JPS6328399A - バイオ接着性ポリフエノ−ル蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ この発明は、チロシン含有残留物を含む前駆物質からジ
ヒドロキシフェニールアラニン（Ｌ−ドーパ）残留物を
含有するところのバイオ接着性ポリフェノール蛋白質を
得る製造方法に関する。

生成されたバイオ接着性ポリフェノール蛋白質は種々の
表面に対し優れた接着力を発揮するものて、これらの表
面は高度の湿気にさらされる表面や水中に沈めた物体の
表面等も含まれる。一方、チロシン含有前駆物質はこれ
らの特性をもっていない。

明細書の浄書（内容に変更なし） ［従来の技術］ 自然生物源に起源をもつバイオ接着性ポリフェノール蛋
白質は、水中又は高湿度環境で硬化するバイオ接着剤の
クループを基本とし、硬化後可撓自在かつ伸長自在であ
る。これらのバイオ接若性接石刑は、正確なＭＨ＆と硬
化条件に左右されなから、腐食と生物学土の攻撃に抵抗
力がある。二枚貝属のミティラス（ｋｌｙｔｉｌｕｓ　
）の幾つかの種に起源をもつバイオ接着性ポリフェノー
ル蛋白質は自然資源から得ることもてきるし、合成的に
製造することもでき、次の式をもつ−乃至それ以上の反
復゛デカペプチドの続きを有する。

赴＾　　　ＬＹＳ　　　円α隋ｐ　史■圏腑ψ力鴎イ鴫
榊戸む倫消Ｓび（１７ＨＲｙｙ塑刀鴎　　ＬＹＳ上式に
おいて、各Ｘは水酸基と水素からなる基から独立して選
択されたものであり、かつ各Ｒは水素とメチル基からな
る基から独立して選択されたものである。この発明て用
いる用語“バイオ接着性ポリフェノール蛋白質”は、ｌ
乃至約１，０００単位の上記反復デカペプチドからなる
蛋白質の混合物を意味し、かつ選択的に他の蛋白質単位
と連鎖を有することもてきる。

公知の大部分の接着剤は単層水の水を含有する清浄な表
面とよく作用し合い、上記単層水は接着剤と接看する水
素用の場所を具える。従来の接着剤の場合、添加水は表
面で作用を弱めたりあるいは接着剤を加水分解したり可
ヨ化する。

一方、バイオ接着性ポリフェノール蛋白質の接着剤にと
っては、アミン、ヒドロキシル及びカテコールの残留物
は、基体（ｓｕｂｓｔ、ｒａｔｅ）に対し結合及び接着
力用の種々の接着剤（共有結合剤、イオン結合剤、水素
結合剤及びファンデアワール結合剤）　（Ｖａｎ　ｄｅ
ｒ　Ｗａａｌｓ　ｂｏｎｄｉｎｇ）を適用できる多数の
反応部位を提供する。バイオ接着性蛋白質（１３０，０
００）の分子量は、結合力を増大させ、−方、大きな極
の側面連鎖は結晶形成を阻止し基体（ｓｕｂｓｔｒａｔ
ｅ）つきの分子のもつれを促進する。

海中棲９の二枚貝に起源をもつバイオ接着性ポリフェノ
ール蛋白質の反復デカペプチド構造体は“バイオ接着性
ポリフェノール蛋白質から生成したデカペプチド”と称
する米国特許第４，５８５，５８５号に開示されている
。

二枚貝（Ｍｙｔｉ　１ｕｓ）からバイオ接着性ポリフェ
ノール蛋白質を抽出する方法は、かかる抽出された蛋白
質の反復ペプチドへの消化方法（Ｗａｉｔｃ　１９８３
Ｊ、　Ｒｉｏｔ　、Ｃｈｅｍ　２４．５０１０）として
、　Ｗａｉｔｅ　ａｎｄ　Ｔａｎｚｅｒ７の１９８１．
５ｃｉｅｎｃｅ　２１２　、１０３８に開示されている
。　しかしながら、これまでバイオ接着性ポリフェノー
ル蛋白質の合成製造方法は全く知られていない。

