JPS6341428A - 牛流行熱・イバラキ病・アカバネ病３種混合不活化ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の１ 本発明は牛の伝染病予防薬、さらに詳しくは牛流行熱、
イバラキ病およびアカバネ病の３種混合不活化ワクチン
に間する。

良り立且ｌ之且ｌ且Ｉ　′ 牛流行熱、イバラキ病およびアカバネ病はウィルスによ
って起こる牛の伝染病であり、日本で特に多く発生し畜
産業界の生産性を低下させる大きな要因となっている。

牛流行、熱は、中流ｊテ熱ウィルスによる感染によって
起こる急性熱性伝染病゛で゛あり、日本のみならず−南
アフリカやオーストラリアでも広く流行が認゛められて
いる。このウィルスに牛が感染すると４０℃以上の高熱
が２日ないし４日間続き呼吸速進し、重症の場合は窒息
死する例もある。食欲は減退または廃絶し、四肢の関節
に痛みが生じ、歩行困難に陥る場合もある。感染率は高
いが、致死率はそれほど高くなく、予後は一般に良好で
あるが、後に述べるイバラキ病などが合併して発症する
場合は致死率は高くなり、予後不良の例が増すことが多
い。

イバラキ病は、イバラキウイルスによって起こる１下困
難を特徴どする感染症である。−船釣な症状としては、
発病する場合には眼圧状は心弁てあり、結膜の充血、浮
腫を起こし、重症例では結膜が外に露出する０本病の最
も特徴的な症状は、上記の諸症状の消道後に現れる曙下
障害である。

この喰下障害は嘆下に関係する筋肉の変性情死に基づく
もので、舌、咽喉頭部および食道の麻ひ等が生じ、この
ために病中は正常に水を飲むが、飲んだ水は口や鼻孔か
ら逆流するようになる０本病の致死率が高い原因は、こ
のように病中が水分を摂ることかできないために水分子
！ｌ１ｆｌｌ！に陥り、死亡することによるものである
。

これら牛流行熱、イバラキ病はともに家畜法定伝染病と
して指定されているため、疾病のための損失もさること
ながら、法的な移動の制限等により畜産業界に大きな損
失をもたらす伝染病である。

一方、アカバネ病は妊娠中に大きな影響を及ぼすウィル
ス性の伝染病であり、このアカバネウィルスに感染した
妊娠中は、流産や早産を引き起こす、妊媚母牛の体内て
胎子がこのウィルスに感染した場合、非化膿性脳を髄炎
、萎縮筋違、関節湾曲症、ざらには大脳欠損症等を引き
起こすため、繁殖農家に与える経済的損失は非常に大き
い。

これら３つの伝染病の予防を目的としたワクチンは、そ
れぞれ、すでに開発されており、現在では広く畜産業界
で用いられている。

牛流行熱に対するワクチンは、生ワクチンと不活化ワク
チンが開発されており、生ワクチン、不活化ワクチンの
いずれを用いても１回の接種では十分な免疫効果が得ら
れず、現状の接種方法としては、不活化ワクチンを３週
から４週間隔て２回接種する方法と、生ワクチンを接種
し３週から４週後に不活化ワクチンを接種する２通りの
方法が用いられている。

イバラキ病に対するワクチンとしては、これまで生ワク
チンのみが開発され、本病流行時期前にこの生ワクチン
を１回接種することにより十分な免疫が得られることが
確認されている。

また、アカバネ病に対するワクチンは、生ワクチンと不
活化ワクチンがこれまでに開発されているが、不活化ワ
クチン接種の場合には２回の接種が必要であるために現
在では用いられておらず、１回の接種で免疫可能な生ワ
クチンが広く用いられている。

これら牛流行熱、イバラキ病および７カバネ病は、すべ
てウィルスの流行時期が６月から１！月とほとんど一致
していることと、またこれらのワクチンの免疫持続期間
がせいぜい９力月と比較的短いため、これらを予防する
場合には毎年同じ時期にこれら３種の伝染病に対するワ
クチン接種が必要となっている。従って、これらのワク
チンは同時に、好ましくは混合ワクチンとして接種する
が望まれている。しかしながら、今日までこれらの混合
ワクチンは開発されておらず、それぞれの単味ワクチン
を別々に一定の期間をおいて接種することを余儀なくさ
れている。

