NO871664L - Fremgangsmaate for fremstilling av dopa-holdige bioadhesivproteiner fra tyrosinholdige proteiner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder fremstilling av bioadheslve, polyfenollske proteiner som inneholder dihydroksyfenylalanin (L-dopa)-rester fra forløpere som inneholder tyrosin-holdige rester. De bioadheslve, polyfenollske proteinene som fremstilles, oppviser uvanlig overlegne adhesivegenskaper mot en rekke overflater, inkludert overflater som eksponeres for store fuktighetsmengder eller overflater som er neddykket under vann, mens de tyrosin-holdige forløperene ikke oppviser disse egenskapene.

Bioadheslve, polyfenoli ske proteiner som er oppnådd fra naturlige, biologiske kilder, er basis for en gruppe av bioadhesiver som herdes under vann eller i omgivelser med høy fuktighet, og forblir fleksible og sprekkbare etter herding. Disse bioadhesivene motstår korrosjon og biologisk angrep i varierende grad, avhengig av den nøyaktige sammensetningen og herdebetingelsene.

Bioadheslve, polyfenollske proteiner, som opprinnelig ble oppnådd fra mange arter av muslingslekten Mytilus, kan oppnås enten fra naturlige kilder eller fremstilles syntetisk, og inneholder en eller flere sekvenser av gjentatte dekapeptider med formelen:

hvor hver X uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydroksyl og hydrogen og hvor hver R uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og metyl. Slik det anvendes i foreliggende søknad, skal uttrykket "bioadheslve, polyfenollske proteiner" forstås å referere til blandinger av

proteiner som inneholder fra 1 til ca. 1000 enheter av de ovenfor gjentatte dekapeptidene, og kan eventuelt inneholde andre proteinenheter og kjedeforbindere.

De fleste kjente adhesiver reagerer godt med en ren overflate som inneholder et enkeltsjikt av vann, idet dette vannet tilveiebringer stillinger for hydrogenbinding med adhesivet. For kjente adhesiver vil imidlertid hvilket som helst ytterligere vann svekke reaksjonen ved overflaten eller hydroly-sere eller mykne adhesivet. For bioadhesive, polyfenollske proteinadhesiver utstyrer på den annen side amin-, hydroksyl— og katekolestene sammen strukturen med et overveldende antall reaktive stillinger som er i stand til alle nivåer av reaksjoner (kovalent, ionisk, hydrogen- og Van der Waal-binding) for kohesiv og adhesiv styrke. Molekylvekten til de bioadhesive proteinene (130.000) øker kohesiv styrke mens de store, polare sidekjedene hindrer krystalldannelse og fremmer molekylinfiltrering med substratet.

Den gjentatte dekapeptidstrukturen i det bioadhesive, polyfenollske proteinet som er oppnådd fra havmuslingen, er beskrevet i US patent 4.585.585 med tittelen "Decapeptides Produced from Bioadhesive Polyphenolic Proteins". Fremgangsmåter for ekstrahering av det bioadhesive, polyfenollske proteinet fra Mytilus er kjent på fagområdet (Waite og Tanzer, 1981, Science 212, 1038) slik som også fremgangsmåter for fordøyelse av disse ekstraherte proteinene til gjentatte peptider (Waite 1983, J. Biol. Chem. 24, 5010). Til nå har det imidlertid ikke vært kjent noen metode for den syntetiske fremstillingen av bioadhesive, polyfenoliske proteiner.

