JPS63301789A - 安定性が低下したα−アミラーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は耐熱性が低下した、変性された細菌性α−アミ
ラーゼ酵素組成物、及びその製造方法に関する。このよ
うな組成物は特にパン焼菓子用の穀粉への添加物として
有用である。

（従来の技術及びその問題点） コムギ粉がパン焼菓子及びそれに関連した工業において
使用される場合、通例、α−アミラーゼ酵素を含有する
添加物質が加えられる。このことは、パンや菓子を焼く
際のコンシスチンシーのためにα−アミラーゼを最少量
、穀粉に与えるために行われる。この目的のために通常
使用されるアミラーゼはモルトアミラーゼ製品である・
このモルトアミラーゼはパン焼菓子工業において広範に
使用されているが、この使用にはある種の欠点がある。

即ち、このようなアミラーゼはしばしばパン焼菓子製品
に好ましくない色を与える。

さらに、このモルト調製物はしばしば他の多くの酵素を
含み、そのいくつかはパンや菓子を焼く過程において好
ましくない副反応を引き起こす。従って、このような欠
点を持たない他のα−アミラーゼ酵素調製物を見出すこ
とが望まれている。

このため、真菌起源のα−アミラーゼがモルトアミラー
ゼの代替品として試験されているが、このα−アミラー
ゼが熱によりあまりにも容易に破壊されるので、この目
的に対し役立たないことが明らかとなっている。他方で
は、細菌性α−アミラーゼ調製物が試験されており、こ
の調製物は耐熱性があまりに高くこの目的に使用するの
に適していないことが分かっている。このような耐熱性
の酵素はパンや菓子を焼く過程においても存在し続け、
パンや菓子を焼く過程が終了してもデンプン質を加水分
解し続け、好ましくないペースト状製品を作り出すもと
になる。これらの問題は米国特許第４３２０１５１号明
細書に詳細に記載されている。

また、ホラ（Ｈｏｒａ　）は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
３１ｂｔｉｌｔｓ）により生産された細菌性α−アミラ
ーゼをＮ−アセトキシスクシンイミドを用いてアシル化
し、未変性の酵素よりさらに耐熱性の、変性されたα−
アミラーゼを得ている（　ｔｌｏｒａ＋　Ｊ−＋Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　３１０．
２６４−２６７　（１９７３）参照）。上記アシル化は
このような酵素をパンや菓子を焼く工程に使用するのに
さらに不適当なものとする。

（問題点を解決するための手段） 本発明は上記問題点を解決するためになされたもので、
本発明者は驚くべきことに、ある種の細菌性α−アミラ
ーゼが、このα−アミラーゼの耐熱性を低下させる方法
でアシル化され得ることを見出した。このようにして得
られる変性されたα−アミラーゼは特にパン焼菓子工業
において、又は耐熱性が低下した、比較的純粋なα−ア
ミラーゼが必要とされるどのような場合においても、使
用するのに適している。さらに、このα−アミラーゼは
、パン焼菓子及び関連した工業において以前より使用さ
れているモルト及び他のα−アミラーゼに関係した欠点
を有していない。

本発明によれば、変性された細菌性α−アミラーゼ酵素
において、９０℃での耐熱性が対応する未変性の細菌性
α−アミラーゼの９０℃での耐熱性よりも実質的に低い
耐熱性を持つ変性された細菌性α−アミラーゼが提供さ
れる。この変性された細菌性α−アミラーゼはバチルス
・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒ＋ｗｏｐｈｉｌｕｓ）又は枯草菌（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）由来のα−アミラー
ゼ酵素のアシル誘導体からなる。

また、本発明によれば、耐熱性が低下した、変性された
細菌性α−アミラーゼ酵素の製造方法も提供される。こ
の方法は、該酵素中の遊離アミノ基の少なくとも約５０
％がアシル化されるまで、デンプン又はデンプン水解物
の存在下でα−アミラーゼ酵素のアシル誘導体を形成さ
せることからなる。

さらに、本発明によれば、α−アミラーゼ酵素を用いて
穀粉１ｇあたり約０．４乃至０．６３ＫＢ単位のα−ア
ミラーゼレベルに標準化した穀粉が提供される。このα
−アミラーゼ酵素は、バチルス・ステアロサーモフィル
ス由来のα−アミラーゼのアシル誘導体からなる、変性
された細菌性α−アミラーゼ酵素である。