有機方法による蛋白質の合成は複雑である。現在、半自
動又は全自動の合成装置か利用されており、この合成装
置は小規模ながら（すなわち、２．０ｇｍ５まで）製造
工程を単純化している。この方法に必要とされるＬ−４
−バ前駆物質は市場て阪売されておらず、そして有機組
織の中で適切に合成かつ混合されるならば、効率は５０
〜８０％の範囲内にある。直接合成法てチロシンを導入
すること及び完＋Ａｌノたチロシン含有蛋白の酵素修飾
法を利用してＬ−ドーパを導入することは回心である２
組織の中に混入して完成し可能である。モノフェノール
モノオキシゲナーゼ（チロシナーゼ）は、酵母、菌類、
動物及び植物の中に見られる。このタイプの酵素は、き
のこ、果物及びこん虫に見られるキノンなめし反応の原
因である化′７剤として一般に知られている。

は乳動物のチロシナーゼは、メラニン組成物に反応する
細胞、メラノサイト中に見られる（　　Ｊ　　ｉｍｂｏ
ｗ　　、ｅＬ　　ａｌ、Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａ
ｔｏｌ、７５，１２２−１２７．１９７６）　、このメ
カニズムは、蛋白質中のチロシンのドーパへのチロシナ
ーゼ転換を含むものと思料される。すなわち、この転換
は有用なシスチン残留物を介し他の蛋白質に交差結合す
る。

（Ｉｔｏ、ｅｔａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、２２２，４
０７−４１１．１９８４）　、チロシナーゼによって変
形した他の蛋白質は、インシュリン（Ｃｏｒｙ　ａｎｄ
　　Ｆｒ１ｅｄｅｎ＋Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５゜
１１６−１２０．１９６７）と、酵母アルコールシヒ１
−ロゲナーゼ（Ｃｏｒｙ　ａｎｄ　Ｆｒ１ｃｄｅｎ、Ｆ
ｔｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ　５゜１２１−１２６）とウ
シ科の血清アルブミン（Ｆｒ１ｅｄｅｎ。

ｃｔ、ａｌ、、　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｅ、Ｆｅｄ、Ａｍ、Ｓ
ｏＣ，Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、１８，４３８゜１！１５９）
とから成る。これら全ての蛋白質はチロシナーゼにより
５−３−システイニル　ドーパ組織に転換されるものて
、ｌＬｏ、ｅＬ　ａｌ、（Ｑｉｏｃｈｅ＠１．２２２．
４０７−４１１．１９８４）により分析された。

［発明の４ｉ１成コ この発明は、チロシン含有曲部物質からバイオ接着性ポ
リフェノール蛋白質の合成方法とその使用方法に関する
ものである。

その構成を要約すると、 チロシン残留物を含有する蛋白質前駆物質から３．４−
ジヒドロキシフェニールアラニン残留物を含有するバイ
オ接着性ポリフェノール蛋白質の製造方法において、 チロシン含有蛋白質を調整し、 ｔｇｇ蛋白質につき約５乃至約５０単位酵素のｅｆＪ素
対正対蛋白質比率Ｈ約４．５乃至約８並びに約２０℃乃
至約３７℃の温度で、前記蛋白質をチロシナーゼ酵素と
反応させ、それによって３．４−ジヒドロキシフェニー
ルアラニン残留物を含有するバイオ接着性ポリフェノー
ル蛋白質を生成する。

バイオ接着性ポリフェノール蛋白質の線形ポリマー１ｉ
ｉｊ駆物質は、適切にブロック化され、かつ保護された
アミノ酸を利用する従来のペプチド法を用いて合成する
ことかてきる。あるいは、線形ポリマー前駆物質は、ヒ
ドロキシル化されたプロリン又はチロシンを除く遺伝的
に合成されたバイオ接着性ポリフェノール蛋白質（すな
わち、公知の方法によって生化学蛋白質合成試薬を用い
て転換された逍仏子のシーケンス）のそれと類似の第１
次シーケンス（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を具えてもよし＼、
加えて、線形ポリマー前駆物質は、以上２つの組合わせ
てもよく、かつその他の融和性のポリマーを含有させて
もよい。