Syntesen av proteiner ved organiske metoder er kompleks. For tiden er det tilgjengelig synteseutstyr som er semi- eller fullautomatisert, og derfor forenkler prosessen, i det minste i liten skala (dvs. opptil 2,0 g). Den L-dopa-forløper som kreves for denne metoden,; er ikke kommersielt tilgjengelig, og dersom den syntetiseres riktig og innblandes i det orga niske skjemaet, er effektiviteten i området på 50-80$. Det er mulig å innblande tyrosin i det direkte synteseskjemaet og bruke enzymatisk modifikasjon av det ferdige, tyrosin-holdige proteinet for å gjennomføre innblandingen av L-dopa. Monofenol-monooksygenaser (tyrosinaser) er beskrevet i gjær, sopp, planter og dyr. Denne type av enzym er generelt kjent som det middel som er ansvarlig for den kinongarvereaksjonen som forekommer i sopp, frukt og insekter. Pattedyrtyrosina-ser er beskrevet i melanocytter, celler som er ansvarlige for melanindannelse (Jimbow et al., J. Invest. Dermatol. 75, 122-127, 1976). Denne mekanismen antas å omfatte tyrosinaseomdannelse av tyrosin i proteiner til dopa som så tverrbinder med andre proteiner ved tilgjengelige cystinrester (Ito et al., Biochem. J. 222, 407-411, 1984). Andre proteiner som er modifisert av tyrosinase, omfatter insulin (Cory og Frieden, Biochemi stry, 6, 116-120, 1967 ), g j æralkoholdehydrogenase (Cory og Frieden, Bi ochemi st ry, 6, 121-126) og kvegserum-albimun (Frieden et al., Fed. Proe. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 18, 438, 1959). Alle disse proteinene ble omdannet med tyrosinase til S-S-cysteinyldopa-tverrbundne strukturer og analysert av Ito et al. (Biochem. J. 222, 407-411, 1984).

Det er derfor hovedformålet med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for syntese og bruk av bioadhesive, polyfenollske proteiner fra tyrosin-holdige forløpere.

Dette så vel som andre formål og fordeler oppnås ved hjelp av foreliggende oppfinnelse som tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av bioadhesive, polyfenollske proteiner som inneholder 3,4-dihydroksyfenylalanin-rester fra protein-forløpere inneholdende tyrosinrester omfattende:

fremstilling av et tyrosin-holdig protein,

omsetning av dette proteinet med et tyrosinaseenzym ved et pH på fra ca. 4,5 til ca. 8 og en temperatur på fra ca. 20 til

ca. 37°C ved et forhold mellom enzym og protein på fra ca. 5 til ca. 50 enheter enzym pr. mikrogram protein, og

derved fremstilling av et bioadhesivt, polyfenolisk protein som inneholder 3,4-dihydroksyfenylalanin-rester.

Foreliggende oppfinnelse vil forstås lettere med henvisning til tegningene hvori: fig. 1 viser grafisk den relative absorpsjonen mot bølge-lengde (nm) for omdannelsen av tyrosin-holdig peptid til L-dopa-holdig peptid overensstemmende med eksempel 1;

fig. 2a viser grafisk absorpsjonen ved 280 nm mot tid i minutter av det utgangsdekapeptid som anvendes i eksempel 1;

fig. 2b viser grafisk absorpsjonen ved 280 nm mot tid i min. for de produkter som oppnås ifølge eksempel 1;

fig. 1 viser grafisk konsentrasjonen av L-dopa (pm/ml) mot tid i minutter som oppnås ifølge eksemplene 7-8; og

fig. 4 viser grafisk bruddstyrken (g/1,3 cm<2>) mot forholdet mellom enzym og bundet protein (enheter enzym/pm bundet protein) overensstemmende med eksempel 9.

En lineær, polymer forløper for de bioadhesive, polyfenollske proteinene kan syntetiseres fullstendig ved bruk av tradi-sjonelle peptidmetoder ved anvendelse av passende blokkerte og beskyttede aminosyrer. Alkternativt kan den lineære polymerf or løperen omfatte en primær sekvens som er lik den til de bioadhesive, polyfenoliske proteinene som syntetiseres genetisk (dvs. genesekvensen er overført ved bruk av bio-kjemiske proteinsyntesereagenser ved metoder som er kjent på fagområdet) uten eventuelle hydroksylerte proliner eller tyrosiner. I tillegg kan den lineære polymerforløperen være en hvilken som helst kombinasjon av disse to, og kan inne holde andre forenlige polymerer. Forenlige polymerer kan defineres som amin-rike, hydroksyl-rike proteiner, eller organiske polymerer som, når de anvendes i kombinasjon med bioadhesive, polyfenollske proteiner, ikke på uheldig måte påvirker adhesjon/kohesjonssystemet.

