JP2547327B2 - Ｎ▲上６▼−置換ｎａｄ、ｎａｄｐ又はｆａｄの製造方法 - Google Patents
Ｎ▲上６▼−置換ｎａｄ、ｎａｄｐ又はｆａｄの製造方法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ジムロー（Dimroth）転位によりN6−置換N
AD、NADP又はFADを製造する方法に関するものであり、
特に詳細には該転位の前の還元および該転位の後の酸化
を伴なわない反応により製造する方法に関するものであ
る。
AD、NADP又はFADを製造する方法に関するものであり、
特に詳細には該転位の前の還元および該転位の後の酸化
を伴なわない反応により製造する方法に関するものであ
る。
従来の技術とその問題点 固体状高分子基材又は水溶性マクロ分子物質に結合し
たNAD（Ｈ）又はNADP（Ｈ）はすでに研究されておりそ
してここ15年程の間に実用化されて来ている。固体基材
に結合したこれら補酵素はアフィニティークロマトグラ
フィーの使用に成功している（１）。（本文中この番号
は、本文末尾に記載した参考文献を表示する番号であ
る。）水溶性マクロ分子NAD（Ｈ）又はNADP（Ｈ）は、
補酵素利用の酵素触媒分解による精化学品の連続製造用
の酵素膜反応器中の酵素再生可能な補酵素誘導体として
使用される（２）。
たNAD（Ｈ）又はNADP（Ｈ）はすでに研究されておりそ
してここ15年程の間に実用化されて来ている。固体基材
に結合したこれら補酵素はアフィニティークロマトグラ
フィーの使用に成功している（１）。（本文中この番号
は、本文末尾に記載した参考文献を表示する番号であ
る。）水溶性マクロ分子NAD（Ｈ）又はNADP（Ｈ）は、
補酵素利用の酵素触媒分解による精化学品の連続製造用
の酵素膜反応器中の酵素再生可能な補酵素誘導体として
使用される（２）。
これらのマクロ分子NAD（Ｈ）又はNADP（Ｈ）誘導体
合成の従来法は、NAD又はNADPのアデニン環系のＮ
（１）−位をアルキル化し、これを化学的に還元してＮ
（１）−アルキル化NADH又はNADPHとし、次いで塩基性
溶媒中の高められた温度（pH10−11,60−70℃）でのデ
ィムロス転位に元された補酵素をマクロ分子と共有結合
させるか又はこれを酵素酸化してN6−アルキル化NAD又
はNADPとし次いでマクロ分子と共有結合させることから
成るものである。
合成の従来法は、NAD又はNADPのアデニン環系のＮ
（１）−位をアルキル化し、これを化学的に還元してＮ
（１）−アルキル化NADH又はNADPHとし、次いで塩基性
溶媒中の高められた温度（pH10−11,60−70℃）でのデ
ィムロス転位に元された補酵素をマクロ分子と共有結合
させるか又はこれを酵素酸化してN6−アルキル化NAD又
はNADPとし次いでマクロ分子と共有結合させることから
成るものである。
この反応順序はNADおよびNADPを例えばよう化酢酸
（３、４）、プロピオラクトン（５）、3,4−エポキシ
酪酸（６、７）又はエチレンイミン（８、９）の様なア
ルキル化剤を使用してアルキル化する場合のものであ
る。こうしてアルキル化された補酵素はマクロ分子と共
有結合するためにアデニン環のN6−原子の位置の連鎖末
端にカルボキシル基又はアミノ基を有している。
（３、４）、プロピオラクトン（５）、3,4−エポキシ
酪酸（６、７）又はエチレンイミン（８、９）の様なア
ルキル化剤を使用してアルキル化する場合のものであ
る。こうしてアルキル化された補酵素はマクロ分子と共
有結合するためにアデニン環のN6−原子の位置の連鎖末
端にカルボキシル基又はアミノ基を有している。
この結合用には、その結合に反応性を有する１個又は
それ以上の官能基を有する不溶性マクロ分子（固体基
材、マトリックス）又は可溶性の、特に水溶性のマクロ
分子が使用可能である。マクロ分子はそれ自体その様な
官能基を有するものであっても良く、又は官能基を当業
者に公知の方法によりマクロ分子中に導入することもで
きる。使用可能なマクロ分子の例としては、デキストラ
ン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポ
リアクリルアミド、メチルビニルエーテル／無水マレイ
ン酸、エチレン／無水マレイン酸およびジビニルエーテ
ル／無水マレイン酸の様なコポリマー、アガロース、ガ
ラス、セルロース、シリカゲルおよびこれらマクロ分子
の誘導体を挙げることができる。マクロ分子補酵素誘導
体の合成法としては、先の従来法の変法と考えられる別
法が開発されており多くの場合これら別法はその合成を
簡略化することを意図しているものである。例えば、従
来法で合成したN6−〔（６−アミノヘキシル）カルバモ
イルメチル〕−NAD+を水溶性たん白質に結合する場合の
トランスグルタミナーゼを使用しての触媒反応による共
有結合カップリング、例えばＬ−グルタミンのγ−カル
ボキシアミド基を介したカゼインのカップリングが報告
されている（10）。
それ以上の官能基を有する不溶性マクロ分子（固体基
材、マトリックス）又は可溶性の、特に水溶性のマクロ
分子が使用可能である。マクロ分子はそれ自体その様な
官能基を有するものであっても良く、又は官能基を当業
者に公知の方法によりマクロ分子中に導入することもで
きる。使用可能なマクロ分子の例としては、デキストラ
ン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポ
リアクリルアミド、メチルビニルエーテル／無水マレイ
ン酸、エチレン／無水マレイン酸およびジビニルエーテ
ル／無水マレイン酸の様なコポリマー、アガロース、ガ
ラス、セルロース、シリカゲルおよびこれらマクロ分子
の誘導体を挙げることができる。マクロ分子補酵素誘導
体の合成法としては、先の従来法の変法と考えられる別
法が開発されており多くの場合これら別法はその合成を
簡略化することを意図しているものである。例えば、従
来法で合成したN6−〔（６−アミノヘキシル）カルバモ
イルメチル〕−NAD+を水溶性たん白質に結合する場合の
トランスグルタミナーゼを使用しての触媒反応による共
有結合カップリング、例えばＬ−グルタミンのγ−カル
ボキシアミド基を介したカゼインのカップリングが報告
されている（10）。
又、従来法により最初にNADのN6−ビニル誘導体を作
り次いでこれらを他のビニルモノマーと共重合してマク
ロ分子NADとすることもできる（５）。簡略化した共重
合法（すなわち、Ｎ（１）−ビニル−NAD+の生成と同時
に共重合とディムロス転位を行う）では限られた程度
（＜40％）にのみ酵素還元可能なマク分子NAD誘導体が
生成した（11）。エポキシ基を有する水溶性ポリマーに
よるものとしては、変性していないNADから出発してこ
れをＮ（１）−アルキル化し、そして還元してＮ（１）
−アルキル化NADHとし次いでジムロー転位によりポリマ
ーと共有結合したN6−アルキル化NADHとする工程を３工
程で行う方法が知られている（12）。NADHから出発する
場合は、Ｎ（１）−アルキル化と塩基性溶媒中でのジム
ロー転位とによるカップリングを同一条件下で同時に行
うことができるので１工程でも行うことができる。最高
の場合で、約60％まで酵素酸化可能なマクロ分子NADHが
得られた。
り次いでこれらを他のビニルモノマーと共重合してマク
ロ分子NADとすることもできる（５）。簡略化した共重
合法（すなわち、Ｎ（１）−ビニル−NAD+の生成と同時
に共重合とディムロス転位を行う）では限られた程度
（＜40％）にのみ酵素還元可能なマク分子NAD誘導体が
生成した（11）。エポキシ基を有する水溶性ポリマーに
よるものとしては、変性していないNADから出発してこ
れをＮ（１）−アルキル化し、そして還元してＮ（１）
−アルキル化NADHとし次いでジムロー転位によりポリマ
ーと共有結合したN6−アルキル化NADHとする工程を３工
程で行う方法が知られている（12）。NADHから出発する
場合は、Ｎ（１）−アルキル化と塩基性溶媒中でのジム
ロー転位とによるカップリングを同一条件下で同時に行
うことができるので１工程でも行うことができる。最高
の場合で、約60％まで酵素酸化可能なマクロ分子NADHが
得られた。
これらの簡略法は第２工程での補酵素の反応のために
非常に不明瞭なマクロ分子NAD（Ｈ）が生成する点にお
いて欠点があり、そしてこれらは酸化性又は還元性が限
られる原因となるものである。
非常に不明瞭なマクロ分子NAD（Ｈ）が生成する点にお
いて欠点があり、そしてこれらは酸化性又は還元性が限
られる原因となるものである。
この簡略法と従来法の中間であってカップリング後の
NADH類を均一なものとして得る利点を有する方法とし
て、Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−NADを合成し、
これを水溶性ポリマーと共有結合してマクロ分子Ｎ
（１）−（２−アミノエチル）−NADとし、これを化学
的還元してマクロ分子Ｎ（１）−（２−アミノエチル）
−NADHとし、次いでこれをジムロー転位してマクロ分子
N6−（２−アミノエチル）−NADHとすることから成る方
法が見出された（13、14）。
NADH類を均一なものとして得る利点を有する方法とし
て、Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−NADを合成し、
これを水溶性ポリマーと共有結合してマクロ分子Ｎ
（１）−（２−アミノエチル）−NADとし、これを化学
的還元してマクロ分子Ｎ（１）−（２−アミノエチル）
−NADHとし、次いでこれをジムロー転位してマクロ分子
N6−（２−アミノエチル）−NADHとすることから成る方
法が見出された（13、14）。
充分に明瞭な補酵素を有するマクロ分子NAD（Ｈ）又
はNADP（Ｈ）の製造方法は全て通常還元されたＮ（１）
−アルキル化補酵素のジムロー転位工程を含むものであ
るという点が重要である。この転位は補酵素にとって非
常に厳しい条件下で行なわれるものであり、その結果、
未カップリング状態のかなりのロスが出る（pH10.5〜1
1.2:温度60〜70℃：所要時間1.5〜２時間）。
はNADP（Ｈ）の製造方法は全て通常還元されたＮ（１）
−アルキル化補酵素のジムロー転位工程を含むものであ
るという点が重要である。この転位は補酵素にとって非
常に厳しい条件下で行なわれるものであり、その結果、
