が可能であると考えられる。従って、本発明は特許請求
の範囲の欄に示す限定のみ付加されるべきである。

図面の簡単な説明第１図は、HBsAgを発現する酵母の発酵のための標準的
な発酵操作のための条件を示すグラフである。

第２図は、第１図に示した条件におけるエタノール濃
度、グルコース濃度およびOD₆₀₀を示すグラフである。

第３図は、第１図に示した条件における増殖収量データ
を示すグラフである。

第４図は、最少培地および増菌培地を用いた細胞増殖に
おけるOD₆₀₀のグラフである。

第５図は、時間に対する細胞およびエタノール濃度のグ
ラフである。

第６図は、カザミノ酸添加および無添加の場合のエタノ
ール中での酵母菌株の増殖を示すグラフである。

第７図は、カザミノ酸の濃度が異なる場合の、時間に対
する細胞濃度を示したグラフである。

第８図は、カザミノ酸を補給した培地を用いた操作条件
における増殖曲線を示すグラフである。

第９図は、カザミノ酸を補給した培地を用いた他の操作
条件における増殖曲線を示すグラフである。

第10図は、本発明の培地を用いた操作条件における増殖
曲線を示すグラフである。

第11図は、本発明に従って低温で行われた操作条件にお
ける増殖曲線を示すグラフである。

第12図は、最少培地を用い、かつ本発明に従って低温で
行われた操作条件を示すグラフである。

第13図は、本発明の培地を用い、かつ本発明に従って低
温で行われた操作条件を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酵母細胞から外来遺伝子生成物を発現させ
るための培地であって、前記培地が20〜160g/の濃度
のカザミノ酸を含むことを特徴とする、酵母細胞から外
来遺伝子生成物を発現させるための培地。
【請求項２】前記カザミノ酸の濃度が、100g/である
特許請求の範囲第１項に記載の培地。
【請求項３】酵母細胞から外来遺伝子生成物の発現を増
進させるための方法であって、下記工程、すなわち； 25℃の温度下で、20〜160g/の濃度のカザミノ酸を含
む培地にて酵母を培養する、工程を含むことを特徴とする酵母細胞から外来遺伝子生
成物の発現を増進させるための方法。
【請求項４】酵母細胞から外来遺伝子生成物の発現を増
進させるための方法であって、下記工程、すなわち；炭素源濃度とエタノール濃度を共に可能な限り零に近づ
け、かつカザミノ酸の濃度を20/160g/とした発酵培地
にて、酵母を培養し；および前記発酵培地の温度を25℃に維持する、工程を含むことを特徴とする酵母細胞からの外来遺伝子
生成物の発現を向上させるための方法。
【請求項５】前記酵母を培養する工程が、少なくとも30
％の空気飽和度となるように、前記培地を酸素で飽和す
る工程をさらに含む特許請求の範囲第４項に記載の方
法。