En lineær polymerforløper for det bioadhesive, polyfenollske proteinet kan avbildes som følger:

hvor hver R uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og metyl.

I tilfeller der den lineære polymerforløperen syntetiseres uten L-dopa eller en L-dopa ekvivalent, kan tyrosin eller en tyrosinekvivalent omdannes kjemisk eller enzymatisk til den katekoliske rest en. Dersom prolin er inkludert i den lineære polymerforløperen, kan det på lignende måte omdannes enzymatisk til hydroksyprolinresten.

Den valgte sekvens av syntesetrinnene må ta i betraktning flere egenskaper hos klassen av proteiner: 1) uløseligheten for ekstraherte, bioadhesive, polyfenollske proteiner ved et nøytralt pH eller ved lavt pH i nærvær av salter (0,5-3 M NaCL, KC1 eller LiCl) er en funkssjon av høyt lysin, tyrosin og L-dopa, 2) korte peptider med antall aminosyrerester som er større enn ca. 20, med den den samme mengde av disse aminosyrer, har lignende oppløselighetsegenskaper som korte peptider som inneholder tyrosin, men ikke L-dopa har, 3) blokkert, helt beskyttet L-dopa er ikke kommersielt til gjengelig, og p.g.a. den ekstreme labiliteten til dette molekylet, er dets syntese og rensing med etterfølgende inn-føring i peptider på det beste vanskelig, 4) med innføringen av L-dopa, blir peptidet eller proteinet ekstremt følsomt for metaller, oksydasjon og tap p.g.a. binding til glasstøy og andre proteiner.

Mange tyrosinrike proteiner og peptider er hydroksylert enzymatisk ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse er: 1) Syntetiske proteiner, de dekapeptider som er beskrevet i US patent 4.585.585 inneholdende hydroksyprolin, men ikke L-dopa, hydrosin er til stede i 200 rester pr. 1000, de brukte dekapeptidene var enkle dekapeptider og opp til 5 gjentagelser av dekapeptidet, 2) ekstrahert kasein, et naturlig protein som inneholder 46 rester pr. 1000 tyrosin, og 3) ekstrahert kollagen, naturlig protein som inneholder 10 rester pr. 1000 tyrosin.

De følgende eksemplene illustrerer ytterligere spesielle ut-førelsesformer av foreliggende oppfinnelse, men skal ikke anses begrtenssende hverken når det gjelder ånd eller område for foreliggende oppfinnelse.

Eksempler 1- 3

Omdannelsen av tyrosinrester til L-dopa-rester i dekapeptider

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan den enzymatiske omdannelsen av tyrosinrester til L-dopa-rester gjennomføres ved hjelp av den klasse av enzymer som kalles tyrosinase; monofenol-monooksygenase , polyf enoloksydase , katekol-oksydase , monofenol, dihydroksyf enylalanin: oksygenokssidoreduktase; (EC 1.14.18.1), o.l. I disse eksemplene bleden lett tilgjengelige sopptyrosinasen brukt. Disse enzymene formidler ikke bare omdannelsen av tyrosin til L-dopa, men også omdannelsen av L-dopa til kinon. Denne sistnevnte reaksjonen kan imidlertid forsinkes eller reverseres i nærvær av reduksjons-middelet som f.eks. L-askorbinsyre, bisulfitt, o.l.