未カップリング状態のかなりのロスが出る（pH10.5〜1
1.2:温度60〜70℃：所要時間1.5〜２時間）。
Ｎ（１）−（カルボキシメチル）−ATPについては、
そのN6−（カルボキシメチル）−ATPへのジムロー転位
の条件は、そのトリフォスフェート基の安定化のためと
思われるOH-の形の陰イオン交換剤をＮ（１）−（カル
ボキシメチル）−ATP水溶液中に加えることによって改
善することが出来た（15）。HPLCによって100℃、75℃
又は50℃においてそれぞれ５分、10分又は240分間保持
してほとんど生成物を分解することなく完全なディムロ
ス転位を検出することが出来た。Ｎ（１）−（カルボキ
シメチル）−NADから出発する場合は、補酵素活性を有
するN6−（カルボキシメチル）−NADを同様な方法で生
成することは不可能であった（15）。
そのN6−（カルボキシメチル）−ATPへのジムロー転位
の条件は、そのトリフォスフェート基の安定化のためと
思われるOH-の形の陰イオン交換剤をＮ（１）−（カル
ボキシメチル）−ATP水溶液中に加えることによって改
善することが出来た（15）。HPLCによって100℃、75℃
又は50℃においてそれぞれ５分、10分又は240分間保持
してほとんど生成物を分解することなく完全なディムロ
ス転位を検出することが出来た。Ｎ（１）−（カルボキ
シメチル）−NADから出発する場合は、補酵素活性を有
するN6−（カルボキシメチル）−NADを同様な方法で生
成することは不可能であった（15）。
問題点を解決するための手段 本発明の１態様としては、本発明はマクロ分子に結合
したNAD又はNADPの製造方法を提供するものであって、
その方法は補酵素のアデニン環系を１−位においてエチ
レンイミンでアルキル化してＮ（１）−（２−アミノエ
チル）−NAD又はＮ（１）−（２−アミノエチル）−NAD
Pとし、こうしてアルキル化された補酵素をジムロー転
位にとって非常に温和な条件（好ましくはpH5〜８、温
度50℃、所要時間６〜８時間）下で水性媒体中で酸化状
態に転位してN6−（２−アミノエチル）−NAD又はN6−
（２−アミノエチル）−NADPとし、次いでN6−（２−ア
ミノエチル）−NAD又はN6−（２−アミノエチル）−NAD
Pを第１級アミノ基に反応性のある基を有するポリマー
と結合させることから成る。
したNAD又はNADPの製造方法を提供するものであって、
その方法は補酵素のアデニン環系を１−位においてエチ
レンイミンでアルキル化してＮ（１）−（２−アミノエ
チル）−NAD又はＮ（１）−（２−アミノエチル）−NAD
Pとし、こうしてアルキル化された補酵素をジムロー転
位にとって非常に温和な条件（好ましくはpH5〜８、温
度50℃、所要時間６〜８時間）下で水性媒体中で酸化状
態に転位してN6−（２−アミノエチル）−NAD又はN6−
（２−アミノエチル）−NADPとし、次いでN6−（２−ア
ミノエチル）−NAD又はN6−（２−アミノエチル）−NAD
Pを第１級アミノ基に反応性のある基を有するポリマー
と結合させることから成る。
アデニン環のN6−位の変性により合成したFAD誘導体
の水溶性ポリマー又は固体基材上への固定については２
つの方法がこれまでに報告されている。Zapelli等（1
6）は、FADの3,4−エポキシ酪酸でのアルキル化の後に
Ｎ（１）−（２−ヒドロキシ−３−カルボキシプロピ
ル）−FADを厳しい条件（pH10、80℃）下にジムロー転
位することにより合成したN6−（２−ヒドロキシ−３−
カルボキシプロピル）−FADとポリエチレンイミンとを
カップリングさせた。彼らは共有結合していない、従っ
て溶出可能なFADを有するＤ−アミノ酸オキシダーゼお
よびグルコースオキシダーゼの固着形としての長期間保
存安定性は連続的にFADを補充する作用を有するポリエ
チレンイミン−N6−（２−ヒドロキシ−カルボキシプロ
ピル）−FADの存在下に著しく改善されることを示し
た。
の水溶性ポリマー又は固体基材上への固定については２
つの方法がこれまでに報告されている。Zapelli等（1
6）は、FADの3,4−エポキシ酪酸でのアルキル化の後に
Ｎ（１）−（２−ヒドロキシ−３−カルボキシプロピ
ル）−FADを厳しい条件（pH10、80℃）下にジムロー転
位することにより合成したN6−（２−ヒドロキシ−３−
カルボキシプロピル）−FADとポリエチレンイミンとを
カップリングさせた。彼らは共有結合していない、従っ
て溶出可能なFADを有するＤ−アミノ酸オキシダーゼお
よびグルコースオキシダーゼの固着形としての長期間保
存安定性は連続的にFADを補充する作用を有するポリエ
チレンイミン−N6−（２−ヒドロキシ−カルボキシプロ
ピル）−FADの存在下に著しく改善されることを示し
た。
NarasimhanおよびWingard（17）は存在するホルムア
ルデヒド活性化アミノシラン基と反応するインジウム／
酸化すず電極上にFADを固着してアデニン環のN6−位を
介して直接−NH−CH2−NH−結合を生成した。これはそ
の電極においてNADHのNADへの酸化を満足させるには充
分でないが、NADHの過電圧を180mV減少させることがで
きた。そして彼らは第２の反応によりFAD分子の別のカ
ップリング位が固定化に利用できるであろうとの可能性
を言及している。
ルデヒド活性化アミノシラン基と反応するインジウム／
酸化すず電極上にFADを固着してアデニン環のN6−位を
介して直接−NH−CH2−NH−結合を生成した。これはそ
の電極においてNADHのNADへの酸化を満足させるには充
分でないが、NADHの過電圧を180mV減少させることがで
きた。そして彼らは第２の反応によりFAD分子の別のカ
ップリング位が固定化に利用できるであろうとの可能性
を言及している。
N6−アミノアルキル化FAD誘導体、例えばN6−（２−
アミノエチル）FADはこれまでに知られていない。
アミノエチル）FADはこれまでに知られていない。
先に記載した本発明方法である水性媒体中非常に温和
な条件下でＮ（１）−（アミノエチル）−アデニンをNA
DおよびNADPのN6−（２−アミノエチル）−アデニン誘
導体へ変換する方法は、そのＮ（１）−（２−アミノエ
チル）−NADの変換の場合と同様の変換率で本発明の別
の態様であるＮ（１）−（２−アミノエチル）−FADのN
6−（２−アミノエチル）−FADへの変換にも適用可能で
ある。
な条件下でＮ（１）−（アミノエチル）−アデニンをNA
DおよびNADPのN6−（２−アミノエチル）−アデニン誘
導体へ変換する方法は、そのＮ（１）−（２−アミノエ
チル）−NADの変換の場合と同様の変換率で本発明の別
の態様であるＮ（１）−（２−アミノエチル）−FADのN
6−（２−アミノエチル）−FADへの変換にも適用可能で
ある。
マクロ分子NADの製造 A.N（１）−（２−アミノエチル）−NADの製造 200g（300mmol）のNAD（オリエンタル酵母、遊離酸）
を400mlの蒸留水中に溶解した。70％の過塩素酸（全量6
50ml）でpH値を3.2±0.05に保ちながら、これに42.5ml
（850mmol）のエチレンイミン（Serva）をゆっくりと加
えた。反応混合物を30℃、pH3.2±0.05（70％過塩素で
調整）で50時間撹拌した。NADのＮ（１）−（２−アミ
ノエチル）−NADへの転換は、可動相として66/33/1（v/
v/v）のイン酪酸／蒸留水/25％アンモニア水（pH3.7）
を使用したシリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（DC
アルミニウム箔シリカゲル60F254、膜厚0.2mm、メルク
社製）での紫外線走査により測定した。反応混合物は蒸
留水を加えて１とした。各々10倍量の工業用エタノー
ルを使用して４℃で５回沈でんをくり返した後に遠心分
離することにより未反応であつてエタノールに可溶性の
エチンレンイミンを除去した。沈でん物を乾燥オーブン
中25℃で真空下に乾燥し、４℃でNaOH上のデシケーター
中に保持した。分画のために、5.3mmol（23％）のNADと
15mmol（65％）のＮ（１）−（２−アミノエチル）NAD
と2.6mmol（12％）の副生成物とから成る組成の乾燥反
応混合物20gを蒸留水で40mlとした。10NのNaOHでpHを5.
0とした後に、溶液を0.01MのLiCl（pH4.5）で平衡化し
た陽イオン変換カラム（100×2.6cm、Biorex70、50−10
0メッシュ、Bio−Rad）に４℃で導入した。充てん後
に、NADを0.01MのLiCl（pH4.5、5.3mmol）で定量的に２
の画分に溶出した。更に0.01MのLiCl（pH4.5）２で
溶出して、２つの化合物から成る混合物2.5mmolが得ら
れた。これらは薄層クロマトグラフィーにおいてN6−
（２−アミノエチル）−NADと、下記（Ｂ）に記載の様
にＮ（１）−（２−アミノエチル）−NADから容易に生
成する1,N6−エタンアデニン−NADと思われる化合物と
の様な挙動を示した。
を400mlの蒸留水中に溶解した。70％の過塩素酸（全量6
50ml）でpH値を3.2±0.05に保ちながら、これに42.5ml
（850mmol）のエチレンイミン（Serva）をゆっくりと加
えた。反応混合物を30℃、pH3.2±0.05（70％過塩素で
調整）で50時間撹拌した。NADのＮ（１）−（２−アミ
ノエチル）−NADへの転換は、可動相として66/33/1（v/
v/v）のイン酪酸／蒸留水/25％アンモニア水（pH3.7）
を使用したシリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（DC
アルミニウム箔シリカゲル60F254、膜厚0.2mm、メルク
社製）での紫外線走査により測定した。反応混合物は蒸
留水を加えて１とした。各々10倍量の工業用エタノー
ルを使用して４℃で５回沈でんをくり返した後に遠心分
離することにより未反応であつてエタノールに可溶性の
エチンレンイミンを除去した。沈でん物を乾燥オーブン
中25℃で真空下に乾燥し、４℃でNaOH上のデシケーター
中に保持した。分画のために、5.3mmol（23％）のNADと
15mmol（65％）のＮ（１）−（２−アミノエチル）NAD
と2.6mmol（12％）の副生成物とから成る組成の乾燥反
応混合物20gを蒸留水で40mlとした。10NのNaOHでpHを5.
