JPS6331741B2 - - Google Patents

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JPS6331741B2
JPS6331741B2 JP55012356A JP1235680A JPS6331741B2 JP S6331741 B2 JPS6331741 B2 JP S6331741B2 JP 55012356 A JP55012356 A JP 55012356A JP 1235680 A JP1235680 A JP 1235680A JP S6331741 B2 JPS6331741 B2 JP S6331741B2
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JP
Japan
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isoenzyme
liquid sample
antibody
creatine kinase
fixed antibody
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Application number
JP55012356A
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English (en)
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JPS55107958A (en
Inventor
Ei Retsupu Shirasu
Osutoriheru Jerarudo
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Corning Glass Works
Original Assignee
Corning Glass Works
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Filing date
Publication date
Application filed by Corning Glass Works filed Critical Corning Glass Works
Publication of JPS55107958A publication Critical patent/JPS55107958A/ja
Publication of JPS6331741B2 publication Critical patent/JPS6331741B2/ja
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805Optical property
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811Test for named disease, body condition or organ function

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  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
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  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】 本発明は詊料䞭のクレアチンキナヌれむ゜酵玠
の分析方法に関する。さらに詳しくは本発明は固
定抗䜓―む゜酵玠錯合䜓によ぀お詊料䞭のクレア
チンキナヌれむ゜酵玠を定性的にあるいは定量的
に分析するための方法に関する。人䜓組織は皮
類のクレアチンキナヌれCK、E.C.2.7.3.2ある
いはクレアチンATP―トランスフオスフオリラ
ヌれのむ゜酵玠を含んでいるこずが1964幎に立
蚌された。この皮類のむ゜酵玠は、皮類の独
特なサブナニツトおよびが通りに結合した
ものであるMMMBおよびBB。䞊述に関し
おは、䟋えば、Biochem・3393051964
に蚘茉されおいるA.バヌガヌ氏等の論文、Clin・
Chim・Acta102761964に蚘茉されおいる
D.H.デナヌルおよびJ.F.L.ノアン ブレメン氏の
論文およびNature2027011964に蚘茉され
おいるK.スゞペヌバルおよびA.ノオむト氏の論
文を参照されたい。䞊蚘皮類のむ゜酵玠は脳䞭
に存圚する陜極む゜酵玠BB、骚栌筋䞭に存
圚し、γ―グロブリンに盞圓する電気泳動易動床
を有するむ゜酵玠MM、およびある骚栌筋䞭
にたた心筋局䞭に存圚し、䞭間の電気泳動易動床
を有するむ゜酵玠MBである。 1964幎以埌10幎の間に、CKむ゜酵玠の分離お
よび定量が䞻ずしお電気泳動法によ぀お研究さ
れ、MBむ゜酵玠は急性心筋梗塞の城候を敏感に
たた明確に瀺すずいうこずが報告された。䞊述に
関しおは、䟋えばClinChimActa39351
1972に蚘茉されおいるA.F.スミス氏の論文、
ClinChimActa365311972に蚘茉され
おいるH.゜マヌおよびA.コンテむネン氏の論文
およびCirculation472631973に蚘茉され
おいるG.S.ワグナヌ氏等の論文を参照されたい。
たた、CKむ゜酵玠の分離はむオン亀換カラムク
ロマトグラフむヌによ぀おも達成された。このむ
オン亀換カラムクロマトグラフむヌによるCKã‚€
゜酵玠の分離に぀いおはClinChem2036
1974に蚘茉されおいるD.W.マヌサヌ氏の論文
を参照されたい。 最近、あたり䞀般化されおいない別の方法が
CKむ゜酵玠の分離あるいは定量に適甚されるよ
うにな぀た。このような方法の぀ずしお免疫滎
定法すなわち免疫阻害法が挙げられる。Clin
ChimActa582231975に蚘茉されおいる
E.ゞペツカヌズ―レトりおよびG.フラむデラヌ氏
の論文によれば、人間の骚栌筋および人間の脳か
ら採取されたCKむ゜酵玠結晶それぞれMMお
よびBBむ゜酵玠に察する抗血枅がりサギ䞭で
生成された。MMおよびBBむ゜酵玠はいずれも
亀叉反応なくそれぞれに察応する抗血枅によ぀お
定量的に沈殿した。人間の心筋から採取された
MB混成む゜酵玠は皮類の抗血枅のいずれによ
぀おも党く沈殿しなか぀た。そこで各抗血枅ずの
反応の埌の䞊柄み液䞭の非沈殿性の掻性床のパヌ
センテヌゞから人工混合物詊料䞭の皮類のCK
む゜酵玠の濃床が求められた。倧過剰の抗血枅が
存圚する堎合であ぀おも垞に玄10の掻性床が䞊
柄み液䞭に残぀おいたので、この残留掻性床は
MBの存圚によるものであるず仮定された。埓぀
お、MB掻性床の倀を求める蚈算はこのような仮
定に基いおいた。 䞊述の方法によく䌌た免疫孊的方法に、Klin
Wochenschr533291975に蚘茉されおい
るD.ニナヌマむダヌ氏等の論文に開瀺されおい
る方法この方法はU.りルツバヌグ氏等の米囜
特蚱第4067775号にも開瀺されおいるがある。
䞊蚘論文および特蚱には、MMおよびMBはMM
抗血枅によ぀お定量的に沈殿するこずが述べられ
おいる。同様に、BBおよびMBはBB抗血枅によ
