JPS6333394A - Ｎ↑６−置換ｎａｄ、ｎａｄｐ又はｆａｄの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ジＡ　Ｏ−（Ｄｉｍｒｏｔｈ）転位によシＮ
６−置換ＮＡＤ％ＮＡＤＰ又はＦ’ＡＤ　ｉ製造する方
法に関するものであり、特に詳細には該転位の前の還元
および該転位の後の酸化を伴なわない反応によシ製造す
る方法に関するものである。 固体状高分子基材又は水溶性マクロ分子物質に結合した
ＮＡＤ（Ｈ）又はＮＡＩ）Ｐ（Ｈ）はすでに研究されて
おりモしてここ１５年程の間に実用化されて来ている。 固体基材に結合したこれら補酵素はアフィニティークロ
マトグラフィーの使用に成功している（１）。（本文中
この番号は、本文末尾に記載した参考文献を表示する番
号である。）水溶性マクロ分子ＮＡＤ（Ｈ）又はＮＡＤ
Ｐ（Ｈ）は、補酵素利用の酵素触媒分解による精化学品
の連続製造用の酵素膜反応器中の酵素再生可能な補酵素
誘導体として使用される（２ル これらのマクロ分子ＮＡＤ（Ｈ）又はＮＡＤＰ（Ｈ）誘
導体合成の従来法は、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ　　のアデニ
ン環系のＮ（１）−位をアルキル化し、・これを化学的
に還元してＮ（１）−アルキル化ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰ
Ｈとし、次いで塩基性溶媒中の高められた温度（ｐＨ１
０−１１，６０を０℃）でのディムロス転位に元され九
補酵素をマクロ分子と共有結合させるか又はこれを酵素
酸化してＮ６−アルキル化ＮＡＤ又はＮＡＤＰとし次い
でマクロ分子と共有結合させることから成るものである
。 この反応順序はＮＡＤおよびＮＡＤＰ　を例えばよう化
酢酸（３，４）、プロピオラクトン（５）、３，４−エ
ポキシ酪酸（６，７）又はエチレンイミン（８，９）の
様なアルキル化剤を使用してアルキル化する場合のもの
である。こうしてアルキル化された補酵素はマクロ分子
と共有結合するためにアデニン環のＮ６−原子の位置の
連鎖末端にカルボキシル基又はアミノ基を有している。 この結合用には、その結合に反応性を有する１個又はそ
れ以上の官能基金布する不溶性マクロ分子（固体基材、
マトリックス）又は可溶性の、特に水溶性のマクロ分子
が使用可能である。マクロ分子はそれ自体その様な官能
基を有するものであっても良く、又は官能基を当業者に
公知の方法によシマクロ分子中に導入することもできる
。使用可能なマクロ分子の例としては、デキストラン、
ポリエチレングリコール、ホリエチレンイミン、ポリア
クリルアミド、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸
、エチレン／無水マレイン酸およびジビニルエーテル／
無水マレイン酸の様なコポリマー、アガロース、カラス
、セルロース、シリカゲルおよびこれらマクロ分子の誘
導体を挙げることができる。マクロ分子補酵素誇導体の
合成法としては、先の従来法の変法と考えられる別法が
開発されており多くの場合これら別法はその合ａｔ簡略
化することを意図しているものである。例えば、従来法
で合成したＮ’−（（６−アミノヘキシル）カル・よモ
イルメチル）−ＮＡＤ＋全水溶性たん白質に結合する場
合のトランスグルタミナーゼを使用しての触媒反応によ
る共有結合カップリング、例えばＬ−グルタミンのγ−
カルボキシアミド９基を介したカゼインのカップリング
が報告されているＱ（１゜ 又、従来法により最初にＮＡＤのＮ６−ビニル誘導体を
作り次いでこれらを他のビニルモノマーと共塩合してマ
クロ分子ＮＡＤ　　とすることもできる（５）。簡略化
した共重合法（すなわち、Ｎ（１）−ビニル−ＮＡＤ＋
の生成と同時に共本合とディムロス転位を行う）では限
られた程度（＜４０％）にのみ酵素還元可能なマクロ分
子ＮＡＤ　　′ａ誘導体生成した任υ。 エポキシ基を有する水溶性ポリマーによるものとしては
、変性していないＮＡＤ　　から出発してこれ’ｔ　Ｎ
　（１）−アルキル化し、そして還元してＮ（１）−ア
ルキル化ＮＡＤＨとし次いでジムロ−転位によりポリマ
ーと共有結合したＮ６−アル中ル化ＮＡＤＨとする工程
金３工程で行う方法が知られている！１２１゜ＮＡＤＨ
から出発する場合は、Ｎ（１）−アルキル化と塩基性溶
媒中でのジムロ−転位とによるカップリングを同一条件
下で同時に行うことができるので１工程でも行うことが
できる。ｋ　Ａ％の場合で、ヤリ６０％まで酵素酸化ｏ
Ｔ症なマクロ分子ＮＡＤＰ（が得られた。 これらの簡略法は第２工程での補酵素の反応のために非
常に不明瞭なマクロ分子ＮＡＤ（Ｈ）　　が生成する点
において欠点がｆｂＦ）、そしてこれらは酸化性又は還
元性が限られる原因となるものである。 このｎＭＮ法と従来法の中間であってカップリング後の
Ｎ　ＡＤＨ類を均一なものとして得る利点を有する方法
として、Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ　上
台成し、これｔ水溶性ポリマーと共有結合してマクロ分
子Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ　　とし、
これ位化学的還元してマクロ分子Ｎ（１）−（２−アミ
ノエチル）−１１ＡＤＨとし、次いでこれをジムロ−転
位してマクロ分子Ｎ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ
Ｈとすることから成る方法が見出された（１人１４）。 充分に明瞭な補酵素上布するマクロ分子ＮＡＤ（Ｈ）又
はＮＡＤＰＪ団の製造方法は全て通常還元されたＮ　ｍ
−アルキル化補酵素のジムロ−転位工程を含むものであ
るという点が貞要である。この転位は補酵素にとって非
常に厳しい条件下で行なわれるものであり、その結果、
未カップリング状態のかなりのロスが出る（ｐｉ−１１
０，５〜１１．２：温度６０〜７０℃二所要時間１．５
〜２時間）。 Ｎ（１１（カルボキシメチル）−ＡＴＰについては、そ
のＮａ−（カルボキシメチル）−ＡＴＰへのジムロ−転
位の条件は、そのトリフオスフェート基の安定化のため
と思われるＯ）！−の形の陰イオン交換剤ｔ−Ｎ（１）
−（カルボキシメチル）−ＡＴＰ水溶液中に加えること
によって改善することが出来た（１ツ。ＨＰＬＣによっ
て１００℃、７５℃又は刃℃においてそれぞれ５５＋、
１０分又は２４０分間保持してほとんど生成物ｒ分解す
ることなく完全なディムロス転位を検出することが出来
た。Ｎ（１１（カルボキシメチル）−ＮＡＤ　から出発
する場合は、補酵素活性を有するＮａ−（カルボキシメ
チル）　−ＮＡＤを同様な方法で生成することは不可能
であった口９゜問題点を解決するための手段 本発明の１態様として、本発明はマクロ分子に結合した
ＮＡＤ又はＮＡＤＰ　の製造方法金史供するものであっ
て、その方法は補酵素のアデニン環系を１−位において
エチレンイミンでアルキル化してＮ（１）−（２−アミ
ノエチル）−ＮＡＤ又は　Ｎ　（１）−（２−アミノエ
チル）−ＮＡＤＰとし、こうしてアルキル化された補酵
素全ジムロ−転位にとって非常に温和な条件（好ましく
はｐ！（５〜８．温度９℃、所要時間６〜８時間）下で
水性媒体中で酸化状態に転位してＮａ−（２−アミノエ
チル）　−ＮＡＤ又はＮａ−（２−アミノエチル）−Ｎ
ＡＤＰとし、次いでＮａ−（２−アミノエチル）−ＮＡ
Ｄ又はＮａ−（２−アミノエチル）ＮＡＤＰｉ第１級ア