0とした後に、溶液を0.01MのLiCl（pH4.5）で平衡化し
た陽イオン変換カラム（100×2.6cm、Biorex70、50−10
0メッシュ、Bio−Rad）に４℃で導入した。充てん後
に、NADを0.01MのLiCl（pH4.5、5.3mmol）で定量的に２
の画分に溶出した。更に0.01MのLiCl（pH4.5）２で
溶出して、２つの化合物から成る混合物2.5mmolが得ら
れた。これらは薄層クロマトグラフィーにおいてN6−
（２−アミノエチル）−NADと、下記（Ｂ）に記載の様
にＮ（１）−（２−アミノエチル）−NADから容易に生
成する1,N6−エタンアデニン−NADと思われる化合物と
の様な挙動を示した。
主生成物のＮ（１）−（２−アミノエチル）−NADの
溶出をより速くするために、カラム充てんを少なくする
ことによりカラムを50cmの長さに短かくした。この溶出
は0.2MのLiCl（pH4.7）1.5で行ない、11.3mmolの純粋
なＮ（１）−（２−アミノエチル）−NADが回収され
た。エチレンイミンでのアルキル化中に生成した副生成
物（2.6mmol）は単離されなかった。
溶出をより速くするために、カラム充てんを少なくする
ことによりカラムを50cmの長さに短かくした。この溶出
は0.2MのLiCl（pH4.7）1.5で行ない、11.3mmolの純粋
なＮ（１）−（２−アミノエチル）−NADが回収され
た。エチレンイミンでのアルキル化中に生成した副生成
物（2.6mmol）は単離されなかった。
各画分を減圧下に濃縮（フラッシュ蒸発）して30mlと
し、工業用エタノール（20倍過剰容量）で５回沈でんさ
せ、これによりエタノールに可溶のLiClを分離した。画
分生成物を出来るだけ少量の蒸留水中に溶解してから凍
結乾燥してNaOH上のデシケーター中に４℃で保存した。
し、工業用エタノール（20倍過剰容量）で５回沈でんさ
せ、これによりエタノールに可溶のLiClを分離した。画
分生成物を出来るだけ少量の蒸留水中に溶解してから凍
結乾燥してNaOH上のデシケーター中に４℃で保存した。
得られた画分を次表１にまとめて示す。
Ｎ−（１）−（２−アミノエチル）−NADはニンヒド
リン（第１級アミノ基を有する）と陽性反応を示し、又
pH11.5において300〜310nmの範囲でアデニン環のＮ
（１）−アルキル化に特有の閾値を示す。
リン（第１級アミノ基を有する）と陽性反応を示し、又
pH11.5において300〜310nmの範囲でアデニン環のＮ
（１）−アルキル化に特有の閾値を示す。
B.N6−（２−アミノエチル）−NADの製造と精製 2g（2.78mmol）のＮ（１）−（２−アミノエチル）−
NADを200mlの蒸留水中溶解して1NのLiOHでpH6.5に調整
した。この溶液を50℃の温水浴に７時間保持した。その
間に1NのLiOHでpH値を調整した。（Ａ）と同様の薄層ク
ロマトグラフィーに付して、Ｎ（１）−（２−アミノエ
チル）−NADから２つの化合物、すなわちN6−（２−ア
ミノエチル）−NAD（Rf＝0.13）および1,N6−エタンア
デニン−NADと思われる化合物（Rf＝0.068）が生成して
いることが検出された。この処理液の組成を薄層クロマ
トグラフィーによる紫外線走査により測定した結果、6
2.5％（1.74mmol）のN6−（２−アミノエチル）−NADと
37.5％（1.04mmol）の1,N6−エタンアデニン−NADであ
った。
NADを200mlの蒸留水中溶解して1NのLiOHでpH6.5に調整
した。この溶液を50℃の温水浴に７時間保持した。その
間に1NのLiOHでpH値を調整した。（Ａ）と同様の薄層ク
ロマトグラフィーに付して、Ｎ（１）−（２−アミノエ
チル）−NADから２つの化合物、すなわちN6−（２−ア
ミノエチル）−NAD（Rf＝0.13）および1,N6−エタンア
デニン−NADと思われる化合物（Rf＝0.068）が生成して
いることが検出された。この処理液の組成を薄層クロマ
トグラフィーによる紫外線走査により測定した結果、6
2.5％（1.74mmol）のN6−（２−アミノエチル）−NADと
37.5％（1.04mmol）の1,N6−エタンアデニン−NADであ
った。
凍結乾燥した反応混合物を16.5mlの蒸留水に溶解し、
1NのLiOHでpH5.5に調整した。この溶液を、0.01M LiCl
（pH3.5）で平衡化した陽イオン交換カラム（100×1.6c
m、Biorex70、50〜100メッシュ、Bio−Rad）中に導入し
た。0.01M LiCl（pH3.5）で４℃で溶出することによ
り、２つの化合物がわずかに重なりあって別々に溶出さ
れ、N6−（２−アミノエチル）−NADが最後にカラムか
ら溶出された。
1NのLiOHでpH5.5に調整した。この溶液を、0.01M LiCl
（pH3.5）で平衡化した陽イオン交換カラム（100×1.6c
m、Biorex70、50〜100メッシュ、Bio−Rad）中に導入し
た。0.01M LiCl（pH3.5）で４℃で溶出することによ
り、２つの化合物がわずかに重なりあって別々に溶出さ
れ、N6−（２−アミノエチル）−NADが最後にカラムか
ら溶出された。
1,N6−エタンアデニン−NAD（250ml中0.98mmol）と混
合物（120ml中0.20mmol）と純粋なN6−（２−アミノエ
チル）−NAD（660ml中1.56mmol）とから成る３つの薄層
クロマトグラフィーによる均一画分を減圧下に濃縮して
3mlとし、冷工業用エタノール（20倍過剰容量）で２回
沈でんさせてLiClを除去した。出来るだけ少量の蒸留水
中に溶解した後に、各画分を凍結乾燥してNaOH上のデシ
ケーター中に４℃で保存した。この精製の結果を下記表
２にまとめて示す。
合物（120ml中0.20mmol）と純粋なN6−（２−アミノエ
チル）−NAD（660ml中1.56mmol）とから成る３つの薄層
クロマトグラフィーによる均一画分を減圧下に濃縮して
3mlとし、冷工業用エタノール（20倍過剰容量）で２回
沈でんさせてLiClを除去した。出来るだけ少量の蒸留水
中に溶解した後に、各画分を凍結乾燥してNaOH上のデシ
ケーター中に４℃で保存した。この精製の結果を下記表
２にまとめて示す。
UVスペクトルおよびNMRデータによりN6−（２−アミ
ノエチル）−NAD化合物自体であることが確認された。
この化合物はニンヒドリン（第１級アミノ基を含有）と
陽性反応をする。λmaxは267nmにあり、そしてこの化合
物はもはやアデニン環のＮ（１）−アルキル化に特有の
pH11.5における300〜310nmの範囲内に閾値を示さない。
これはビール酵母アルコールデヒドロゲナーゼでの定量
還元により、N6−アルキル化NADH誘導体に特有の267nm
における吸光度/338nmにおける吸光度＝3.2を有する螢
光N6−（２−アミノエチル）−NADH（366nmで励起）を
生成する。
ノエチル）−NAD化合物自体であることが確認された。
この化合物はニンヒドリン（第１級アミノ基を含有）と
陽性反応をする。λmaxは267nmにあり、そしてこの化合
物はもはやアデニン環のＮ（１）−アルキル化に特有の
pH11.5における300〜310nmの範囲内に閾値を示さない。
これはビール酵母アルコールデヒドロゲナーゼでの定量
還元により、N6−アルキル化NADH誘導体に特有の267nm
における吸光度/338nmにおける吸光度＝3.2を有する螢
光N6−（２−アミノエチル）−NADH（366nmで励起）を
生成する。
C.実施例１ ポリエチレングリコールN6−（２−アミノエチル）−NA
Dの製造 Bueckmann等の方法（Makromol.Chem.182.1379−1384,
1981）により作ったカルボキシル化ポリエチレングリコ
ール（分子量20000、0.1mmol中0.14mmolのカルボキシル
基含有）2gを蒸留水に溶解して4mlとし、125μmolのN6
−（２−アミノエチル）−NAD2mlを加えた。1NのHClでp
Hを4.7に調整後に、200mg（（1.04mmol）の１−（３−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジミド−
HClを２つの等量に分けて10分間で加えた。反応混合物
を室温で２時間撹拌した。（この際1NのHCl又は1NのNaO
HでpH値を4.5〜4.8の範囲内に保持した。）４℃で16時
間反応させた後に、反応混合物（7ml）を蒸留水で平衡
化したSephadex G50カラム（100×2.6cm）を通して各3.
5mlの２つのバッチに分けてゲルろ過した。ポリエチレ
ングリコール−N6−（２−アミノエチル）−NADを含有
する画分を合わせて減圧下に濃縮して15mlとした。これ
はカップリング率68％でポリエチレングリコールに結合
したN6−（２−アミノエチル）−NAD（濃度5.5mM）85μ
molを含有している。
Dの製造 Bueckmann等の方法（Makromol.Chem.182.1379−1384,
1981）により作ったカルボキシル化ポリエチレングリコ
ール（分子量20000、0.1mmol中0.14mmolのカルボキシル
基含有）2gを蒸留水に溶解して4mlとし、125μmolのN6
−（２−アミノエチル）−NAD2mlを加えた。1NのHClでp
Hを4.7に調整後に、200mg（（1.04mmol）の１−（３−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジミド−
HClを２つの等量に分けて10分間で加えた。反応混合物
を室温で２時間撹拌した。（この際1NのHCl又は1NのNaO
HでpH値を4.5〜4.8の範囲内に保持した。）４℃で16時
間反応させた後に、反応混合物（7ml）を蒸留水で平衡
化したSephadex G50カラム（100×2.6cm）を通して各3.
5mlの２つのバッチに分けてゲルろ過した。ポリエチレ
ングリコール−N6−（２−アミノエチル）−NADを含有
する画分を合わせて減圧下に濃縮して15mlとした。これ
はカップリング率68％でポリエチレングリコールに結合
したN6−（２−アミノエチル）−NAD（濃度5.5mM）85μ
molを含有している。
D.実施例２ デキストラン−N6−（２−アミノエチル）−NADの製造 Bueckmann等の方法（J.Appl.Biochem.3,301〜315,198
1）により作ったカルボキシル化デキストラン T70（分
子量70000,無水グルコースモノマー1mmol中0.3mmolがカ
ルボキシル化されている）0.2gを2mlの蒸留水中に溶解
し、65μmolのN6−（２−アミノエチル）−NAD 1mlを
加えた。1NのHClでpHを4.7に調整後に、150mg（0.78mmo
l）の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミド−HClを２つの等量に分けて10分間で
加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。（この際
1NのNCl又は1NのNaOHでpH値を4.5〜4.8の範囲内に保持
した。）４℃で16時間反応させた後、反応混合物（3.5m
l）を蒸留水で平衡化したSephadex G50カラム（100×2.
6cm）を通して40℃でゲルろ過した。デキストラン−N6
−（２−アミノエチル）−NADを含有する画分を減圧下
に濃縮して10mlとした。これはカップリング率22％でデ
キストランに結合したN6−（２−アミノエチル）−NAD
（濃度1.4mM）14μmolを含有している。
1）により作ったカルボキシル化デキストラン T70（分
子量70000,無水グルコースモノマー1mmol中0.3mmolがカ
ルボキシル化されている）0.2gを2mlの蒸留水中に溶解
し、65μmolのN6−（２−アミノエチル）−NAD 1mlを
加えた。1NのHClでpHを4.7に調整後に、150mg（0.78mmo
l）の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミド−HClを２つの等量に分けて10分間で
加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。（この際
1NのNCl又は1NのNaOHでpH値を4.5〜4.8の範囲内に保持
した。）４℃で16時間反応させた後、反応混合物（3.5m
l）を蒸留水で平衡化したSephadex G50カラム（100×2.
