JPS6134002A - リガンド不動化担体物質 - Google Patents
リガンド不動化担体物質Info
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- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0087—Glucomannans or galactomannans; Tara or tara gum, i.e. D-mannose and D-galactose units, e.g. from Cesalpinia spinosa; Tamarind gum, i.e. D-galactose, D-glucose and D-xylose units, e.g. from Tamarindus indica; Gum Arabic, i.e. L-arabinose, L-rhamnose, D-galactose and D-glucuronic acid units, e.g. from Acacia Senegal or Acacia Seyal; Derivatives thereof
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- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
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- C08B37/0087—Glucomannans or galactomannans; Tara or tara gum, i.e. D-mannose and D-galactose units, e.g. from Cesalpinia spinosa; Tamarind gum, i.e. D-galactose, D-glucose and D-xylose units, e.g. from Tamarindus indica; Gum Arabic, i.e. L-arabinose, L-rhamnose, D-galactose and D-glucuronic acid units, e.g. from Acacia Senegal or Acacia Seyal; Derivatives thereof
- C08B37/0093—Locust bean gum, i.e. carob bean gum, with (beta-1,4)-D-mannose units in the main chain branched with D-galactose units in (alpha-1,6), e.g. from the seeds of carob tree or Ceratonia siliqua; Derivatives thereof
-
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
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- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0087—Glucomannans or galactomannans; Tara or tara gum, i.e. D-mannose and D-galactose units, e.g. from Cesalpinia spinosa; Tamarind gum, i.e. D-galactose, D-glucose and D-xylose units, e.g. from Tamarindus indica; Gum Arabic, i.e. L-arabinose, L-rhamnose, D-galactose and D-glucuronic acid units, e.g. from Acacia Senegal or Acacia Seyal; Derivatives thereof
- C08B37/0096—Guar, guar gum, guar flour, guaran, i.e. (beta-1,4) linked D-mannose units in the main chain branched with D-galactose units in (alpha-1,6), e.g. from Cyamopsis Tetragonolobus; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は特に、単に化学親和性クロマトグラフィー分析
にのみ用いられるのではない、リカン)−を不動化する
担体物質(Support material)に関す
る。
にのみ用いられるのではない、リカン)−を不動化する
担体物質(Support material)に関す
る。
(従来技術−バートA)
化学親和性クロマトグラフィー分析において、担体物質
は精製さ)するべき結合パー1−ナーにたいして化学親
和性を有するリガンドと該リカントに通常共有結合によ
り結合した不溶性7トリノクスから成る。例えば、蛋白
質Aは不溶性マトリックスに結合したIgGを有するカ
ラムて精製してもよい。
は精製さ)するべき結合パー1−ナーにたいして化学親
和性を有するリガンドと該リカントに通常共有結合によ
り結合した不溶性7トリノクスから成る。例えば、蛋白
質Aは不溶性マトリックスに結合したIgGを有するカ
ラムて精製してもよい。
種々のマトリックスが提案されているか、生物分子の精
製のためには、選択は比較的限られている。アガロース
は親水性、多孔質および安定であるためにしばしば用い
られるか、アガロースは高価で、例えば、CNBrによ
る活性化が蛋白質の結合に要求される。最近、ノリカッ
ト1ルツクスを有する担体物質が見直されてきた(オー
ルソン(SOhlson)およびグラフト(M 、 G
1ad)、「化学親和性クロマトグラフィーと生物学
的認識」、ニド(ed)・カイケン(chaiken)
、ウィルチx’)り(Wiichek)およびタリク−
(Darikh)、アカデミツク・プレス(A、 ca
demic P ress)ニューヨーク(JJewY
orkXI 983)、第241−250頁)。これら
の物質には前記文献の筆者も記載するように種々の欠点
を有する。
製のためには、選択は比較的限られている。アガロース
は親水性、多孔質および安定であるためにしばしば用い
られるか、アガロースは高価で、例えば、CNBrによ
る活性化が蛋白質の結合に要求される。最近、ノリカッ
ト1ルツクスを有する担体物質が見直されてきた(オー
ルソン(SOhlson)およびグラフト(M 、 G
1ad)、「化学親和性クロマトグラフィーと生物学
的認識」、ニド(ed)・カイケン(chaiken)
、ウィルチx’)り(Wiichek)およびタリク−
(Darikh)、アカデミツク・プレス(A、 ca
demic P ress)ニューヨーク(JJewY
orkXI 983)、第241−250頁)。これら
の物質には前記文献の筆者も記載するように種々の欠点
を有する。
「発明の要約」の記載かなければ、上記以外の従来技術
は明らかにはならないのて、従来技術の追加部分(パー
トB)は「発明の要約」の後に記載する。
は明らかにはならないのて、従来技術の追加部分(パー
トB)は「発明の要約」の後に記載する。
(発明の要約)
本発明はアガロース(そのいくつかの形態のものは大量
に市販されている。)とは全く異なるポリサッカライド
を用い、更にそれが不動化および活性化の両者によりア
ミン含角゛リカノドと極めて容易に反応し得る事実に基
ついてなされた。本発明において、ポリサッカライドは
多くのペンタッドまたは末端(非還元)D−ガラクトー