ミノ基に反応性のある基土布するポリマーと結合させる
ことから成る。 アデニン環のＮａ−位の変性によシ合成した１１’ＡＤ
誘導体の水溶性ポリマー又は固体基材上への固定につい
ては２つの方法がこれまでに報告されている。　　Ｚａ
ｐｅｌｌｉ　　等ａＩＧは、Ｆ’ＡＤの３，４−エポキ
シ酪酸でのアルキル化の後にＮ（１）−（２−ヒドロキ
シ−３−カルボキシプロピル）−ＦＡＤｔ？厳しい条件
（ｐＨＩＱ、８０℃）下にジムロ−転位することにより
合成したＮａ−（２−ヒドロキシ−３−カルボキシプロ
ピル）−ＦＡＤ　　とポリエチレンイミントｔカップリ
ングさせた。彼らは共有結合していない、従って溶出可
能なＦ”ＡＤ　　ｋＷするＤ−アミノ償オキシダーゼお
よびグルコースオキシダーゼの固着形としての長期間保
存安定性は連続的にＦ’ＡＤ　　２補充する作用を有す
るポリエチレンイミン−Ｎａ−（２−ヒドロキシ−カル
ボキシプロピル）　−ＦＡＤの存在下に著しく改善され
ることを示した。 ＮａｒａｓｉｍｈａｎおよびＷｉｎｇａｒｄ　（１７）
は存在するホルムアルデヒド活性化アミノシラン基と反
応するインジウム／酸化すず電極上にＦＡＤ　　２固層
してアデニン環のＮａ−位を介して直接−ＮＨ−ＣＨ２
−ＮＨ−結合を生成した。これはその電極においてＮ　
ＡＤＨのＮＡＤへの酸化を満足させるには充分でないが
、ＮＡＤＨの過電圧ｔ−１８０ｍＶ減少させることがで
きた。そして彼らは第２の反応によりＦＡＤ　　分子の
別のカップリング位が固定化に利用できるであろうとの
可能性を言及している。 Ｎａ−アミノアルキル化ＦＡＤ　誘導体、し１１えばＮ
ａ−（２−アミノエチル）Ｆ’Ａｎｄこれまでに知られ
ていない。 先に記載した本発明方法である水性媒体中非常に温和な
条件下でＮ（１）−（アミノエチル）−アデニンをＮＡ
ＤおよびＮＡＤＰのＮ６−（２−アミノエチル）−アデ
ニン誘導体へ変換する方法は、そのＮ（１）−（２−ア
ミノエチル）−ＮＡＤの変換の場合と同様の変換率で本
発明の別の態様であるＮ（１）−（アミノエチル）−Ｆ
’ＡＤのＮ６−　（ｚ−アミノエチル）−ＦＡＤへの変
換にも適用可能である。 Ａ、Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−ＮＡＤの製造２
００９　（３００ｍｍｏｅ）のＮＡＤ　　（、ｔリエン
タル酵母、遊離酸）を４００−の蒸留水中に溶解した。 ７０％の過塩素酸（全量６５０　ｍｌ　）で≠１値を３
．２±０．０５に保ちながら、これに４２．５　ｔｄ　
（８５０ｍｍｏ　ｌ　）のエチレンイミン（Ｓｅｒｖａ
）　　ｔ−ゆっくりと加えた。反応混合物１＆：３０’
ｃ、ｐＨ３，２±０．０５（７０％過塩素で調整）で刃
時間攪拌した。ＮＡＤのＮ（１）−（２−アミノエチル
）−ＮＡＤへの転換は、可動相として６６　／　３３／
１　（ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）のイソ酪酸／蒸留水／２
５％アンモニア水（ｐＨ３，７）ｅ使用したシリカゲル
上の薄層クロマトグラフィー（ＤＣアルミニウム箔シリ
カゲルω’２５４、膜厚０．２　ｍｍ、メルク社製）で
の紫外線走査により測定した。反応混合物は蒸留水を加
えて１ｇとした。各々１０倍量の工業用エタノール全使
用して４℃で５回沈でんをくり返した後に遠心分離する
ことＫよシ未反応であってエタノールに可溶性のエチレ
ンイミンを除去した。沈でん物を乾燥オーブン中５℃で
真空下に乾燥し、４℃でＮａＯＨ上のデシケータ−中に
保持した。分画のために、５．３　ｍｍｏｌ（２３％）
のＮＡＤと１５　ｍｍｏｌ　（６５％）のＮ（１）−（
２−アミノエチル）ＮＡＤと２．６　ｍｍｏｌ　　（１
２％）の副生成物とから成る組成の乾燥反応混合物２０
１蒸留水で４０−とし穴。ＩＯＮのＮａＯＨでｐ１″１
ｔ５．０　とシタ後に、溶液ｋ　Ｏ，０１Ｍ　＋７）　
ＬｉＣＪ　（ｐｉｔ　４．５）で平衡化した陽イオン交
侠カラム（＋ｏｏ　Ｘ　２．６　ｃｍ。 Ｂｉｏｒｅｘ　７０．５０−１００メｙ　シｘ、Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）に４℃で導入した。充てん後に、ＮＡＤ’ｉ
Ｈ０，０１ＭのＬｌｏｇ（ｐＨ４，５，５，３ｍｍｏＪ
　）で定量的に２ｊの両分に溶出した。更ＫＯ，ＯＩ　
ＭＯＬｉ＋Ｊ　（ｐＨ４，５）２　ｇテ溶出して、２つ
の化合物から成る混合物２．５　ｍｍｏｌが得られた。 これらは薄層クロマトグラフィーにおいてＮ’−（２−
アミノエチル）−ＮＡＤと、下記中）に記載の様にＮ（
１）−（２−アミノエチル）−ＮＡＤから容易に生成す
る１、Ｎ６−ニタンアデニンーＮＡＤ　　と思われる化
合物との様な挙動を示した。 主生成物のＮ（１）−（２−アミノエチル）　−ＮＡＤ
の溶出をより速くするために、カラム充てんを少なくす
ることによりカラムで５０ｃＷ＆の長さに短かくした。 この溶出は０．２　ＭのＬｌｏｌ　（ｐＨ４，７）　　
１．５１３で行ない、１１．３　ｍｍｏｇの純粋なＮ（
１）−（２をミノエチル）−ＮＡＤ　　が回収された。 エチレンイミンでのアルキル化中に生成した副生成物（
２，６ｍｍｏＪ）は単離されなかった。 各画分を減圧下に濃縮（フラッフ為蒸発）シ

【３０ｍｇ
とし、工業用エタノール（２０倍過剰Ｗｔ１１）で５回
沈でんさせ、これによりエタノールに可溶のＬｉＣｅを
分離した。画分生成′吻會出米るだけ少量の蒸留水中に
溶解してから凍結乾燥してＮａＯＨ上のデシケータ−中
に４℃で保存した。 得られた画分を次表１にまとめて示す。 表１ 夕」υ姶合物分佃ル匙う階　回即Ｑも　カラム眸ト萄転
入中の責　　　　　　　　　　　　した°に（ｍｍｏｌ
）ＮＡＤ　　　　　　　　５．３　　　　　５．３１０
０　　　　２３注 （＊）　　反応混合物中のＮ（１）−（２−アミノエチ
ル）−ＮＡＤＫ対する割合５／ｄ會示す・ Ｎ　−（１）−（２−アミノエチル）−ＮＡＩ）はニン
ヒドリン（第１級アミノ基’１７ＴｔＫする）と陽性反
応を示し、又ｐ８１１．５において３００〜３１０ｎｍ
の範囲でアデニン環のＮ　（１）−アルΦル化に特イイ
の閾値ン示す。 Ｂ、Ｎ−（２−アミノエチル）−ＮＡＤの製造と精製 ２９　（２，７８ｍｍｏｅ）　　のＮ（１）−（２−ｙ
ミノｘ−ｙ−ル）−ＮＡＤを２００コの蒸留水中溶解し
てＩＮのＬｌｏＨでｐＨ６，５に調整した。この溶液を
５０℃の温水浴に７時間保持した。その間ＫＩＮのＬｌ
ｏＨで…値を調整した。（Ｎと同様の薄層クロマトグラ
フィーに付して、Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−Ｎ
ＡＤから２つの化合物、すなわちＮ”　（２−アミ／　
：ｃチル）　−Ｎ　Ａ　Ｄ　（Ｒｆ−０，１３）および
１．Ｎ６−エタンアデニンーＨＡＤと思われる化合物（
Ｒｆ−０，０６８）が生成していることが検出された。 この処理液の組成を薄層クロマトグラフィーによる紫外
線走査により測定した結果、６２．５％（１，７４ｍｍ
ｏｇ）のＮ６−　（２−アミノエチル）−ＮＡＤと３７
．５％（１，０４ｍｍｏ／）のｌ、Ｎ’−ｚタンアデニ
ン　−Ｎ　ＡＤであった。 凍結乾燥した反応混合物を１６．５１Ｌｔの蒸留水に溶
解し、ＩＮのＬｌｏＨでｐＨ５，５に調整した。この溶
液を、０．０１Ｍ　ＬｉＣｇ　（ｐＨ３，ｓ　）　ｆ平
衡化した隣イオン交換カラム（１００Ｘ　１．６ｃｆｎ
、　Ｂｉｏｒｅｃ　７０．５０〜１００　　メｙ　’／
　ｚ、Ｂｉ　ｏ　−Ｒａｄ　）中に導入した。０．０１
　Ｍ　　Ｌｌ（Ｊ（ｐＨ３，５’）　　で４℃で溶出す