6cm）を通して40℃でゲルろ過した。デキストラン−N6
−（２−アミノエチル）−NADを含有する画分を減圧下
に濃縮して10mlとした。これはカップリング率22％でデ
キストランに結合したN6−（２−アミノエチル）−NAD
（濃度1.4mM）14μmolを含有している。
E.実施例３ ポリビニルピロリドンN6−（２−アミノエチル）−NAD
の製造 Specht,Hoppe−SeylerのJournal Physiol.Chem.354,1
659〜1660（1973）に記載の方法により作ったカルボキ
シル化ポリビニルピロリドン（分子量160000,2.7mmolの
ビニルピロリドンモノマー中0.135mmolのカルボキシル
基含有）0.3gを3mlの蒸留水に溶解して100mg（63μmo
l）のN6−（２−アミノエチル）−NADを加え、1NのHCl
でpHを4.7に調整した。150mg（0.78mmol）の１−（３−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
−HClを２つの等量に分けて10分間で加えた。反応混合
物を室温で２時間撹拌した。（この際1NのHCl又は1NのN
aOHでpH値を4.5〜4.8の範囲内で保持した。）４℃で16
時間反応させた後に、反応混合物（3.8ml）を蒸留水で
平衡化したSephadex G50カラム（100×2.6cm）を通して
４℃でゲルろ過した。ポリビニルピロリドン−N6−（２
−アミノエチル）NADを含有する画分を減圧下に濃縮し
て10mlとした。これはカップリング率16％でポリビニル
ピロリドンに結合したN6−（２−アミノエチル）−NAD
（濃度1mM）10μmolを含有している。
の製造 Specht,Hoppe−SeylerのJournal Physiol.Chem.354,1
659〜1660（1973）に記載の方法により作ったカルボキ
シル化ポリビニルピロリドン（分子量160000,2.7mmolの
ビニルピロリドンモノマー中0.135mmolのカルボキシル
基含有）0.3gを3mlの蒸留水に溶解して100mg（63μmo
l）のN6−（２−アミノエチル）−NADを加え、1NのHCl
でpHを4.7に調整した。150mg（0.78mmol）の１−（３−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
−HClを２つの等量に分けて10分間で加えた。反応混合
物を室温で２時間撹拌した。（この際1NのHCl又は1NのN
aOHでpH値を4.5〜4.8の範囲内で保持した。）４℃で16
時間反応させた後に、反応混合物（3.8ml）を蒸留水で
平衡化したSephadex G50カラム（100×2.6cm）を通して
４℃でゲルろ過した。ポリビニルピロリドン−N6−（２
−アミノエチル）NADを含有する画分を減圧下に濃縮し
て10mlとした。これはカップリング率16％でポリビニル
ピロリドンに結合したN6−（２−アミノエチル）−NAD
（濃度1mM）10μmolを含有している。
F.実施例４ ポリ−（エチレン／マレイン酸）−N6−（２−アミノエ
チル）−NADの製造 50mgのポリ−（エチレン／無水マレイン酸）（分子量
不明、エチレン／無水マレイン酸モノマー0.4mmol、Ald
rich）を10mlの蒸留水中に溶解し、1NのNaOHでpHを7.5
に調整し、そして20μmolのN6−（２−アミノエチル）
−NADを加えた。室温で５時間撹拌（この際1NのNaOHでp
Hを7.5に調整）後、反応混合物を５の蒸留水で16時間
４℃で透析した。13μmolのN6−（２−アミノエチル）
−NAD（濃度0.6mM）がカップリング率65％でポリ−（エ
チレン／マレイン酸）に結合した生成物22mlが得られ
た。
チル）−NADの製造 50mgのポリ−（エチレン／無水マレイン酸）（分子量
不明、エチレン／無水マレイン酸モノマー0.4mmol、Ald
rich）を10mlの蒸留水中に溶解し、1NのNaOHでpHを7.5
に調整し、そして20μmolのN6−（２−アミノエチル）
−NADを加えた。室温で５時間撹拌（この際1NのNaOHでp
Hを7.5に調整）後、反応混合物を５の蒸留水で16時間
４℃で透析した。13μmolのN6−（２−アミノエチル）
−NAD（濃度0.6mM）がカップリング率65％でポリ−（エ
チレン／マレイン酸）に結合した生成物22mlが得られ
た。
G.実施例５ ポリ−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）−N6−
（２−アミノエチル）−NADの製造 50gのポリ−（メチルビニルエーテル／無水マレイン
酸）（分子量20000、メチルビニルエーテル／無水マレ
イン酸モノマー0.32mmol、Polysciences）を10mlの蒸留
水中に溶解し、1NのNaOHでpHを7.5に調整し、そして20
μmolのN6−（２−アミノエチル）−NADを加えた。室温
で５時間撹拌（この際1NのNaOHでpHを7.5に調整）後、
反応混合物を５の蒸留水で16時間４℃で透析した。17
μmolのN6−（２−アミノエチル）−NAD（濃度0.78mM）
がカップリング率85％でポリ−（メチルビニルエーテル
／マレイン酸）に結合した生成物22mlが得られた。
（２−アミノエチル）−NADの製造 50gのポリ−（メチルビニルエーテル／無水マレイン
酸）（分子量20000、メチルビニルエーテル／無水マレ
イン酸モノマー0.32mmol、Polysciences）を10mlの蒸留
水中に溶解し、1NのNaOHでpHを7.5に調整し、そして20
μmolのN6−（２−アミノエチル）−NADを加えた。室温
で５時間撹拌（この際1NのNaOHでpHを7.5に調整）後、
反応混合物を５の蒸留水で16時間４℃で透析した。17
μmolのN6−（２−アミノエチル）−NAD（濃度0.78mM）
がカップリング率85％でポリ−（メチルビニルエーテル
／マレイン酸）に結合した生成物22mlが得られた。
H.実施例６ ポリ−（ジビニルエーテル／マレイン酸）−N6−（２−
アミノエチル）−NADの製造 50mgのポリ−（ジビニルエーテル／無水マレイン酸）
（分子量18000、ジビニルエーテル／無水マレイン酸モ
ノマー0.19mmol、Hercules）を10mlの蒸留水中に溶解
し、1NのNaOHでpHを7.5に調整し、そして20μmolのN6−
（２−アミノエチル）−NADを加えた。室温で５時間撹
拌（この際1NのNaOHでpHを7.5に調整）後、反応混合物
を５の蒸留水で16時間４℃で透析した。20μmolのN6
−（２−アミノエチル）−NAD（濃度0.92mM）がカップ
リング率100％でポリ−（ジビニルエーテル／マレイン
酸）に結合した生成物22mlが得られた。
アミノエチル）−NADの製造 50mgのポリ−（ジビニルエーテル／無水マレイン酸）
（分子量18000、ジビニルエーテル／無水マレイン酸モ
ノマー0.19mmol、Hercules）を10mlの蒸留水中に溶解
し、1NのNaOHでpHを7.5に調整し、そして20μmolのN6−
（２−アミノエチル）−NADを加えた。室温で５時間撹
拌（この際1NのNaOHでpHを7.5に調整）後、反応混合物
を５の蒸留水で16時間４℃で透析した。20μmolのN6
−（２−アミノエチル）−NAD（濃度0.92mM）がカップ
リング率100％でポリ−（ジビニルエーテル／マレイン
酸）に結合した生成物22mlが得られた。
下記の条件下での酵母アルコールデヒドロゲナーゼに
よる触媒反応における水溶性ポリマー結合N6−（２−ア
ミノエチル）−NAD誘導体の酵素還元性をN6−（２−ア
ミノエチル）−NADのそれと比較して測定した。
よる触媒反応における水溶性ポリマー結合N6−（２−ア
ミノエチル）−NAD誘導体の酵素還元性をN6−（２−ア
ミノエチル）−NADのそれと比較して測定した。
0.1Mトリス/ECl、pH8.2、室温 0.1Mエタノール 7mMセミカルバジド/HCl 0.1mM N6−（２−アミノエチル）−NAD （遊離形又はポリマー結合形） 0.3mgアルコールデヒドロゲナーゼ 還元性データを下記の表３にまとめて示した。
表 ３ 還元性（％） N6−（２−アミノエチル）−NAD 100 ポリエチレングリコール（MW,20000）−N6−（２−アミ
ノエチル）−NAD 90 デキストランT70（MW,70000）−N6−（２−アミノエチ
ル）−NAD 90 ポリビニルピロリドン（MW,160000）−N6−（２−アミ
ノエチル）−NAD 90 ポリ−（エチレン／マレイン酸）−N6−（２−アミノエ
チル）−NAD 60 ポリ−（メチレンビニルエーテル／マレイン酸）−N6−
（２−アミノエチル）−NAD 70 ポリ−（ジビニルエーテル／マレイン酸）−N6−（２−
アミノエチル）−NAD 60 注:N6−（２−アミノエチル）−NADおよびN6−（２−ア
ミノエチル）−NADH誘導体の吸光係数はε267＝21000M
-1cm-1およびε340＝6200M-1cm-1である。
ノエチル）−NAD 90 デキストランT70（MW,70000）−N6−（２−アミノエチ
ル）−NAD 90 ポリビニルピロリドン（MW,160000）−N6−（２−アミ
ノエチル）−NAD 90 ポリ−（エチレン／マレイン酸）−N6−（２−アミノエ
チル）−NAD 60 ポリ−（メチレンビニルエーテル／マレイン酸）−N6−
（２−アミノエチル）−NAD 70 ポリ−（ジビニルエーテル／マレイン酸）−N6−（２−
アミノエチル）−NAD 60 注:N6−（２−アミノエチル）−NADおよびN6−（２−ア
ミノエチル）−NADH誘導体の吸光係数はε267＝21000M
-1cm-1およびε340＝6200M-1cm-1である。
I.実施例７ CH−セファロース 4B−N6−（２−アミノエチル）−NA
Dの製造 10mlの蒸留水に漬けた1.5gのCH−セファロース4B（Ph
armacia社製、60−84μmolのカルボキシヘキシル基含
有）をガラスフリット上100mlの蒸留水で洗浄した。半
乾燥したCH−セファロース4Bを2mlの蒸留水中にけん濁
させ、430mg（2.25mmol）の１−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−３−エチルカルボジイミド−HClを加え
た。このけん濁液を室温で10分間保持した。（その際、
1NのNaOH又は1NのHClでpHを4.8〜5.0に調整した。）こ
うして活性化したCH−セファロース4Bを25mlの蒸留水で
１分間づつ２回洗浄し、そして34μmolのN6−（２−ア
ミノエチル）−NADを含有する水溶液2mlに加えた。pHを
4.6に調整（1NのNaOH又は1NのHClで）後、このけん濁液
を室温で16時間保持した。
Dの製造 10mlの蒸留水に漬けた1.5gのCH−セファロース4B（Ph
armacia社製、60−84μmolのカルボキシヘキシル基含
有）をガラスフリット上100mlの蒸留水で洗浄した。半
乾燥したCH−セファロース4Bを2mlの蒸留水中にけん濁
させ、430mg（2.25mmol）の１−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−３−エチルカルボジイミド−HClを加え
た。このけん濁液を室温で10分間保持した。（その際、
1NのNaOH又は1NのHClでpHを4.8〜5.0に調整した。）こ
うして活性化したCH−セファロース4Bを25mlの蒸留水で
１分間づつ２回洗浄し、そして34μmolのN6−（２−ア
ミノエチル）−NADを含有する水溶液2mlに加えた。pHを
4.6に調整（1NのNaOH又は1NのHClで）後、このけん濁液
を室温で16時間保持した。
75mlの20％LiClと25mlの蒸留水で洗浄しそして蒸留水
中で沈降させると、20.6μmolのN6−（２−アミノエチ
ル）−NAD（濃度3mM）がカップリング率60.5％で結合し
ているCH−セファロース4B−N6−（２−アミノエチル）
−NAD7mlが得られた。
中で沈降させると、20.6μmolのN6−（２−アミノエチ
ル）−NAD（濃度3mM）がカップリング率60.5％で結合し
ているCH−セファロース4B−N6−（２−アミノエチル）
−NAD7mlが得られた。
マクロ分子NADPの製造 A.N（１）−（２−アミノエチル）−NADPの製造と精製 7.5g（9.51mmol）のNADP（Boehringer社製、ジナトリ
ウム塩）を10mlの蒸留水中に溶解した。70％の過塩素酸
（全量25ml）でpH値を3.35±0.05に保ちながら、これに
1.4ml（28mmol）のエチレンイミン（Serva）をゆっくり
と加えた。反応混合物を30℃、pH3.35±0.05（70％過塩
素で調整）で120時間撹拌した。NADPのＮ（１）−（２
−アミノエチル）−NADPへの転換は、可動相として66/3
3/1（v/v/v）のソイ酪酸／蒸留水/25％アンモニア水（p
H3.7）を使用したシリカゲル上の薄層クロマトグラフィ
ー（DCアルミニウム箔シリカゲル60F254、膜厚0.2mm、
メルク社製）での紫外線走査により測定した。反応混合
物は蒸留水を加えて50mlとした。各々10倍量の工業用エ
タノールを使用して４℃で５回沈でんをくり返した後に
遠心分離することにより未転換であってエタノールに可
溶性のエチレンイミンを除去した。沈でん物を出来るだ
け少量の蒸留水に溶解しそして凍結乾燥した。この凍結
乾燥物を４℃でNaOH上のデシケーター中に保持した。分
画のために、0.235mmol（27.5％）のNADPと0.575mmol
（68％）のＮ（１）−（２−アミノエチル）−NADPと0.