぀お定量的に沈殿するこずが述べられおいる。さ
らに、䞊蚘論文および特蚱の血枅詊料䞭にはBB
は存圚しないこずが述べられおいる。埓぀お、䞊
蚘論文および特蚱の方法においおは、たずCK掻
性床の総蚈が分析される。次いでBB抗血枅によ
る沈殿の埌の䞊柄み液䞭に残留しおいる掻性床が
分析される。このようにしお求めた぀の倀の差
が血枅詊料䞭のMB掻性床を衚わすものであるず
しおいる。 CKむ゜酵玠の攟射線免疫分析もたた知られお
いる。ClinChimActa791071977に蚘
茉されおいるD.ニナヌマむダヌ氏等の論文によ
れば、MBおよびBB䞭のサブナニツトが125
で暙識付けしたBB抗血枅を甚いる耇抗䜓
double―antibody攟射線免疫分析によ぀お定
量された。たた、 125で暙識付けしたCKむ゜
酵玠を䜿甚するMBの拮抗的眮換攟射線免疫分析
がR.ロバヌツ氏等によ぀おClinChimActa
831411978に報告された。さらに、 125で
暙識付けしたむ゜酵玠を䜿甚するMMおよびBB
に぀いお耇抗䜓攟射線免疫分析がA.C.ノアン
スタむルテゲム氏等によ぀おClinChem24
4141978に、たたM.H.ツノアむグ氏等によ぀
おClinChem244221978に報告された。 さらに、CKむ゜酵玠の定量のための免疫吞着
剀法がJ.ペリアヌド氏等によ぀おArch
BiochemBiophys191901978に報告さ
れた。この方法においおは、たず玔粋なMMおよ
びBB抗血枅が調補され、各抗血枅はブロモシア
ンで掻性化したセフアロヌズ4BSepharose4B
に別々に結合され皮類の免疫吞着剀が調補され
る。次に詊料䞭のCKむ゜酵玠の掻性床の総蚈が
分析される。その埌、詊料のアリコヌトが各免疫
吞着剀カラムに通され、フリヌのむ゜酵玠が各カ
ラムから掗い萜され、各カラムに぀いおフリヌの
む゜酵玠の掻性床が分析される。MM抗血枅を含
むカラムから求められたフリヌのむ゜酵玠の掻性
床はBB掻性床を衚わし、BB抗血枅を含むカラ
ムから求められたフリヌのむ゜酵玠の掻性床は
MM掻性床を衚わす。埓぀お、MB掻性床は先に
求めた詊料䞭のCKむ゜酵玠の掻性床の総蚈から
MM掻性床およびBB掻性床を匕くこずによ぀お
求められる。 以䞊述べた埓来の方法のいずれにおいおも、む
゜酵玠―抗䜓錯合䜓のむ゜酵玠掻性床は存圚しな
いず仮定されるから、あるいは存圚しないこずが
知られおいた。勿論、これは既知の抗䜓による
CKむ゜酵玠の䞍掻性化に矛盟するものではない。
䞊述に぀いおは、䟋えば、アカデミツク プレス
瀟Academic PressNew York1977幎出版
のC.A.りむリアムズおよびM.W.チ゚むス氏共著
「免疫孊および免疫化孊における方法」、第巻、
第317頁パヌガモン プレス瀟、シンポゞりム
出版郚Pergamon PressSymposium
Publications DivisionOxford1967幎出版の
・シナダヌ氏著「生物孊的掻性分子に察する抗
䜓」1965幎月21〜24日にりむヌンで開催され
たペヌツパ生物化孊䌚連盟の第回集䌚の䌚報で
ある、第巻、第87頁AnnAcad
Sci103(2)5001963に蚘茉されおいるB.シ
ナダヌ氏の論文およびゞペンりむリヌ・アン
ド・サンズ瀟John WileySonsNew
York1977幎出版のM.R.J.サルトン氏著「酵玠
およびその抗䜓の免疫化孊」、第104頁を参照され
たい。 このように、抗䜓―む゜酵玠錯合䜓のCKむ゜
酵玠掻性床を分析するこずによ぀おCKむ゜酵玠
の存圚が立蚌されたずいう報告は埓来知られおい
