JPS6327500A - ヒト乳ガン特異性乳腫瘍関連タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ねずみの乳腺腫瘍モデル（ｍｕｒｉｎｅ　ｍａｍｍａｒ
ｙｔｕｍｏｒ　ｓ＋ｏｄｅｌ　）による研究は、ウィル
ス性タンパク質の血漿中濃度（ｐｌａｓｏ＋ａ−ｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　）を使用して固形腫瘍（ｓｏｌ
ｉｄ　ｔｕ＋＊ｏｒ）の存在及び状態を評価することの
可能性を確立した。かかる研究に使用されたウィルス性
タンパク質は、アフィニティー・クロマトグラフィー（
ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｎａｔｏｇｒａｐｈｙ　）
を使用してねずみの乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）から
単離した５２，０００ダルトンの糖タンパク質（ｇｐ５
２）であった、前記方法により精製されたｇＰ５２が入
手可能であることは、０．ｌｎｇ／１００μ２より低い
血漿中濃度水準に対して測定可能のこのタンパク質に対
する放射性免疫検定（ｒａｄ　ｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ　）の発展を可能にした。この点に関しては、Ｒ
ｉｔｚｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７５，
１８８　（１９７６）及びＲｉｔｚｉ　ｅｔａｌ、、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　７３
．　ｋｌ　１゜４１９０　（１９７６）参照。

乳腺腫瘍とｇｐ５２の血漿中濃度水準との間の関係は下
記の通りであることが見出された。

（ａ）腫瘍を有する雄又は雌のマウスは血漿中の遊離可
溶性タンパク質としてのｇＰ５２の顕著に高められた水
準（１００〜１０００ｎｌ／ｍｊり及び平均腫瘍寸法と
共に増大する平均濃度を示した；（ｂ）他の悪性腫瘍（
ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）　（白血病）の存在によっては
血漿中のｇＰ５２は何ら変化しなかった； （ｃ）移植により乳腺以外に位置した乳腺腫瘍もまた高
い血漿ｇｐ５２水準により検出される；（ｄ）腫瘍のな
いマウスにおいては、それらが高頻度の自然発生（３ｐ
ｏｌｔａｎｅｏｓ　）乳腺腫瘍により特徴づけられる種
を起源とするものであれ、低頻度の自然発生乳腺腫瘍に
より特徴づけられる種を起源とするものであれ、ｇｐ５
２の低い（２−１０ｎｇ／＋ｊり血漿水準が見出される
； （ｅ）腫瘍のない泌乳している雌は、それらの乳汁がこ
の蛋白質を平均して２０，０００ｎｇ／ｍ１含有してい
るという事実にもかかわらず、通常は低水準の血漿ｇｐ
５２を示す；そして （ｆ）腫瘍性（ｔｕｍｏｒｏｕｓ）動物における循環器
の浄化時間（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ　ｃｌｅａｒａｎ
ｃｅ　ｔｉｍｅ）は十分に速く（半寿命４−６ｈｒ）、
観測される高水準を維持するために連続して補充する必
要があることを示唆する。

上記ＭＭＴＶモデルは、ヒト乳ガン（ｈｕｍａｎｂｒｅ
ａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ）の存在及び状態を監視するため
に、血漿中のウィルス性タンパク質「標ｇｌ　Ｊ　　（
ｍａｒｋｅｒ　）を使用することの可能性を確立するた
めの基礎を提供するものである。ウィルス性タンパク質
標識の使用は、米国特許第３，９９９，９４４号に開示
されているような、腫瘍特異性細胞性免疫（ｃｅｌｌｍ
ｅｄｉａｔｅｄ　ｉ＋＋ｎ＋ｕｎｉｔｙ）により引起さ
れた抗原誘起白血球粘着阻害を検出することに基づく検
定とは区別されるであろう。

本発明は、血漿試料中の成る種の腫瘍特異性ウィルス関
連タンパク質（ｔｕｍｏｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｖｉｒ
ａｌｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を検定すること
により人間におけるガンの存在及び状態を検出する方法
、及びそのために有用な新規な試薬に関する。従って、
かかる方法は、診断においてたとえば上記病気の年期検
出のための最初のスクリーニングプログラムにおいて、
治療においてたとえば外科、放射線及び／スは化学療法
による治療後の上記病気の状態を評価するに際して、及
び予後においてたとえば再発又は転移の可能性を検出す
るに際して有用である。