Det syntetiske dekapeptidet fremstilles ved peptidsyntese i fast fase. Uttrykket "fast fase" refererer til den metoden ved hvilken syntesen foregår, dvs. festet til en matriks og den første aminosyren festes til en kromatografisk harpiks. Den lineære kjeden av aminosyrer fremstilles ved tilsetning i rekkefølge av hver aminosyre, en av gangen, under betingeler som fremmer dannelse av amidbindingen. Labile sidegrupper, som f. eks. hydroksylgruppene i serin, treonin og tyrosin, tilsettes med beskyttende eller "blokkerende" grupper som avblokkeres etter at syntesen er fullstendig. Peptidene spaltes fra matriksen ved slutten av den siste aminosyre-tilsetningen, avblokkeres og renses.

Generelt foregår omdannelsen av tyrosin til L-dopa i pH-området på 4,5 til 8, og fortrinnsvis ved pH 7 til 7,5. Reaksjonen foregår raskt ved romtemperatur og over (20-37°C) og meget langsomt ved 4°C. Tre testede buffere var forenlige: 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0, 0,1 M natriumacetat, pH 5,0 og 0,1 M 2[N-morfolino]etansulfonsyre (pH 7,0). Juste-ring av forholdet mellom enzym og proteinsubstrat, temperatur og pH kan anvendes for å regulere reaksjonshastigheten. For de fleste av de beskrevne eksemplene var forholdet mellom enzym og substrat 5,4 til 15 enheter enzym pr. mikrogram proteinsubstrat. pH var 7,0 i 0,1 M natr iumf osf atbuf fet, og temperaturen var 21-23°C. L-askorbinsyre innblandes i de eksempler som krever biokjemisk bestemmelse av reaksjons-produkter, fordi den retarderer og reverserer den andre reaksjonen, omdannelsen av L-dopa til kinon. Når det gjelder adhesivbestemmelse, utelates vanligvis L-askorbinsyren for å tillate kovalent tverrbindingsdannelse. Tilsetningen av et like stort volum av 10% volum/volum eddiksyre til en hvilken som helst omdannelsesreaksjon minsker raskt pH til under 3,0 og avslutter reaksjonen.

I eksempel 1 består reaksjonsblandingen som holdes ved romtemperatur, av 0,9 ml natriumfosfatbuffer (0,1 M, pH 7,0), 0,1 ml syntetisk enkelt enhet av tyrosin-holdig dekapeptid (10 mg/ml i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0), 0,025 ml tyrosinase (216 enheter/pl i 0,1 M natriumfosfatbuffer) og 0,01 ml L-askorbinsyre (0,1 M i den samme f osfatbuffer). Slik det kan sees i fig. 1 er bølgelengden for maksimal forandring (minskning) 292-294 nm over en 10 minutters periode. I et kontrollforsøk uten L-askorbinsyre er den samme reaksjonen fullstendig i løpet av 3 min., og kinonrest-dannelse fra L-dopa er rask.

Reaksjonen blekarakterisertmer presist ved bruk av en høytrykks væskekromatograf som analytisk verktøy, sammen med analyse av produktets aminosyresammensetning. Reksjons-hastigheten ble senket ved tilsetning av mer L-askorbinsyre (50 ganger den ovenstående konsentrasjonen). De to produkttoppene er kromatografisk distrinkte topper og antas å representere hydroksylering av tyrosin i nr. 9-stilling eller nr. 5-stilling, og begge produserer et L-dopa-holdig peptid. Arealet for utgangsdekapeptidtoppen og produkttoppene ble integrert som en indikator på prosent omdannelse (se fig. 2a og 2b). I eksempel 2 ble en 7,0 pH natriumfosfatbuffer brukt som i eksempel 1. I eksempel 3 ble en 5,0 pH natriumacetat-buffer brukt istedenfor fosfatbufferen. Resultatene er opp-summert i tabell 1.