038mmol（4.5％）の副生成物とから成る組成の凍結乾燥
反応混合物0.75gを蒸留水に溶解して22mlとした。1NのH
ClでpHを3.5とした後に、この溶液を0.01Mのトリエタノ
ールアミン炭酸水素塩（pH3.5）で平衡化した陽イオン
交換カラム（60×1.5cm、AG W50X4、100〜200メッシ
ュ、Bio−Rad）に導入した。0.01Mのトリエタノールア
ミン炭酸水素塩（pH3.5）で４℃で溶出すると、副生成
物を含有するNADP（0.29mmol、25ml中34％）と、アルキ
ル反応中のＮ（１）−（２−アミノエチル）−NAPPから
のものと分画の際のカラム中のものとで成る副生成物
（0.115mmol、100ml中13.5％）と、純粋なＮ（１）−
（２−アミノエチル）−NADP（0.39mmol、200ml中46
％）とである３つの画分が順次得られた。
ウム塩）を10mlの蒸留水中に溶解した。70％の過塩素酸
（全量25ml）でpH値を3.35±0.05に保ちながら、これに
1.4ml（28mmol）のエチレンイミン（Serva）をゆっくり
と加えた。反応混合物を30℃、pH3.35±0.05（70％過塩
素で調整）で120時間撹拌した。NADPのＮ（１）−（２
−アミノエチル）−NADPへの転換は、可動相として66/3
3/1（v/v/v）のソイ酪酸／蒸留水/25％アンモニア水（p
H3.7）を使用したシリカゲル上の薄層クロマトグラフィ
ー（DCアルミニウム箔シリカゲル60F254、膜厚0.2mm、
メルク社製）での紫外線走査により測定した。反応混合
物は蒸留水を加えて50mlとした。各々10倍量の工業用エ
タノールを使用して４℃で５回沈でんをくり返した後に
遠心分離することにより未転換であってエタノールに可
溶性のエチレンイミンを除去した。沈でん物を出来るだ
け少量の蒸留水に溶解しそして凍結乾燥した。この凍結
乾燥物を４℃でNaOH上のデシケーター中に保持した。分
画のために、0.235mmol（27.5％）のNADPと0.575mmol
（68％）のＮ（１）−（２−アミノエチル）−NADPと0.
038mmol（4.5％）の副生成物とから成る組成の凍結乾燥
反応混合物0.75gを蒸留水に溶解して22mlとした。1NのH
ClでpHを3.5とした後に、この溶液を0.01Mのトリエタノ
ールアミン炭酸水素塩（pH3.5）で平衡化した陽イオン
交換カラム（60×1.5cm、AG W50X4、100〜200メッシ
ュ、Bio−Rad）に導入した。0.01Mのトリエタノールア
ミン炭酸水素塩（pH3.5）で４℃で溶出すると、副生成
物を含有するNADP（0.29mmol、25ml中34％）と、アルキ
ル反応中のＮ（１）−（２−アミノエチル）−NAPPから
のものと分画の際のカラム中のものとで成る副生成物
（0.115mmol、100ml中13.5％）と、純粋なＮ（１）−
（２−アミノエチル）−NADP（0.39mmol、200ml中46
％）とである３つの画分が順次得られた。
各画分を減圧下に濃縮して25mlとし、凍結乾燥してト
リエタノールアミン炭酸水素塩を除去し、そしてNaOH上
のデシケーター中４℃に保存した。分画の結果を次の表
４に示す。
リエタノールアミン炭酸水素塩を除去し、そしてNaOH上
のデシケーター中４℃に保存した。分画の結果を次の表
４に示す。
Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−NADPはニンヒドリ
ン（第１級アミノ基を有する）と陽性反応を示し、又pH
11.5において300〜310nmの範囲でアデニン環のＮ（１）
−アルキル化に特有の閾値を示す。
ン（第１級アミノ基を有する）と陽性反応を示し、又pH
11.5において300〜310nmの範囲でアデニン環のＮ（１）
−アルキル化に特有の閾値を示す。
B.N6−（２−アミノエチル）−NADPの製造と精製 0.35g（0.24mol）のＮ（１）−（２−アミノエチル）
−NADPを0.5の蒸留水中に溶解して1NのLiOHでpH6.0に
調整した。この溶液を50℃の温水浴に４時間保持した。
その間に1NのLiOHでpH値を調整した。（Ａ）と同様の薄
層クロマトグラフィーに付して、Ｎ（１）−（２−アミ
ノエチル）−NADPから２つの化合物、すなわちN6−（２
−アミノエチル）−NADP（Rf＝0.048）および1,N6−エ
タンアデニン−NADPと思われる化合物（Rf＝0.031）が
生成していることが検出された。この処理液の組成を薄
層クロマトグラフィーによる260nmでの紫外線走査によ
り測定した結果、75％（0.18mmol）の1,N6−エタンアデ
ニン−NADPと25％（0.06mmol）のN6−（２−アミノエチ
ル）−NADPとであった。
−NADPを0.5の蒸留水中に溶解して1NのLiOHでpH6.0に
調整した。この溶液を50℃の温水浴に４時間保持した。
その間に1NのLiOHでpH値を調整した。（Ａ）と同様の薄
層クロマトグラフィーに付して、Ｎ（１）−（２−アミ
ノエチル）−NADPから２つの化合物、すなわちN6−（２
−アミノエチル）−NADP（Rf＝0.048）および1,N6−エ
タンアデニン−NADPと思われる化合物（Rf＝0.031）が
生成していることが検出された。この処理液の組成を薄
層クロマトグラフィーによる260nmでの紫外線走査によ
り測定した結果、75％（0.18mmol）の1,N6−エタンアデ
ニン−NADPと25％（0.06mmol）のN6−（２−アミノエチ
ル）−NADPとであった。
この処理を減圧下で濃縮して7mlとした。pHを5.0に調
整後、この溶液を、0.01Mのトリエタノールアミン炭酸
水素塩（pH3.5）で平衡化した陰イオン交換カラム（100
×1.6cm、AG1X4、100〜200メッシュ、Bio−Rad）中に４
℃で導入した。0.01Mのトリエタノールアミン炭酸水素
塩（pH3.5）で溶出するとにより、２つの主画分、すな
わち1,N6−エタンアデニン−NADP（0.17mmol、１中70
％）およびN6−（２−アミノエチル）−NAPP（0.053mmo
l,250ml中22％）が順次溶出された。
整後、この溶液を、0.01Mのトリエタノールアミン炭酸
水素塩（pH3.5）で平衡化した陰イオン交換カラム（100
×1.6cm、AG1X4、100〜200メッシュ、Bio−Rad）中に４
℃で導入した。0.01Mのトリエタノールアミン炭酸水素
塩（pH3.5）で溶出するとにより、２つの主画分、すな
わち1,N6−エタンアデニン−NADP（0.17mmol、１中70
％）およびN6−（２−アミノエチル）−NAPP（0.053mmo
l,250ml中22％）が順次溶出された。
各２つの画分を減圧下に濃縮して2mlとし、そしてト
リエタノールアミン炭酸水素塩を除去するためにこれを
蒸留水で平衡化したSephadex G10カラム（100×1.5cm）
を通して室温で２回溶出した。
リエタノールアミン炭酸水素塩を除去するためにこれを
蒸留水で平衡化したSephadex G10カラム（100×1.5cm）
を通して室温で２回溶出した。
凍結乾燥後、両生成物をNaOH上のデシケーター中に４
℃で保存した。この分画の結果を次の表５にまとめて示
す。
℃で保存した。この分画の結果を次の表５にまとめて示
す。
UVスペクトルおよびNMRデータによりN6−（２−アミ
ノエチル）−NADP化合物自体であることが確認された。
この化合物はニンヒドリン（第１級アミノ基を含有）と
陽性反応をし、そしてλmaxは267nmにあり、そしてこの
化合物はもはやアデニン環のＮ（１）−アルキル化に特
有のpH11.5における300〜310nmの範囲内に閾値を示さな
い。これはビール酵母グルコース−６−りん酸デヒドロ
ゲナーゼでの定量還元により、N6−アルキル化NADPH誘
導体に特有の267nmにおける吸光度/338nmにおける吸光
度＝3.2を有する螢光N6−（２−アミノエチル）−NADPH
（366nmで励起）を生成する。
ノエチル）−NADP化合物自体であることが確認された。
この化合物はニンヒドリン（第１級アミノ基を含有）と
陽性反応をし、そしてλmaxは267nmにあり、そしてこの
化合物はもはやアデニン環のＮ（１）−アルキル化に特
有のpH11.5における300〜310nmの範囲内に閾値を示さな
い。これはビール酵母グルコース−６−りん酸デヒドロ
ゲナーゼでの定量還元により、N6−アルキル化NADPH誘
導体に特有の267nmにおける吸光度/338nmにおける吸光
度＝3.2を有する螢光N6−（２−アミノエチル）−NADPH
（366nmで励起）を生成する。
C.実施例１ ポリエチレングリコールN6−（２−アミノエチル）−NA
DPの製造 PEG（MW4000）−N6−（２−アミノエチル）−NADP: Bueckmann等の方法（Makromol.Chem.182、1379−138
4、1981）により作ったＮ−ヒドロキシスクシンイミド
活性化カルボキシル化ポリエチレングリコール（分子量
4000、0.015mmol中0.03mmolの活性化カルボキシル基含
有）60mgを、1NのNaOHでpHを7.2に調整して15μmolのN6
−（２−アミノエチル）−NADPと一緒に1mlの蒸留水中
に溶解した。この混合物を室温でpH7.2（pH調整は1NのN
aOHで行った）で５時間撹拌した。この反応混合物を蒸
留水で平衡化したSephadex G50カラム（100×2.6cm）を
通して４℃でゲルろ過した。ポリエチレングリコール−
N6−（２−アミノエチル）−NADPを含有する画分を濃縮
して10mlとした。これはカップリング率80％でポリエチ
レングリコール（分子量4000）に結合したN6−（２−ア
ミノエチル）−NADP（濃度1.2mM）12μmolを含有してい
る。PEG（MW20000）−N6−（２−アミノエチル）−NAD
P: Bueckmann等の方法（Makromol.Chem.182,1379〜1384,
1981）により作ったＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性
化カルボキシル化ポリエチレングリコール（分子量2000
0、0.015ml中0.03mmolの活性化カルボキシル基含有）32
5mgを1NのNaOHでpHを7.2に調整して15μmolのN6−（２
−アミノエチル）−NADPと一緒に1mlの蒸留水中に溶解
した。これを室温でpH7.2〜7.3で１時間更にpH6.8で３
時間撹拌した。（pH調整は1NのHCl又は1NのNaOHで行っ
た。）この反応混合物を蒸留水で平衡化したSephadex G
50カラム（2.6×100cm）を通して４℃でゲルろ過した。
ポリエチレングリコール−N6−（２−アミノエチル）−
NADPを含有する画分を濃縮して10mlとした。これはカッ
プリング率100％でポリエチレングリコール（分子量200
00）に結合したN6−（２−アミノエチル）−NADP（濃度
1.5mM）15μmolを含有している。
DPの製造 PEG（MW4000）−N6−（２−アミノエチル）−NADP: Bueckmann等の方法（Makromol.Chem.182、1379−138
4、1981）により作ったＮ−ヒドロキシスクシンイミド
活性化カルボキシル化ポリエチレングリコール（分子量
4000、0.015mmol中0.03mmolの活性化カルボキシル基含
有）60mgを、1NのNaOHでpHを7.2に調整して15μmolのN6
−（２−アミノエチル）−NADPと一緒に1mlの蒸留水中
に溶解した。この混合物を室温でpH7.2（pH調整は1NのN
aOHで行った）で５時間撹拌した。この反応混合物を蒸
留水で平衡化したSephadex G50カラム（100×2.6cm）を
通して４℃でゲルろ過した。ポリエチレングリコール−
N6−（２−アミノエチル）−NADPを含有する画分を濃縮