ガン、特に乳ガンの検出用の標識として使用し得るウィ
ルス関連タンパ２貫には、ウィルス酸素、例えばＲＮＡ
−依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）　　（ｒｅ
ｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓ　ｃｒｉｐｔａｓｅ）又はウィ
ルス起源の腫瘍関連タンパク質が包含される。

従って、本発明の第一の観点は血漿標識としてＲＮＡ−
依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによるヒト乳
ガンの検出に指向するものである。

ヒト乳ガン粒子はＲＮＡ腫瘍ウィルスの多くの特徴を備
えていることが既に知られている。予期される寸法（６
００Ｓ）及び密度（１，１６２／−１）に加えて、これ
らの特長は、外膜（ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ　）及
びＤＮＡポリメラーゼ並びにマウスの乳腺腫瘍ウィルス
（ＭＭＴＶ）及びメーソンーフイツツエル・モンキー・
ウスルス（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆ　１ｚｅｒ　Ｍｏｎｋｅｙ
　Ｖｉｒｕｓ　）　（Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｖ）のＲＮＡに対す
る検出可能な同族性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する大分
子量（７０Ｓ）ＲＮＡを含有する「芯」を取囲む内膜を
有することを包含する。

ヒト乳ガン粒子からのＤＮＡポリメラーゼの精製及び特
性化が今回達成され、これは本１発明の一部をなす。こ
の酵素の重要な性質はＭＭＴＶ及びＭ　Ｐ　Ｍ　Ｖ中に
見出された逆転写酵素の性質に非常に類似している。従
って、これらのウィルス起源と同様に、精製したヒト乳
ガンＤＮＡポリメラーゼは公知のウスルス逆転写酵素を
正常細胞のＤＮＡポリメラーゼから区別する下記の三つ
の特徴を示す：ａ）ポリ（ｄＴ）の合成のためのテンプ
レートとしてオリゴ（ｄＴ）、ポリ（ｄＡ）にまさるオ
リゴ（ｄＴ）：ポリ（ｒＡ）に対する強い優先性；ｂ）
ポリ（ｄＧ）の形成のためのテンプレートとして高度に
特異性のオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣｍ＞の受容（ａｃ
ｃｅｐｔａｎｃｅ　）　；　ｃ　）忠実なりＮ　Ａ相補
的複写（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｃｏｐｙ）を形
成するためにテンプレートとしてウィルスＲＮＡ（ＡＭ
■）を使用し得る能力。Ｍ　Ｍ　Ｔ　Ｖ及びＭ　Ｐ　Ｎ
Ｉ　Ｖの逆転写酵素に対するヒトの酵素の類似性は、そ
れが７０，０００ダルトンの分子是を有すること及びＭ
　ｎ＊　＋よりもＭｇ”に対するそれの優先性において
更に広がる。今日まで、これらの性質を有する酵素は正
常な乳房組Ｑ　（ｂｒｅａｓｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ）又（
１良性の乳腺腫７５（ｔｕｍｏｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂ
ｒｅａ’ｓｔ）においては検出されなかった。

ヒト乳ガンＤＮＡポリメラーゼの単離は、乳ガンｆｆｌ
織を均質化しそして不連続なサッカロース濃度勾配の上
に重ねることによって達成された。

１．１６〜１．１９，９／ｃｃにおける密度領域をプー
ルし、希釈し、そして遠心分離した。そのペレットの懸
濁液をポリアクリルアミドアガロースゲル濾過により分
別した。ＤＮＡポリメラーゼ検定により活性であること
が見出された両分をプールし、そしてホスホセルロース
カラムによりクロマトグラフにかけた。０．ＩＭ〜０．
５Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，２の線状濃度勾配により溶
出した。ポリメラーゼ活性の主要ピークをプールし、そ
して該酵素を透析により濃縮した。

精製したヒト乳ガンＤＮＡ−ポリメラーゼは多数の方法
においてヒト乳ガンに対する診断検定を開発するのに使
用することができる。好ましくは完全なフロイント・ア
ジュバント（Ｆｒｅｕｎｄｓａｄｊｕｖａｎｔ　）のエ
マルジョン中の精製したヒト乳ガンＤＮＡ−ポリメラー
ゼを、成る期間にわたって、家兎、モルモット、やぎ、
馬等の如き適当な宿主動物に注入し、次いで宿主から採
血して［通常増強注入（ｂｏｏｓｔｅｒ　１ｎｊｅｃｔ
ｉｏｎ）を行った後コ所望の抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ
）を得ることによって、ヒト乳ガンＤＮＡ−ポリメラー
ゼ特異性抗体を誘発させるのに前記ポリメラーゼを使用
することができる。