融和性ポリマーは、アミン多量、かつ、ヒドロキシル多
量蛋白質又は有機ポリマーを意味し、そ明細書の浄書（
内容に′Ｘ財なし） してバイオ接着性ポリフェノール蛋白質と組合わせて使
用する時、これらの融和性ポリマーは接着・結合組織に
何ら悪い影響を及ぼさない、バイオ接着性ポリフェノー
ル蛋白質の一つの前駆Ｔｈ質は次の様に表わすことかで
きる。

Ａｕ　　　　ＬｙＳ　　　ＰＲＯテ〜１ｅＴＹＲｐＫ＋
　　　？ＦＯ５ＥＪＩ／ｒＨＲ１ＬＹＳこの化学式にお
いて、各Ｒは水素とメチルから成る基から独立的に選択
される。線形ポリマー前駆物質はＬ−ドーパ（Ｌ−ｄｏ
ｐａ　）あるいはし−ドーパ等価物なしに合成される場
合、チロシン又はチロシン等価物を化学的に又は酵素的
にカブコール残留物に変換することかできる。同様に、
もしプロリンか線形ポリマー前駆物質に含まれている場
合、プロリンをヒドロモジプロリン残留物に酵素的にｆ
換することかできる。

合成工程の手順は蛋白質のクラスについて、いくつかの
性走を４處しなければならない。

■）塩（，５−３Ｍ　Ｎａｃｌ、Ｋｃｌ、又はＬｉＣ１
）の存在する中で中位ｐＨ又は低ｐＨによる抽出された
バイオ接着性ポリフェノール蛋白質の不溶解性は、高リ
シン、チロシン及びＬ−ドーパの機炬である。

２）約２０以上の残留物の数をもち、かつこれらアミノ
酸と同比率をもつ短ペプチドはＬ−ドーパではなくチロ
シンを含有する短ペプチドと同じ溶解性をもつ。

３）ブロック（ｂｌｏｃｋｅｄ）され、完全に保護され
たＬ−ドーパ（ｆｕｌｌｙ　ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）は商
業的に使用することばてきす、かつその分子の極度の不
安定性の故にその合成と引続くペプチドへの混入を伴う
浄化はむずかしい。

４）Ｌ−ドーパの混入と共に、ペプチド又は蛋白質は金
属、酸化に極度に感応し、そしてガラス器具又は他の蛋
白質への拘束力による損失にも過敏となる。

この発明によれば、幾つかのチロシン塁厚蛋白質とペプ
チドは酵素的にヒドロキシル化されている。

１）合成蛋白質：Ｌ−ドーパてなくヒドロキシプロリン
を含有する米国特許第４，５８５，５８５号に開示され
たデカペプチド：チロシンは１，０００につき２００の
残留物で存在する。使用したデカペプチドは単一のデカ
ペプチド及びデカペプチドの５回の尺復であった。

２）抽出したカゼイン、１，０００のチロシンにつき４
６の残留物を含有する自然蛋白質：３）抽出したカゼイ
ン、ｌ　、０００のチロシンにつき１０の残留物を含有
する自然蛋白質。

［実施例］ 実施例　１−３ デカペプチドにおけるチロシン残留物のし一ドーパ残留
物への変換 この発明によれば、チロシン残留物のし一ドーパ残留物
への酵素変換は、チロシネーゼと言われる酵素の区分に
より仲介することか可ｆｌである。

すなわち、モノフェノールモノオキシゲナーゼ：ボソフ
ェノール才キシダーゼ；カテコールオキシダーゼ：モノ
フェノール、ジヒドロキシフエニールアラニン二Ｍ′素
オキシド還元酵素、（ＥＣＩ。

１４．１８．１）等、これらの実施例において、すぐに
利用できるきのこ形チロシナーゼか使用された。これら
の酵素はチロシンのし一ドーパへの変換のみならずＬ−
ドーパのキノンへの転換をもたらす。

しかしながら、後者の反応を、アスコルビン酸、重亜硫
酸塩等の還元酵素の存在の中で遅滞又は取消す（ｒｅｔ
ａｒｄｅｄ　ｏｒ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ）ことかできる。