ス基を有する。これがD−ガラクトースオキノターセ酵
素(EC1,1,3,9)により活性化されに、アルデ
ヒド基か形成される。このアルデヒド基がアミン含有り
カントと反応し得る。ポリサッカライドを不動化するた
めには、それを架橋してもよく、また、本発明の特に何
州な態様では、ペンタッドまた(」末端D−ガラクトー
ス基のいくつかは予めl〕−ツノラクトースオギノダー
ゼにより酸化さね、次いでアミノ基含有マトリックスど
反応してもよい。使用される酵素の量は意識的に限定さ
A1、遊離の■)−ガラクト−ス基を別の酸化のために
残し、それらをリガンドとの反応のために活性化する。
に市販されている。)とは全く異なるポリサッカライド
を用い、更にそれが不動化および活性化の両者によりア
ミン含角゛リカノドと極めて容易に反応し得る事実に基
ついてなされた。本発明において、ポリサッカライドは
多くのペンタッドまたは末端(非還元)D−ガラクトー
ス基を有する。これがD−ガラクトースオキノターセ酵
素(EC1,1,3,9)により活性化されに、アルデ
ヒド基か形成される。このアルデヒド基がアミン含有り
カントと反応し得る。ポリサッカライドを不動化するた
めには、それを架橋してもよく、また、本発明の特に何
州な態様では、ペンタッドまた(」末端D−ガラクトー
ス基のいくつかは予めl〕−ツノラクトースオギノダー
ゼにより酸化さね、次いでアミノ基含有マトリックスど
反応してもよい。使用される酵素の量は意識的に限定さ
A1、遊離の■)−ガラクト−ス基を別の酸化のために
残し、それらをリガンドとの反応のために活性化する。
1つの観点において、本発明は一般式
%式%
[式中、GはD−ガラクトース残基を表わし、L I
Gはリガント残糸を表わし、Rは水素原子を表わす(但
し、L I GおよびRは共に同一のリガント分子の残
基を示す)] て表わされるペンダント基または末端基を有する不動化
ポリサッカライドを含有する担体物質を提供する。
Gはリガント残糸を表わし、Rは水素原子を表わす(但
し、L I GおよびRは共に同一のリガント分子の残
基を示す)] て表わされるペンダント基または末端基を有する不動化
ポリサッカライドを含有する担体物質を提供する。
好ましいポリサッカライドはD−ガラクト−D−マンナ
ンであって、[グアラン(guaran)、1としてグ
アーカムおよび後に記載する他の自然物質から入手でき
る。
ンであって、[グアラン(guaran)、1としてグ
アーカムおよび後に記載する他の自然物質から入手でき
る。
別の観点ては、本発明Ll:(a)ペンダントまたは末
端非還元−D−カラクトース残基を有するポリサッカラ
イドを不動化し、 (b) D−ガラクトースオキシダーゼによりD−ガラ
クトース残基中に存在する一CI−I 、OH基を酸化
することにより不動化ポリサッカライドを活性化し、そ
して (c)該活性化不動化ポリサッカライドを第1級または
第2級アミノ基を有するリガントと反応して、ノソフ塩
基(アル上′−イミンまたはアルド−イミニウムイオン
)を形成し、次いで還元剤によりノソフ塩基を還元する
ことからなる上記担体物質の製造方法を提供する。
端非還元−D−カラクトース残基を有するポリサッカラ
イドを不動化し、 (b) D−ガラクトースオキシダーゼによりD−ガラ
クトース残基中に存在する一CI−I 、OH基を酸化
することにより不動化ポリサッカライドを活性化し、そ
して (c)該活性化不動化ポリサッカライドを第1級または
第2級アミノ基を有するリガントと反応して、ノソフ塩
基(アル上′−イミンまたはアルド−イミニウムイオン
)を形成し、次いで還元剤によりノソフ塩基を還元する
ことからなる上記担体物質の製造方法を提供する。
3番目に、本発明は」−記担体物質の化学親和性クロマ
トグラフィー分析における用途を提供する。
トグラフィー分析における用途を提供する。
これは化学親和性クロマトグラフィーによる分析方法と
して表現され、該担体物質−にでリガント用の結合パー
トナ−をクロマトグラフィー分析することよりなる。
して表現され、該担体物質−にでリガント用の結合パー
トナ−をクロマトグラフィー分析することよりなる。
(従来技術の追加(バートB))
本発明において新規かつ進歩的なこと(J、アガロース
法から脱却し、その様な脱却か異なる種の水溶性ポリサ
ッカライドを不動化し、それにリカンド基を付加するこ
とによりどのようになされるのかという考えに基づいて
いる。使用される化学反応は公知あるいは公知方法に類
似する方法である。カーポハイドレート・リザーチ(c
arbohy−draLe Re5earcb) 81
、CI 0−CI 2(+ 980)にホール(L、D
:Hall)およびヤルパニ(MYalpani)には
D−ガラクト−D−マンナンの化学的誘導法を示した。
法から脱却し、その様な脱却か異なる種の水溶性ポリサ
ッカライドを不動化し、それにリカンド基を付加するこ
とによりどのようになされるのかという考えに基づいて
いる。使用される化学反応は公知あるいは公知方法に類
似する方法である。カーポハイドレート・リザーチ(c
arbohy−draLe Re5earcb) 81
、CI 0−CI 2(+ 980)にホール(L、D
:Hall)およびヤルパニ(MYalpani)には
D−ガラクト−D−マンナンの化学的誘導法を示した。
このポリサッカライドはアルデヒド基をペンダントD−
ガラクトース残基に導入するためにD−ガラクトースオ
キノダーセ(EC]、1.3.9)により酸化される。
ガラクトース残基に導入するためにD−ガラクトースオ
キノダーセ(EC]、1.3.9)により酸化される。
次いで得られたアルデヒド基をアミノ遊離ラジカル、4
−アミノ−2,2,6,6−チトラメヂルーピペリジノ
ー1−オギンルおよびノアノホウ水ナトリウムと反応し
、それによりアミンがアルデヒドのC−原子に共有結合
ずろ。その機構を以下に示す。
−アミノ−2,2,6,6−チトラメヂルーピペリジノ
ー1−オギンルおよびノアノホウ水ナトリウムと反応し
、それによりアミンがアルデヒドのC−原子に共有結合
ずろ。その機構を以下に示す。
OI
この方法によりニド【Jキノトラノカル基かカラクトマ
ンナンにイ」加され、それによIJ電子スピン共鳴によ
る分子実験のためにラベル化を行なう。
ンナンにイ」加され、それによIJ電子スピン共鳴によ
る分子実験のためにラベル化を行なう。
この文献の執筆者はこの方法を特定選択(アルデヒドと
反応するためのアミンの選択)の置換基の導入に用いら
れることは潜在的に記載しているか、彼等はそうケるこ
とによる実際的な目的は何ら開示しなかった。架橋する
ことにより[)−カラン1〜マンナンを不溶化すること
は、ロンクレノ(JLonngren)、ゴールドスタ
イン(1、、I 、GoldsL−ei n)およびパ
イウォータ・−(R、B ywaLer)による、フェ
ツス・レター(F ebs L etters)、68
、第31〜34頁(1976)ににり公知てあり、彼等
は化学親和性クロマトグラフィーによるある種のレクチ
ンの精製に架橋ククアランを用いた(ペクチンおよびα
−D−カラクトーピラノンル塙はロック−アント−キー
結合相互反応を示す)。酵素を不動化するために不溶性
マトリックスとしてのアミノプロピルガラスの使用がウ
ィートオール−(IIH、WeeLal l)により、
メソッド・イン・エノザイモロジー(Methods
in Enzymology) 44、第134〜14
B頁に提案されているが、この文献には、このガラスと
ポリサンカライドとの反応は何ら示唆されていない。
反応するためのアミンの選択)の置換基の導入に用いら
れることは潜在的に記載しているか、彼等はそうケるこ
とによる実際的な目的は何ら開示しなかった。架橋する
ことにより[)−カラン1〜マンナンを不溶化すること
は、ロンクレノ(JLonngren)、ゴールドスタ
イン(1、、I 、GoldsL−ei n)およびパ