して10mlとした。これはカップリング率80％でポリエチ
レングリコール（分子量4000）に結合したN6−（２−ア
ミノエチル）−NADP（濃度1.2mM）12μmolを含有してい
る。PEG（MW20000）−N6−（２−アミノエチル）−NAD
P: Bueckmann等の方法（Makromol.Chem.182,1379〜1384,
1981）により作ったＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性
化カルボキシル化ポリエチレングリコール（分子量2000
0、0.015ml中0.03mmolの活性化カルボキシル基含有）32
5mgを1NのNaOHでpHを7.2に調整して15μmolのN6−（２
−アミノエチル）−NADPと一緒に1mlの蒸留水中に溶解
した。これを室温でpH7.2〜7.3で１時間更にpH6.8で３
時間撹拌した。（pH調整は1NのHCl又は1NのNaOHで行っ
た。）この反応混合物を蒸留水で平衡化したSephadex G
50カラム（2.6×100cm）を通して４℃でゲルろ過した。
ポリエチレングリコール−N6−（２−アミノエチル）−
NADPを含有する画分を濃縮して10mlとした。これはカッ
プリング率100％でポリエチレングリコール（分子量200
00）に結合したN6−（２−アミノエチル）−NADP（濃度
1.5mM）15μmolを含有している。
（注）１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチ
ルカルボジイミドでのカルボキシル基の活性化によるカ
ップリング法はNADP誘導体に使用することはできない。
なぜならば、この反応剤は分子のアデニン側においてリ
ボースの２−りん酸基を介しての2,3−環化をもひき起
し、このためNADP誘導体は補酵素活性を失うからであ
る。
ルカルボジイミドでのカルボキシル基の活性化によるカ
ップリング法はNADP誘導体に使用することはできない。
なぜならば、この反応剤は分子のアデニン側においてリ
ボースの２−りん酸基を介しての2,3−環化をもひき起
し、このためNADP誘導体は補酵素活性を失うからであ
る。
D.実施例２ ポリ−（エチレン／マレイン酸）−N6−（２−アミノエ
チル）−NADPの製造 12mgのポリ−（エチレン／無水マレイン酸）（分子量
不明、エチレン／無水マレイン酸モノマー0.1mmol、Ald
rich）を1mlの蒸留水中に溶解し（0.2NのNaOHでpHを7.5
に調整）、そして5.5μmolのN6−（２−アミノエチル）
−NADPを加えた。室温で５時間撹拌（0.2NのNaOHでpHを
7.5に調整）後、反応混合物を５の蒸留水で16時間４
℃で透析した。0.8μmolのN6−（２−アミノエチル）−
NADP（濃度0.24mM）がカップリング率15％でポリ−（エ
チレン／マレイン酸）に結合した生成物3.3mlが得られ
た。
チル）−NADPの製造 12mgのポリ−（エチレン／無水マレイン酸）（分子量
不明、エチレン／無水マレイン酸モノマー0.1mmol、Ald
rich）を1mlの蒸留水中に溶解し（0.2NのNaOHでpHを7.5
に調整）、そして5.5μmolのN6−（２−アミノエチル）
−NADPを加えた。室温で５時間撹拌（0.2NのNaOHでpHを
7.5に調整）後、反応混合物を５の蒸留水で16時間４
℃で透析した。0.8μmolのN6−（２−アミノエチル）−
NADP（濃度0.24mM）がカップリング率15％でポリ−（エ
チレン／マレイン酸）に結合した生成物3.3mlが得られ
た。
E.実施例３ ポリ−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）−N6−
（２−アミノエチル）−NADPの製造 12mgのポリ−（メチルビニルエーテル／無水マレイン
酸）（分子量20000、メチルビニルエーテル／無水マレ
イン酸モノマー0.077mmol、Polysciences）を1mlの蒸留
水中に溶解（0.2NのNaOHでpHを7.5に調整）し、そして
5.5μmolのN6−（２−アミノエチル）−NADPを加えた。
室温で５時間撹拌（0.2NのNaOHでpHを7.5に調整）後、
反応混合物を５の蒸留水で16時間４℃で透析した。0.
6μmolのN6−（２−アミノエチル）−NADP（濃度0.24m
M）がカップリング率11％でポリ−（メチルビニルエー
テル／マレイン酸）に結合した生成物4.4mlが得られ
た。
（２−アミノエチル）−NADPの製造 12mgのポリ−（メチルビニルエーテル／無水マレイン
酸）（分子量20000、メチルビニルエーテル／無水マレ
イン酸モノマー0.077mmol、Polysciences）を1mlの蒸留
水中に溶解（0.2NのNaOHでpHを7.5に調整）し、そして
5.5μmolのN6−（２−アミノエチル）−NADPを加えた。
室温で５時間撹拌（0.2NのNaOHでpHを7.5に調整）後、
反応混合物を５の蒸留水で16時間４℃で透析した。0.
6μmolのN6−（２−アミノエチル）−NADP（濃度0.24m
M）がカップリング率11％でポリ−（メチルビニルエー
テル／マレイン酸）に結合した生成物4.4mlが得られ
た。
F.実施例４ ポリ−（ジビニルエーテル／マレイン酸）−N6−（２−
アミノエチル）−NADPの製造 12mgのポリ−（ジビニルエーテル／無水マレイン酸）
（分子量18000、ジビニルエーテル／無水マレイン酸モ
ノマー0.046mmol、Hercules）を1mlの蒸留水中に溶解
（0.2NのNaOHでpHを7.5に調整）し、そして5.5μmolのN
6−（２−アミノエチル）−NADPを加えた。室温で５時
間撹拌（0.2NのNaOHでpHを7.5に調整）後、反応混合物
を５の蒸留水で16時間４℃で透析した。0.7μmolのN6
−（２−アミノエチル）−NADP（濃度0.136mM）がカッ
プリング率13％でポリ−（ジビニルエーテル／マレイン
酸）に結合した生成物3.5mlが得られた。
アミノエチル）−NADPの製造 12mgのポリ−（ジビニルエーテル／無水マレイン酸）
（分子量18000、ジビニルエーテル／無水マレイン酸モ
ノマー0.046mmol、Hercules）を1mlの蒸留水中に溶解
（0.2NのNaOHでpHを7.5に調整）し、そして5.5μmolのN
6−（２−アミノエチル）−NADPを加えた。室温で５時
間撹拌（0.2NのNaOHでpHを7.5に調整）後、反応混合物
を５の蒸留水で16時間４℃で透析した。0.7μmolのN6
−（２−アミノエチル）−NADP（濃度0.136mM）がカッ
プリング率13％でポリ−（ジビニルエーテル／マレイン
酸）に結合した生成物3.5mlが得られた。
（注）（Ｏ）、（Ｅ）および（Ｆ）におけるN6−（２
−アミノエチル）−NADPのカップリング率は、N6−（２
−アミノエチル）−NADの同様のカップリングに比べて
実質的に低い。それは酸無水物からの陰イオン性カルボ
キシル基が原因となって、同様に陰イオン性のN6−（２
−アミノエチル）−NADP分子のカップリングを陽イオン
性のN6−（２−アミノエチル）−NAD分子の場合に比べ
て困難なものとしているためと思われる。
−アミノエチル）−NADPのカップリング率は、N6−（２
−アミノエチル）−NADの同様のカップリングに比べて
実質的に低い。それは酸無水物からの陰イオン性カルボ
キシル基が原因となって、同様に陰イオン性のN6−（２
−アミノエチル）−NADP分子のカップリングを陽イオン
性のN6−（２−アミノエチル）−NAD分子の場合に比べ
て困難なものとしているためと思われる。
下記の条件下での酵母グルコース−６−りん酸デヒド
ロゲナーゼによる触媒反応における水溶性ポリマー結合
N6−（２−アミノエチル）−NADP誘導体の酵素還元性を
N6−（２−アミノエチル）−NADPのそれと比較して測定
した。
ロゲナーゼによる触媒反応における水溶性ポリマー結合
N6−（２−アミノエチル）−NADP誘導体の酵素還元性を
N6−（２−アミノエチル）−NADPのそれと比較して測定
した。
0.05M トリエタノールアミン/HCl、pH8.0室温 5.5mM MgCl2 4.5mM グルコース−６−りん酸 0.1M N6−（２−アミノエチル）−NADP （遊離形又はポリマー結合形） 30μｇグルコース−６−りん酸デヒドロゲナーゼ還元
性データを下記の表６にまとめて示した。
性データを下記の表６にまとめて示した。
表 ６ 還元性（％） N6−（２−アミノエチル）−NADP 100 ポリエチレングリコール（MW,4000）−N6−（２−アミ
ノエチル）−NADP 95 ポリエチレングリコール（MW,20000）−N6−（２−アミ
ノエチル）−NADP 95 ポリ−（エチレン／マレイン酸）−N6−（２−アミノエ
チル）−NADP 50 ポリ−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）−N6−
（２−アミノエチル）−NADP 60 ポリ−（ジビニルエーテル／マレイン酸）−N6−（２−
アミノエチル）−NADP 63 注:N6−（２−アミノエチル）−NADPおよびN6−（２−
アミノエチル）−NADPH誘導体の吸光係数はε267＝2100
0M-1cm-1およびε340＝6200M-1cm-1であると推定され
た。
ノエチル）−NADP 95 ポリエチレングリコール（MW,20000）−N6−（２−アミ
ノエチル）−NADP 95 ポリ−（エチレン／マレイン酸）−N6−（２−アミノエ
チル）−NADP 50 ポリ−（メチルビニルエーテル／マレイン酸）−N6−
（２−アミノエチル）−NADP 60 ポリ−（ジビニルエーテル／マレイン酸）−N6−（２−
アミノエチル）−NADP 63 注:N6−（２−アミノエチル）−NADPおよびN6−（２−
アミノエチル）−NADPH誘導体の吸光係数はε267＝2100
0M-1cm-1およびε340＝6200M-1cm-1であると推定され
た。
G.実施例５ CH−セファロース 4B−N6−（２−アミノエチル）−NA
DPの製造 3mlの蒸留水に漬けた0.25gのCH−セファロース4B（Ph
armacia社製、10−14μmolのカルボキシヘキシル基含
有）をガラスフリット上25mlの蒸留水で洗浄した。半乾
燥したCH−セファロース4Bを0.45mlの蒸留水中にけん濁
させ、70mg（365μmol）の１−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−３−エチルカルボジイミド−HClを加えた。
このけん濁液を室温で10分間保持した。（その際、0.1N
のNaOH又は0.1NのHClでpHを4.8〜5.0に調整した。）こ
うして活性化したCH−セファロース4Bを10mlの蒸留水で
１分間づつ２回洗浄し、そして1.4μmolのN6−（２−ア
ミノエチル）−NADPを含有する水溶液0.45mlに加えた。
pHを4.6に調整（0.1NのNaOH又は0.1NのHClで）後、この
けん濁液を室温で16時間保持した。
DPの製造 3mlの蒸留水に漬けた0.25gのCH−セファロース4B（Ph
armacia社製、10−14μmolのカルボキシヘキシル基含
有）をガラスフリット上25mlの蒸留水で洗浄した。半乾
燥したCH−セファロース4Bを0.45mlの蒸留水中にけん濁
させ、70mg（365μmol）の１−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−３−エチルカルボジイミド−HClを加えた。
このけん濁液を室温で10分間保持した。（その際、0.1N
のNaOH又は0.1NのHClでpHを4.8〜5.0に調整した。）こ
うして活性化したCH−セファロース4Bを10mlの蒸留水で
１分間づつ２回洗浄し、そして1.4μmolのN6−（２−ア