合成デカペプチドは固相ペプチド合成によって調整され
る。用語“固相”は合成か発生する方法に関するもので
、すなわち、それはマトリックスに固定され、そして第
１アミノ酸はクロマトグラフ樹脂に付着（ａｔｔａｃｈ
ｅｄ　ｔｏ）される、アミノ酸の譲形鎖は各アミノ酸の
連続追加によって生成され、アミノ接合の形成を促進す
る状態で１回に−っである。セリン、スレオニン及びチ
ロシンのヒドロキシル等の変化しやすいサイドグループ
（ｓｉ、Ｊｃ　ｇｒｏｕｐ）は合成か完成後、非ブロッ
ク化されている「プロテクテイブ又はブロッキング」グ
ループと共に添加される。ペプチドは最後のアミノ酸添
加物の端でマトリックスから押しきってすすみ、非ブロ
ック化されかつ純化される。

一般に、チロシンのし一ドーパへの変換は４．５乃至８
のＰＨ範囲、望ましくはｐＨ７〜７．５で生ずるのかよ
い６反応は室温及び２０乃至３７℃以上で急速に生じ、
かつ４℃て極めてゆるやかに反応する。試験された緩衝
剤は融和性がある。すなわち、０．１廼燐酸ナトリウム
、ｐＨ７；０．ＩＭ酢酸ナトリュウム、ＰＨ５：０．１
舅２（Ｎ−モルフォリノ）エタン硫酸、ｐＨ７である。

酵素対蛋白質基の比率の調整、温度及びｐＨは反応比率
を調整するために用いることかできる。はとんどの実施
例にとって、酵素対蛋白質基の比率はＩＡＬｇの蛋白質
に対し５．４乃至１５単位の酵素てあった。

Ｐ）Ｉは０，１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝剤において７て、
ｉＳ！度は２１ないし２３℃てあった。Ｌ−アスコルビ
ン酸は実施例に含まれており、これらは反応生成物の生
化学反応を必要とする。何故なら、Ｌ−アスコルビン酸
は第２の反応、すなわちＬ−ドーパのキノンへの変換を
遅延させ、かつ逆転（ｒｅｔａｒｄ　ｏｒ　ｒｅｖｅｒ
ｓｅ）させるからである、接着決定（ａｄｈｅｓｉｖｅ
　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）の場合、Ｌ−アスコル
ビン酸は通常削除され、共有架橋結合の形成を可能とす
る。１０％のｖ　／　ｖ酢酸の等址の変換反応への添加
はｐＨを３以下に減少させ、そして反応を終了する。実
施例１において、室温で保たれた反応混合物は０．９１
の燐酸ナトリウム（０，１Ｍ、ｐＨ７）、　　０．１ｍ
１合成単独ユニットのチロシン含有デカペプチド（０，
１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝剤において１０ｍｇ／ｍｌ、ｐ
Ｈ７）、　０．０２５ｍ１チロシナーゼ（０，１ｍ燐酸
ナトリウム緩衝剤において２１６単位／弘１）及び０、
Ｏ１■ＩＬ−アスコルビン酸（同じ燐酸ナトリウム緩衝
剤におけるｏ、ｔｌｌｌ）から成る。

第１図において明かな通り、１０分間以上の間、最大変
化（減少）の波長は２９２〜９２４ｎｍである。Ｌ−ア
スコルビン酸なしの制御操作として、同じ反応が３分間
で完了し、Ｌ−ドーパからのキノン残留物形成は急速で
ある。

反応は、生成物のアミノ酸組成物分析と共に、分析工具
としての高圧液体クロマトグラフを用いて、より精とに
特徴ずけられている０反応はより多くのアスコルビン酸
（５０ＸＪ−記＝度）の添加に伴いゆるやかになった。

２つの生成物ピークはクロマトグラフの見地から明瞭な
ビーつてあり。

９の位を又は５の位ｔでチロシンのヒドロキシル化を表
わすものと考えられ、いずれか一つはＬ−ドーパ含有ペ
プチドを生成する。親のデカペプチドピーク（ｔｈｒ　
ｐａｒｅｎｔ　ｄｅｃａｐｅｐＬｉｄｅ　ｐｅａｋ）と
生成物ピークの領域は、比率変換のインディケータとし
て４１１成される。（第２ａ図及び第２ｂ図参照）実施
例２において、７．ＯｐＨ燐酸ナトリウム緩衝剤か第１
実施例の如く使用された。実施例３において、５．Ｏｐ
Ｈの酢酸ナトリウム緩衝剤が燐酸塩緩衝剤の代りに使用
された。その結果は第１表に要約されている。