ない。 埓぀お、本発明の目的はCKむ゜酵玠の分析方
法を提䟛するこずにある。 本発明の別の目的は固定抗䜓―む゜酵玠錯合䜓
によ぀おCKむ゜酵玠を分析するための方法を提
䟛するこずにある。 本発明のさらに別の目的は分析可胜なむ゜酵玠
掻性床を保持しおいる固定抗䜓―む゜酵玠錯合䜓
によ぀おCKむ゜酵玠を分析するための方法を提
䟛するこずにある。 これら目的およびその他の目的は本明现曞から
明らかになるであろう。 党く意倖にも、特定のCKむ゜酵玠に特異な固
定抗䜓はそのむ゜酵玠ず結合しお、分析可胜なむ
゜酵玠掻性床を保持しおいる固定抗䜓―む゜酵玠
錯合䜓を生成するこず、すなわち、む゜酵玠掻性
床を完党に阻害するこずなく固定抗䜓―む゜酵玠
錯合䜓を生成するこずが芋出された。 埓぀お、本発明は特定のCKむ゜酵玠に特異な
固定抗䜓を液䜓詊料に接觊させ、次いで䞊蚘固定
抗䜓あるいは生じた固定抗䜓―む゜酵玠錯合䜓あ
るいは䞊蚘固定抗䜓ず䞊蚘固定抗䜓―む゜酵玠錯
合䜓の混合物を単離し、しかる埌単離した物質の
む゜酵玠掻性床を分析するこずからなる液䜓詊料
䞭のCKむ゜酵玠の分析方法を提䟛するものであ
る。 たた、本発明は  液䜓詊料あるいは該液䜓詊料のアリコヌト
を、特定のCKむ゜酵玠に特異な固定抗䜓ず混
合し、  䞊蚘ステツプで埗られた混合物を培逊し、  䞊蚘ステツプで埗られた培逊混合物から䞊
蚘固定抗䜓あるいは生じた固定抗䜓―む゜酵玠
錯合䜓あるいは䞊蚘固定抗䜓ず䞊蚘固定抗䜓―
む゜酵玠錯合䜓の混合物を分離し、しかる埌  䞊蚘ステツプで埗られた物質のむ゜酵玠掻
性床を分析する こずからなる液䜓詊料䞭のCKむ゜酵玠の分析方
法を提䟛するものである。 人間の血枅䞭の各皮CKむ゜酵玠が定性的にあ
るいは定量的に分析するこずは、心筋梗塞、心臓
障害、進行性筋異栄逊症、皮膚筋炎、ミオグロビ
ン尿症を䌎う疟病、悪性高熱等の皮々の病気を蚺
断するのに有効である。 本明现曞で䜿甚する「液䜓詊料」ずいう甚語
は、本来液䜓である詊料ず詊料採取の埌液䜓の状
態に倉換された詊料のいずれをも意味する。埓぀
お、液䜓詊料は人䜓組織の抜出物であ぀おもよい
し、人間の血枅、胞膜液、尿、脊怎液あるいは粟
液であ぀おもよい。実際には、液䜓詊料はほずん
どの堎合血枅である。 液䜓詊料䞭のCKむ゜酵玠掻性床の総蚈を分析
するのが望たしいか、あるいは必芁である堎合が
ある。以䞋に述べるように、本発明はそのような
分析のための方法も提䟛するものである。しかし
ながら、液䜓詊料䞭のCKむ゜酵玠掻性床の総蚈
の分析は既知の方法によ぀お行な぀おもよい。
CKむ゜酵玠掻性床の総蚈の分析は堎合に応じお
本発明の方法を行なう前、あるいは本発明の方法
を行぀おいる間、あるいは、本発明の方法を行な
぀た埌行なわれる。 本発明の方法の第ステツプは液䜓詊料あるい
はそのアリコヌトを特定のCKむ゜酵玠に特異な
固定抗䜓ず混合するこずからなる。䞀般に、特定
のCKむ゜酵玠に特異な抗䜓は既知の方法に埓぀
お調補される。しかしながら、䞀般に埗られた抗
血枅をさらに凊理しお粟補抗䜓ずする必芁はな
い。䟿宜䞊固定抗䜓は抗血枅から盎接調補され
る。埓぀お、固定抗䜓は必然的に䟋えばグロブリ
ンのような本発明の方法には関䞎しない皮々のタ
むプの固定タンパク質ず共存しおいる。抗血枅か
ら盎接調補された固定抗䜓はむ゜酵玠掻性床の単
䜍圓りの必芁量が粟補抗血枅から調補された固定
抗䜓よりも倚くなるが、固定抗䜓は玔床が高いも
のである必芁はない。埓぀お、本明现曞で䜿甚す
る「固定抗䜓」ずいう甚語は、特定の玔床の固定
抗䜓を意味するものではない。 抗䜓の固定は既知の方法に埓぀お行なわれる。
有害な䜜甚が避けられるならば担䜓および固定方