ることによシ、２つの化合物がわずかに富なりあって別
々に溶出され、Ｎ６−　（２−アミノエチル）−ＮＡＤ
が最後にカラムから溶出された。 １、　Ｎ’−二タンアデニンーＮＡＤ（２５０ｄ中０．
９８　ｍｍｏｌ　）と混合物（１２０ｍＡ！中０．２０
　ｍｍｏｇ　）と純粋なＮ’　（２−アミノエチル）−
ＮＡＤ（６６０ゴ中１．５６　ｍｍｏｌ）とから成る３
つの薄層クロマトグラフィーによる均一画分を減圧下に
濃縮して３−とし、冷工業用エタノール（２０倍過剰容
量）で２回沈でんさせてＬｉＣｌを除去した。出来るだ
け少量の蒸留水中に溶解した後に、各両分を凍結乾燥し
てＮａＯＨ上のデシケータ−中に４℃で保存した。 この精製の結果を下記表２にまとめて示す。 表２ １、Ｎ’−（エタン　　１．０４　　　　０．９８　　
　９４．２　　　　３０．８アデニン）−ＮＡＤ 混合物　　　　　　　　　　　　０．２１　　　　　　
　　７．７Ｎ’−（２−アミノ　　１．７３　　　１．
５６　　９０　　　　５６．５エチル）−ＮＡＤ ＵＶスペクトルおよびＮＭＲデータによりＮ６−（２−
アミノエチル）−ＮＡＤ化合物自体であることが確認さ
れた。この化合物はニンヒドリン（第１級アミノ基を含
有）と陽性反応をする。 λｍａＸは２６７ｎｍにあシ、そしてこの化合物はもは
やアデニン環のＮ　（１）−アルキル化に特有の−１１
．５における３００〜３１０　ｎｍの範囲内に閾値を示
さない。これはビール酵母アルコールデヒビロゲナーゼ
での定奇還元により、Ｎ６−アルキル化ＮＡＤＨ誘導体
にｔ￥Ｆ有の２６７　ｎｍにおける吸光ＩＫ　／　３３
８ｎｍにおける吸光度−３，２を有する螢光Ｎ’−（２
−アミノｘ　チル）　−ＮＡＤＨ（３６６ｎｍで励起）
を生成する。 Ｃ０実施例１ ポリエチレングリコールＮ’−（２−アミノエチル）−
ＮＡＤの製造 Ｂｕｅｃｋｍａｎｎ等の方法（Ｍａｋｒｏｍｏｌ！、　
　Ｃｈｅｍ。 １８２、１３７９−１３８４．１９８１）によシ作った
カルボキシル化ポリエチレングリコール（分子＋ｄ：２
００００、Ｑ、ｉ　ｍｍｏｌ中０．１４　ｍｍｏＪ　　
のカルボキシル基含有）２ｇを蒸留水に溶解して４ｄと
し、１２５μｍｏｇ　　のＮ’−（２−アミノエチル）
−ＮＡＤ２ｍｌを加えた。 ＩＮのＨ（Ｊで−を４．７　に調整後に、２００■（１
，０４ｍｍｏＪ）　　の１−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−３−エチルカルボジイミド−ＨＣｅを２つの辱
量に分けて１０分間で加えた。反応混合物を室温で２時
間攪拌した。（この際ＩＮのＨＣ７ｊ又はＩＮのＮａＯ
Ｈで州値を４．５〜４．８の範囲内に保持した。）４℃
で１６時間反応させた後に、反応混合物Ｃ７ａｇ＞を蒸
留水で平衡化したＳθｐｈａｄｅｘ　Ｇ５Ｑカラム（＋
００ｘ　２．Ｓ　ｃｔＩ＆）　　を通して各３．５ｄの
２つのバッチに分けてゲルろ過した。ポリエチレングリ
コール−Ｎ・６−（２−アミノエチル）−ＮＡＤを含有
する両分を合わせて減圧下に濃縮して１５　ａｇとした
。これはカップリング率６８％でポリエチレングリコー
ルに結合したＮ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ（濃
度５．５　ｍ　Ｍ　）　８５　ｔｉｒｎｏｌｌを含有し
ている。 Ｄ、実施例２ デキストラン−Ｎ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤの
製造 Ｂｕｅｃｋｍａｎｎ等の方法（Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。 ３、３０１〜３１５．１９８１　）により作ったカルボ
キシル化デキストラン　Ｔ２Ｏ（分子量７００００　、
無水グルコースモノマー　１　ｍｍｏＪ中０．３　ｍｍ
ｏｌ　　がカルボキシル化されている）　０．２　ｇ　
を２ゴの蒸留水中に溶解し、６５μｍｏＪのＮ’−（２
−アミ／ｘｆｈ）−ＮＡＤ　　ｌｄを加えた。ＩＮのＨ
ＣＩで　−を４．７に調整後に、１５０　ｍｌ　（０，
７８ｍｍｏｌ）　　の１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミｒ−ＨＣｅを２つの等量
に分けて１０分間で加えた。反応混合物を室温で２時間
攪拌した。（この際ＩＮのＨ（Ｊ又はＩＮのＮａＯＨで
一値を４．５〜４．８の範囲内に保持した。）４℃で１
６時間反応させた後に、反応混合物（３，５ａｄ）を蒸
留水で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０カラム（
１００Ｘ　２．６　ａｎ　）を通して４０℃でゲルろ過
した。デキストラン−Ｎ’−（２−アミノエチル）−Ｎ
ＡＤを含有する両分を減圧下に濃縮して１０−とした。 これはカップリング率？２％でデキストランに結合した
Ｎ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ（＠度１．４　ｍ
　Ｍ　）　１４　ｂｍｏｌを含有している。 Ｅ、実施例３ ポリビニルピロリドンＮ’−（２−アミノエチル）−Ｎ
ＡＤの製造 ５ｐｅｃｈｔ、　Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒのＪｏｕｒ
ｎａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、　３５４．１６５９〜１６６０（１９７３）
に記載の方法により作ったカルボキシル化ポリビニルピ
ロリドン（分子量１６００００　、２．７　ｍｍｏ６の
ビニルピロリドンモノマー中０．１３５　ｍｍｏｇ　　
のカルボキシル基含有）０．３９を３ｍＪの蒸留水に溶
解して１００１１００１１Ｉ　μｍｏｌ　）のＮ’−（
２−アミノエチル）−ＮＡＤを加え％ｌＮのＨ（Ｊで…
を４．７に調整した。１５０キ（０，７８ｎａｎｏ　ｌ
　）の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミド”−ＨＣｌを２つの等量に分けて１０
分間で加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。（
この際１１（ｏａＣｇ又はＩＮのＮ　ａＯＨで一値を４
．５〜４．８の範囲内に保持した。）４℃で１６時間反
応させた後に、反応混合物（３，８ｄ　）を蒸留水で平
衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０カラム（ｔｏｏｘ
２．６　ａｍ　）を通して４℃でゲルろ過した。ポリビ
ニルピロリドン−Ｎａ−（２−アミノエチル）ＮＡＤを
含有する両分を減圧下に濃縮してｌＯｄとした。これは
カップリング率１６％でポリビニルピロリドンに結合し
たＮ”　（２−アミノエチル）−ＮＡＤ（濃度１ｍＭ）
１０μｍｏｌを含有している。 Ｆ、実施例４ ポリ−（エチレン／マレイン酸）−Ｎ’−（２−アミノ
エチル）−ＮＡＤの製造 ５０■のポリ−（エチレン／無水マレイン酸）（分子四
不明、エチレン／無水マレイン酸モノマー　０．４　ｍ
ｍｏＪ　、　Ａｇｄｒｉｃｈ）をＬＯｙｘｌの蒸留水中
に溶解し、ＩＮのＮａＯＨで−を７．５　　に調整し、
そしてにＢｒｎｏｇのＮ’−（２をミノエチル）−ＮＡ
Ｄを加えた。室温で５時間攪拌（この際ＩＮのＮａＯＨ
でｐｉ（を７．５に調整）後、反応混合物を５１の蒸留
水で１６時間４℃で透析した。１３μｍｏＪのＮ’−（
２−アミノエチル）−ＮＡＤ（像度０．６　ｍ　Ｍ　）
がカップリング率６５％でポリ−（エチレン／マレイン