ミノエチル）−NADPを含有する水溶液0.45mlに加えた。
pHを4.6に調整（0.1NのNaOH又は0.1NのHClで）後、この
けん濁液を室温で16時間保持した。
20mlの20％LiClを16mlの蒸留水で洗浄しそして蒸留水
中で沈降させると、１μmolのN6−（２−アミノエチ
ル）−NADP（濃度1mM）がカップリング率71.4％で結合
しているCH−セファロース4B−N6−（２−アミノエチ
ル）−NADP1mlが得られた。
中で沈降させると、１μmolのN6−（２−アミノエチ
ル）−NADP（濃度1mM）がカップリング率71.4％で結合
しているCH−セファロース4B−N6−（２−アミノエチ
ル）−NADP1mlが得られた。
マクロ分子FADの製造 A.N（１）−（２−アミノエチル）−FADの製造と精製 0.5g（0.6mmol）のFAD（Serva.ジナトリウム塩）を1m
lの蒸留水中に溶解した。35％の過塩素産（全量1.5ml）
でpH値を3.5±0.1に保ちながら、これに40μ（0.8mmo
l）のエチレンイミン（Serva）をゆっくりと加えた。反
応混合物を30℃、pH3.5±0.1（35％過塩素で調整）で14
4時間撹拌した。FADのＮ（１）−（２−アミノエチル）
−FADへの転換は、可動相として66/33/1（v/v/v）のソ
イ酪酸／蒸留水/25％アンモニア水（pH3.7）を使用した
シリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（DCアルミニウ
ム箔シリカゲル60F254、膜厚0.2mm、メルク社製）での
紫外線走査により測定した。反応混合物は蒸留水を加え
て3mlとした。各々50mlの工業用エタノールを使用して
４℃で２回沈でんをくり返した後に遠心分離することに
より未転換であってエタノールに可溶性のエチレンイミ
ンを除去した。
lの蒸留水中に溶解した。35％の過塩素産（全量1.5ml）
でpH値を3.5±0.1に保ちながら、これに40μ（0.8mmo
l）のエチレンイミン（Serva）をゆっくりと加えた。反
応混合物を30℃、pH3.5±0.1（35％過塩素で調整）で14
4時間撹拌した。FADのＮ（１）−（２−アミノエチル）
−FADへの転換は、可動相として66/33/1（v/v/v）のソ
イ酪酸／蒸留水/25％アンモニア水（pH3.7）を使用した
シリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（DCアルミニウ
ム箔シリカゲル60F254、膜厚0.2mm、メルク社製）での
紫外線走査により測定した。反応混合物は蒸留水を加え
て3mlとした。各々50mlの工業用エタノールを使用して
４℃で２回沈でんをくり返した後に遠心分離することに
より未転換であってエタノールに可溶性のエチレンイミ
ンを除去した。
沈でん物を出来るだけ少量の蒸留水に溶解して凍結乾
燥した。この凍結乾燥物を４℃でNaOH上のデシケーター
中に保持した。
燥した。この凍結乾燥物を４℃でNaOH上のデシケーター
中に保持した。
分画のために、0.192mmol（32％）のFADと0.354mmol
（59％）のＮ（１）−（２−アミノエチル）−FADと0.0
54mmol（９％）の副生成物とから成る組成の凍結乾燥反
応混合物を蒸留水に溶解して20mlとした。1NのHClでpH
を5.0とした後に、この溶液を蒸留水で平衡化（pH3.5）
した陽イオン交換カラム60×1.5cm、Biorex70、50−100
メッシュ、Bio−Rad）に導入した。蒸留水でpH3.5、４
℃で溶出すると、副生成物を含有するFAD（0.22mmol、1
50ml中46.6％）とカラムでの分画中に生成した副生成物
（0.043mmol、100ml中8.9％）とである２つの画分が順
次得られた。純粋なＮ（１）−（２−アミノエチル）−
FAD（0.215mmol、1000ml中44.5％）は0.5MのLiCl（pH3.
5）で溶出した。
（59％）のＮ（１）−（２−アミノエチル）−FADと0.0
54mmol（９％）の副生成物とから成る組成の凍結乾燥反
応混合物を蒸留水に溶解して20mlとした。1NのHClでpH
を5.0とした後に、この溶液を蒸留水で平衡化（pH3.5）
した陽イオン交換カラム60×1.5cm、Biorex70、50−100
メッシュ、Bio−Rad）に導入した。蒸留水でpH3.5、４
℃で溶出すると、副生成物を含有するFAD（0.22mmol、1
50ml中46.6％）とカラムでの分画中に生成した副生成物
（0.043mmol、100ml中8.9％）とである２つの画分が順
次得られた。純粋なＮ（１）−（２−アミノエチル）−
FAD（0.215mmol、1000ml中44.5％）は0.5MのLiCl（pH3.
5）で溶出した。
FADおよびＮ（１）−（２−アミノエチル）−FADの各
画分を減圧下で濃縮してそれぞれ5mlおよび10mlとし
た。それぞれ250mlの工業用エタノール中４℃で３回沈
澱させ次いで遠心分離してＮ（１）−（２−アミノエチ
ル）−FAD画分からLiClを除去した。このFAD画分とＮ
（１）−（２−アミノエチル）−FADとをそれぞれ10ml
の蒸留水中に溶解後に凍結乾燥し、NaOH上のデシケータ
ー中に４℃で保存した。
画分を減圧下で濃縮してそれぞれ5mlおよび10mlとし
た。それぞれ250mlの工業用エタノール中４℃で３回沈
澱させ次いで遠心分離してＮ（１）−（２−アミノエチ
ル）−FAD画分からLiClを除去した。このFAD画分とＮ
（１）−（２−アミノエチル）−FADとをそれぞれ10ml
の蒸留水中に溶解後に凍結乾燥し、NaOH上のデシケータ
ー中に４℃で保存した。
この分画の結果を次の表７にまとめて示す。
Ｎ（１）−（２−アミノエチル）−FADはニンヒドリ
ン（第１級アミノ基を有する）と陽性反応を示し、又紫
外線スペクトルにおいてFADおよびその誘導体に通常み
られるピークを450、373および262nmに示す。360nmで刺
激すると、明白な螢光が観察される。前記の薄層クロマ
トグラフィーでの溶出系においてRf値は0.138である。
ン（第１級アミノ基を有する）と陽性反応を示し、又紫
外線スペクトルにおいてFADおよびその誘導体に通常み
られるピークを450、373および262nmに示す。360nmで刺
激すると、明白な螢光が観察される。前記の薄層クロマ
トグラフィーでの溶出系においてRf値は0.138である。
B.N6−（２−アミノエチル）−FADの製造と精製 39μmolのＮ（１）−（２−アミノエチル）−FADを8.
3mlの蒸留水中に溶解して0.1NのLiOHでpH6.5に調整し
た。この溶液を40℃の温水浴に７時間保持した。この間
に0.1NのLiOHでpH値を調整した。（Ａ）と同様の薄層ク
ロマトグラフィーに付して、Ｎ（１）−（２−アミノエ
チル）−FADから２つの化合物、すなわちN6−（２−ア
ミノエチル）−FAD（Rf＝0.177）および1,N6−エタンア
デニン−FADと思われる化合物（Rf＝0.12）が生成して
いることが検出された。この処理液の組成を薄層クロマ
トグラフィーによる紫外線走査により測定した結果、35
％（13.5μmol）の1,N6−エタンアデニン−FADと65％
（25.5μmol）のN6−（２−アミノエチル）−FADとであ
った。
3mlの蒸留水中に溶解して0.1NのLiOHでpH6.5に調整し
た。この溶液を40℃の温水浴に７時間保持した。この間
に0.1NのLiOHでpH値を調整した。（Ａ）と同様の薄層ク
ロマトグラフィーに付して、Ｎ（１）−（２−アミノエ
チル）−FADから２つの化合物、すなわちN6−（２−ア
ミノエチル）−FAD（Rf＝0.177）および1,N6−エタンア
デニン−FADと思われる化合物（Rf＝0.12）が生成して
いることが検出された。この処理液の組成を薄層クロマ
トグラフィーによる紫外線走査により測定した結果、35
％（13.5μmol）の1,N6−エタンアデニン−FADと65％
（25.5μmol）のN6−（２−アミノエチル）−FADとであ
った。
この処理を減圧下で濃縮して4mlとした。pHを6.5に調
整後、この溶液を、蒸留水で平衡化（pH3.5）した陰イ
オン交換カラム（100×0.5cm、AG1X4、100〜200メッシ
ュ、Bio−Rad）中に４℃で導入した。蒸留水（pH3.5）
で溶出すると、最初に不明の分解生成物が溶出した（±
２μmol、５％）。次いで０〜0.2MのLiCl（pH3.5、500m
l/500ml）で傾斜溶離すると、N6−（２−アミノエチ
ル）−FAD（13.7μmol、400ml中53％）と1,N6−エタン
アデニン−FADと思われる化合物（5.6μmol、300ml中40
％）が順次溶出された。各２つの画分を減圧下に濃縮し
て4mlとし、そしてLiClを除去するためにこれを蒸留水
で平衡化したSephadex G10カラム（100×1cm）を通して
ゲルろ過した。
整後、この溶液を、蒸留水で平衡化（pH3.5）した陰イ
オン交換カラム（100×0.5cm、AG1X4、100〜200メッシ
ュ、Bio−Rad）中に４℃で導入した。蒸留水（pH3.5）
で溶出すると、最初に不明の分解生成物が溶出した（±
２μmol、５％）。次いで０〜0.2MのLiCl（pH3.5、500m
l/500ml）で傾斜溶離すると、N6−（２−アミノエチ
ル）−FAD（13.7μmol、400ml中53％）と1,N6−エタン
アデニン−FADと思われる化合物（5.6μmol、300ml中40
％）が順次溶出された。各２つの画分を減圧下に濃縮し
て4mlとし、そしてLiClを除去するためにこれを蒸留水
で平衡化したSephadex G10カラム（100×1cm）を通して
ゲルろ過した。
凍結乾燥後、両生成物をNaOH上のデシケーター中に４
℃で保存した。この分画の結果を次の表８にまとめて示
す。
℃で保存した。この分画の結果を次の表８にまとめて示
す。
UVスペクトルおよび最初のNMRデータによりN6−（２
−アミノエチル）−FAD化合物自体であることが確認さ
れた。この化合物はニンヒドリン（第１級アミノ基を含
有）と陽性反応をし、λmaxは266nmにあり、そしてUVス
ペクトルにおいてFADおよびその誘導体に特有のピーク
を450および373nmに示す。366nmで刺激すると明白な螢
光が観察される。
−アミノエチル）−FAD化合物自体であることが確認さ
れた。この化合物はニンヒドリン（第１級アミノ基を含
有）と陽性反応をし、λmaxは266nmにあり、そしてUVス
ペクトルにおいてFADおよびその誘導体に特有のピーク
を450および373nmに示す。366nmで刺激すると明白な螢
光が観察される。
C.実施例１ ポリエチレングリコールN6−（２−アミノエチル）−FA
Dの製造 BEG（MW20000）−N6−（２−アミノエチル）−FAD: Bueckmann等の方法（Makromol.Chem.182、1379−138
4、1981）により作ったＮ−ヒドロキシスクシンイミド
活性化カルボキシル化ポリエチレングリコール（分子量
20000、５μmol中10μmolの活性化のカルボキシル基含
有）100mgを、0.1NのNaOHでpHを7.2に調整して５μmol
のN6−（２−アミノエチル）−FADと一緒に1mlの蒸留水
中に溶解した。この混合物を室温でpH7.2〜7.3（pH調整
は0.1NのHCl又は0.1NのNaOHで行った）で１時間撹拌し
た。この反応混合物を蒸留水で平衡化したSephadex G50
カラム（0.5×60cm）を通して４℃でゲルろ過した。ポ
リエチレングリコール−N6−（２−アミノエチル）−FA
Dを含有する画分を濃縮して1.7mlとした。これはカップ
リング率40％でポリエチレングリコール（分子量2000
0）に結合したN6−（２−アミノエチル）−FAD（濃度1.