微生物であるバチルス・ステアロサーモフィルスにより
生産されるα−アミラーゼは本発明の変性された細菌性
α−アミラーゼの製造の際の好ましい出発物質である。

バチルス・ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼ及
びその製造方法は米国特許第４２８４７２２号明細書及
び同第４４９３８９３号明細書に記載されている。市販
のバチルス・ステアロサーモフィルスα−アミラーゼは
ニューヨーク州、ニューヨーク、ペン・プラダ２所在の
、エンザイム・ディベロプメント・コーポレーション（
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐ、）
から入手可能である。

本発明の実施に使用できる他のα−アミラーゼはミズー
リ州、セント・ルイス所在のシグマ・ケミカル・コーポ
レーション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）
から入手可能なα−アミラーゼである。この酵素は枯草
菌としてカタログに掲載されているが、生産微生物は密
接に関連したバチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
）であると考えられている。

α−アミラーゼ酵素溶液の濃度は次の検定法により求め
た。即ち、分析すべき溶液を２．５ｎ＋Ｍの塩化カルシ
ウム溶液で、１Ｉｌｊ！あたりの活性が約０．２５単位
の最終濃・度となるように希釈する。正確に希釈したこ
の酵素溶液１＃！１！を０．０３Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ
６，０）と０．０３Ｍの塩化カルシウムとを含む１％濃
度の溶性デンプン溶液１０ｄに加える。反応は６０℃で
１０分間行われる。得られる反応溶液ｌＩｄを０．０２
Ｎの塩酸５０ｍｆｌの入った容量１（１０　ｄメスフラ
スコに入れ、ここに０．０５％濃度のヨウ素溶液３　ｍ
ｌを加えたのち、水を加えて全容量を１（１０　ｄとす
る。

次第に生じてくる青色の、６２０ｎｍでの吸光度を測定
する。１分間でデンプン１０■を分解するために必要と
される酵素量を１単位として定義する（このように定義
されたバチルス・ステアロサーモフィルス１単位はパン
焼菓子工業に使用されているＳＫＢ単位０．８に等しい
）。即ち、 ×（希釈ファクター） 〔式中、 Ｄｏは対照溶液（酵素溶液の代わりに水が加えられてい
る）の吸光度であり、 Ｄ３は反応溶液の吸光度である。〕 である。

本発明の変性されたα−アミラーゼは、α−アミラーゼ
の遊離アミノ基をアシル化することにより製造される。

アシル化は、酵素分子中の他の官能基と反応することな
く遊離アミノ基と反応するアシル化剤の使用によりなさ
れる。

本発明の方法に使用される好ましいアシル化剤はモノカ
ルボン酸の無水物である。無水酢酸は好ましい試薬の１
つである。他の有用な試薬としては、無水プロピオン酸
、無水酪酸、無水吉草酸及び無水安息香酸がある。無水
コハク酸は耐熱性が妥当に低下した、変性されたα−ア
ミラーゼを提供するが、一般にはジカルボン酸の環式無
水物はこの目的にはあまり適していない。

本発明の方法において使用されるアシル化剤の量は臨界
的ではない。しかしながら、酵素中の遊離アミノ基の少
なくとも５０％をアシル化するのに充分な量の試薬が使
用される。

本発明の実施において、未変性のα−アミラーゼ酵素は
最初、当該酵素をアシル化反応の際の変性から保護する
ためにデンプン又は低り、　Ｅ。

（ブドウ糖当量（ｄｅｘｔｒｏｓｅ　ｅｑｕｉｖａｌｅ
ｎｔ））のデンプン水解物と混合される。この目的のた
め、１０Ｄ、Ｅ、の水溶性デンプン水解物を約１０％含
有する溶液中で反応を行うのが好都合である。

アシル化反応が酸無水物を使用して行われる場合、この
反応は当該酵素が不活性になる温度より低い温度で行わ
れる。この目的のために有用な温度範囲は約５℃乃至約
５０℃である。好ましい温度範囲は約２５℃乃至約３０
℃である。