酸）に結合した生成物２２ｍが得られた。 Ｇ、実施例５ ポリ−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）−Ｐｉ’
−（２−アミノエチル）−ＮＡＤの製造５０９のポリ−
（メチルビニルエーテル／無水マレイン酸）（分子−＠
　２００００％メチルビニルエーテル／無水マレイン酸
モノマー０．３２　ｍｍｏ　ｇ　。 Ｐｏ１）ｒｓｃｉｅｎｃｅｅ）を１０１１１１の蒸留水
中に溶解し、ＩＮのＮａＯＨで−を７．５　に調整し、
そして題μｍｏｌのＮ’−（２−アミノエチル）−ＮＡ
Ｄを加えた。 室温で５時間攪拌（この際Ｉ　ＮのＮａＯＨで…を７．
５に調整）後、反応混合物を５ｅの蒸留水で１６時間４
℃で透析した。１７μｍｏｇのＮ’−（２−アミノエチ
ル）−ＮＡＤ（濃度０．７８ｍＭ）がカップリング率８
５％でポリ−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）に
結合した生成物２２ｄが得られた。 １１、実施例６ ポリ−（ジビニルエーテル／マレインｆｌ）−Ｎ’−（
２−アミノエチル）−ＮＡＤの製造５０■のポリ−（ジ
ビニルエーテル／無水マレイン酸）（分子号・１８００
０、ジビニルエーテル／無水マレイン酸モノマー　０．
１９　ｍｍｏｌＩＩＨｅｒｃｕｌｅｓ）　　を１０ゴの
蒸留水中に溶解し、ｌＮのＮａＯＨで−を７．５に調整
し、そして加μｍｏｇのＮ’−（２−アミノエチル）−
ＮＡＤを加えた。室温で５時間攪拌（この際Ｉ　Ｎ　（
ｉり　ＮａＯＨで−を７．５に調整）後、反応混合物を
５ｇの蒸留水で１６時間４℃で透析した。加ｐｍｏｌの
Ｎ’−（２−アミ）ｘｆル）　−Ｎ　ＡＤ　（ｆｉ度０
．９２ｍＭ）　　がカップリング率１００％でポリ−（
ジビニルエーテル／マレイン酸）に結合した生成物？２
１Ｌｔが得られた。 下記の条件下での醇母アルコールデヒドロゲナーゼによ
る触媒反応における水溶性ポリマー結合Ｎ−（２−アミ
ノエチル）−ＮＡＤ誘導体の酵素還元性をＮ’−（２−
アミノエチル）−ＮＡＤのそれと比較して測定した。 ０．１　Ｍ　）リス／ＨＣＩ％ｐＨ８，２、室温０．１
　Ｍエタノール ７ｍＭセミカルノ；シト／ＨＣｌｌ ０．１　ｍＭ　　Ｎ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ
（遊離形又はポリマー結合形） ０．３■アルコ一ルデヒｒロゲナーゼ 還元性データを下記の表３にまとめてボした。 表３ Ｎ６−　（２−アミノエチル）−ＮＡＤ　　　１００ポ
リエチレングリコール（ＭＷ、２００００）−Ｎ’−（
２−アミノエチル）　−ＮＡＤ　　　　　　９０デキス
トランＴ７０　（ＭＷ　、　７００００）　−Ｎ６−（
２−アミノエチル）−ＮＡＤ　　　　　　９０ボ＋）　
ビニルピロリ’にン（ＭＷ、１６００００）−Ｎ’−（
２−アミノエチル）　−ＮＡＤ　　　　　　９０ポリ−
（エチレン／マレイン酸）− Ｎ−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ　　　　　　６０ポ
ＩＪ　−（メチンルビニルエーテル／マレイン散）−Ｎ
’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ　　７０ポ’Ｊ−（
ジビニルエーテル／マレインａ＞−Ｎ’−（２をミノエ
チル）−ＮＡＤ　　　　　６０注：　Ｎ’−（２−アミ
ノエチル）−ＨＡＤおよびＮ６−（２−アミノエチル）
−ＮＡＤＨ誘導体の吸光係数は’　２６７　”　２１０
ＱＱ　Ｍ　”１信−１およびｇ　３４ｇ　＝　６２００
　Ｍ”　’　ａｎ−”　　である。 工、実施例７ ＣＨ−セファロース　４Ｂ−Ｎ’−（２−アミノエチル
）−ＮＡＤの製造 １０ゴの蒸留水Ｋｆｉけた１、５ｇのＣＨ−セファロー
ス４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社夷、６０−８４　ｐ
ｍｏ　ｌのカルボキシヘキシル基含有）をガラスフリッ
ト上１００　ｄの蒸留水で洗浄した。半乾燥したＣＨ−
セファロース４Ｂを２ｒｔｔｌの蒸留水中にけん濁させ
、４３０■（２，２５ｍｍｏ　ｌ　）の１−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミＩ−に
−Ｉｃｅを加えた。このけん濁液を室温で１０分間保持
した。（その際、１ＮＯＮａＯＨ又はｌＮ０ＨＣｅチー
を４．８〜５．０に調整した。）こうして活性化した〇
Ｈ−セファロース４Ｂｔ−２５−の蒸留水で１分間づつ
２回洗浄し、そして３４ｔｔｍｏｌのＮ’−（２−アミ
ノエチル）−ＮＡＤを含有する水溶液２１１１１Ｋ加え
た。−を４．６　に調整（ｌ　Ｎ　ＯＮａＯＨ又はＩＮ
のＨＣＪで）後、このけん濁液を室温で１６時間保持し
た。 ７５−の２０％Ｌ１Ｃ４と２５ｍ４の蒸留水で洗浄しそ
して蒸留水中で沈降させると、２０．６Ｊ！ｍｏＪのＮ
６−（２−アミノエチル）−ＭＡＤ（ｉＱ３ｍＭ）がカ
ップリング率６０．５％で結合しているＣ）Ｉ−セファ
ロース４Ｂ−Ｎ６−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ７ｄ
が得られた。 Ａ、　Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰの製
造と精製 ７．５９　（９，５１ｍｍｏＪ　）のＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製、ジナトリウム塩）を１０
　ｒｒｔｅの蒸留水中に溶解した。７０％の鍋塩素酸（
全”−）ｋ　２Ｊ屑ｌ）でｐ＋４で直上３３５±０．０
５に保ちながら、これに１．４　ｍｌ　（２８ｍｍｏ　
ｇ　）のエチレンイミン（Ｓｅｒｖａ）をゆっくりと加
えた。 反応混合物を３０℃、ｐＨ３，３５±０．０５　　（７
０％過塩素で調整）で１２０時間攪拌した。ＮＡＤＰの
Ｎ　（１）　−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　へ
の転換は、可動用として６６／３３／１（ｖ／ｖ／ｖ）
のイソ酪酸／蒸留水７２５％アンモニア水（Ｐｉ（３，
７）を使用したシリカゲル上の薄層クロマトグラフィー
（ＤＣアルミニウム箔シリカゲル６０　Ｆ２．、、嘆厚
０．２ｍ、メルク社製）での紫外線走査により測定した
。反応混合物は蒸留水を加えて５０ｍとした。各々１０
倍量の工業用エタノールを使用して４℃で５回流でんを
くシ返した後に遠心分離することにより未転換であって
エタノールに可溶性のエチレンイミンを除去した。沈で
ん物を出来るだけ少量の蒸留水に溶解しそして凍結乾燥
した。この凍結乾燥物を４℃でＮａＯＨ上のデシケータ
−中に保持した。分画のために、０．２３５　ｍｍｏｇ
　（２７，５％）のＮＡＤＰと０．５７５ｍｍｏ　ｌ　
（６８％）のＮ（１）−（２−アミノ：ｓｆル）−ＮＡ
ＤＰと０．０３８ｍｍｏｇ（４，５％）ノ副生成物、！
−カラ成る組成の凍結乾燥反応１合物０．７１　　を蒸
留水に溶解して２２コとした。ＩＮのＨＣＪで−を３．
５　　とした後に、この溶液を０．０１Ｍ　のトリエタ
ノールアミン炭酸水素塩（ｐＨ３，５）で平衡化した陽
イオン交換カラム（６０Ｘ　１．５ｃｍ、　ＡＧ　　Ｗ
５０Ｘ４、ｌＯｏ〜２００　　メッシユ、Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）　Ｋ導入した。 ０、ＯＩＭ　　のトリエタノールアミン炭酸水素ｔ”　