イウォータ・−(R、B ywaLer)による、フェ
ツス・レター(F ebs L etters)、68
、第31〜34頁(1976)ににり公知てあり、彼等
は化学親和性クロマトグラフィーによるある種のレクチ
ンの精製に架橋ククアランを用いた(ペクチンおよびα
−D−カラクトーピラノンル塙はロック−アント−キー
結合相互反応を示す)。酵素を不動化するために不溶性
マトリックスとしてのアミノプロピルガラスの使用がウ
ィートオール−(IIH、WeeLal l)により、
メソッド・イン・エノザイモロジー(Methods
in Enzymology) 44、第134〜14
B頁に提案されているが、この文献には、このガラスと
ポリサンカライドとの反応は何ら示唆されていない。
多孔性ガラスをグリセリル残基ンで被覆し、該グリセリ
ル残基の近接する一〇H基を過沃素酸ナトリウムで酸化
し、該酸化担体を酵素、例えば、トリプシンで反応し、
次いで、得られたンッフ塩基をホウ水素化ナトリウムま
たはンアノポウ水素塩で還元することは公知であるLロ
ジャー(G、P。
ル残基の近接する一〇H基を過沃素酸ナトリウムで酸化
し、該酸化担体を酵素、例えば、トリプシンで反応し、
次いで、得られたンッフ塩基をホウ水素化ナトリウムま
たはンアノポウ水素塩で還元することは公知であるLロ
ジャー(G、P。
Royer)ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(B io−
chemical and Biophysical
Re5each Communi−cations)
64、第478〜484頁(1975)参照]。米国特
許第4.430,348号には同様の方法(こよりグル
コアミラーゼをセラミック担体に付加することが開示さ
れている。
ジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(B io−
chemical and Biophysical
Re5each Communi−cations)
64、第478〜484頁(1975)参照]。米国特
許第4.430,348号には同様の方法(こよりグル
コアミラーゼをセラミック担体に付加することが開示さ
れている。
アガロースを酵素ミニオイノシトボールオキノゲナーゼ
、即ち、種々のオリゴマー状態で存在する鉄含有酵素の
化学親和性クロマトグラフィーに用いるために変性する
試みがなされてきた。ジャーナル・オブ・クロマトグラ
フィー(Journal orChromatogra
phy) 2831第191〜+97頁(1984)に
、コラ−およびコラ−(F 、Kolllerand
E、Koller)は、アガロースを部分的に酸加水分
解し、得られた生成物をパーオキシダーゼおよびガラク
トースオキノターゼの混合物で酸化し、次いで酵素のク
ロマトグラフィーに用いることを開示している。このク
ロマトグラフィーはFe’“イオンの添加により十分に
作動する。しかしながら、リガントとアルデヒド基との
共有結合は何ら示唆されていない。
、即ち、種々のオリゴマー状態で存在する鉄含有酵素の
化学親和性クロマトグラフィーに用いるために変性する
試みがなされてきた。ジャーナル・オブ・クロマトグラ
フィー(Journal orChromatogra
phy) 2831第191〜+97頁(1984)に
、コラ−およびコラ−(F 、Kolllerand
E、Koller)は、アガロースを部分的に酸加水分
解し、得られた生成物をパーオキシダーゼおよびガラク
トースオキノターゼの混合物で酸化し、次いで酵素のク
ロマトグラフィーに用いることを開示している。このク
ロマトグラフィーはFe’“イオンの添加により十分に
作動する。しかしながら、リガントとアルデヒド基との
共有結合は何ら示唆されていない。
発明者により既知の上記文献は、本発明の幾つかの特徴
はそれ自体公知である旨を示唆するか、それは最初に本
発明のアイデアがあったから認識し得るものである。言
わば、従来技術の遡及的結合である。本発明者らの知識
によれば、り浦fiにガラクトマンナンを不動化し、化
学親和性クロマトグラフィーに用いるために変性するこ
とは誰によっても示唆されていない。
はそれ自体公知である旨を示唆するか、それは最初に本
発明のアイデアがあったから認識し得るものである。言
わば、従来技術の遡及的結合である。本発明者らの知識
によれば、り浦fiにガラクトマンナンを不動化し、化
学親和性クロマトグラフィーに用いるために変性するこ
とは誰によっても示唆されていない。
(好ましい実施例の開示)
簡単のために、ポリサッカライドとしてD−ガラクト−
D−マンナン(以下、単に「ガラクトマンナン」と言う
)を用いて本発明を説明する。しかしながら、(1−位
O−原子を通して他のノユガー残基と結合するものと異
なり)末端1−炭素原子と共に5−CH20Hが存在す
る遊離カラクトース基を有する他のポリサッカライドに
し本発明反応が適応されると理解されるへきである。
D−マンナン(以下、単に「ガラクトマンナン」と言う
)を用いて本発明を説明する。しかしながら、(1−位
O−原子を通して他のノユガー残基と結合するものと異
なり)末端1−炭素原子と共に5−CH20Hが存在す
る遊離カラクトース基を有する他のポリサッカライドに
し本発明反応が適応されると理解されるへきである。
他のその様なポリサッカライドの例としては、(1−4
)−β−グルカン骨格上にガラクトノルギノロノル側鎖
を宵するグルカンである「アミロイド]が挙げ、られ、
「エノサイクロピディア・オブ・プラント・フィジオロ
ノー(Encyclopedia ofP 1ant
P hysiology)j、ニューンリーズ、第13
A巻、ローウス(F 、 A 、 L oewus)お
よびタナ−(WT anner)による「プラント・カ
ーボハイドレイツ・1」、ストリンノヤー−バーラグ(
S trjnger −v erlag)、1982、
第430〜431頁に記載されている。
)−β−グルカン骨格上にガラクトノルギノロノル側鎖
を宵するグルカンである「アミロイド]が挙げ、られ、
「エノサイクロピディア・オブ・プラント・フィジオロ
ノー(Encyclopedia ofP 1ant
P hysiology)j、ニューンリーズ、第13
A巻、ローウス(F 、 A 、 L oewus)お
よびタナ−(WT anner)による「プラント・カ
ーボハイドレイツ・1」、ストリンノヤー−バーラグ(
S trjnger −v erlag)、1982、
第430〜431頁に記載されている。
ガラクトマンナンは通常、レグミノースアエ(L eg
uminoseae)種の種、特にファーカムから得ら
れる。またガラクトマンナンはi ii二物からも得ら
れるか、水溶性の植物性ガラクトマンナンか好ましい。
uminoseae)種の種、特にファーカムから得ら
れる。またガラクトマンナンはi ii二物からも得ら
れるか、水溶性の植物性ガラクトマンナンか好ましい。
種々のガラクトマンナンとその原料はプアー(1、C,
M、Dea)およびモリリン(Δ Morrison)
による「アトバノノズ・イノ・カーボハイトレイト・ケ
ミストリー・アンド・バイオケミストリーA(Adva
nces in Carbohydrate Chem
istry andBiochemistry)J 3
1巻、第241−312頁(1975)に記載されてい
る。ガラクト・マンナンはマンノース鎖を有し、該マン
ノース鎖の半分の残基に対しガラクトース基がマンノー
スの6−C−原子とガラクトースのI−C−原子を通し
て結合している。
M、Dea)およびモリリン(Δ Morrison)
による「アトバノノズ・イノ・カーボハイトレイト・ケ
ミストリー・アンド・バイオケミストリーA(Adva
nces in Carbohydrate Chem
istry andBiochemistry)J 3
1巻、第241−312頁(1975)に記載されてい