第１表 Ａ、燐酸塩ｐＨ７，０の変換 ペプチドの比率 時間　　　　親　生成物ｌ　生成物２ Ｂ、　酢酸ナトリウムｐＨ５，０の変換時間　　　　親
　　生Ｊ＆物ｌ　　生成物２実施例　４−６ チロシン残留物をもつデカペプチドの３．４及び５の反
復を含む蛋白質は、４３単位／ｇｇデカベチトの酵素対
基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の比率でｐ＋＋　７．０の
燐酸ナトリウムの緩衝剤に変換される。

酵素対基質の比率は、より大きなペプチドの変換が１ｆ
ｆｉ項（ｓｉｎｇｌｅｔ）のデカペプチドに対するより
も遅いが故に増強される。生成物分布の色層分析は生成
物ピークの数かヒドロキシル化されるチロシンの数に正
比例して増大される故に不可能である。クロマトグラフ
ィーは反応か完結してしまったことを証明するために使
用された。　０．１Ｍ　　燐酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ
７，０）における室温（２１〜２３℃）ての反応混合物
は、２．０１の全量において２１．５００単位のチロシ
ナーゼ、ｓｏｏ　ｔｔｇの合成ペプチド及び１．ＯＭＬ
−アルコルビン酸１００μ、ｌからなる。

第２表は反応生成物のアミノ酸組Ｉ＆物を示す。

酵素とＬ−アルコルビン酸は超ろ過による生成物から分
離された。

第２表 在人ｊ膚ｊ罫Ｖ（亡乏上からのチロシナーゼ転換生成物
のアミノ酸組成物（基本アミノ酸のみ） 非転換デカ　　３Ｘ　　　　４Ｘ　　　　５Ｘペプチド
　生　成　生　成　生　成 １．３．５Ｘ　　合成物　合成物　合成物４−ヒドロキ
ー シブロリン　　２０５　１７３　１４５　１１６スレオ
ニン　　　９５　　９２　　９０　　８２セ　　リ　　
ン　　　　　８５　　　１０２　　　　９１１　　　１
０７ブロリン　　９９　１０３　　ｔｏｌ　　　９８ア
ラニン　　９９　　９！］　　　９５　　９１Ｌ−ドー
パ　　　　　　　　７０　　　７３　　５１チロシン　
２０３　　９２　１１３　１１６リ　　ジ　　ン　　　
１９７　　　１６７　　　１７７　　　１５５出発材料
に比較する時生Ｉ＆物のアミノ酸組成物は、チロシン残
留物のＬ−ドーパ残留物への転換を確認するものである
。

１ｍヱ４７−多 ２つの天然蛋白質は、Ｌ−１・−バ転換へのチロシンを
実証するため同様の方法で処理され１ト、カゼインにと
って、転換は１−一バー硝酸処理を用いて監視された（
Ｗａｉｔｅ　ａｎｄ　Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、１９３４．酵
素学の方法１０７，３９７−４１３）、カゼインに平行
して、上記実施例６において処理された合成５　×　デ
カペプチドは、反応制御として使用された。酵素対基質
の２つの比率すなわちＬ−アスコルビン酸の不在の中で
の燐酸ナトリウムｍｉ剤（０，１１１，ｐＨ７）の全て
が、８０分間モニターされた１つの分析物のケースを除
き、４０＋ｊ（ｌｆｉにわたりモニターされた０合成デ
カペプチド（５Ｘ反復）にとって、酵素対基質の比率は
１３．５及び２１．６単位／井ｇであった。カゼインに
とって、酵素対基質の比率は１．３及び５．１単位／１
２−ｇてあった。コラーゲンにとって、その比率は１２
及び３６単位／ｇｇであった０反応は室温（２１〜２３
℃）て１１の燐酸ナトリウム緩衝剤（Ｇ、１Ｍ、　９１
１７）の中にみとめられた。