（ｐＨ３，５）で４℃で溶出すると、副生成物を含有す
るＮＡＤＰ　（０，２９ｍｍｏＪ　、　２５−中３４％
）と、アルキル反応中のＮ（１）−（２−アミノエチル
）−ＮＡＰＰからのものと分画の際のカラム中のものと
で成る副生成物（０，１１５ｍｍｏＪ　、１００−中１
３．５％）と、純粋なＮ（１）−（２−アミノエチル）
−ＮＡＤＰ（０，３９ｍｍｏＪ　、　２００　ｍ６９４
６％）とである３つの一１分が順次得られた。 各両分を減圧下に濃縮して２５ｄとし、凍結乾燥してト
リエタノールアミン炭酸水素塩を除去し、そしてＮａＯ
Ｈ上のデシケータ−中４℃に保存した。 分画の結果を次の表４に示す。 表４ ＮＡＤｐ　　Ｏ，２３５０，２３５１００２７，５副生
成吻　　　　　０．０３８　　０．１７　　　−　　　
　　２ＯＮ（１）−（２−アミノ エチル）−ＮＡＤＰ　　Ｏ，５７５０，３９６８４９Ｎ
（１１−（２−アミノエチル）＋ＮＡＤＰ　　はニンヒ
ドリン（第１級アミノ基を有する）と陽性反応を示し、
又−１１，５において３００〜３１０ｎｍの範囲でアデ
ニン環のＮ　（１）−アルキル化に特有の＠値を示す。 Ｂ、Ｎ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰの製造と精
製 ０．３５９　（０，２４ｍｍｏＪ）のＮ（１）−（２−
アミノエチル）　−ＮＡＤＰを０．５ｇの蒸留水中に溶
解し−（ＩＮのＬｌｏＨで−１６，０に調整した。この
溶Ｍを□□□℃の１１水浴に４時１１１保持した。その
間に１ｚＪのＬｉＯＨで圀値を調整した。ｔＡｌと同様
の薄層クロマトグラフィーに付して、Ｎ（１）−（２−
アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　から２つの化合物、すな
わちＮ６−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ（Ｒｆ糠０
．０４８）および１、Ｎ６−エタンアデニンーＮＡＤＰ
　　と思われる化合物（Ｒｆ−０，０３１）　　が生成
していることが検出された。この処理液の組成を薄層ク
ロマトグラフィーによる２６０　ｎ　ｍでの紫外線走査
によシ測定した結果、７５％（０，１８ｍｍｏＪ）のｌ
、ｌ（’−ｚタンアデニンーＮＡＤＰと２５％（０，０
６ｍｍｏＪ）のＮ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ
とであった。 この処理を減圧下で濃縮して７ｄとした。−を５、ＯＫ
調整後、この溶液を、０．ＯＩＭのトリエタノールアミ
ン炭酸水素塩（ｐＨ３，５）　　で子嚢化した陰イオン
交換ｆ）５ム（１００Ｘ　１．６ｃｍ、　ＡＧＩＸ４．
１００−魚メｙ　’／　ｓ、、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中に４
℃で導入した。０．０１Ｍのトリエタノールアミン炭酸
水素ＬＭ　（ｐＨ３，５）で溶出することにより、２つ
の主画分、すなわち１、　Ｎ’−エタンアデニ：／　−
ＮＡＩ）Ｐ　（０，１７ｍｍｏｅ、　１１！中７０％）
およびＮ’−（２−アミノエチル）　−ＮＡＰＰ（０，
０５３ｍｍｏｅ、　　２５０諷ｊ中ｎ％）が１偵次溶出
された。 各２つの画分を減圧下に濃縮して２１ｔｌとし、そして
トリエタノールアミン炭酸水素塩を除去するためにこれ
を蒸留水で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　１０カラ
ム（１００Ｘ　１．５濡）を通して室温で２回溶出した
。 凍結乾燥後、両生酸物＝ｉＮａＯＨ上のデシケータ−中
に４℃で保存した。この分画の結果を次の表５にまとめ
て示す。 表５ １、Ｎ６−エタンアデ　　　０．１８　　　　０．１？
　　　　　９４．４　　　　７０．８二ンーＮＡＤＰ Ｎ’−（２−アミノエ　　０．０６　　　０．０５３　
　８８．３　　　２２．０チル）−ＮＡＰＰ ＵＹスペクトルおよびＮＭＲデータによりＮ６−（２−
アミノエチル）−ＮＡＤＰ化合物自体であることが確認
された。この化合物はニンヒドす／（第１級アミノ基を
含有）と陽性反応をし、そしてλｍａＸば２６７　ｎｍ
　　にあり、そしてこの化合物はもはやアデニン環のＮ
（１）−アルキル化に特有の…１１．５における３００
〜３１０ｎｍの範囲内に閾値を示さない。これはビール
酵母グルコース−６−りん酸デヒドロゲナーゼでの定量
還元により、Ｎ６−アルキル化ＮＡＤＰＨ誘導体に特有
の２６７　ｎｍ　　における吸光度／　３３８ｎｍにお
ける吸光度−３，２を有する螢光Ｎ’−（２−アミノエ
チル）　−ＮＡＤＰＨ（３６６ｎｍで励起）を生成する
。 Ｃ０実施例１ ポリエチレングリコールＮ６−（２−アミノエチル）−
ＮＡＤＰの製造 ＰＥＧ（ＭＷ４０００）−Ｎ６−　（２−アミノエチル
）−ＮＡＤＰ： Ｂｕｅｃｋｍａｎｎ　等の方法（Ｍａｋｒｏｍｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ。 １８２．１３７９−１３８４．１９８１）　　により作
ったＮ−ヒドロキシスクシンイミド９活性化カルボキシ
ル化ポリエチレングリコール（分子＠　４０００．０．
０１５ｍｍｏ　ｌ中０．０３ｍｍｏｅの活性化カルボキ
シル基含有）ｅｏｑを％　ＩＮのＮａＯＨで−１を７．
２に力、１整して】５Ｂｍｏ　ｇのＮ’−（２−アミノ
エチ／’）−ＮＡＤＰと一緒に１ｍの蒸留水中に溶解し
た。この混合物を室温でｐＨ７，２（ｐｉ（調整はＩＮ
のＮａＯＨで行った）で５時間攪拌した。この反応混合
物を蒸留水で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０カ
ラム（＋００ｘ２．６ｃ１ｎ）　　を通して４℃でゲル
ろ過した。ポリエチレングリコール−Ｎ６−（２−アミ
ノエチル）−ＮＡＤＰ　　を含有する両分を濃縮して１
０ｄとした。これはカップリング率８０％でポリエチレ
ングリコール（分子量４０００　）に結合したＮ’−（
２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ（濃度１．２　ｍＭ　）
１２　ｔｔｍｏｌｌを含有している。 ＰＥＧ（ＭＷ　２００００　）　−Ｎ’　−（２−アミ
ノエチル）−ＮＡＤＰ： Ｂｕｅｃｋｍａｎｎ　等の方法（Ｍａｋｒｏｍｏｌ　Ｃ
ｈｅｍ。 １８２、１３７９〜１３８４．１９８１　）によシ作っ
たＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化カルボキシル化
ポリエチレングリコール（分子量２００００．０．０１
５ｄ中０．０３　ｍｍｏ　ｌ　の活性化カルボキシル基
含有）３２５■をＩＮのＮａＯＨで−を７．２　に調整
して１５μｍＯｌのＮ６−　（２−アミノエチル）−Ｎ
ＡＤＰと一緒に１ｒｔｔｅの蒸留水中に溶解した。これ
を室温で区１７．２〜７．３　で１時間更に−６，８で
３時間攪拌した。（ｐＨ調整はＩＮのＨＣＩ又はＩＮの
ＮａＯＨで行った。）この反応混合物を蒸留水で平衡化
した５ｅｐｈａｄｅｘＧ５Ｑカラム（２，６刈００ｃｍ
）を通して４℃でゲルろ過した。ポリエチレングリコー
ル−Ｎ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　を含有
する画分を濃縮して１０ｍＪとした。これはカップリン
グ率１００％でポリエチレングリコール（５＋子量２０
０００　）に結合したＮ６−（２−アミノエチル）−Ｎ
ＡＤＰ（濃ｉ　１，５ｍＭ）１５μｎｏ／を含有してい