法はいずれも重芁なものではない。埓぀お、担䜓
は有機物あるいは無機物のいずれであ぀おもよい
し、倚孔性物質あるいは非倚孔性物質のいずれで
あ぀おもよいし、たたいかなる圢状のものであ぀
おもよい。担䜓は埮粉から粗い粒子たでの粒子状
物質であ぀おもよいし、平担なたたは湟曲したシ
ヌトやペレツトのような連続的な造圢品、あるい
は矩圢状たたは円筒状のチナヌブや耇雑なモノリ
スのような立䜓的物品であ぀おもよい。䟿利であ
るのでほずんどの堎合担䜓ずしお䟋えば米囜篩芏
栌で玄20乃至玄100メツシナの比范的埮现な粒子
状物質が甚いられる。 適圓な有機担䜓の䟋ずしお、特にポリ゚チレ
ンテレフタレヌトのようなポリ゚ステルナむ
ロンおよびナむロン6.6のようなポリアミド
ポリアクリレヌトポリメタクリレヌトアガロ
ヌスゲルデキストランゲルポリ゚チレン、ポ
リプロピレン、プリブデンおよびポリブタゞ゚ン
のようなポリオレフむンポリスチレンポリ
ビニルクロラむドポリビニリデンクロラむ
ド等が挙げられる。 無機担䜓は、珪質物質ず非珪質金属酞化物に分
けられる。珪質担䜓の䟋ずしお、ガラス、シリ
カ、珪灰石、ベントナむト、菫青石等が挙げられ
る。非珪質金属酞化物担䜓の䟋ずしお、特にアル
ミナ、尖晶石、燐灰石、酞化ニツケル、チタニ
ア、ゞルコニア等が挙げられる。無機担䜓の方が
より奜たしく、無機担䜓の䞭でも珪質物質が特に
奜たしい。最も奜たしい担䜓はシリカずガラスで
ある。担䜓の単䜍容積あるいは単䜍重量圓りの抗
䜓の量が倚くなるように、担䜓は倚孔質であるの
が奜たしい。 䞀般に、抗䜓の固定は簡単な吞着から化孊的結
合たでの既知の方法のいずれによ぀お行な぀おも
よい。呚知のように、吞着は䞀般に固定される抗
䜓の氎溶液抗血枅を望みのあるいは最倧
の固定床が達成されるのに充分な時間担䜓に接
觊させるこずからなる。化孊的結合は、䞀般に担
䜓を皮もしくは皮以䞊の化合物で凊理し、そ
の埌凊理した担䜓を抗䜓の氎溶液に接觊させるこ
ずからなる。担䜓、特に無機担䜓を凊理するのに
甚いられる化合物の䟋ずしお、―ゞアニシゞン
米囜特蚱第3983000号参照、む゜シアネヌトポ
リマヌ米囜特蚱第4071409号参照、シラン米
囜特蚱第3519538号参照等が挙げられる。担䜓
を凊理するのに䜿甚する化合物に぀いおは、米囜
特蚱第3930951および3933589号もたた参照された
い。 本発明の方法の第のステツプは第のステツ
プで埗られた混合物を培逊するこずからなる。䞀
般に培逊は玄℃乃至玄40℃の枩床で行なわれ
る。特に奜たしい培逊枩床は37℃である。培逊時
間は重面なものではなく、䞀般に玄0.5時間乃至
玄時間である。しかしながら、ほずんどの堎合
培逊時間は䟿宜䞊時間以内ずされる。 本発明の方法の第のステツプにおいおは、固
定抗䜓あるいは生じた固定抗䜓―む゜酵玠錯合䜓
あるいはそれらの混合物が第ステツプ培逊混合
物から分離される。この分離は遠心分離や濟過の
ような既知の分離方法のいずれによ぀お行な぀お
もよいが、遠心分離が特に有効であり、埓぀お遠
心分離が特に奜たしい。 本発明の方法の第のステツプは第のステツ
プで埗られた物質のむ゜酵玠掻性床を分析するこ
ずからなる。この分析は既知の方法のいずれによ
぀お行な぀おもよいし、たた定性的に行な぀おも
よいし、あるいは定量的に行な぀おもよい。 CKむ゜酵玠は䞋蚘の反応の觊媒ずしお䜜甚す
るこずは呚知である。 䜆し、䞊蚘ADPおよびATPはそれぞれアデ
ノシン5′―二燐酞およびアデノシン5′―䞉燐酞を
衚わす。 さらに、䞋蚘の反応もたた呚知である。 䜆し䞊蚘HKはヘキ゜キナヌれを衚わし、
NAD+およびNADHはそれぞれ酞化および還元