第３図はそのデータを示す、全ての調整におけるチロシ
ンは同様の比率で転換された。同じ反応かコラーゲンに
対しもたらされたか、サンプルは酵素によるコラーゲン
の迅速ゲル化による分析物に対し除去されることはでき
なかった。Ｊ：述した４す、Ｌ−アスコルビン酸はキノ
ン組成を逆転（ｒｅｖ／！ｒｓｅ）するか、それは交差
結合反応において完結する。接着剤の強さと粘着の強さ
か共有原子価相互作用ずなわちＬ−ドーパ交差結合を通
して強化される場合、し−アルコルビン酸は反応から除
去されるべきである。

）プｒ−礼先デー！λ割、−二止二イ：（−一シ；−１
≧艷−（夕と−ａＣワーｊ二ｒｍ蛋白質の接着力は接Ｅ
基板としてのアルミニューム片と、１平方ｃｍの接τ１
ｆｆｉｖＬ及び垂直剪断力テスト（第３表）を用いてテ
スｌ−された（第３表参照）。ＪＣらの特殊な箔片は約
６００グラムで破断した。条件と比率は、チロシナーゼ
転換の接着力に対する影ゴを用確に実証するため第３表
に示す通つに変えた。

カゼインの前培養とチロシナーゼとの合成ペプチドは、
Ｉ！ｓ大するＬ−ドーパ含有の接着力に対するＷｆｆを
示すため行なわれた０合成デカペプチド用の接着力は、
より高い酵素比率又は低酵素比率で増大した前培養時間
に伴って増大した。

Ｌ−アスコルビン酸の不在の中で、限界はキノン形成に
より５分から１０分の前培養詩間の間で到達した。カゼ
インの場合も同して、１０分から２０分の前培養時間の
間て生した。

第３表 １，０００残留物ごとのＬ−ドーパ残留物へのチロシン
転換と相互に関係した接着力接着性　　　チロシナーゼ
　前培養　破断力蛋白質　　（単位／μｇ）　　（分）
　　（ｇ＋＋／ｃｒｎ’）ｌ１合成デカ ペプチド　　　０　　　　０　　　０ ５×　反復　　２１．６　　　０　　３００４０μｇ／
接着　　　１３．５　　　　０　　　　　０１１．５　
　　２　　１３０ ＋１．５　　　５　　１７５ １１．５　　１０　　　　０ ２、カゼイン　　　　ｌ：１．５　　　　０　　　５４
０４０壓ｇ／接若　　１：１．５　　　２　　４８８１
コ、５５５５０ １３．５　　１０　　７２０ １１．５　　２０　　２９０ ３、コラーゲン ４５鉢ｇ／ｌａ着　　　１２　　　　　　０　　１ｉ０
０コ０琲ｇ／接着　　　　　　３６　　　　　　　　　
　　ロ　　　　　６００χｊ」（−麿 この実施例は、ただ一つの＋ｉカ培養時間でカテコール
オキシターゼ対バイオ接着性ポリフェノール蛋白質の比
率の接着力に対する影響を実記するものである０合成ペ
プチドの一定量（すなわち５回反復した線形デカベブチ
１〜連鎖）を、アルミニュム箔の２つの部材間で接着を
形成する前に、きのこ形チロシナーゼ（カテコールオキ
シダーゼ）の量を変化させて、２分間培養した。接着面
積は１、コｃｒｎ’であった。