Eksempler 4- 6

Proteiner inneholdende 3, 4 og 5 gjentagelser av dekapeptider med tyrosinrester omdannes i pH 7,0 natriumfosfatbuffer i et forhold mellom enzym og substrat på 43 enheter/pm dekapeptid. Forholdet mellom enzym og substrat økes her fordi omdannelsen av større peptider er langsommere enn for enkle dekapeptider. Kromatografisk analyse av produkt-fordelingen er ikke mulig fordi antallet produkttopper økes proporsjonalt med antallet tyrosiner som hydroksyleres. Kromatograf! ble brukt for å verifisere at reaksjonen var fullstendig. Reaksjonsblandingen ved romtemperatur (21-23°C) i 0 , 1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) besto av: 21.600 enheter tyrosinase, 500 pm syntetisk peptid og 100 pl av 1,0 M L-askorbinsyre i et totalvolum på 2,0 ml.

Tabell 2 angir aminosyresammensetningene i reaksjonsprodukt-ene. Enzymet og L-askorbinsyren ble separert fra produktet ved ultrafiltrering.

Disse aminosyresammensetningene i produktene bekrefter omdannelsen av tyrosinrester til L-dopa-rester, når de sammenlignes med startmaterialet.

Eksempler 7- 8

To naturlige proteiner ble behandlet på lignende måte for a vise omdannelse av tyrosin til L-dopa. For kasein ble omdannelsen fulgt ved bruk av dopa-nitreringsreaksjonen (Waite og Benedict, 1984, Methods in Enzymology, 107, 397-413). Parallelt med kasein ble syntetisk 5x dekapeptid behandlet i eksempel 6 ovenfor, kjørt som en reaksjons-kontroll. To forhold mellom enzym og substrat, alle i natriumfosfatbuffer (0,1 M, pH 7,0) i fravær av L-askorbinsyre ble styrt i 40 min., med unntagelse av ddet ene forsøket som ble styrt i 80 min. For syntetisk dekapeptid (5 x gjen-tagelse) var forholdene mellom enzym og substrat 13,5 og 21,6 enheter/pg. For kasein var forholdene mellom enzym og substrat 1,3 og 5,1 enheter/jjg. For kollagen var forholdene 12 og 36 enheter/pg. Reaksjonene foregikk i 1,0 ml natriumfosfatbuffer (0,1 M, pH 7,0) ved romtemperatur (21-23°C). Dataene fremgår av fig. 3. I alle fremstillingene omdannes tyrosiner med lignende hastigheter. De samme reaksjonene ble gjennomført for kollagen, men prøvene kunne ikke fjernes for forsøk på grunn av umiddelbar gelering av kollagenet med enzym.

Som beskrevet her, reverserer L-askorbinsyre kinondannelsen, men den konkurrerer også i tverrbindingsreaksjonen. Når adhesiv styrke og kohesiv styrke skal økes ved kovalente reaksjoner, dvs. L-dopa-tørrbindinger, skal L-askorbinsyre utelates fra reaksjonen.

Korrelasjon av L-dopa-omdannelse med adhesivitet

Proteinenes adhesivstyrke ble testet ved bruk av aluminium-strimler som bindesubstrat, et 1 cm<2>bindeareal og en loddrett skjærstyrketest (tabell 3). Disse spesielle polystrimlene svikter ved ca. 600 g. Betingelser og forhold ble variert som vist i tabell 3 for klart å påvise effekten av tyrosinaseomdannelse på bindestyrken. Forhåndsinkuberin-ger av kasein og syntetisk peptid med tyrosinase ble utført for å vise effekten av økning av L-dopa-innholdet på bindingsstyrken. Bindingsstyrkene for det syntetiske dekapeptidet øket med et høyere enzymforhold eller med øket pre-inkuberingstid ved lavere enzymforhold. I fravær av L-askorbinsyre nås en grense mellom 5 og 10 minutters pre-inkuberingstid p.g.a. kinondannelse. Det samme er tilfelle for en pre-inkuberingstid på mellom 10 og 20 min. for kasein.