る。ガラクト・マンナンはマンノース鎖を有し、該マン
ノース鎖の半分の残基に対しガラクトース基がマンノー
スの6−C−原子とガラクトースのI−C−原子を通し
て結合している。
ガラクトマンナンの酵素酸化は式
%式%
に従って室温で容易に進行する。上記酸化で生成する過
酸化水素は禁止的な濃度の形成を防止するために除去さ
れることを要する。一般に除去はカタラーゼまたはペル
オキシダーゼの如き酵素によって行なってもよいが、電
気化学的に除去してもよい。酵素の変性に注意すれば、
所望により高温を用いて反応を行なってもよい。D−ガ
ラクトースオキシダーゼの里またはインキュヘーノヨン
の時間および温度はアルデヒド基か所望の割合で生成す
るよう調整される。
酸化水素は禁止的な濃度の形成を防止するために除去さ
れることを要する。一般に除去はカタラーゼまたはペル
オキシダーゼの如き酵素によって行なってもよいが、電
気化学的に除去してもよい。酵素の変性に注意すれば、
所望により高温を用いて反応を行なってもよい。D−ガ
ラクトースオキシダーゼの里またはインキュヘーノヨン
の時間および温度はアルデヒド基か所望の割合で生成す
るよう調整される。
使用し得るリガンドアミンは適当なりガツト残基をイ」
加する手段を提供し得る如何なる第1級ま′たは第2級
アミンであってもよい。従って、酸化されたガラクトマ
ンナンは式LIG−NH2または、 LIG−N−H [式中、LIGおよびRは前記の通り。]を有する第1
級または第2級アミンであるリガンドと反応させる。上
記定義中、rLIGJは化学親和性クロマトグラフィー
に有用な方法でそのLIG残基と相互作用する他の分子
に対し特定の結合作用を有する分子残基を意味する。活
性化されたガラクトマンナン」二に所望の結合作用は有
するか必要とするアミン基の欠如した分子を導入するに
は、まず該分子をアミン爪を提供する基と反応すると理
解される。例えば、その様な基を何する分子をアルキレ
ンジアミンと反応させることにより、アミン末端基を提
供する。得られたアミノ−末端分子を式’LIG−NH
2または LIG−NH と見なされる。
加する手段を提供し得る如何なる第1級ま′たは第2級
アミンであってもよい。従って、酸化されたガラクトマ
ンナンは式LIG−NH2または、 LIG−N−H [式中、LIGおよびRは前記の通り。]を有する第1
級または第2級アミンであるリガンドと反応させる。上
記定義中、rLIGJは化学親和性クロマトグラフィー
に有用な方法でそのLIG残基と相互作用する他の分子
に対し特定の結合作用を有する分子残基を意味する。活
性化されたガラクトマンナン」二に所望の結合作用は有
するか必要とするアミン基の欠如した分子を導入するに
は、まず該分子をアミン爪を提供する基と反応すると理
解される。例えば、その様な基を何する分子をアルキレ
ンジアミンと反応させることにより、アミン末端基を提
供する。得られたアミノ−末端分子を式’LIG−NH
2または LIG−NH と見なされる。
LIGおよびR基か共にリガンドの残基である場合、そ
れらは全く独立の残基であってらよく、また両残暴によ
り環を形成してもよL)。
れらは全く独立の残基であってらよく、また両残暴によ
り環を形成してもよL)。
好ましくはリガントは酸化されたガラクトマンナンのア
ルデヒド基に対してアミノ基かモル過剰に用いられる。
ルデヒド基に対してアミノ基かモル過剰に用いられる。
好ましくはリガントは、生物学的分子、例えば、抗原、
抗体、イムノグロブリン、メタホライト、酵素血清蛋白
、DNAまたはオリゴヌクレオヂドか挙げられる。使用
し得る酵素の例としてはラクテートデバイトロゲナーゼ
、インバーターゼおよびβ−グルコンダーセか挙げられ
る。2またはそれ以上の異なるリガンドを1つのガラク
トマンナン分子に加えてムよい。ソノダル−ストランデ
イノ1” D N Aはアデニンヘースの6−アミノ基
により結合され得る。
抗体、イムノグロブリン、メタホライト、酵素血清蛋白
、DNAまたはオリゴヌクレオヂドか挙げられる。使用
し得る酵素の例としてはラクテートデバイトロゲナーゼ
、インバーターゼおよびβ−グルコンダーセか挙げられ
る。2またはそれ以上の異なるリガンドを1つのガラク
トマンナン分子に加えてムよい。ソノダル−ストランデ
イノ1” D N Aはアデニンヘースの6−アミノ基
により結合され得る。
アルデヒド基とアミンとの反応により、シッフ塩基、好
ましくは部分式 %式% を有するシッフ塩基が生しる。いずれにしても、反応生
成物は還元剤、例えば、ソアノポウ水素ナトリウムによ
る還元を必要とし、結果として所望の生成物に好ましい
反応平行になる。
ましくは部分式 %式% を有するシッフ塩基が生しる。いずれにしても、反応生
成物は還元剤、例えば、ソアノポウ水素ナトリウムによ
る還元を必要とし、結果として所望の生成物に好ましい
反応平行になる。
化学親和性クロマトグラフィーに用いられる結合パート
ナ−は適当に選択される。例えば活性化ガラクトマンナ
ン上でアくンセロトニンを不動化し、ノイラミン酸また
はその誘導体の精製に用いられる。また蛋白Aを不動化
し、IgGの精製に用いてしよい(逆に用いてもよい)
。不動化抗原はその抗体−の精製に有用であり、また逆
に用いてもよい。種々の酵素をカラン)・マンナノに結
合(conコugate) してもよい。
ナ−は適当に選択される。例えば活性化ガラクトマンナ
ン上でアくンセロトニンを不動化し、ノイラミン酸また
はその誘導体の精製に用いられる。また蛋白Aを不動化
し、IgGの精製に用いてしよい(逆に用いてもよい)
。不動化抗原はその抗体−の精製に有用であり、また逆
に用いてもよい。種々の酵素をカラン)・マンナノに結
合(conコugate) してもよい。
結合したパートナ−(リケード)を常套のケルフィルト
レーノヨンを含む種々の方法により固定リヵンドから回
収してもよい。
レーノヨンを含む種々の方法により固定リヵンドから回
収してもよい。
ガラクトマンナンを固体マトリックスに対し物理的、化
学的(好ましくは、化学的)または一部分物理的/一部
分化学的に接触する接触子あるいは、ガラクトマンナン
のマトリックスを形成することにより不動化してもよい
。本発明の一態様においては、ガラクトマンナンをD−
ガラクトースオキシダーゼと反応して、有効な−CH2
0R基の一部分だ1プを酸化し、これを用いてガラクト
マンナンをペンダント第1級または第2級アミノ基、例
えばアミノプロピル、 (cH2)3NI−12基を有
するマトリックス物質に結合してもよい。ノリヶート、
例えば、アミツブ〔7ビル基を有するコントロールボア
ークラスまたは多孔質珪藻土を用いてもよい。カップリ
ングの結果としてシッフ塩基が生成し、これを好ましく
は、例えばンアノホウ水素ナトリウムで還元し、l)H
の変化に対しより高い安定性を有する結合を提供する。
学的(好ましくは、化学的)または一部分物理的/一部
分化学的に接触する接触子あるいは、ガラクトマンナン
のマトリックスを形成することにより不動化してもよい
。本発明の一態様においては、ガラクトマンナンをD−
ガラクトースオキシダーゼと反応して、有効な−CH2
0R基の一部分だ1プを酸化し、これを用いてガラクト
マンナンをペンダント第1級または第2級アミノ基、例
えばアミノプロピル、 (cH2)3NI−12基を有
するマトリックス物質に結合してもよい。ノリヶート、
例えば、アミツブ〔7ビル基を有するコントロールボア
ークラスまたは多孔質珪藻土を用いてもよい。カップリ
ングの結果としてシッフ塩基が生成し、これを好ましく
は、例えばンアノホウ水素ナトリウムで還元し、l)H
の変化に対しより高い安定性を有する結合を提供する。
少なくとも力ラクトース残基上の残存−CH7OHのい
くつかをD−ガラクトースオキノターセで反応し、」−
述の如きリカンドに対しカップリンクするためアルデヒ
ド基を形成する。