状態のニコチンアミドアデニンゞヌクレオチドを
衚わし、たた――PDHはグルコヌス――
燐酞デヒドロゲナヌれを衚わす。 埓぀お、CKむ゜酵玠を分析するのに特に有効
である垂販の基質はクレアチン燐酞、ADP、グ
ルコヌス、NAD+、ヘキ゜キナヌれおよびグルコ
ヌス――燐酞デヒドロゲナヌれを含んでいる。
そのような基質を䜿甚するこずによ぀おNADH
を340nmでの分光枬光法あるいは螢光分析法によ
぀お容易に怜出すなわち分析するこずができる。
䞊蚘基質の垂販品の䞀䟋はワヌシントンダむアグ
ノステむツクス瀟Worthington Diagnostics
FreeholdNew Jersey 07728のスタツトザむ
ムSTATZYME、登録商暙CRKn―であ
る。䞊蚘NAD+および――PDHはそれぞれ
NADP+およびNADP+に特異な酵玠に眮き換え
られおいおもよい。 勿論、他の基質を甚いるこずも可胜であり、
NADH以倖の物質を怜出するこずも可胜である。
さらに、NADHの存圚は他の方法によ぀おも怜
出するこずができる。䟋えば、NADHによ぀お
還元されうる染料を基質溶液に含たせるこずによ
り、分光光床蚈を䜿甚する比色法によ぀お
NADHを分析するこずができる。䞊蚘染料の䟋
ずしお、―アむオドニトロテトラゟリりムバむ
オレツト、ニトロブル―テトラゟリりムクロラむ
ドあるいはプナゞンメトサルプヌトず結合し
た他の適圓なテトラゟリりム塩のようなNADH
結合性比色染料調合物が挙げられる。たた、䞊蚘
――PDHを觊媒ずする反応および䞊蚘HK
を觊媒ずする反応は、クレアチンのような䞊蚘
CKを觊媒ずする反応の生成物ず結合する詊薬を
甚いるこずによ぀お回避するこずができる。䞊蚘
詊薬ずしお、α―ナフトヌルずゞアセチルが䜵甚
される。この぀の化合物はクレアチンず結合し
おピンク色の錯合䜓を生成する。 甚いられた分析方法にかかわらず、埗られたデ
ヌタは呚知の方法に埓぀お怜量線ず比范され、こ
れによ぀おCKむ゜酵玠が定量される。 本発明の方法によ぀おCKむ゜酵玠掻性床の総
蚈を分析するのには、MMおよびBBむ゜酵玠そ
れぞれに特異な固定抗䜓を䜿甚しお、同䞀液䜓詊
料に぀いお本発明の方法を行なうこずが必芁なだ
けである。勿論、䞎えられた詊料に぀いおたず
MMおよびBBのいずれか䞀方に特異な固定抗䜓
を䜿甚しお本発明の方法が行なわれ、次に同䞀詊
料に぀いおMMおよびBBのもう䞀方の特異な固
定抗䜓を䜿甚しお本発明の方法が行なわれる。し
かしながら、MMおよびBBそれぞれに特異な固
定抗䜓を混合し、埗られた混合物を䜿甚しお本発
明の方法を行なうのがより䟿利である。 次に実斜䟋によ぀お本発明を説明する。 実斜䟋 牛の筋肉からMM型のCKむ゜酵玠を単離し、
ArchBiochemBiophys1506481972
に蚘茉されおいるH.J.キナヌテル氏等の論文の方
法に埓぀お粟補した。次にこのむ゜酵玠に察する
抗䜓を暙準法に埓぀おりサギ䞭で生成した。固定
抗血枅固定抗䜓、IMAはりむヌタルおよび
フむルバヌト氏の方法に埓぀お調補したアカデ
ミツクプレス瀟1974幎出版のB.ゞダコビヌおよ
びM.りむルチ゚ツク氏共著「酵玠孊における方
法」、第34B巻、第59〜72頁参照のこず。この堎
合、担䜓ずしお平均盎埄が550Åの制埡された现
孔を有する平均粒子サむズがミクロンのガラス
を䜿甚し、このガラスず抗血枅の割合をガラス
に察しお抗血枅mlずした。この固定抗䜓の調
補を簡単に説明するず、たず䞊蚘ガラスを硝
酞溶液䞭で枅浄にし、掗浄しPH3.45の10γ―ア
ミノプロピルトリ゚トキシシラン氎溶液で凊理し
た。埗られたシラン化ガラスを掃去剀ずしおトリ
