JPS63301785A - 毛球部細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 歳果よΔ机堆分野 本発明は、マウス、ラット、モルモット、あるいは人の
毛球部細胞の培養方法に関する。

従来の技術および問題点 毛球部は、毛母細胞を含み発毛の根源をなすものである
。すなわち、毛母細胞は、内根鞘、小麦、皮質、髄質に
分化する。このような毛球部の細胞を培養を行うことは
、育毛剤の開発研究、並びに毛の基礎研究のために極め
て重要である。

従来、毛の細胞培養方法に関しては、いくつかの報告が
ある。しかしながら、これらの培養細胞は、すでに分化
した後の毛根鞘由来の細胞にかかるものであって、いわ
ゆる多岐に分化する前の毛母細胞を含む毛球部の細胞を
培養した例はない。

本発明は、増殖、分化能力を有し、角化状態に至る毛球
部を培養する方法を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段 本発明は、表皮および／または真皮細胞が付着したまま
の毛球部を含む皮膚を酵素処理して、表皮および／また
は真皮細胞、並びに毛球部からなる懸濁液をえ、該懸濁
液より毛細部を分離して組織培養を行うことを特徴とす
る毛球部細胞の培養方法を提供するものである。

本発明によれば、損傷することなく多数の毛球部細胞が
容易に得られる。本発明にて得られた毛球部の細胞は、
増殖、分化能力を持ち、最終的には角化状態の特徴を呈
する。すなわち、生体内において生ずる生理学的現象が
、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのシャ−レ内にて生ずる。

なお、毛球部の細胞を培養した場合には、僅かながら真
皮線維芽細胞が混入する。しかしながら、このような混
入真皮線芽細胞は、細胞をシャーレに植え込んだ後、毛
球部の細胞とのトリプシン感受性の差を利用してとり除
くことができる。したがって、本発明により毛球部の細
胞の純粋培養が可能となる。

これに対し、従来、分化前の毛球部の細胞培養が行えな
かった原因は、細胞を得る方法が毛の抜去、もしくは皮
下縁、真皮をメスで切り離すという方法であるため、毛
球部に損傷を与えているからと考えられる。真皮と毛、
あるいは表皮と毛、相互間の結合はかなり強く、したが
って、抜去による細胞の採取はそれら相互間の結合力に
抗して行うもので毛球部細胞は損傷を受けたり、あるい
は皮膚内に残留する。

本発明者らが行った従来法による細胞の採取、培養試験
においても、６００例の抜去した毛の培養において、成
功例はわずか２例にすぎず、また、これら成功例にあっ
ても、毛根鞘の細胞が遁走、増殖するのみであり、毛球
部の細胞はすべて死細胞であり増殖可能な毛球部の細胞
を得ることはできなかった。

本発明によれば、毛の色素細胞を多数得ることが可能で
ある。毛球部を構成する重要な細胞の１つである毛の色
素細胞を培養した例は従来なく、毛母色素細胞と毛母細
胞の関係を調べることは、脱毛および白髪化の両面から
の毛の老化現象の解明に有用である。

本発明にて培養に用いられる毛球部を含む毛髪サンプル
は、表皮細胞、または真皮細胞、あるいはこれらの両方
が付着したままのものを用いる。

該サンプルは、毛球部を含む皮膚を切除して得られる。

つぎに、かかる試料より毛球部の細胞を得るには、表皮
細胞と毛、真皮細胞と毛の各々相互間の結合を酵素処理
により取り除くことにより行なわれる。このような酵素
処理に用いられる酵素としては、例えば、コラゲナーゼ
、ディスパーザ、トリプシンなどが挙げらる。コラゲナ
ーゼおよびディスパーザはＣａ”およびＭｇ”″を含有
する培養液を、またトリプシンはＰＢＳ　（−）を溶液
として用いるが好ましく、酵素溶液の濃度は、通常、デ
ィスパーザ５００〜１０，０００　Ｕ／ｍｌＪ　、　コ
ラゲナーゼ０．２５％、トリプシン０゜１５〜０゜２５
％であるのが好ましい。

つぎに、かかる酵素処理により得られた表皮細胞、真皮
細胞および毛球部細胞がばらばらになった懸濁液を遠心
分離などを用いて相分離するか、あるいはパーコールの
密度勾配を用いて分離し純粋の毛球部を得る。

このようにして得られた毛球部を組織培養する。

組織培養を行うには、牛胎児血清を添加した培養液を使
用し、３７℃、５％ＣＯを下、インキュベーター内で培
養する。

なお、毛球部細胞の培養を行った後、さらにトリプトシ
ンの感受性の差に基づき、真皮線維芽細胞を除去し、毛
球部の細胞のみを単離するのが好ましい。

罠蔓牲 つｊに、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する
。

（ａ）毛球部を得る方法 マウスをクロロホルムでと殺し、７０％エタノールで皮
膚を消毒した。皮膚を採取し、イーグル培養液（Ｅａｇ
ｌｅ’ｓ　ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄ
ｉｕｍ　：以下、ＭＥＭと略す）で洗浄後、皮下縁、血
管をていねいにメスで取り除いた。