くつかをD−ガラクトースオキノターセで反応し、」−
述の如きリカンドに対しカップリンクするためアルデヒ
ド基を形成する。
上記反応は逆に行なってもよく、即ち、リカントに対す
るカップリングを最初に行ない、次いでガラクトマンナ
ンを酸化し、マトリックスに対し生成物をカップリング
または架橋してもよい。
るカップリングを最初に行ない、次いでガラクトマンナ
ンを酸化し、マトリックスに対し生成物をカップリング
または架橋してもよい。
アミノ基か基本的なマトリックス物質上に与えられる必
要は必ずしもない。例えばアクリルポリマーに存在する
如き、カルホキシル基を含有する基本マトリックスをア
ミン官能基を提供する反応試薬と反応してもよい。無機
酸化物、例えば、珪素、アルミニウムおよびチタンの酸
化物または水酸化物である基本マトリックスをそれ自体
公知の方法により変性して、ペンダントアミノ基、例え
ばアミノプロピル基を導入してしよい。また、゛基本マ
トリックスにアミノ基を含有オろ補助物質に物理的に吸
着または吸収させろことにより導入し、次いでガラクト
マンナンを補助物質のアミノ基に化学的に結合してもよ
い。好ましくは補助物質は蛋白質、特にBSΔである。
要は必ずしもない。例えばアクリルポリマーに存在する
如き、カルホキシル基を含有する基本マトリックスをア
ミン官能基を提供する反応試薬と反応してもよい。無機
酸化物、例えば、珪素、アルミニウムおよびチタンの酸
化物または水酸化物である基本マトリックスをそれ自体
公知の方法により変性して、ペンダントアミノ基、例え
ばアミノプロピル基を導入してしよい。また、゛基本マ
トリックスにアミノ基を含有オろ補助物質に物理的に吸
着または吸収させろことにより導入し、次いでガラクト
マンナンを補助物質のアミノ基に化学的に結合してもよ
い。好ましくは補助物質は蛋白質、特にBSΔである。
また、ガラクトマンナンをアミンと反応し、マトリック
スに付加するための官能基を導入してもよい。いすノ1
の場合においても、本明細書の定義の目的において、反
応残基は71〜リノクス残暴の一部であると見tJ−さ
れる。従って便宜的には、ボリザノ力ライト:J式%式
% [式中、G′はポリザノカライト」二の別のペンダント
または末端D−カラクトース残基を示し、MATはマト
リックス残基を示し、Rは水素原子を示す(但し、MA
Tおよびr(は兵にマI・リークス残基である)(注:
前出のRおよびL I G定義に似ているが、Rおよび
MATか同一の一個の分子の一部である必要はない)]
を有する基によりマトリックスと結合したものと定義さ
れる。従って、マトリックスがアミノプロピル基を有す
る場合、−NR−基(」アミノプロピル基の−N 1−
1−残基てあり、−(cH2)、−結合はマトリックス
残基MATの一部である。
スに付加するための官能基を導入してもよい。いすノ1
の場合においても、本明細書の定義の目的において、反
応残基は71〜リノクス残暴の一部であると見tJ−さ
れる。従って便宜的には、ボリザノ力ライト:J式%式
% [式中、G′はポリザノカライト」二の別のペンダント
または末端D−カラクトース残基を示し、MATはマト
リックス残基を示し、Rは水素原子を示す(但し、MA
Tおよびr(は兵にマI・リークス残基である)(注:
前出のRおよびL I G定義に似ているが、Rおよび
MATか同一の一個の分子の一部である必要はない)]
を有する基によりマトリックスと結合したものと定義さ
れる。従って、マトリックスがアミノプロピル基を有す
る場合、−NR−基(」アミノプロピル基の−N 1−
1−残基てあり、−(cH2)、−結合はマトリックス
残基MATの一部である。
便宜」二、酸化されたガラクトマンナンはマトリックス
のアミノ基に対してアルデヒド基か過剰になるように用
いる。
のアミノ基に対してアルデヒド基か過剰になるように用
いる。
別の態様においては、架橋、例えは、エポキノ架橋がガ
ラクトマンナン中に形成される。エビクロロヒドリンか
架橋を導入する有用な試薬であり、上記文献から公知の
方法により導入される。他の架橋試薬はジビニルスルホ
ンである。
ラクトマンナン中に形成される。エビクロロヒドリンか
架橋を導入する有用な試薬であり、上記文献から公知の
方法により導入される。他の架橋試薬はジビニルスルホ
ンである。
本発明を以下の実施例に基づいて説明する。
寒檄咋
実施例1
り゛アー(ノアモプンステトラゴノし、・\(す町mo
psis TeLragonoloba))の市販品を
エタノール沈澱により精製した。力l・の1%(w/v
)溶液を前記グアーを湿潤するのに必要とするエタノー
ルの最も少ない量を添加し、グアーを2時間放置し、次
いで強攪拌子に蒸留水を加えることにより調製した。次
いで、得られた溶液を攪拌下に90°Cで30分加熱(
7た。冷却後、不溶性物質を10分間の遠心分離(70
00g)により除去しノー6.1−澄み液を50%(W
/V)エタノールに添加し、白い沈澱物をハスリンを通
過させることにより回収した。
psis TeLragonoloba))の市販品を
エタノール沈澱により精製した。力l・の1%(w/v
)溶液を前記グアーを湿潤するのに必要とするエタノー
ルの最も少ない量を添加し、グアーを2時間放置し、次
いで強攪拌子に蒸留水を加えることにより調製した。次
いで、得られた溶液を攪拌下に90°Cで30分加熱(
7た。冷却後、不溶性物質を10分間の遠心分離(70
00g)により除去しノー6.1−澄み液を50%(W
/V)エタノールに添加し、白い沈澱物をハスリンを通
過させることにより回収した。
lit物を96%エタノールとン」−デルエーテルによ
り洗浄し、室温で乾燥した。
り洗浄し、室温で乾燥した。
(2)架橋によるガラクトマンナンの不動化段階(1)
から得られた精製グアーカム(10!/)を激しい攪拌
下に水酸化すトリウノ、(1,49)を含む20%(v
/v)プロパン−2−オール(200xC)に添加した
。混合物を窒素で1時間還流し、次いでエビクロロヒド
リン(1,5y)を添加した。次いで、グアーガムを振
盪ウォーターハス中で40℃16時間インキュベートし
、次いで更に60°C8時間インキュベートした。得ら
れた架橋グアーガム(cL−グアー)を塩酸でpH7に
し、プリンタで計量した1(!中に@濁した。懸濁およ
び沈澱により巨大粒子と微細粒子を除去した。次いで、
CL−グアーを凍結乾燥し乾燥状態に保持した。
から得られた精製グアーカム(10!/)を激しい攪拌
下に水酸化すトリウノ、(1,49)を含む20%(v
/v)プロパン−2−オール(200xC)に添加した
。混合物を窒素で1時間還流し、次いでエビクロロヒド
リン(1,5y)を添加した。次いで、グアーガムを振
盪ウォーターハス中で40℃16時間インキュベートし
、次いで更に60°C8時間インキュベートした。得ら
れた架橋グアーガム(cL−グアー)を塩酸でpH7に
し、プリンタで計量した1(!中に@濁した。懸濁およ
び沈澱により巨大粒子と微細粒子を除去した。次いで、
CL−グアーを凍結乾燥し乾燥状態に保持した。
(3)CL−ガラクトマンナンの活性化CL−グアー(
259)をpH7、0の0.1M燐酸塩緩衝液(125
靜)中で25℃ 24時間でカラクト−スオキンターゼ
(50U)およびカタラーゼ(10000tJ)で酸化
した。酸化後、CL−グアーを20mM重炭酸ナトリウ
ム(2Os&)で洗浄し、燐酸ナトリウム緩衝液中で0
.1Mにした。
259)をpH7、0の0.1M燐酸塩緩衝液(125
靜)中で25℃ 24時間でカラクト−スオキンターゼ
(50U)およびカタラーゼ(10000tJ)で酸化
した。酸化後、CL−グアーを20mM重炭酸ナトリウ
ム(2Os&)で洗浄し、燐酸ナトリウム緩衝液中で0
.1Mにした。
段階(3)からの酸化されたCL−グアーに0゜1M燐
酸ナトリウム緩衝液pH7,0(12,5酎)中でセロ
トニン(50πg)およびシアノホウ水素ナトリウム(