その理由は、従来の生ワクチンを主体とするワクチンで
は、これらのワクチンを同時に牛に接種した場合や期間
を十分におかずに接種した場合、それぞれのワクチンが
互いに干渉作用を及ぼすことが認められ、特に７カバネ
ウイルスに対する抗体埋土が大きく抑制されることが確
認されており、このために、７カバネ生ワクチンは池の
ワクチン接種と十分期間をおいて接種しなければならな
いからである。

叩ち、　　４２的なワクチン接種方法としては、上記の
干渉作用を避けるため、まずアカバネ生ワクチンを１４
初に１妾ｆＪｔ　Ｌ、、その後、牛流行熱生ワクチン、
イバラキ生ワクチンおよび牛流行熱不活化ワクチン（２
回目）をそれぞれ２週間から４週間の間隔をおいて接種
せざるを得ない、このように牛飼育業界では、これらの
伝染病予防として、流行前の４月から６月の非常に長い
期間に亙って少なくとも４回のワクチン接種が必要とな
っている。

このことは、労力的にも経済的にも牛飼育業者にとって
大きな負担とな７ているとともに、牛に対しても接種時
に何度も捕獲・保定することによって不必要なストレス
を数多く与える結果となっている。

またワクチン接種に長期閏必要とすることにより、最初
に接種するワクチンはウィルスの流行が始まるまでに２
ケ月間近くの無駄な期間が過ぎることになり、流行時期
末期までの十分な免疫効果の持続という点でも問題が残
されている。しかも、イバラキウイルスがオルビウイル
ス属であるために、イバラキ生ワクチン接種によりウィ
ルス血症をおこしたイバラキウイルスが、牛やベクター
となるヌカ力の生体内でＭＪ換えを起こし、牛に所しい
ウィルス感染を生じさせる可能性があるということが最
近示唆されており、この点についても現在のイバラキ生
ワクチン使用は問題が残されている。

＾朋Ｊとｌ旬 従って、本発明の目的は、従来の技術では得ることので
きなかった有効かつ安全な牛流行熱・イバラキ病・アカ
バネ病３種混合ワクチンを提供することである９本発明
のこの目的は、上記３種の牛病ウィルスすべてを不活化
した３種混合不活化ワクチンを提供することによって達
成できる０本発明によれば、これまでに問題となってい
た接種時の手間を大きく削減するとともに、抗原相互の
干渉作用がなく、免疫効果が増強され、さらに牛に対す
る安全性の向上した牛流行熱・イバラキ病・アカバネ病
３種混合ワクチンが提供される。

特に、本発明はイバラキウイルスを不活化する隙におい
て、ウィルス液を超音波処理を行った後、ホルマリン処
理をすることによって、従来不活化されにくいとされて
いたイバラキウイルスを完全に不活化し、これまで開発
されてなかったイバラキ病不活化ワクチンを調製し、こ
れを牛に２回接種し免疫効果を調べたところ、現在用い
られているイバラキ病生ワクチンと同等またはこれを上
回る免疫効果が得られることを見い出したことに基づく
、さらにこのイバラキ病不活化ワクチンは、これに牛流
行熱不活化ワクチンおよびアカバネ病不活化ワクチンを
混合し、牛に接種したところ、これまでのワクチンのよ
うな干渉作用を起こさず、これら３種のワクチンそれぞ
れを単味で牛に接種した場合と比較して免疫効果が低下
することもなく、３種のワクチン同時接ｆ１が混合ワク
チンの形で、有効かつ安全に可能であることを見いだし
本発明を完成するに至った。