この皮膚を約９ｍｍ’の大きさに細断し、５００もしく
は１０００　Ｕ／ｍｌのディスパーゼ溶液（５％牛脂児
血清（ＦＢＳ）・ＭＥＭ内）に浸積し、−昼夜４℃下で
静置した。ディスパーゼ処理後、ビンセットでていねい
に表皮を剥離除去して真皮を得た。

得られた真皮を　ＰＢＳ　（−）に浸積し、ディスパー
ザを失活させた。

つぎに、この真皮を０．２５％コラゲナーゼ（ＭＥＭ内
）により処理した。コラゲナーゼ処理時間は、用いた皮
膚の種属・日令により変化させてよいが、いずれも３７
℃下で行う。コラゲナ−ゼ溶液内で軽く混ぜるだけで真
皮が完全に懸濁状態になる。すなわち、真皮が組織の原
形をとどめず、細胞１つ１つになる状態までコラゲナー
ゼ処理を行う。この状態では、真皮細胞の中に丸い球形
の毛球部が浮遊している。

つぎに、この懸濁液を１００Ｏｒｐｍ、　５分間遠心し
て毛球部の層を得た。得られた層をＰＢＳ　（−）で３
回洗浄することにより、混入した真皮線維芽細胞をでき
る限り取り除いた。得られた層には真皮線維芽細胞は殆
ど存在せず毛球部が優勢の状態で浮遊している。

つぎに、得られた毛球部を１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ（抗生
物質および１０　ｎｇ／ｓｌのコレラトキシンを含む）
を加え、軽く撹拌し、組織培養用シャーレに植え込み、
５％ＣＯｔインキュベーター内（３７℃）で培養したと
ころ、多くの毛球部の細胞が遊走し増殖した。

（ｂ）毛球部単離培養方法 上記の方法によりほとんど真皮を取り除くことができる
が、なお僅かながら真皮線維芽細胞が混入する。培養後
、真皮線維芽細胞を除去し、毛球部の細胞のみを単離す
るには、毛球部の細胞と真皮細胞の両細胞のトリプシン
感受性の差を利用する。

まず、ＰＢＳ　（−）で細胞をよく洗浄し、さらに０．
０２％ＥＤＴＡで洗う。その後、０．１５％トリプシン
（３７℃、５分間）処置をする。これらの一連の操作を
施すと、毛球部の細胞はシャーレに付着するが、混入し
た真皮線維芽細胞は浮遊する。

また、１０　ｎｇ／ｍｌのコレラトキシンを添加するこ
とにより、真皮線維芽細胞の増殖を抑制することができ
る。培養の結果、真皮線維芽細胞は除去され毛球部の細
胞の純粋培養を行うことができた。

培養されたこれらの細胞は、つぎの方法により毛球部の
細胞であることが確認された。

（１）毛球部の細胞と表皮細胞のケラチンパターンを等
電点、分子量により二次元解析すると、各々のケラチン
スポットに相違がある。

（２）通常マウス表皮には色素細胞は存在しない。

従って、表皮細胞を培養すると色素細胞が共存している
ことはない。一方、マウス毛球部には多数の色素細胞が
存在する。

本発明によりマウス毛球部の細胞を単離培養すると、多
数の毛母色素細胞が共存している。

（３）表皮細胞を通常培養液のＣａ濃度で培養すると、
角化が起こり、毛球部の細胞も同様に角化が起こる。し
かし、両者の角化の状態には相違がある。すなわち、表
皮細胞はシート状に角化するが、毛球部の細胞は縦に長
く線維状に角化する。

（４）シャーレに対する付着率について、表皮細胞と毛
球部の細胞の間で相違がある。表皮細胞は組織培養用プ
ラスチックシャーレでも付着する率は悪く、ガラスシャ
ーレ並びにバクテリア用シャーレにはほとんど付着する
ことはない。

本発明により得られた毛球部のシャーレに対する付着率
は良く、ガラスシャーレ並びにバクテリア用シャーレで
も付着し得る。

本発明の方法により培養された毛球部の細胞は、育毛剤
開発研究や、多方面にわたる毛の基礎研究に使用しうる
。したがって、毛の発生に関与する因子をとらえ、永年
未解決のままであった脱毛の機構の解明の手だてとなる
。

及胛Δ然果 本発明によれば、増殖、分化能力を有した角化状態に至
る毛球部の培養が可能となり、育毛剤の開発研究、並び
に毛の基礎研究に利用することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）表皮および／または真皮細胞が付着したままの毛
   球部を含む皮膚を酵素処理して、表皮および／または真
   皮細胞、並びに毛球部からなる懸濁液をえ、該懸濁液よ
   り毛細部を分離して組織培養を行うことを特徴とする毛
   球部細胞の培養方法。