24ff@)を加え、36時時間光を進行させた。次い
で生成物を段階(3)に記載の如く洗浄した。
酸ナトリウム緩衝液pH7,0(12,5酎)中でセロ
トニン(50πg)およびシアノホウ水素ナトリウム(
24ff@)を加え、36時時間光を進行させた。次い
で生成物を段階(3)に記載の如く洗浄した。
段階(4)からのりカント−保持担体をプリンタ、/<
レル(syringe barrel)に挿入し、約2
戚のヘッド容積を得た。クロマトクラ“フィー分析を6
0mM燐酸す)・リウム緩衝ecpl−17,Oの出発
緩衝液中で純粋フェツインを用いて実施した。カラムの
結合能は2mgフェツインであった。OD、s。
レル(syringe barrel)に挿入し、約2
戚のヘッド容積を得た。クロマトクラ“フィー分析を6
0mM燐酸す)・リウム緩衝ecpl−17,Oの出発
緩衝液中で純粋フェツインを用いて実施した。カラムの
結合能は2mgフェツインであった。OD、s。
か0になるまで溶出を続けた。この際、フェツインは1
M塩化すl・リウムを含む出発緩衝液で溶出した。
M塩化すl・リウムを含む出発緩衝液で溶出した。
カラムに対する蛋白質の非特異的結合を牛の血清アルミ
ン(+Ozg)を用いて測定し、1007Bの量でフェ
ツインで溶出したことか解った。7Jツイン含有フラク
ノヨンは280nmの吸光度を有し、ノアリン酸呈色を
示した。
ン(+Ozg)を用いて測定し、1007Bの量でフェ
ツインで溶出したことか解った。7Jツイン含有フラク
ノヨンは280nmの吸光度を有し、ノアリン酸呈色を
示した。
実施例2
0−カスト・ヒーノ(セラトニア・7リクア(cera
Lonia 1環l胆))カムを用いて実施例1の段階
(1)を繰り返した。プロパン−2=オールの350z
ρを200i(jの代わりに用いる以外は段階(2)を
繰り返した。
Lonia 1環l胆))カムを用いて実施例1の段階
(1)を繰り返した。プロパン−2=オールの350z
ρを200i(jの代わりに用いる以外は段階(2)を
繰り返した。
■凱
タラ(カエスルピニア・スピノザ(caesull)i
niaspinosa))カムを出発物質として用いて
実施例2を繰り返した。
niaspinosa))カムを出発物質として用いて
実施例2を繰り返した。
害施例4
実施例Iの段階(3)を2倍のスケールで繰り返した。
ヒトノT gG(50mg)ノ0 、1 M燐酸塩緩衝
液pH7,0(25靜)およびシアノホウ水素ナトリウ
ム(47Ry)を加え、48時時間先を実施した。次い
で生成物を実施例1の段階(3)に記載の如く洗浄した
。より好ましい洗浄方法を実施例8に記載する。
液pH7,0(25靜)およびシアノホウ水素ナトリウ
ム(47Ry)を加え、48時時間先を実施した。次い
で生成物を実施例1の段階(3)に記載の如く洗浄した
。より好ましい洗浄方法を実施例8に記載する。
純粋な蛋白質A(ングマ5 mg)を上記のように調製
したrgGカップルド担体のシリンジバレルカラムC2
mQヘット容積)でクロマトグラフィー分析した。出発
緩衝液は0.1M燐酸ナトリウム−〇、25M NaC
0,pHs、oであった。溶出を0D28oか0になる
まで継続した。この場合、蛋白質Δは0.1M グリン
ン緩衝液p)(2、5で溶出された。このカラムの能力
は少なくとし 5Mg蛋白質Aである。更に吸収物質を
l lvi塩化ナトリウムで除去し、カラムを再生した
。
したrgGカップルド担体のシリンジバレルカラムC2
mQヘット容積)でクロマトグラフィー分析した。出発
緩衝液は0.1M燐酸ナトリウム−〇、25M NaC
0,pHs、oであった。溶出を0D28oか0になる
まで継続した。この場合、蛋白質Δは0.1M グリン
ン緩衝液p)(2、5で溶出された。このカラムの能力
は少なくとし 5Mg蛋白質Aである。更に吸収物質を
l lvi塩化ナトリウムで除去し、カラムを再生した
。
牛の血清アルブミンの非特異的結合は検出されなかった
。蛋白質Aは各フラクノジン中でIgG中へのロ゛−レ
ルロケソトイムノー電気泳動により探知した。
。蛋白質Aは各フラクノジン中でIgG中へのロ゛−レ
ルロケソトイムノー電気泳動により探知した。
実施例5
(1)ガラクトマンナンの11岡−
精製グアーカムを実施例1の段階(1)から得た。
歿佳旭
アミノプロピル−CPGを3−アミノプロピル−l−リ
エトギンンランおよび700人孔径(200〜400メ
ソツユ)CPGおよびウイートオール(H、H、Wee
tal l)によるメソッド・イン・エンザイモロジー
(Methods in Enzymology)、4
4、第134〜+48頁に記載の水性法を用いて調製し
た。
エトギンンランおよび700人孔径(200〜400メ
ソツユ)CPGおよびウイートオール(H、H、Wee
tal l)によるメソッド・イン・エンザイモロジー
(Methods in Enzymology)、4
4、第134〜+48頁に記載の水性法を用いて調製し
た。
段階(+)からの精製ファーガム(0,29)をガラク
トースオキシダーゼ(50U)およびカタラーゼ(10
0OOU)を加えて0.1.M燐酸ナトリウム緩衝液1
)87 、0 (50m(1)中で4時間25°Cて酸
化した。次いで溶液を5時間100°Cに加熱し、冷却
した。アミノプロピル−C1)G(19)をシアノホウ
水素ナトリウム(lofRg)と共に加えた。
トースオキシダーゼ(50U)およびカタラーゼ(10
0OOU)を加えて0.1.M燐酸ナトリウム緩衝液1
)87 、0 (50m(1)中で4時間25°Cて酸
化した。次いで溶液を5時間100°Cに加熱し、冷却
した。アミノプロピル−C1)G(19)をシアノホウ
水素ナトリウム(lofRg)と共に加えた。
還元を25℃で36時間継続し、その後CPG−ガラク
トマンナン結合体を20mM酢酸ナトリウムpH4,5
(50xC)、1M塩化ナトリウム(50aQ)、20
mM重炭酸ナトリウム(50Iρ)で洗浄し、0.1M
燐酸塩緩衝溶液に戻した。生成物を「Sl−ガラクトマ
ンナン」とした。
トマンナン結合体を20mM酢酸ナトリウムpH4,5
(50xC)、1M塩化ナトリウム(50aQ)、20
mM重炭酸ナトリウム(50Iρ)で洗浄し、0.1M
燐酸塩緩衝溶液に戻した。生成物を「Sl−ガラクトマ
ンナン」とした。
(3)Si−ガラクトマンナンの活性化前記のごとく調
製した81−ガラクトマンナンのO,1M燐酸塩緩衝溶
液pH7,0(50酎)をガラクトースオキシダーゼ(
50U)およびカタラーゼ(100OOU)で25℃8
時間処理し、実施例1の段階(3)に記載の如く洗浄し
た。
製した81−ガラクトマンナンのO,1M燐酸塩緩衝溶
液pH7,0(50酎)をガラクトースオキシダーゼ(
50U)およびカタラーゼ(100OOU)で25℃8
時間処理し、実施例1の段階(3)に記載の如く洗浄し
た。
(4)活性化St−ガラクトマノナン)例」又(兜椿企
次いで活性化S1−ガラクトマンナンをOIM燐酸塩緩
衝液pI(7,0(20aQ)中てヒトのIgG(30
m9)とシアノホウ水素ナトリウム(38Ug)と48
時間反応し、実施例1の段階(3)に記載の如く洗浄し
た。得られたIgG−保持担体は実施例1の段階(5)
の方法により蛋白質Aを精製するのに有用である。
衝液pI(7,0(20aQ)中てヒトのIgG(30
m9)とシアノホウ水素ナトリウム(38Ug)と48
時間反応し、実施例1の段階(3)に記載の如く洗浄し
た。得られたIgG−保持担体は実施例1の段階(5)
の方法により蛋白質Aを精製するのに有用である。
への結合
St−ガラクトマンナン(lI?)を実施例5の段階(
2)および(3)の如く調製した。次いで、活性化S1
−ガラクトマンナン(1g)をO,1M燐酸すl・リウ
ム緩衝液pH7,0(20好)中で48時間にわたって
β−グルコシダーゼ(EC3,2,1,21)(30g
)およびシアノホウ水素ナトリウム(38xy)で反応