18mM）２μmolを含有している。
Dの製造 BEG（MW20000）−N6−（２−アミノエチル）−FAD: Bueckmann等の方法（Makromol.Chem.182、1379−138
4、1981）により作ったＮ−ヒドロキシスクシンイミド
活性化カルボキシル化ポリエチレングリコール（分子量
20000、５μmol中10μmolの活性化のカルボキシル基含
有）100mgを、0.1NのNaOHでpHを7.2に調整して５μmol
のN6−（２−アミノエチル）−FADと一緒に1mlの蒸留水
中に溶解した。この混合物を室温でpH7.2〜7.3（pH調整
は0.1NのHCl又は0.1NのNaOHで行った）で１時間撹拌し
た。この反応混合物を蒸留水で平衡化したSephadex G50
カラム（0.5×60cm）を通して４℃でゲルろ過した。ポ
リエチレングリコール−N6−（２−アミノエチル）−FA
Dを含有する画分を濃縮して1.7mlとした。これはカップ
リング率40％でポリエチレングリコール（分子量2000
0）に結合したN6−（２−アミノエチル）−FAD（濃度1.
18mM）２μmolを含有している。
D.実施例２ CH−セファロース4B−N6−（２−アミノエチル）−FAD
の製造 3mlの蒸留水に漬けた0.25gのCH−セファロース4B（ph
armacia社製、10−14μmolのカルボキシヘキシル基含
有）をガラスフリット上25mlの蒸留水で洗浄した。半乾
燥したCH−セファロース4Bを0.5mlの蒸留水中にけん濁
させ、100mg（520μmol）の１−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−３−エチルカルボジイミド−HClを加え
た。このけん濁液を室温で10分間保持した。（その際、
0.1NのNaOH又は0.1NのHClでpHを4.8〜5.0に調整し
た。）こうして活性化したCH−セファロース4Bを10mlの
蒸留水で１分間づつ２回洗浄し、そして2.1μmolのN6−
（２−アミノエチル）−FADを含有する水溶液0.5mlに加
えた。pHを4.6に調整（0.1NのNaOH又は0.1NのHClで）
後、このけん濁液を室温で16時間保持した。
の製造 3mlの蒸留水に漬けた0.25gのCH−セファロース4B（ph
armacia社製、10−14μmolのカルボキシヘキシル基含
有）をガラスフリット上25mlの蒸留水で洗浄した。半乾
燥したCH−セファロース4Bを0.5mlの蒸留水中にけん濁
させ、100mg（520μmol）の１−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−３−エチルカルボジイミド−HClを加え
た。このけん濁液を室温で10分間保持した。（その際、
0.1NのNaOH又は0.1NのHClでpHを4.8〜5.0に調整し
た。）こうして活性化したCH−セファロース4Bを10mlの
蒸留水で１分間づつ２回洗浄し、そして2.1μmolのN6−
（２−アミノエチル）−FADを含有する水溶液0.5mlに加
えた。pHを4.6に調整（0.1NのNaOH又は0.1NのHClで）
後、このけん濁液を室温で16時間保持した。
30mlの20％LiClと20mlの蒸留水で洗浄しそして蒸留水
中で沈降させると、1.75μmolのN6−（２−アミノエチ
ル）−FAD（濃度1.45mM）がカップリング率83％で結合
しているCH−セファロース4B−N6−（２−アミノエチ
ル）−FAD1.2mlが得られた。
中で沈降させると、1.75μmolのN6−（２−アミノエチ
ル）−FAD（濃度1.45mM）がカップリング率83％で結合
しているCH−セファロース4B−N6−（２−アミノエチ
ル）−FAD1.2mlが得られた。
参考文献 （１） Kosback,K.,“Advances in Enzymology",46,20
5−278（1978） （２） Wickmann,R.,Wandray,C.,Sackmann,A、Ｆ、お
よびKula,N.−R.,“Biotech.Bioeng.",23,2789−2802
（1981） （３） Lindberg,N.,Larsson,P.−O.,およびMosback,
K.,“Eur.J.Biochem.",40,187−193（1973） （４） Lowe,C.R.およびMosbach,K.,“Eur.J.Bioche
m.",49,511−520（1974） （５） ムラマツ,M.,ウラベ,I.,ヤマダ,Y.およびオカ
ダ,H.,“Eur.J.Biochem.",80,111−117（1977） （６） Zappelli,P.,Rossodivita,A.およびRe.L.,“Eu
r.J.Biochem.",54,475−482（1975） （７） Zappelli,P.,Pappa,R.,Rossodivita,A.およびR
e.L.,“Eur.J.Biochem.",72,309,315（1977） （８） Schmidt,H.L.およびGrenner,G.,“Eur.J.Bioch
em.",67,295−302（1976） （９） Weibei,M.K.,Fuller,C.W.,Stadel,J.M.,Bckm
ann,A.F.,Doyle,T.およびBrigth,M.T.,“Enzyme Engine
ering",2,203−208（1974） （10） ヨシカワ,M.,ゴトー,N.,イクラ,K.,ササキ,R.,
およびチバ,H.,“Atric.Biol.Chem.",46,207−213（198
2） （11） LeGoffic,F.,Sicaic,S.およびVincent,C.,“Eu
r.J.Biochem.",108,143−148（1980） （12） Fuller,C.W.,Rubin,J.R.およびBright,H.J.,
“Eur.J.Biochem.",103,421−430（1980） （13） Ｂckmann,A.F.,西独特許28,41,414（1979） （14） Ｂckmann,A.F.,Kula,N.R.,Wichmann,R.およ
びWandry,C.,“J.Appl.biochem.",3,301−315（1981） （15） ヤマザキ,Y.,およびマエダ,H.,“Agric.Biol.C
hem.",45,2631−2632（1981） （16） Zapelli,P.,Pappa,R.,Rossodivita,A.およびR
e.L., “Eur.J.Biochem.",89,491−499（1978） （17） Narashimhan,K.およびWingerd.L.B.,“Appl.Bi
ocwhem.Biotechn.",11,221−232（1985）
5−278（1978） （２） Wickmann,R.,Wandray,C.,Sackmann,A、Ｆ、お
よびKula,N.−R.,“Biotech.Bioeng.",23,2789−2802
（1981） （３） Lindberg,N.,Larsson,P.−O.,およびMosback,
K.,“Eur.J.Biochem.",40,187−193（1973） （４） Lowe,C.R.およびMosbach,K.,“Eur.J.Bioche
m.",49,511−520（1974） （５） ムラマツ,M.,ウラベ,I.,ヤマダ,Y.およびオカ
ダ,H.,“Eur.J.Biochem.",80,111−117（1977） （６） Zappelli,P.,Rossodivita,A.およびRe.L.,“Eu
r.J.Biochem.",54,475−482（1975） （７） Zappelli,P.,Pappa,R.,Rossodivita,A.およびR
e.L.,“Eur.J.Biochem.",72,309,315（1977） （８） Schmidt,H.L.およびGrenner,G.,“Eur.J.Bioch
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ann,A.F.,Doyle,T.およびBrigth,M.T.,“Enzyme Engine
ering",2,203−208（1974） （10） ヨシカワ,M.,ゴトー,N.,イクラ,K.,ササキ,R.,
およびチバ,H.,“Atric.Biol.Chem.",46,207−213（198
2） （11） LeGoffic,F.,Sicaic,S.およびVincent,C.,“Eu
r.J.Biochem.",108,143−148（1980） （12） Fuller,C.W.,Rubin,J.R.およびBright,H.J.,
“Eur.J.Biochem.",103,421−430（1980） （13） Ｂckmann,A.F.,西独特許28,41,414（1979） （14） Ｂckmann,A.F.,Kula,N.R.,Wichmann,R.およ
びWandry,C.,“J.Appl.biochem.",3,301−315（1981） （15） ヤマザキ,Y.,およびマエダ,H.,“Agric.Biol.C
hem.",45,2631−2632（1981） （16） Zapelli,P.,Pappa,R.,Rossodivita,A.およびR
e.L., “Eur.J.Biochem.",89,491−499（1978） （17） Narashimhan,K.およびWingerd.L.B.,“Appl.Bi
ocwhem.Biotechn.",11,221−232（1985）
Claims (8)
- 【請求項１】（ａ）NAD又はNADPをそのＮ（１）−位に
おいてエチレンイミンでアルキル化してＮ（１）−（２
−アミノエチル）−NAD又はＮ（１）−（２−アミノエ
チル）−NADPとし、 （ｂ）このアルキル化生成物をジムロ−（Dimroth）転
位に付してN6−（２−アミノエチル）−NAD又はN6−
（２−アミノエチル）−NADPとし、そして （ｃ）所望により（ａ）又は（ｂ）で得られた生成物を
それ自体公知の方法によりマクロ分子に共有結合させる
ことにより、N6−置換NAD又はNADPを製造するにあた
り、 （ｄ）ジムロ−転位の前の還元およびこれに相当する該
転位後の酸化を行なわないことを特徴とする、前記N6−
置換NAD又はNADPの製造方法。 - 【請求項２】該転位を水性媒体中で行う、特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】該転位をpH4〜９、特にpH5〜８で行う、特
許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 - 【請求項４】該転位を25〜75℃、特に40〜60℃の温度で
行う、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項５】（ａ）FADをそのＮ（１）−位においてエ
チレンイミンでアルキル化してＮ（１）−（２−アミノ
エチル）−FADとし、 （ｂ）このアルキル化生成物をジムロ−（Dimroth）転
位に付してN6−（２−アミノエチル）−FADとし、そし
て （ｃ）所望により（ａ）又は（ｂ）で得られた生成物を
それ自体公知の方法によりマクロ分子に共有結合させる
ことにより、N6−置換FADを製造するにあたり、 （ｄ）ジムロ−転位の前の還元およびこれに相当する該
転位後の酸化を行なわないことを特徴とする、前記N6−
置換FADの製造方法。 - 【請求項６】該転位を水性媒体中で行う、特許請求の範
囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】該転位をpH4〜９、特にpH5〜８で行う、特
許請求の範囲第５項又は第６項に記載の方法。 - 【請求項８】該転位を25〜75℃、特に40〜60℃の温度で
行う、特許請求の範囲第５項〜第７項のいずれか１項に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3617535.8 | 1986-05-24 | ||
| DE19863617535 DE3617535A1 (de) | 1986-05-24 | 1986-05-24 | Verfahren zur herstellung von n(pfeil hoch)6(pfeil hoch)-substituiertem nad oder nadp |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6333394A JPS6333394A (ja) | 1988-02-13 |
| JP2547327B2 true JP2547327B2 (ja) | 1996-10-23 |
Family
ID=6301583
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62124061A Expired - Fee Related JP2547327B2 (ja) | 1986-05-24 | 1987-05-22 | Ｎ▲上６▼−置換ｎａｄ、ｎａｄｐ又はｆａｄの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5399681A (ja) |
| EP (1) | EP0247537B1 (ja) |
| JP (1) | JP2547327B2 (ja) |
| DE (2) | DE3617535A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE3728772A1 (de) * | 1987-08-28 | 1989-03-09 | Hoechst Ag | Enzymreaktor mit polymerfixiertem cofaktor |
| WO2024088893A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-02 | Basf Se | Polyamide foams with high thermal stability |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2841414C2 (de) * | 1978-09-22 | 1980-04-03 | Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig | Verfahren zur Herstellung von an Makromoleküle gebundenen, ein Adeninringsystem enthaltenden Koenzymen |
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- 1986-05-24 DE DE19863617535 patent/DE3617535A1/de not_active Withdrawn
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-
1990
- 1990-01-24 US US07/469,760 patent/US5399681A/en not_active Expired - Fee Related
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