る。 （注）１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミドでのカルボキシル基の活性化によるカ
ップリング法はＮ　ＡＤＰ　　誘導体に使用することは
できない。なぜならば、この反応剤は分子のアデニン側
においてリボースの２−りん酸基を介しての２，３−環
化をもひき起し、このためＮＡＤＰ誘導体は補酵素活性
を失うからである。 Ｄ、実施例２ ポリ−（エチレン／マレイン酸）　−Ｎ６−　（２−ア
ミノエチル）−ＮＡＤＰの製造 １２■のポリ−（エチレン／無水マレイン酸）（分子量
不明、エチレン／無水マレイン酸モノマー　Ｏ，１ｍｍ
ｏＪ　％Ａｌｄｒｉｃｈ）を１−の蒸留水中に溶解しく
０．２ＮのＮａＯＨで田を７．５に調整）、そして５．
５Ｂｍｏ　ｌのＮ６−　（２−アミ／ｘｆル）−ＮＡＤ
Ｐｅ加えた。室温で５時間攪拌（０，２ＮのＮａＯＨで
ｐＨｔを，５に調整）後１反応混合物を５１の蒸留水で
１６時間４℃で透析した。０．８μｍｏｌのＮ６−（２
−アミノエチル）−ＮＡＤＰ（濃ｉｏ、２４ｍＭ）がカ
ップリング率１５％でポリ−（エチレン／マレイン酸）
に結合した生成物３．３　ａｇが得られた。 Ｅ、実施例３ ポリ−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）−Ｎ’−
（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　の製造１２■のポ
リ−（メチルビニルエーテル／無水マレイン酸）（分子
１ｉｔ　２００００　、メチルビニルエーテル／無水マ
レイン酸モノマー　０．０７７ｍｍｏｌ。 Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅｅ）　ｔ−Ｉ　ＩＬｅの蒸留水
中に溶解（０，２ＮのＮａＯＨで…を７．５　　に調整
）し、そして５．５　ｔｔ　ｍ　ｏ　１のＮ６−（２−
アミノエチル）−ＮＡＤＰを加えた。 室温で５時間攪拌（０，２ＮのＮａＯＨで−を７．５に
調整）後、反応混合物を５８の蒸留水で１６時間４℃で
透析した。０．６μｍｏｌのＮ６−（２−アミノエチｈ
）−ＮＡＤＰ（濃度０．２ｍＭ）がカップリング率１１
％でポリ−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）に結
合した生成物４．４ｄが得られた。 Ｆ、実施例４ ｙＮ＋）−（シヒニルエーテル／マレイン［）−Ｎ’−
（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰの製造１２■のポリ−
（ジビニルエーテル／無水マレイン酸）（分子ｉ　１８
０００、ジビニルエーテル／無水マレイニｌ酸モノマー
０．０４６μｍｏＪ　％Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）をｌａｔの
蒸留水中に溶解（０，２ＮのＮａＯＨで…を７．５に調
整）し、そして５．５Ａ４ｍｏ６のｒｉ６−＜２−アミ
ノエチル）−ＮＡＤＰを加えた。室温で５時間攪拌（０
，２ＮのＮａＯＨでｐｉ（を７．５　に調整）後、反応
混合物を５ｇの蒸留水で１６時間４℃で透析した。０．
７μｍｏｌのＮ６−　（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ
（両度０．１３６ｍＭ）がカップリング率１３％でポリ
−（ジビニルエーテル／マレイン酸）に結合した生成物
３．５　ｒｕｇが得られた。 （注）（Ｏ）、（Ｅ）および（Ｆ）におけるＮ６−（２
−アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　のカップリング率は、
Ｎ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤの同様のカップリ
ングに比べて実質的に低い。これは酸無水物からの陰イ
オン性カルボキシル基が原因となって、同様に陰イオン
性のＮ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ分子のカッ
プリングを陽イオン性のＮ６−（２−アミノエチル）−
ＮＡＤ分子の場合に比べて困難なものとしているためと
思われる。 下記の条件下での酵母グルコース−６−りん酸デヒｒｏ
ダナーゼによる触媒反応における水溶性ポリマー結合Ｎ
’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ誘導体の酵素還元
性をＮ’−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　のそれ
と比較して測定した。 ０．０５Ｍ　　　）ｌ）エタ／−ル７ミｙ／ＨＣ７？、
ｐＨ８，０室温５．５ｍＭ　　ＭｇＣｅ２ ４．５ｍＭ　　グルコース−６−りん酸ｏ、ｒＭ　Ｎ６
−（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ（遊離形又はポリマ
ー結合形） （資）μ９グルコース−６−りん酸デヒドロゲナーゼ還
元性データを下記の表６にまとめて示した。 表６ ポリエチレングリコール（ＭＷ　４０００）　−Ｎ’−
（２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　　　　９５ポリエ
チレングリコール（ＭＷ　２００００）　−Ｎ’−（２
−アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　　　　９５ポリ−（エ
チレン／マレイン酸→− Ｎ’−（２−アミノエチル）　−ＮＡＤＰ　　　　　５
０４り−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）−Ｎ’
−（２−アミノエチル）　−ＮＡＤＰ　　６０ｙｇｖ−
＜ジビニルエーテル／マレイン酸）−Ｎ’−（２−アミ
ノエチル）−ＮＡＤＰ　　　　　６３注：　Ｎ’−（２
−アミノエチル）−ＮＡＤＰ　　およびＮ’−（２−ア
ミノエチル）−ＮＡＤＰＨ誘導体の吸光係数は’　２６
７　””　２１０００　Ｍ−１ｃＷｌ−１および’３４
ｏ　”　６２２０　Ｍ−１ｃｍ−１であると１を定さｔ
した。 Ｇ、実施９’ｌＪ　５ ＣＨ−セファロース　４Ｂ−Ｎ’−（２−アミノエチル
）　−ＮＡＤＰの製造 ３ゴの蒸留水に漬けた０、２５９０ＣＨ−セファロース
４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、１０−１４μｍｏ
ｂのカルボキシヘキシル基含有）をガラスフリット上２
５ｍ１！の蒸留水で洗浄した。半乾燥したＣＨ−セファ
ロース４Ｂを０．４５　ｍＪの蒸留水中にけん濁させ、
７０７７１９（３６５μｍｏｌの１−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド’−Ｈ（４
を加えた。 このけん濁液を室温で１０分間保持した。（その際、０
、Ｉ　ＮのＮａＯＨ又は０．Ｉ　ＮのＨＣｇで…を４．
８〜５．０に調整した。）こうして活性化したＣＨ−セ
ファロース４Ｂを１０−の蒸留水で１分間づつ２回況浄
し、そして１．４　ａ　ｍ　ｏ　ｌｊのＮ’　−（２−
アミノエチル）−ＮＡＤＰを含有する水溶液０．４５−
に加えた。田を４．６に調整（０，Ｉ　ＮのＮａＯＨ又
は０．Ｉ　ＮａＨＣ／で）後、とのけん濁液を室温で１
６時間保持した。 ２０　ａｇの２０％Ｌｔｃｇを１６ｄの蒸留水で洗浄し
そして蒸留水中で沈降させると、１μｍｏｌのＮａ−（
２−アミノエチル）−ＮＡＤＰ（濃度１ｍＭ）がカップ