し、実施例1の段階(3)の如く洗浄した。
2)および(3)の如く調製した。次いで、活性化S1
−ガラクトマンナン(1g)をO,1M燐酸すl・リウ
ム緩衝液pH7,0(20好)中で48時間にわたって
β−グルコシダーゼ(EC3,2,1,21)(30g
)およびシアノホウ水素ナトリウム(38xy)で反応
し、実施例1の段階(3)の如く洗浄した。
全ての洗浄物をプールし、25mM酢酸ナトリウムl)
H5、Oに対して透析し、β−グルコンダーゼ活性を測
定した。
H5、Oに対して透析し、β−グルコンダーゼ活性を測
定した。
結合β−グルコンダーゼの活性
lユニットの酵素活性=IμMのp−ニトロフェノール
が37℃で1分間にっきp−ニトロフェノール−β−ゲ
ルコツトから放出された。
が37℃で1分間にっきp−ニトロフェノール−β−ゲ
ルコツトから放出された。
β−グルコシダーゼ活性を0.25M酢酸ナトリウムp
I(5,0(0,l1Q)とp−=トロフェノール−β
−ゲルコントC2yng/m(lの0 、8 +aQ)
)中で既知量の懸濁液(0゜1mcまて)中の担体を用
いて37°Cて測定した。アリコート(0,1m(りを
30秒間隔で除去し、0.25M グ’)’yンpl(
10,0(3,91)に加えると、400nmの吸収を
示した。
I(5,0(0,l1Q)とp−=トロフェノール−β
−ゲルコントC2yng/m(lの0 、8 +aQ)
)中で既知量の懸濁液(0゜1mcまて)中の担体を用
いて37°Cて測定した。アリコート(0,1m(りを
30秒間隔で除去し、0.25M グ’)’yンpl(
10,0(3,91)に加えると、400nmの吸収を
示した。
(a)全ての洗浄物およびSl−カラクトマンナンへの
結合物中の酵素活性の回復は出発ユニットの85%であ
った。
結合物中の酵素活性の回復は出発ユニットの85%であ
った。
(b)出発混合物は120Uのβ−グルコシダーゼを含
有し、その7 、7 Uh<S i−ガラクトマンナン
(1g)ニ結合し、94Uが洗浄物中にあることがわか
った。
有し、その7 、7 Uh<S i−ガラクトマンナン
(1g)ニ結合し、94Uが洗浄物中にあることがわか
った。
(c)25mM酢酸ナトリウム緩衝t&pH5,0中で
20°C39日後、Sl−カラクトマンナンに結合した
β−グルコシダーゼは72%の活性を保持した。
20°C39日後、Sl−カラクトマンナンに結合した
β−グルコシダーゼは72%の活性を保持した。
寒施童]
β〜タルコンタヘセ川用Jラフ上/ノナノへの結合
0.1M燐酸ナトリウム緩衝液pH7,0(125II
INりに存在する実施例1の段階(3)から得た酸化C
L−ガラクトマンナンに、β−グルコシダーゼ(EC3
,2,I 、21)(2511g)およびシアノホウ水
素ナトリウム(24R9)を添加し、還元を48時時間
待した。次いで生成物を実施例1の段階(3)のように
洗浄し、洗浄物をプールし、25mM酢酸ナトリウム緩
衝液pH1=対して透析し、β−グルコシダーゼ活性を
測定した。
INりに存在する実施例1の段階(3)から得た酸化C
L−ガラクトマンナンに、β−グルコシダーゼ(EC3
,2,I 、21)(2511g)およびシアノホウ水
素ナトリウム(24R9)を添加し、還元を48時時間
待した。次いで生成物を実施例1の段階(3)のように
洗浄し、洗浄物をプールし、25mM酢酸ナトリウム緩
衝液pH1=対して透析し、β−グルコシダーゼ活性を
測定した。
結合β−グルコンダーゼの活泄
(a)カップリング結合に使用した条件下でβ−グルコ
シダーゼの照査実験で48時間にわjJって初期の酵素
g性と比べて、ノアノホウ水素ナトリウムの存在または
不存在下に(実施例6の如き測定した)β〜グルコンダ
ーゼ活性の損失はなかった。
シダーゼの照査実験で48時間にわjJって初期の酵素
g性と比べて、ノアノホウ水素ナトリウムの存在または
不存在下に(実施例6の如き測定した)β〜グルコンダ
ーゼ活性の損失はなかった。
(b)洗浄物および担体への結合物中の酵素活性の回復
は最初のユニットの80%であった。
は最初のユニットの80%であった。
(c)出発混合物は175Uのβ−クルコノダーゼを含
有し、その134Uか洗浄物中に見られ、6UかCL−
ガラクトマンナン(250I1g)にカップリングした
。
有し、その134Uか洗浄物中に見られ、6UかCL−
ガラクトマンナン(250I1g)にカップリングした
。
(d)25mM酢酸ナトリウム pH5,0中で20℃
において24日経過後、CL−ガラクトマンナンへ結合
したβ−グルコノダーゼは75%の活性を保持した。
において24日経過後、CL−ガラクトマンナンへ結合
したβ−グルコノダーゼは75%の活性を保持した。
実施例8
(+)4之りトマンナンの精製
精製グアーマンナンを実施例1の段階(1)から得た。
(2)ガラクトマンナンのコントロールボアーガかへの
共有付力町 この方法は蛋白質(牛の血清アルジミン)のコントロー
ルポアーガラス(cPG)への安定吸着および酸化され
たガラクトマンナンを蛋白質−CPGマトリックスへ結
合するために蛋白質の遊離アミノ基を利用する。
共有付力町 この方法は蛋白質(牛の血清アルジミン)のコントロー
ルポアーガラス(cPG)への安定吸着および酸化され
たガラクトマンナンを蛋白質−CPGマトリックスへ結
合するために蛋白質の遊離アミノ基を利用する。
コントロールボアーガラスをカラム中て過剰のB S
A(10m9/mσ)を用いてBSAか溶出液中に存在
するまで、すなわち、カラムか飽和されるまで洗浄した
。次いで、CPGを1MNacρて蛋白質が溶出液中に
検知されなくなるまで洗浄した。
A(10m9/mσ)を用いてBSAか溶出液中に存在
するまで、すなわち、カラムか飽和されるまで洗浄した
。次いで、CPGを1MNacρて蛋白質が溶出液中に
検知されなくなるまで洗浄した。
このCD G −B SΔコンプレックスを実施例5の
段階(2)と同様に処理し、ガラクトマンナン−I3S
A−CPGコンプレックスを生成した。ガラクトマンナ
ンはBSAに共有結合的に結合し、略2mgガラクトマ
ンナン/gCPGの収率であった。
段階(2)と同様に処理し、ガラクトマンナン−I3S
A−CPGコンプレックスを生成した。ガラクトマンナ
ンはBSAに共有結合的に結合し、略2mgガラクトマ
ンナン/gCPGの収率であった。
(3)ガラクトマンナン−B、5A−CPGコンプレッ
クスの活性 段階(2)のコンプレックスを実施例5の段階(3)に
記載の如く、ガラクトースオギノダーゼおよびカタラー
ゼで処理した。
クスの活性 段階(2)のコンプレックスを実施例5の段階(3)に
記載の如く、ガラクトースオギノダーゼおよびカタラー
ゼで処理した。
(4)インバーターゼの担体物質への結合過剰のインバ
ーターゼ(100OU)をNaCNDH*(9,511
g)含有0.1M酢酸塩緩衝に1pHsO(5mg)中
の段階(3)からの担体物質に添加した。
ーターゼ(100OU)をNaCNDH*(9,511
g)含有0.1M酢酸塩緩衝に1pHsO(5mg)中
の段階(3)からの担体物質に添加した。
室温(20°C)で48時間後、担体を0.5M塩化ナ
トリウムを含有する0、1M酢酸ナトリウム緩衝液1)
H40、次いで非緩衝1M塩化ナトリウム、および0.
5M塩化ナトリウム含有0.1M燐酸酸緩衝液pI(8
,0で3回洗浄した。洗浄により[ゆるく結合した(l
oosθ)」ガラクトマンナン、すなわち、爪木マトリ
ックスに対し共有結合的に結合していないしのを除去す
る。勿論、リガンド、例えばインバーターゼもガラクト
マンナンに結合しているので、「ゆるく結合した」ガラ
クトマンナンに結合したりガントをも除去する。洗浄方
法はまたIgGに用いてもよい。そのことは実施例4お
よび5に記載されている。
トリウムを含有する0、1M酢酸ナトリウム緩衝液1)
H40、次いで非緩衝1M塩化ナトリウム、および0.