酸無水物を用いたアシル化反応は通常７より高いｐＨで
行われる。この反応に好ましいｐＨ範囲は約８乃至９で
ある。

本発明の変性された細菌性α−アミラーゼ酵素組成物は
パン焼菓子用穀粉への添加物として特に有用である。こ
の用途において使用する場合、充分量の変性されたα−
アミラーゼが、所望のα−アミラーゼ活性レベルを持つ
標準化された穀粉を提供するために使用される。この量
は通常穀粉１ｇあたり約０．４乃至約０．６　ＳＫＢ単
位であり、好ましくは、約０．５　ＳＫＢ単位である（
ＳＫＢ単位はパン焼菓子工業に使用されるα−アミラー
ゼ活性の度量単位である。上記の通り、バチルス・ステ
アロサーモフィルスα−アミラーゼ酵素活性１単位は、
本発明において示した試験により測定されるように、Ｓ
ＫＢ単位約０．８に等しい）。

更に、穀粉が、本発明の変性された細菌性α−アミラー
ゼを使用して標準化された場合、この穀粉は以前から使
用されているモルトα−アミラーゼと同様の、ブラベン
ダー粘度における減少を示す。このことは、パン焼菓子
工業において使用されているブラベンダー粘度の標準測
定方法を用いてこの標準化された穀粉試料を評価するこ
とを可能とする。

本発明の変性された細菌性α−アミラーゼ酵素を用いて
標準化された穀粉は種々のパン焼菓子製品を製造する際
に使用し得る。このような製品は良好な抗スタリング（
ａｎｔｉｓｔａｌｉｎｇ）特性を示す改善された貯蔵安
定性を有する。

（実施例） 以下、本発明を実施例により説明する。なお、この実施
例は本発明を単に説明しているに過ぎず、本発明を決し
て限定するものではない。実施例中、特に記載のない限
り、全ての部及び％は重量部及び重量％であり、全ての
温度は摂氏度である。

実施例１ ニューヨーク州、ニューヨーク、ペン・プラグ２に所在
のエンザイム・ディベロプメント・コーポレーションか
らＧ−ＺＹＭＥ　９９５として入手可能なバチルス・ス
テアロサーモフィルスにより生産された市販のα−アミ
ラーゼ酵素をデンプン親和力を用いて次の方法を使用し
て精製した。

コーンスターチはα−アミラーゼを選択的に吸着するた
めに使用された。コーンスターチを最初０．０５Ｍ酢酸
ナトリウム１０．５ｍＭ塩化カルシウム中にｐｎ６．ｏ
で数日間５℃で漬けた。緩衝液をデカンテーションし、
新鮮な室温の緩衝液と置き換えた。

約２７０．（１００単位の酵素を全容量２！の上記゛緩
衝液中でデンプン３（１０ｇに添加した。この２３液を
５℃で３０分間攪拌した。次いでｇ濁液を５℃で１５分
間４０８０Ｘｇで遠心分離した。得られるペレットを新
鮮な冷たい緩衝液中に再懸濁しそして遠心分離した。こ
の洗浄手順を２回繰り返した。最終ペレットを新鮮な緩
衝液（１５（１０ｍｎ）中で再懸濁した。次いでこの懸
濁液の入った容器を６０℃の浴に浸け、攪拌した。容器
内の温度が５４℃に達したら、加水分解を４０分間進行
させる。容器は約３０分間６０℃であった。この懸濁液
を５℃で１５分間１６，３（１０Ｘ　ｇで遠心分離した
。生じるペレットは捨てた。わら色の上澄み液にα−ア
ミラーゼ酵素が含まれていた。

約１０，（１００単位の酵素を含む精製されたα−アミ
ラーゼ酵素溶液２０ｄのｐｉ（を希水酸化ナトリウム溶
液を用いて８．５に合わせた。次いで、１０Ｄ、Ｅ、の
コーンスターチ水解物２ｇを酵素溶液に熔解させた。こ
のスターチ溶液に酸無水物をゆっくりと添加した。酸無
水物は３０分間にわたって滴加された。希水酸化ナトリ
ウムを酸無水物と同時に添加し、ｐＨを８．０より上で
維持した。温度はアシル化反応の間２５乃至２７で維持
された。３０分後、溶液のｐＨを希塩酸を用いて６．８
に調整した。この酵素溶液はそのままで使用することも
できるし、透析もしくは限外濾過のような通常の方法に
よりさらに精製してもよい。