リング率７１．４％で結合しているＣＨ−セファロース
４Ｂ−Ｎ’−（２−アミノエチｈ　）　−ＮＡＤＰ　１
　ｒｎｌが得られた。 マクロ分子Ｆ’ＡＤの製造 Ａ、　Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−ＦＡＤの製造
と精製 ０．５９　（０，６ｍｍｏ／）のＦ　ＡＤ　（５ｅｒｖ
ａ、ジナトリウム塩）を１工ｅの蒸留水中に溶解した。 ３５％の過塩素酸（全＊　１．５　ａｔ　）で田値を３
．５±０．１に保ちながら、これに４０μＪ（０，８ｍ
ｍｏｇ）のエチレンイミン（Ｓｅｒｖａ）をゆっく９と
加えた。反応混合物１＆：３０℃、ｐＨ３，５±０．１
（３５％過塩素で調整）で１４４時間攪拌した。Ｆ’Ａ
ＤのＮ（１）−（２−アミノエチル）−ＦＡＤへの転換
は、可動相として６６／　３３　／　ｌ　（ｖ／Ｖ／Ｖ
）のイソ酪酸／蒸留水７２５％アンモニア水（ｐＨ３，
７’）を使用したシリカダル上の薄層クロマトグラフィ
ー（ＤＣアルミニウム箔シリカダル印Ｐ２５い膜厚０．
２ｍ＋、メルク社竪）での紫外庫走査によシ測定した。 反応混合物は蒸留水を加えて３罰とした。各々５０ｄの
工業用エタノールを使用して４℃で２回流でんをくシ返
した後に遠心分離することによシ未転換であってエタノ
ールに可溶性のエチレンイミ／を除去した。 沈でん物を出来るだけ少量の蒸留水に溶解して凍結乾燥
した。この凍結乾燥物を４℃でＮａＯＨ上のデシケータ
−中に保持した。 分画のために、０．１９２ｍｍｏｇ（３２％）のＦ’Ａ
Ｄ　　と０．３５４ｍｍｏｇ　（５９％）のＮ（１１−
（２−アミノエチル）−ＦＡＤと０．０５４ｍｍｏＪ　
（９％）の副生成物とから成る組成の凍結乾燥反応混合
物を蒸留水に溶解して２０−とした。ＩＮのＨＣｇで−
を５．０とした後に、この溶液を蒸留水で平衡化（ｐＨ
３，５）した陽イオン交換カラム（６０Ｘ１．５ｃｍ、
Ｂｉｏｒｅｘ　７０、関−側　メッシユ、Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）　　に叫入し九。蒸留水で−３，５、４℃で溶出す
ると、副生成物を含有するＦＡＤ（０，２２ｍｍｏｅ、
　　１５０−中４６．６％）とカラムでの分画中に生成
した副生成物（０，０４３ｍｍｏ　ｅ　、　１００ａｕ
中８．９％）とである２つの画分が１１１次得られた。 純粋なＮｉ１）−（２−アミノエチル）　−Ｆ’ＡＤ　
（０，２１５ｍｍｏ　７３　、　１０００　ｍＡ！中４
４５％）は０．５ＭのＬｉＣｇ（ｐＨ３，５）で溶出し
た。 Ｆ’ＡＤおよびＮ（１）−（２−アミノエチル）−Ｉ’
ＡＤの各両分を減圧下で濃縮してそれぞれ５ｒｔｌおよ
び１０５ｇとした。それぞれ２５０ｄの工業用エタノー
ル中４℃で３回流所４九次いで遠心分離してＮ（１）−
（２−アミノエチル）−ＦＡＤ画分からＬｉＧｅｔ−除
去した。このＦＡＤ画分とＮ（１）−（２−アミノエチ
ル）−ＦＡＤとをそれぞれ１０　ｒｔｔｅの蒸留水中に
溶解後に凍結乾燥し、ＮａＯＨ上のデシケータ−中に４
℃で保存した。 この分画の結果を次の表７にまとめて示す。 表７ Ｆ　Ａ　Ｄ　　　Ｏ，１９２０，１９２１００３２副生
成物　　　０．０５４　　０．１７１　　−　　　１１
．８Ｎ（１）−（２−アミノ エチル）−ＦＡＤ　　　Ｏ，３５４０，２１５６１３６
Ｎｆｌ）−（２−アミノエチル）−ＰＡＤはニンヒドリ
ン（第１級アミノ基を有する）と陽性反応を示し、又紫
外線スペクトルにおいてＦＡＤおよびその誘導体に通常
みられるピークを４５０．３７３および２６２　ｎ　ｍ
に示す。３６０　ｎ　ｍで刺激すると、明白な螢光が観
察される。前記の薄層クロマトグラフィーでの溶出系に
おいてＲｆ値は０．１３８である。 Ｂ、Ｎ６−（２−アミノエチル）−ＦＡＤの製造と精製 ３９μｍｏｌのＮ（１）−（２をミ／　ｘｆル）　−Ｆ
ＡＤを８．３　ｍｌの蒸留水中に溶解して０．Ｉ　Ｎの
ＬｔＯＨでｐＨ６，５に調整した。この溶液を４０℃の
温水浴に７時間保持した。その間に０．Ｉ　ＮのＬｔＯ
Ｈで…値を調整した。ＩＡ）と同様の薄１−クロマトグ
ラフィーに付して、Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−
Ｆ″ＡＤから２つの化合物、すなわちＮ６−　（２−ア
ミノエチル）−ＦＡＤ（Ｒｆ−０，１７７）およびｌ、
　Ｎ６−エタンアデニンーＦＡＤと思われる化合物（Ｒ
ｆ−０，１２）が生成していることが検出された。この
処理液の組成を薄層クロマトグラフィーによる紫外線走
査によシ測定した結果、３５％（１３，５μｍｏｎのｌ
、Ｎ６−エタンアデニンーＰＡＤと６５％（２５，５μ
ｍｏｇ）（ＤＮ’−（２−アミノエチル）−ＦＡＤとで
あった。 この処理液を減圧下で濃縮して４ｄとした。…′ｆｒ：
６．５　に調整後、この溶液を、蒸留水で平衡化（ｐＨ
３，５）した陰イオン交換カラム（１００ｘ　Ｏ，５ｃ
ＷＬ。 ＡＧＩＸ４．　ｔｏｏ　〜２００メツシュ、Ｂｌｏ−Ｒ
ａｄ）中に４℃で導入した。蒸留水（ｐＨ３，５）　　
で溶出すると。 最初に不明の分解生成物が溶出した（±２μｍｏｌ、５
％）。次いで０−０．２　ＭノＬ１１Ｊ（ｐｉ（３，５
，５００ｍ／１５００ｘ／）で傾斜溶離すると、Ｎ６−
（２−アミノエチＡ、　）　−Ｆ　Ａ　Ｄ　（１３，７
μｍｏｇ、　４００−中５３％）と１．Ｎ６−エタンア
デニン−Ｆ’ＡＤと思われる化合物（５，６μｍｏｇ、
　３００ＷＬ／中４０％）が１臓次溶出された。各２つ
の両分を減圧下に濃縮して４ｍ／とじ、そしてＬｉＣＪ
を除去するためにこれを蒸留水で平衡化した５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ　１０カラム（＋ｏｏｘ１ｃｍ）を通してダ
ルろ過した。 凍結乾燥後１両生成物をＮａＯＨ上のデシケータ−中に
４℃で保存した。この分画の結果を次の表８にまとめて
示す。 表８ ＵＶスペクトルおよび最初のＮＭＲデータによりＮ６−
　（２−アミノエチル）−ＦＡＤ化合物自体であること
が確認された。この化合物はエンヒト９リン（第１級ア
ミン基含有）と陽性反応をし、λｍａＸ　Ｆｉ　２６６
　ｎ　ｍにあり、そしてＵ’ｌ／スペクトルにおいてＦ
’ＡＤおよびその誘導体に特有のピークを４５０Ｊ？よ
び３７３　ｎ　ｍに示す。３６６　ｎ　ｍで刺激すると
明白な螢光が観察される。 Ｃ０実施例１ ポリエチレングリコールＮ６−（２−アミノエチル）−
ＦＡＤの製造 ＢＥＧ　（Ｍ’ｔ’／２００００）　−Ｎ６−　（２−
アミノエチル）−Ｆ’ＡＤ　　： Ｂｕｅｃｋｍａｎｎ　等の方法（Ｍａｋｒｏｍｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ％１８２．１３７９−１３８４．１９８１）によ
り作ったＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化カルボキ
シル化ポリエチレングリコール（分子ｉ　２００００．
５μｍｏｌ中ｌＯμｍｏｌの活性化のカルボキシル！含
有）　　１１０■を、０．ＩＮのＮａＯＨでｐＨ’ｅ７
．２に調整して５　ＢｒｎｏｌのＮ”　（２−アミノエ
チル）−ＦＡＤと一緒にｌｄの蒸留水中に溶解した。こ
の混合物を室温で…７．２〜７．３　（ｐＨ調整は０．
ＩＮのＭＣＩ又は０．Ｉ　ＮのＮａＯＨで行った）で１
時間攪拌した。この反応混合換金蒸留水で平衡化した５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５ＱカラＡ　（ｏ、ｓ　ｘ６０ｍ）