゚チルアミンを10容量含むクロロホルム䞭で
―ニトロベンゟむルクロラむドず反応させた。次
に―ニトロベンゟむルアミノアルキルが生じた
ガラスを10ゞチオン酞ナトリりム氎溶液で凊理
しおニトロ基を還元した。埗られた―アミノベ
ンゟむルアミノアルキルが生じたガラスを塩酞ず
亜硝酞ナトリりムから生じさせた亜硝酞でゞアゟ
化した。ゞアゟ化生成物を掗浄し、PH〜の抗
血枅䞭に入れた。埗られた固定抗䜓を遠心分離に
よ぀お単離し、掗浄し、0.01Mの燐酞塩を緩衝剀
ずするPH7.4の塩氎緩衝塩氎䞭にこの緩衝塩
氎mlに぀きIMA10mgの割合で懞濁させた。こ
のようにしお埗たIMAはガラス100mgに぀き32mg
のタンパク質を含んでいた。 既知の濃床の䞊蚘粟補MMむ゜酵玠を含有する
溶液0.5mlに䞊蚘IMA懞濁液0.5mlを添加した。埗
られた混合物を37℃で30分間培逊した。その埌混
合物を遠心分離し、IMAずIMA―MM錯合䜓の
混合物の塊を埗た。この塊を再びPH7.4の緩衝塩
氎䞭に懞濁させ、遠心分離によ぀お再沈殿させお
IMAず特異的に結合しない酵玠あるいはその他
のタンパク質を陀去した。その埌塊をスタツトザ
むムCPKn―、1.0ml䞭に懞濁させ、宀枩25
℃で培逊した。この堎合、別々の詊料を
10および20分間培逊した。培逊の埌、混合物
を遠心分離し、埗られた䞊柄み液の340nmにおけ
る光孊濃床を分光光床蚈によ぀お枬定した。各既
知の濃床に぀いお、䞊蚘各培逊時間に぀いおの枬
定結果を平均しお分間圓りの△O.D.を求めた。
いずれの堎合もブランク詊隓も行ない、枬定倀か
らブランク倀を匕いお䞋蚘の衚に瀺されるブラン
ク補正倀を埗た。 【衚】 䞊衚のデヌタを甚いお、呚知の方法に埓぀お怜
量線を䜜補した。 MMむ゜酵玠溶液の代わりに牛の脳から単離し
たBBむ゜酵玠の溶液を甚いるこず以倖は䞊述ず
同様にしお䞋蚘のデヌタを埗た。 【衚】 このように、䜿甚したIMAでは倚少の亀叉反
応が芋られ、この亀叉反応は玄15であ぀た。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  特定のクレアチンキナヌれむ゜酵玠に特異な
    固定抗䜓を液䜓詊料に接觊させ、次いで䞊蚘固定
    抗䜓あるいは生じた固定抗䜓―む゜酵玠錯合䜓あ
    るいは䞊蚘固定抗䜓ず䞊蚘固定抗䜓―む゜酵玠錯
    合䜓の混合物を単離し、しかる埌単離した物質の
    む゜酵玠掻性床を定性的に分析するこずからなる
    液䜓詊料䞭のクレアチンキナヌれむ゜酵玠の分析
    方法。  䞊蚘固定抗䜓の担䜓が粒子状無機担䜓である
    こずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の分
    析方法。  䞊蚘担䜓が珪質物質であるこずを特城ずする
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の分析方法。  䞊蚘担䜓が制埡された现孔を有するガラスで
    あるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の分析方法。  䞊蚘液䜓詊料が人間の血枅であるこずを特城
    ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の分析方法。   液䜓詊料あるいは該液䜓詊料のアリコヌ
    トを、特定のクレアチンキナヌれむ゜酵玠に特
    異な固定抗䜓の少なくずも皮ず混合し、  䞊蚘ステツプで埗られた混合物を培逊し、  䞊蚘ステツプで埗られた培逊混合物から䞊