酵素の変性程度は酵素中の残余遊離アミノ基を−２，４
，６−１−ＩＪニトロベンゼンスルホン酸試薬を用い、
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
１４．３２８−３３６（１９８６）に記載のハビーブ（
Ｈａｂｅｅｂ）分析法で測定することにより求められた
。精製された未変性のα−アミラーゼ酵素に関する同様
の測定結果は参考基準として使用された。

アシル化酵素の耐熱性は、６０℃で標準α−アミラーゼ
酵素活性試験を用いて酵素活性を測定し、この値を試験
を９０℃で行った場合に得られる酵素活性と比較するこ
とにより求められる。この試験結果を表１に示す。この
結果は、かなりの割合の遊離アミノ基が酸無水物と反応
したこと、及び生じたアシル誘導体が未変性の酵素より
かなり低下した耐熱性を有していることをを示している
。

第１表 アシル化したバチルス・ステアロサーモフィルスα−ア
ミラーゼ酵素 なしく農郊＋ｌ）　　　　　　　　　１．３　　　　　
　　　　　０無水酢酸　　　　　　　　　　　０．４０
　　　　　　　　　　７３無水プロピオン酸　　　　　
　　０．３９　　　　　　　　　　７６無水酪酸　　　
　　　　　　　　０．７６　　　　　　　　　　９５無
水吉草酸　　　　　　　　　　１．０２　　　　　　　
　　　７０無水コハク酸　　　　　　　　０．８８　　
　　　　　　　６３無水安息香酸　　　　　　　　　０
．９７　　　　　　　　　　２５アセチル化したバチル
ス・ステアロサーモフィルスα−アミラーゼ酵素の活性
は、ｐＨ４，５乃至５．５である温度範囲にわたって未
変性の酵素の活性と比較された。比較するため、試料は
標準化し６０℃での活性を同一にした。活性は、温度と
ｐｉを変化させること以外は標準の試験条件を用い測定
された。これらの比較結果を第１図及び第２図に示す。

これら結果はアセチル化されたバチルス・ステアロサー
モフィルスα−アミラーゼの耐熱性は未変性の酵素の耐
熱性よりはるかに低いことを示す。

実施例２ 枯草菌由来としてカタログに掲載されている、結晶質の
細菌性α−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ＾６３８０　）を、
実施例１中のバチルス・ステアロサーモフィルス由来の
α−アミラーゼ酵素のアシル化に使用した方法と同じ方
法で、１０Ｄ、Ｅ、のコーンスターチ水解物の存在下で
無水酢酸を用いてアシル化した。

アシル化した酵素の耐熱性は、６０℃で標準α−アミラ
ーゼ酵素活性試験を用いて酵素活性を測定しこの値と試
験を８０℃で行った場合に得られる酵素活性とを比較す
ることにより求められる。未変性の酵素の８０℃での酵
素活性と６０″Ｃでの酵素活性との比は１．３であった
が、アシル化した酵素におけるこの活性比は０．５であ
った。９０℃：６０℃での未変性の酵素及びアシル化し
た酵素における対応する活性比はそれぞれ０．８２及び
０．２８であった。この結果は、本発明の方法により行
われるアセチル化は枯草菌酵素の耐熱性をかなり低下さ
せることを示す。しかしながら、そのアシル化酵素は出
発物質の活性の約１０％しか示さなかった。この結果は
、末法はこの酵素の不活性化をかなり引き起こすという
ことを示す。

比較試験 実施例１の一般手順を、ＴＥＲＭＡＭＬＹ、即ち、コネ
チカット州、ウィルトン所在のノボ・ラボラトリーズ（
Ｎｏｖｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｆｅｓ）から入手可能な
、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の市販のアミラーゼ酵素を
使用して、繰り返した。この酵素は無水酢酸でアセチル
化する前にデンプン親和性を用いて精製された。アセチ
ル化はこの酵素の活性の低下をあまり引き起こさなかっ
た。バチルス・リケニホルミス由来のアミラーゼのアセ
チル化の度合いは、バチルス・ステアロサーモフィルス
由来の酵素のアセチル化の度合いとほぼ同一であること
が、ゲル電気泳動により示された。しかしながら、この
酵素の上記アセチル化法により、この酵素の安定性は明
らかな程度まで低下され得なかった。