Eksempel 9

Dette eksempel viser effekten av forholdet mellom katekol-oksldase og bioadheslvt, polyfenolisk protein med en enkel pre-inkuberingstidd på bindingsstyrken. En konstant mengde syntetisk peptid, den lineære dekapeptidkjeden gjentatt 5 ganger, ble inkubert i 2 minutter ved varierende mengder sopptyrosinase (katekoloksidase) før etablering av bindingen mellom to strimler av aluminiumfolie. Bindingsdimensjonene er 1,3 cm<2>. Hele prosedyren utføres ved romtemperatur. Alle bindinger inneholder 40 pg syntetisk peptid i 1,0 pl 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0). Sopptyrosinasekonsentrasjonene var 5,4, 10,8, 21,6, 32,4, 43,2 og 54 enheter pr. pg av syntetisk peptid på bindingsstillingen. Volumer av væske for hver binding ble holdt konstant på 5,0 pl med tilsetning av den passende mengde av 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0). Hver bindingsstyrke representerer middeltallet av fem forsøk. Bindingene fikk lov å herde i 1 time, og ble så målt ved å klemme strimlene mellom en trykkmåler (0-500 grams område) og en gearet motor med et stempel som produserer spenning med en hastighet på 25 g pr. sek. Dataene fremgår av fig. 4. Det faktum at mange variabler kan manipuleres, er illustrert. Med en fastsatt 2 minutters pre-inkuberingstid er 30-40 enheter av enzym pr. pg bundet protein optimalt. Mer enzym kan tolereres dersom askorbinssyre inkluderes. I dette eksempel ble det inkludert en parallell serie med 0,5 pl 0,1 M askorbinsyre i 0,1 M natriumfosfatbuffer i formuleringen. Både bindingsstyrke og hastighet for omdannelse av tyrosin til L-dopa kan manipuleres ved hjelp av hvilke som helst variabler som påvirker hastigheten for denne enzymreaksjonen. Disse omfatter pH, temperatur og grad av bruk av oksydasjons-og reduksjonsmidler. Utover 40 enheter/pg protein medvirker enzymproteinkonsentrasjonen selv til bindingsstyrken som en tørket proteinsement.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av bioadhesive, polyfenollske proteiner som inneholder 3 ,4-dihydroksyfenylalanin-rester fra proteinforløpere inneholdende tyrosinrester, karakterisert ved at: det fremstilles et tyrosin-holdig protein, dette proteinet omsettes med et tyrosinaseenzym ved et pH på fra ca. 4,5 til ca. 8, og en temperatur på fra ca.

20 til ca. 37°C ved et forhold mellom enzym og protein på fra ca. 5 til c. 50 enheter enzym pr. pg protein og hvorved det dannes et bioahesivt, polyfenolisk protein som inneholder 3,4-dihydoksyfenylalaninrester.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som tyrosinaseenzym anvendes sopptyrosinase.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonen gjennomføres i nærvær av tilstrekkelig askorbinsyre til effektivt å retardere omdannelsen av 3,4-dihydroksyfenylalaninrestene til kinoner.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakter f-sert ved at det tyrosin-holdige proteinet oppnås ved peptidsyntese i fast fase.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH ved reaksjonen varieres fra 7 til 7,5.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonen gjennomføres i et bufret medium.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det tyrosin-holdige proteinet og enzymet pre-inkuberes i blanding med hverandre i en tidsperiode som er omvendt proporsjonal med forholdet mellom enzym og protein.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at pre-inkuberingen gjennomføres i en periode på fra 0 til ca. 15 min.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonen avsluttes ved å senke pH i reaksjonssystemet til under ca. 4 og det bioadhesive, polyfenollske proteinet som inneholder 3,4-dihydroksyfenylalanin-rester, gjenvinnes.