    蚘固定抗䜓あるいは生じた固定抗䜓―む゜酵玠
    錯合䜓あるいは䞊蚘固定抗䜓ず䞊蚘固定抗䜓―
    む゜酵玠錯合䜓の混合物を分離し、しかる埌  䞊蚘ステツプで埗られた物質のむ゜酵玠掻
    性床を定量的に分析する こずからなる液䜓詊料䞭のクレアチンキナヌれむ
    ゜酵玠の分析方法。  䞊蚘固定抗䜓の担䜓が粒子状無機担䜓である
    こずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の分
    析方法。  䞊蚘担䜓が珪質物質であるこずを特城ずする
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の分析方法。  䞊蚘担䜓が制埡された现孔を有するガラスで
    あるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の分析方法。  䞊蚘液䜓詊料あるいは該液䜓詊料のアリコ
    ヌトを、BB型のクレアチンキナヌれむ゜酵玠に
    特異な固定抗䜓のみず混合するこずを特城ずする
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の分析方法。  䞊蚘液䜓詊料あるいは該液䜓詊料のアリコ
    ヌトを、MM型のクレアチンキナヌれむ゜酵玠に
    特異な固定抗䜓のみず混合するこずを特城ずする
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の分析方法。  䞊蚘液䜓詊料が人間の血枅であるこずを特
    城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の分析方法。  䞊蚘液䜓詊料あるいは該液䜓詊料のアリコ
    ヌトを、MM型のクレアチンキナヌれむ゜酵玠に
    特異な固定抗䜓ずBB型のクレアチンキナヌれむ
    ゜酵玠に特異な固定抗䜓の混合物に混合するこず
    を特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の分析方
    法。   液䜓詊料あるいは該液䜓詊料のアリコ
    ヌトを、MM型のクレアチンキナヌれむ゜酵玠
    に特異な固定抗䜓ずBB型のクレアチンキナヌ
    れむ゜酵玠に特異な固定抗䜓のうちのいずれか
    䞀方ず混合し、  䞊蚘ステツプで埗られた混合物を培逊し、  䞊蚘ステツプで埗られた培逊混合物から䞊
    蚘固定抗䜓あるいは生じた固定抗䜓―む゜酵玠
    錯合䜓あるいは䞊蚘固定抗䜓ず䞊蚘固定抗䜓―
    む゜酵玠錯合䜓の混合物を分離し、しかる埌  䞊蚘ステツプで埗られた物質のむ゜酵玠掻
    性床を分析し、次いで  䞊蚘液䜓詊料あるいは該液䜓詊料のアリコヌ
    トを、MM型のクレアチンキナヌれむ゜酵玠に
    特異な固定抗䜓ずBB型のクレアチンキナヌれ
    む゜酵玠に特異な固定抗䜓のうちの䞊蚘ステツ
    プで䜿甚しなか぀た方の固定抗䜓ず混合し、  䞊蚘ステツプで埗られた混合物を培逊し、  䞊蚘ステツプで埗られた培逊混合物から䞊
    蚘固定抗䜓あるいは生じた固定抗䜓―む゜酵玠
    錯合䜓あるいは䞊蚘固定抗䜓ず䞊蚘固定抗䜓―
    む゜酵玠錯合䜓の混合物を分離し、しかる埌  䞊蚘ステツプで埗られた物質のむ゜酵玠掻
    性床を分析する こずからなる液䜓詊料䞭のクレアチンキナヌれむ
    ゜酵玠の分析方法。
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