これらの結果は、本発明の方法が選択したα−アミラー
ゼ酵素の耐熱性を減少することに適しており、特にバチ
ルス・ステアロサーモフィルス由来のα−アミラーゼ酵
素の耐熱性を低下させることに適用できることを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の変性されたα−アミラーゼのｐＨ５
，５での、温度と酵素活性との関係と、未変性のα−ア
ミラーゼにおける同様の関係を示し、第２図は、本発明
の変性されたα−アミラーゼのｐＨ４，５での、温度と
酵素活性との関係と、未変性のα−アミラーゼにおける
同様の関係を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）変性された細菌性α−アミラーゼ酵素において、
   その酵素の９０℃での耐熱性が、未変性の対応する細菌
   性α−アミラーゼの９０℃での耐熱性より実質的に低く
   、その変性された細菌性α−アミラーゼが、バチルス・
   ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ
   ｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）又は枯草菌（Ｂａｃ
   ｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のα−アミラーゼ
   酵素のアシル誘導体からなることを特徴とする、変性さ
   れた細菌性α−アミラーゼ酵素。
2. （２）上記アシル誘導体のアシル基が、アセチル基、プ
   ロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、スクシニル基
   及びベンゾイル基よりなる群から選択される特許請求の
   範囲第１項記載の酵素。
3. （３）耐熱性が低下した変性された細菌性α−アミラー
   ゼ酵素を製造するに際して、当該酵素中の遊離アミノ基
   の少なくとも約５０％がアシル化されるまで、デンプン
   又はデンプン水解物の存在下でα−アミラーゼ酵素のア
   シル誘導体を形成させることを特徴とする、耐熱性が低
   下した変性された細菌性α−アミラーゼ酵素の製造方法
   。
4. （４）上記α−アミラーゼ酵素が、バチルス・ステアロ
   サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏ−ｔ
   ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌ
   ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来である特許請求の範囲第３
   項記載の方法。
5. （５）上記アシル誘導体のアシル基が、アセチル基、プ
   ロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、スクシニル基
   及びベンゾイル基よりなる群から選択される特許請求の
   範囲第４項記載の方法。
6. （６）上記アシル化が、当該酵素と酸無水物とを約７乃
   至約９のｐＨでかつ約５℃乃至約５０℃の温度で反応さ
   せることにより行われる特許請求の範囲第４項記載の方
   法。
7. （７）上記酸無水物が、無水酢酸、無水プロピオン酸、
   無水酪酸、無水吉草酸、無水コハク酸及び無水安息香酸
   からなる群より選択される特許請求の範囲第６項記載の
   方法。
8. （８）α−アミラーゼ酵素を用いて穀粉１ｇあたり約０
   ．４乃至約０．６ＳＫＢ単位のα−アミラーゼレベルに
   標準化した穀粉であって、当該α−アミラーゼ酵素が、
   バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）または枯草
   菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のα−
   アミラーゼのアシル誘導体よりなる変性された細菌性α
   −アミラーゼ酵素であることを特徴とする穀粉。
9. （９）上記穀粉が、穀粉１ｇあたり約０．５ＳＫＢ単位
   のα−アミラーゼレベルに標準化されている特許請求の
   範囲第８項記載の穀粉。
10. （１０）改善された貯蔵安定性を持つパン焼菓子製品を
    製造するに際して、当該パン焼菓子製品中の穀粉原料と
    して、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
    ｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）また
    は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来
    のα−アミラーゼのアシル誘導体よりなる変性された細
    菌性α−アミラーゼ酵素を用いて穀粉１ｇあたり約０．
    ４乃至約０．６ＳＫＢ単位のα−アミラーゼレベルに標
    準化した穀粉を使用することを特徴とする、改善された
    貯蔵安定性を持つパン焼菓子製品の製造方法。