5M塩化ナトリウム含有0.1M燐酸酸緩衝液pI(8
,0で3回洗浄した。洗浄により[ゆるく結合した(l
oosθ)」ガラクトマンナン、すなわち、爪木マトリ
ックスに対し共有結合的に結合していないしのを除去す
る。勿論、リガンド、例えばインバーターゼもガラクト
マンナンに結合しているので、「ゆるく結合した」ガラ
クトマンナンに結合したりガントをも除去する。洗浄方
法はまたIgGに用いてもよい。そのことは実施例4お
よび5に記載されている。
インバーターゼをコンプレックス担体物質にカップリン
グし、得られた結合物はIIUのインバーターゼ活性/
gを有することがわかった。
グし、得られた結合物はIIUのインバーターゼ活性/
gを有することがわかった。
X叛−μ
(1)t?クトマンナンの精製
精製グアーガムを実施例1の段階(1)から得た。
ンチン(ポリ−N−アセチル−グルコースアミン)を水
酸化ナトリウム水溶液で部分的に脱アクリル化し、酸化
ガラクトマンナンの結合に用いられるポリサッカライド
骨格上の遊離アミノ割を生成した。4M水酸化すトリウ
ム(20uρ)中で1゜0℃で2時間加熱したノヂン(
2g)は実施例5の段階(2)の方法を用いてンチンの
19につき5mgのガラクトマンナンをカップルするの
に十分なN H2−基を有した。
酸化ナトリウム水溶液で部分的に脱アクリル化し、酸化
ガラクトマンナンの結合に用いられるポリサッカライド
骨格上の遊離アミノ割を生成した。4M水酸化すトリウ
ム(20uρ)中で1゜0℃で2時間加熱したノヂン(
2g)は実施例5の段階(2)の方法を用いてンチンの
19につき5mgのガラクトマンナンをカップルするの
に十分なN H2−基を有した。
(3)ガラクトマンナン−7チン反応生成物の活慨傷
段階(2)からの生成物を実施例5の段階(3)に記載
の如く、ガラクトースオキンダーセおよびカタラーゼで
処理した。
の如く、ガラクトースオキンダーセおよびカタラーゼで
処理した。
(4)インバ士ゼの担体卿j−
インバーターゼを実施例8に記載の如く、段階(3)か
らの担体物質に力・ソプルし、得らイtた結合物は担体
の1gにつき26Uのインノ\−ターゼ活性を有するこ
とがわかった。
らの担体物質に力・ソプルし、得らイtた結合物は担体
の1gにつき26Uのインノ\−ターゼ活性を有するこ
とがわかった。
特許出願人 ナノヨナル・リサーチ・
ディベロノブメント・
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、一般式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、GはD−ガラクトース残基を表わし、LIGは
リガンド残基を表わし、Rは水素原子を表わす(但し、
LIGおよびRは共に同一のリガンド分子の残基を示す
)] で表わされるペンダント基または末端基を有する不動化
ポリサッカライドを含有する担体物質。 2、ポリサッカライドが架橋されたポリサッカライドで
ある第1項記載の担体物質。 3、ポリサッカライドがガラスマトリックスに結合する
第1項記載の担体物質。 4、ポリサッカライドが式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、G′はポリサッカライド上の別のペンダントま
たは末端D−ガラクトース残基を表わし、MATはマト
リックス残基を表わし、Rは水素原子を表わす(但し、
MATおよびRは共にマトリックスの残基を示す)。] で表わされる基を通してマトリックスに結合される第1
項記載の担体物質。 5、マトリックスがアミノプロピル基を有し、第4項記
載の−NR−基がアミノプロピル基の−NH−残基であ
る第4項記載の担体物質。 6、ポリサッカライドがD−ガラクト−D−マンナンで
ある前項いずれかに記載の担体物質。 7、(a)ペンダントまたは末端非還元−D−ガラクト
ース残基を有するポリサッカライドを不動化し、 (b)D−ガラクトースオキシダーゼによりD−ガラク
トース残基中に存在する−CH_2OH基を酸化するこ
とにより不動化ポリサッカライドを活性化し、そして (c)該活性化された不動化ポリサッカライドを第1級
または第2級アミノ基を有するリガンドと反応して、シ
ッフ塩基(アルド−イミンまたはアルド−イミニウムイ
オン)を形成し、次いで還元剤によりシッフ塩基を還元
する ことからなる第1項記載の担体物質の製造方法。 8、不動化がポリサッカライドを架橋することにより実
施される第7項記載の製法。 9、不動化がD−ガラクトースオキシダーゼにより生成
した過酸化水素の除去を伴うポリサッカライドの非還元
D−ガラクトースを部分酸化し、該酸化ポリサッカライ
ドの第1級または第2級アミノ基を有するマトリックス
またはその様なアミノ基およびマトリックスと反応性の
他の基を有する架橋剤と反応し、次いでマトリックスと
反応性の基をマトリックスと反応することにより行なわ
れ、該反応がシッフ塩基の生成、更に所望により該シッ
フ塩基の還元を実施する第7項記載の製法。 10、第1〜6項いずれかに記載の担体物質または第7
〜9項いずれかに記載の方法で製造された担体物質上で
リガンド用の結合パートナーをクロマトグラフィングに
より分析する化学親和性クロマトグラフィー分析方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8415666A GB8415666D0 (en) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | Support material for immobilisation of ligands |
GB8415666 | 1984-06-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6134002A true JPS6134002A (ja) | 1986-02-18 |
Family
ID=10562680
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP13584585A Pending JPS6134002A (ja) | 1984-06-20 | 1985-06-20 | リガンド不動化担体物質 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0165800A1 (ja) |
JP (1) | JPS6134002A (ja) |
GB (2) | GB8415666D0 (ja) |
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JPH06511197A (ja) * | 1991-12-20 | 1994-12-15 | アライド−シグナル・インコーポレーテッド | 天然高分子材料の多孔性架橋体 |
JP2003505672A (ja) * | 1999-07-14 | 2003-02-12 | エヌ・イー・エヌ・ライフ・サイエンス・プロダクツ・インコーポレイテッド | 分析部材及びその製造方法 |
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SE466534B (sv) * | 1988-12-30 | 1992-03-02 | Exploaterings Ab Tbf | Adsorptionsmedel foer metalljoner, proteiner och andra oorganiska och organiska substanser |
US5554745A (en) * | 1992-05-14 | 1996-09-10 | National Starch And Chemical Investment Holding Corporation | Aldehyde cationic derivatives of galactose containing polysaccharides used as paper strength additives |
NL1021879C2 (nl) * | 2002-11-08 | 2004-05-11 | Univ Delft Tech | Werkwijze voor het bereiden van vernette enzymdeeltjes. |
SE0300624D0 (sv) * | 2003-03-05 | 2003-03-05 | Amersham Biosciences Ab | A method of preparing affinity ligands |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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1984
- 1984-06-20 GB GB8415666A patent/GB8415666D0/en active Pending
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1985
- 1985-06-17 GB GB8515265A patent/GB2160540B/en not_active Expired
- 1985-06-17 EP EP85304328A patent/EP0165800A1/en not_active Ceased
- 1985-06-20 JP JP13584585A patent/JPS6134002A/ja active Pending
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JP2003505672A (ja) * | 1999-07-14 | 2003-02-12 | エヌ・イー・エヌ・ライフ・サイエンス・プロダクツ・インコーポレイテッド | 分析部材及びその製造方法 |
JP4680456B2 (ja) * | 1999-07-14 | 2011-05-11 | パーキンエルマー ライフ サイエンシス インコーポレイテッド | 分析部材及びその製造方法 |
Also Published As
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GB2160540A (en) | 1985-12-24 |
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GB2160540B (en) | 1987-08-12 |
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