■の　　゛　　　の７ 本発明でウィルスの培養に用いる細胞としては、各々の
ウィルスに対して感受性を有する細胞、たとえば培ｌＩ
細胞を用いる場合、ＨｍＬｕ−１″ａ胞（子ハムスター
肺由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（ミドリザル胃細胞）およ
びＢＥに−１（牛脂子腎細胞）等の株化継代細胞等があ
げられ、生体内で培養する場合ではマウス脳内や発育鶏
卵等があげられる。培養するウィルスとしては、牛流行
熱ウィルス、イバラキウイルスおよびアカバネウィルス
を用いる。ウィルスの培養は、通常の培養条件、たとえ
ばＨｍｌｕ−１細胞を用いる場合、回転培１ｍ等を用い
３０℃〜３７℃で３日から７日間培養し、細胞内でウィ
ルスが十分増殖した適当な時期（たとえば細胞変性効果
（ＣＰＥ）の出現等をマーカーとすることができる）に
ウィルス液を回収する。このようにして得たそれぞれの
ウィルス原液を、それぞれのウィルスの性質にあわせて
ホルマリン添加または紫外線照射等によってウィルスを
不活化する。たとえば牛流行熱ウィルスの不活化にはホ
ルマリンを終濃度で０．２％になるように添加し３７℃
で２時間処理する方法、アカバネウィルスの場合は終濃
度で０．０５％のホルマリンを添加し４℃７日閘処理す
る方法が用いられる。イバラキウイルスの場合、ウィル
スが凝集してその表面をシュードエンベロープが覆って
いるために、通常のホルマリン処理ではウィルスを完全
に不活化できないという問題があった。これに対して本
発明者らは、培養したウィルス液をウィルス液を超音波
処理した後ホルマリン処理することによりイバラキウイ
ルスを完全に不活化することに成功した。すなわちイバ
ラキウイルスの不活化には、培養して得られたウィルス
液を前処理として超音波処理を行い、その後ホルマリン
で不活化することが重要である０例えば十分に超音波処
理した後、終濃度で０．２％になるようにホルマリンを
添加し３７℃で７日間の処理する方法が用いられる。こ
のようにして得られた各不活化ウィルス液を不活化前の
ウィルス感染価（ＴＣＩＤｓθ）で３ｆ！のウィルス量
が等量になるように、ウィルス原液を混合し、この混合
ウィルス液について無菌試験、ホルマリン定量試験（ホ
ルマリンで不活化した場合）等を行い安全性を確かめ、
３種混合ウィルス原液を得る。この混合ウィルス液に通
常のアジュバント、例えばリン酸アルミニウムゲル、水
酸化アルミニウムゲル等を添加し、適当量をバイアルに
分注し、所望の牛流行熱・イバラキ病・７カバネ病；３
種混合不活化ワクチンを得ろ。本３種混合不活１ヒワク
チンの接１ｆｆｌ　１１としては、それぞれの不活化ウ
ィルス成分が不活化前のウィルス感染価１０５〜ＩＱ７
ＴｌｌＣ５０／　ｄｏｓｅ程度になる量である。

本発明によれば、中流行熱、イバラキ病および７カバネ
病の予防にこれまで少なくとも４回必要であったワクチ
ン接ｆｆｆｉを、本発明で提供される３４混合不活１ヒ
ワクチンを接種することによって２回の接（１で十分な
免疫を得ることが可能となる。

また、従来の生ワクチンに比べて、生きたウィルスを含
まない本発明の不活化ワクチンが、より安全性が高いこ
とは言うまでもなく、最近示唆されているイバラキウイ
ルスの組換え等により生じろ危険性も完全に否定てきう
るものである。さらに２回の接Ｉて済むことにより接種
期間も大幅に短縮され、これまでのように流行時期の２
力月も前からワクチン接種を始める必要がなくなり、そ
の結果として流行末期まで十分な免疫効果の持続が可能
となる。これに加えて、多数類飼育が進んでいろわが国
をはじめその曲の先進国の畜産業界にとっては、本発明
によりワクチンの接種回数が大きく削減されたことて、
経済的にも労力的にも生産性向上に大きな効果をもたら
すものである。

次に、本発明を実施例に沿って、更に詳細に説明する。

支止１ １１ｍ１ｕ−１，＊胞１０５個／１をイーグルＭＥＭ培
地で培養びん（ルーびん又は回転びん）を用いて３７℃
で３ｈ）ら４日間培養し細胞層を準備した。中流１テ熱
ウィルスＹ　ＩＩ　Ｌ　Ｋ、イバラキウイルスＮｏ２株
および７カバネウイルスＯＲε−１株を別々に、このＨ
ａ＋Ｉｕ−ＩＩ胞に１１０１：０．１で接種した。これ
を３４℃で４〜５日間培養し、それぞれ細胞変性効果（
ＣＰＥ）が出現したところで、そのウィルス液を採取し
、この培養ｉ夜を３０００ｒｐｏ＋。