を通して４℃でダルろ過した。ポリエチレングリコール
−Ｎ’−（２−アミノエチル）　−Ｆ’ＡＤを含有する
両分を濃縮して１．７　ｖｔｔとした。これはカップリ
ング率４０％でポリエチレングリコール（分子量２００
００　）に結合したＮ６−　（２−アミノエチル）　−
Ｆ　Ａ　Ｄ　（＋ａ度１．１８ｍＭ）２μｍｏｅｅ含有
している。 Ｄ、実施例２ Ｃｌ−セファロース４　Ｂ　−Ｎ’　（２−アミノエチ
ル）−Ｆ’ＡＤの製造 ３ゴの蒸留水に漬けた０、２５１）のＣＨ−セファロー
ス４　Ｂ　（ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、１０−１４μｍ
ｏｇのカルボキシヘキシル基含有）をガラスフリット上
２５　ｗｉｔの蒸留水で洗浄した。半乾燥したＣＨ−セ
ファロース４Ｂを０．５　ｗｅの蒸留水中にけん濁させ
、■００■（５２０μｍｏｇ）の１−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド−ＨＣｌ１
を加えた。このけん濁液を室温で１０分間保持した。（
その際、０．Ｉ　ＮのＮａＯＨ又は０．Ｉ　ＮのＨＣｌ
で−（ｔ−４，８〜５．０　に調整した。）こうして活
性化したＣＨ−セファロース４Ｂを１０ｒＩＬｌの蒸留
水で１分間づつ２回洗浄し、そして２．１μｍｏｇのＮ
’　−（２をミ／ｘチル）−Ｆ’ＡＤを含有する水溶液
０．５　ｒｔｔｌに加えた。 …を４．６　に調整（０，Ｉ　ＮのＮａＯＨ又は０．Ｉ
　ＮのＨｃ６で）後、このけん濁ＷＬヲ室温で１６時間
保持した。 ３０ｔｔｔｅの２０％Ｌ１（Ｊと２０　ｍｌの蒸留水で
洗浄しそして蒸留水中で沈降させると、１．７５μｍｏ
ｌのＮ６−（２をミ／　ｘ　ｆ　ル）　−Ｆ　Ａ　Ｄ　
（濃度１．４５ｍＭ）　　がカップリング率８３％で結
合しているＣＨ−セファロース４Ｂ−Ｎ６−（２−アミ
ノエチル）−ＦＡＤｌ、２ｍｌが得られた。 参考文献 （１）　　Ｋｏａｂａｃｋ、　Ｋ、、　”Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”。 ４６、２０５−２７８（１９７８） （２）　　Ｗｉｃｋｍａｎｎ、　Ｒ，、Ｗａｎｄｒａｙ
、　Ｃ，、Ｓａｃｋｍａｎｎ。 Ａ％Ｆ、およびＫｕｌａ、　Ｎ、　−Ｒ，、’Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ。 Ｂｉｏｅｎｇ、’、　２３．２７８９−２８０２（１９
８１）（３）　　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、　Ｎ、、　Ｌａｒ
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１９７４）（５）　　ムラマツ、Ｍ、、ウラベア工、、
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ｉｖｉｔａ、　Ａ、　　およびＲｅ、　Ｌ、、　”Ｅｕ
ｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、”、　５４゜（７）　　　
Ｚａｐｐｅｌｌｉ、Ｐ、、Ｐａｐｐａ、Ｒｏ、Ｒｏｓｓ
ｏｄｉｖｉｔａ。 Ａ、およびＲｅ、　Ｌ、、　”Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏ
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クラ、に、。 ササキ、Ｒ９，およびチバ、　Ｈ，、’Ａｔｒｉｃ。 Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、”、　４６．２０７　２１３（１
９８２）０υ　ＬｅＧｏｆｆｉｃ、　Ｆ、、　５ｉｃａ
ｉｃ、　Ｓ、およびＶｉｎｃｅｎｔ、　Ｃ，、’Ｅｕｒ
、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、”、　１０８゜！ＩＥ　　
Ｆｕｌｌｅｒ、　Ｃ，Ｗ、、　Ｒｕｂｉｎ、　Ｊ、Ｒ，
およびＢｒｉｇｈｔ、　Ｈ，Ｊ、、　＠Ｅｕｒ、Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、”。 １０３、４２１−４３０（１９８０） （１３）　　Ｂｕｃｋｍａｎｎ、　Ａ、Ｆ、、西独特許
２８．４１．４１４（１４）　　Ｂｕｃｋｍａｎｎ、　
Ａ、Ｆ、、Ｋｕｌａ、　Ｎ、Ｒｏ、　Ｗｉｃｈｍａｎｎ
。 Ｒ，オ！びＷａｎｄｒｙ、　Ｃ，、’Ｊ、　Ａｐｐｌ、
　ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、”、３，３０１−３１５（１９８
１）ａ９　　ヤマザキ、Ｙ、、およびマエダ、Ｈ０゜”
Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、”、　４５．２
６３１−αｆ３　　Ｚａｐｅｌｉ、　Ｐ、、　Ｐａｐｐ
ａ、　Ｒ，、Ｒｏｓｓｏｄｉｖｉｔａ。 Ａ、およびＲｅ、　Ｌ、。 ”Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、’、　８９．４９
１−４９９Ｑ７）　　Ｎａｒａｓｈｉｍｈａｎ、　Ｋ、
およびＷｉｎｇａｒｄ、　Ｌ、Ｂ−＋”Ａｐｐｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ、”、　　１１．２
２１代理人　弁理士（８１０７）佐　々　木　渭　隆　
ど（ほか３名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ＮＡＤ又はＮＡＤＰをそのＮ（１）−位にお
   いてエチレンイミンでアルキル化してＮ（１）−（２−
   アミノエチル）−ＮＡＤ又はＮ（１）−（２−アミノエ
   チル）−ＮＡＤＰとし、 （ｂ）このアルキル化生成物をジムロ− （Ｄｉｍｒｏｔｈ）転位に付してＮ＾６−（２−アミノ
   エチル）−ＮＡＤ又はＮ＾６−（２−アミノエチル）−
   ＮＡＤＰとし、そして （ｃ）所望により（ａ）又は（ｂ）で得られた生成物を
   それ自体公知の方法によりマクロ分子に共有結合させる
   ことにより、Ｎ＾６−置換ＮＡＤ又はＮＡＤＰを製造す
   るにあたり、 （ｄ）ジムロ−転位の前の還元およびこれに相当する該
   転位後の酸化を行なわないことを特徴とする、前記Ｎ＾
   ６−置換ＮＡＤ又はＮＡＤＰの製造方法。 ２、（ａ）ＦＡＤをそのＮ（１）−位においてエチレン
   イミンでアルキル化してＮ（１）−（２−アミノエチル
   ）−ＦＡＤとし、 （ｂ）このアルキル化生成物をジムロ− （Ｄｉｍｒｏｔｈ）転位に付してＮ＾６−（２−アミノ
   エチル）−ＦＡＤとし、そして （ｃ）所望により（ａ）又は（ｂ）で得られた生成物を
   それ自体公知の方法によりマクロ分子に共有結合させる
   ことにより、Ｎ＾６−置換ＦＡＤを製造するにあたり、 （ｄ）ジムロ−転位の前の還元およびこれに相当する該
   転位後の酸化を行なわないことを特徴とする、前記Ｎ＾
   ６−置換ＦＡＤの製造方法。 ３、該転位を水性媒体中で行う、特許請求の範囲１又は
   ２項に記載の方法。 ４、該転位をｐＨ４〜９、特にｐＨ５〜８で行う、特許
   請求の範囲１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、該転位を２５〜７５℃、特に４０〜６０℃の温度で
   行う、特許請求の範囲１〜４項のいずれかに記載の方法
   。