手順は全て室温て行なわれた。全ての接着剤は１．０　
鉢１の０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７，０）中
４０、ｇの合成ペプチドな含有する。きのこ形チロシナ
ーゼの濃度は接着面上の合成ベブチｌ−１ｇ　ｇにつき
５．４，１０．８，２１．６，３２．４，４１２及び５
４であった。各接着剤に対する液体遍、は、０．１補燐
酸ナトリウム緩衝剤（ｐｌ＋　７．０）の適正量の添加
でｓ、ｏ延ｉで一定に保たれた。それぞれの接着力は平
均５回のテスト結果を示す、接着剤を１時間放置して硬
化し、それから１秒２５グラムの比率でピストン生成応
用変形をもって、圧力ゲージ（０〜５００Ｇ■範囲）と
ギアモータ間に上記部材を締結させることにより測定し
た。第４図はその測定データを示す、幾つかの変数を使
えるという事実が図示されている　２分間設定の前培養
時間て、１延ｇの接着蛋白質につき酵素３０〜４０単位
が最適である。アスコルビン酸か含有されているならば
、更に、酵素を増加させることも出来る。　０．Ｈｌ燐
酸ナトリウム緩衝剤中の０．５．１のｏ、ｉｎアスコル
ビン酸との平行の続きが組成物中に含まれていた。接着
力とチロシン対し一ドーパ転換率の双方は、この酵素反
応率に影響を及ぼす変数によ−）で操作自在である。こ
れらは酸化・量元剤のＰＨ，湿度及び使用度を含む、蛋
白質か４０単位／　ｈ　ｇ以上の場合、酵素蛋白質濃度
は乾性蛋白質結合剤としで接着力に寄与する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の実施例１に系るチロシン含有ペプ
チドのＬ−４−バ含有ペプチド−＼の転換に対する相対
吸収性対波長（ｎｍ）のグラフ、第２ａＵＡは、実施例
１で使用した親デカペプチド（ｐａｒｅｎｔ　ｄｅｃａ
ｐｅｐｔｉｄｅ）の２８０ｎｍ対時間（分）ての吸収性
のグラフ。 第２ｂ図は、実施例で得た生成物の分による２８０１１
＆対時間（分）での吸収性のグラフ、第３図は、実施例
７〜８において得られたＬ−トーバ（ｇ／ｍｌ）対時間
（分）の濃縮を示すグラフ、 第４図は、実施例９における破断力（ｇｍ／１．３ｃｒ
ｎ′）対酵素・接着蛋白質率（中位Ｍ素／μｇ接２７蛋
白質）の関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）チロシン残留物を含有する蛋白質前駆物質から３
   ，４−ジヒドロキシフェニールアラニン残留物を含有す
   るバイオ接着性ポリフェノール蛋白質の製造方法におい
   て、 チロシン含有蛋白質を調整し、 １μｇ蛋白質につき約５乃至約５０単位酵素の酵素対蛋
   白質比率でｐＨ約４．５乃至約８並びに約２０℃乃至約
   ３７℃の温度で、前記蛋白質をチロシナーゼ酵素と反応
   させ、それによって３，４−ジヒドロキシフェニールア
   ラニン残留物を含有するバイオ接着性ポリフェノール蛋
   白質を生成させるバイオ接着性ポリフェノール蛋白質の
   製造方法。 （２）前記チロシナーゼ酵素は、きのこ形チロシナーゼ
   である特許請求の範囲第１項記載のバイオ接着性ポリフ
   ェノール蛋白質の製造方法。 （３）前記反応は、十分なアスコルビン酸の存在の中で
   行なわれ、３，４−ジヒドロキシフェニールアラニン残
   留物のキノンへの転換を効果的に遅らせるようにした特
   許請求の範囲第１項記載のバイオ接着性ポリフェノール
   蛋白質の製造方法。 （４）前記チロシン含有蛋白質は、固相ペプチド合成に
   より得られる特許請求の範囲第１項記載のバイオ接着性
   ポリフェノール蛋白質の製造方法。 （５）前記反応のｐＨは７乃至７．５である特許請求の
   範囲第１項記載のバイオ接着性ポリフェノール蛋白質の
   製造方法。 （５）前記反応は、緩衝媒体中で行なわれる特許請求の
   範囲第１項記載のバイオ接着性ポリフェノール蛋白質の
   製造方法。 （７）前記チロシン含有蛋白質と前記酵素は酵素対蛋白
   質の比率に反比例する時間の間に互いに混合して前培養
   されてなる特許請求の範囲第１項記載のバイオ接着性ポ
   リフェノール蛋白質の製造方法。 （８）前記前培養は０乃至約１５分間行なわれる特許請
   求の範囲第７項記載のバイオ接着性ポリフェノール蛋白
   質の製造方法。 （９）前記反応は反応系のｐＨを約４以下に減少させる
   ことにより終了され、かつ３，４−ジヒドロキシフェニ
   ールアラニン残留物を含有するバイオ接着性ポリフェノ
   ール蛋白質が回収されてなる特許請求の範囲第１項記載
   のバイオ接着性ポリフェノール蛋白質の製造方法。