１５分遠心分なし、それぞれのウィルス液を得た。

中流行熱ウィルス液は、終濃度で０．２％のホルマリン
を添加し、３７℃で２時間処理し、不活化を（デなった
。アカバネウィルス液は、終濃度でホルマリンを０．０
５％添加し、４℃で７日間処理し、不活化した。さらに
イバラキウイルスの場合は、ウィルス液ｒ：超音波処理
した後、終１度でホルマリンを０．２％添加し３７℃で
７日問感作し１．ウィルスの不活化を行った。このよう
にして得た各不活化ウイルスンαをＴＣＩ　０５０量で
等量になるように混合した。この混合ワクチンをバイア
ルに分注し、２〜５℃で暗所りこ保存した。

本混合ワクチンの安全性を確認するために約４週齢のマ
ウスと体重約３００ｇモルモットを用い、その皮下、筋
肉内および腹腔内に接種し臨床症状を観察した。結果を
第１表および第２表に示した。

第１表 Ｙ１＋ｔＪ：ｌ：［Ｂコ１０５７５ＴＣ１［）５０、イ
バラキウイルスＮｏ、１２ｔｌ［Ｉ］ｌＯ’θＴＣｌ　
０５０およびアカバネウィルス０ＲＥ−１株［ＡコｌＯ
’８ＴＣＩ０５０を含む。

※：培培土上清み 第２表 臨床観察 Ｉ　　　　　５　　　皮下　　：！、０（ＩｃＩ）　　
異常なし　　３０２　　　３６０■　　　　　５　　筋
肉内　１−０（＊２）　　異常なし　　３０９　　　３
７０ＩＩＩ　　　　　５Ｍ腔内　５．０＜＊３）　　異
常なし　　３０５　　　３６８■（７札０５　　腹腔内
　５．０（※）　異常なし　　３００　　　３６０注　
それぞれのｔ１ｉ種量には下記の不活化前ウィルス回を
含む零１　　　［８１：＋０６２’ＴＣＩＤ５０　　　
［１１：１０’・５ＴＣＩ０５０　　　［Ａコニ１０６
５ＴＣＩＤ５０＊２　　　［８］：１０’・θＴＣＩＤ
５０　　　１１’ｌ］：１０’　　２７ＣＩ０５０　　
　［ＡコニｌＯ”ＴＣＩＤ５０ネ３　　［８１：１０６
・”ＴＣＩ［）５０　　［＋１：１０６−ｇＴｃｌ０５
０　　［Ａ］：１０’＝ＴＣＩＤ５０※　培養上清のみ さらに体重約１５９ｋｇの牛を用いて、皮下および筋肉
内に接種し、臨床症状を観察した結果を第３表に示した
。。

第３表 ■　　　　３　　筋肉内　３．０（＊）　　　　　　す
べて異常なし注　＊：接種ｉ３．Ｏｍｌには、不活１ヒ
前ウイルスｆｆｉ［Ｂ］：１０６５”　ＴＣＩＤ５０、
［，１］；１０６”　ＴＣＩＤ５０および［Ａ］：１０
””　ＴＣＩ０５０を含む。

上記の表から明かなようにマウス、モルモットおよび牛
のいずれにも接種による異常は認められず、本混合ワク
チンが安全であることを確認した。

さらに本混合ワクチンの有効性を確認するため、約４適
齢のマウスおよび体重３００ｇのモルモットに、本混合
ワクチンとそれぞれの単味ワクチンを、それぞれ４週間
隔で２回接種し、２回目の接種から１週間の後それぞれ
のウィルスに対する中和抗体の産生を測定した。その結
果を第４表、第５表に示した。また、牛に本混合ワクチ
ンとそれぞれの単味ワクチンを同様に接種し、２回目接
種後７週間と接種後９ケ月間の中和抗体価の変化を調べ
た。

その結果を第６表、第７表に示した。

（以下余白） 第４表 （注）ネ：５匹ずつ血清をプールした中和抗体価（３群
を横１列に記載）ＢＥＦＶ　：中流行熱ウィルス　　Ｉ
ＢＶ：イバラキウイルスＡＫＡＶ：アカバネウイルス 接種量は、中流行熱つィルスＹＨＬ株［Ｂ］ｌ０５７５
ＴＣＩＤ５０、イバラキウィルスＮｏ、１２株［＋］１
０６″ＴＣＩＤ５０．７−ｊ）ハネウィルス０ＲＥ−１
株［Ａコ］０６８ＴＣＩＤ５０第５表 １１４［Ｂ］不活化　６４，６４，６４．３２　　　　
ＮＴ　　　　　　ＮＴ■　　　　４　　［！コ不活化　
　　　ＮＴ　　　　１６．３２．３２．１６　　　　Ｎ
ＴＩＶ４［Ａ］不活化　　　　ＮＴ　　　　　　ＮＴ　
　　　６４．（３４，６４，３２Ｖ　（対照）４　　　
　　　非を身程　　　　　（２，（２，＜２．（２＜２
．＜２．＜２．＜２　　　＜２．＜２．＜２．＜２（注
）木：個体ごとの血清の中和抗体価（４匹を横１列に記
載）ＢＥＦＶ　：中流行熱ウィルス　　ＩＢＶ：イバラ
キウイルスＡにＡｖ：アカバネウィルス 接種量は、中流行熱ウィルスＹ）１１株［８］１０’・
２ＴＣＩ９５０、イバラキウイルスＮｏ、１２株［＋］
１０”　ＴＣＩＤ５０、アカバネウィルス０ＲＥ−１株
［Ａコｌｏ”４ＴＣＩＤ５０第６表 Ｖｌ　　　　　　　非接種　　　ＩＢＶ　　　　　　　
＜２　　　＜２　　　＜２　　　＜２　　　＜２　　　
＜２　　　＜２　　　＜２ＡＫＡＶ　　　　　　＜：ｌ
　　　＜２　　　＜２　　　＜２　　　＜２　　　＜２
　　　＜２　　　＜２ＡＫＡＶ：アカバネウィルス 接種量は、中流行熱つィルスＹＨＬ株［８１１０６・５
７ＣＩ０５０、イバラキウイルスＮｏ、１２株［１コ１
０６７５ＴＣＩＤ５０、アカバネウィルス０ＢＥ−１株
［Ａ］１０’−７５７ＣＩ０５０（以下余白） 第７表 ４　　　　　　　　非接種　　　　　ＩＢＶ　　　　　
　＜２　　　　＜２　　　＜２　　　＜２　　＜２　　
　＜２　　（２ＡＫＡＶ：アカバネウィルス　前ｌ：１
回目接種前　前２：２回目接種前接種量は、中流行熱つ
ィルスＹＨＬ株［８１１０６・５ＴＣＩ０５０、イバラ
キウイルスＮｏ、１２株［１］１０６７５ＴＣＩＤ５０
．７カ／Ｑ、’７−１’／１．ス０ＢＥ−１株［Ａコ１
ｏ６７ｓ　ＴＣＩＤ５０以上の表かられかるように、マ
ウス、モルモットおよび牛において、いずれも抗体産生
は良好な結果を示し、各単味ワクチンを接種した場合と
比較しても同等以上の産生量を示した。この結果からも
本発明の混合不活化ワクチンは、これよての生ワクチン
の場合と異なり、互いに抗体産生の抑ｖ１ヲ起こすよう
な各ワクチン成分の干渉作用を起こさないことが確認さ
れる。

このように中流行熱、イバラキ病および７カバネ病の３
種の伝染病に対して２回のみの接種で、有効かつ安全な
ワクチン接種ができるようになったことは、経済的にも
労力的にも今日の畜産業界の生産性向上に大きな効果を
もたらすものと確信される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）牛流行熱ウィルス、イバラキウイルスおよびアカ
   バネウイルスを細胞でそれぞれ培養して得たウィルス液
   を不活化し、混合した牛流行熱・イバラキ病・アカバネ
   病３種混合不活化ワクチン。