更に、上記精製酵素は放射性ヨウ素化のための基質とし
て使用して［＋２５１］酵素を生成せしめることができ
る。放射性ヨウ素化のための好適な方法は、上記酵素を
［＋２５１−］　−３−（４−ヒドロキシフェニル）プ
ロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂ
ｏｌｔｏｎ−ＨｕｎｔｅｒｖＳ薬）で処理し、続いてＧ
−１００カラムにより精製することを包含する。

前記した抗体及び標識した酵素は、ヒト血漿試料中にお
けるヒト乳ガンＤＮＡ−ポリメラーゼに対する放射性免
疫検定において使用することができる。好適な放射性免
疫検定方法は当業界において公知である。従って、たと
えば使用し得る類似した方法がＲｉｔｚｉ　ｅｔ　ａｌ
、、ＶｉｒｏｌｏＨｙ、７５　、　１８８（１９７６）
に記載されている。かかる方法においては、緩衝化した
試料を抗血清、即ち家兎の抗−ＤＮＡ−ポリメラーゼで
処理し、次いで３７℃で約４５分間インキュベーション
の後、［１２Ｓｉコー標識酵素を加えた。試料を更に３
７℃で２時間インキュベートし、そして結合放射能（ｂ
ｏｕｎｄｒａｄｉｏ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を、正常なＩ
ｇＧ（家兎）及びＩｇＧ（家兎）の最大量の（ｏｐｔｉ
ｍａｌ）沈澱を生ぜしぬるのに十分な量の第二の抗体（
やぎの抗−家兎Ｉ　ｇＧ）を加えることにより遊離の放
射能から分離した。

上記試料におけるＤＮＡ−ポリメラーゼの濃度は、結合
した及び／又は遊離の両分においてＷＡ測された放射能
の計数を、同じ検定法でいろいろな既知景のＤＮＡ−ポ
リメラーゼを使用して得られた標準曲線と比較すること
によって決定することができる。

別の方法において、血漿試料中の酵素濃度水準は、上記
酵素を単離しそして酵素活性を測定することにより決定
することができる。単離は、血漿試料を硫酸アンモニウ
ムで処理して酵素を沈♂せしめ、続いて再溶解（ｒｅｃ
ｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）　した沈澱物を、酵素に対する合
成テンプレートを共有結合せしめであるセファロースビ
ーズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ｂｅａｄｓ）のカラムによ
りアフィニティー・クロマトグラフィーに付することに
よって容易に達成することができる。この目的に好適な
テンプレートは、ポリリボアデニレート［Ｐｏ１ｙ（ｒ
＾）コ又はポリ（２’　−０−メチルシチジレート）　
　［Ｐｏｌｙ（ｒｃｍ）　］を包含する。カラムからの
酵素の溶出はｐＨ７，２で緩衝された０、０１Ｍリン酸
塩中の０．ＯＩＭＫＣ］〜１．０ＭＫＣｌの勾配を使用
して達成される。昨離した酵素のＤＮＡ−ポリメラーゼ
活性は、前記した乳ガン組織からの酵素の精製を行なう
際に使用したのと同じ検定方法を使用して検定する、二
とができる。

本発明の方法の更に一つの態様は、ウィルス起源のヒト
腫瘍関連タンパク質の発見に関する。一つのかかるタン
パク質はヒト乳ガン組織標本の細胞間空隙に実質的濃度
で見出されるのみならず；ＩＬガン患者の血漿中にも循
環していることが証明され得る。腫瘍関連タンパク質は
、ウィルスが乳房細胞に感染した後のウィルスにより産
生された又はウィルス制御下に該細胞自体により産生さ
れた過剰のタンパク質であると考えられる。従って本発
明の更に一つの観点は、たとえば乳ガンの如きガンに対
する診断及び予後の試験として血漿試料中におけるこの
腫瘍関連タンパク質の存在を検定することである。

均質化したガン組織からの腫瘍関連タンパク質の単離は
、アフィニティー・クロマトグラフィー及びカラムクロ
マトグラフィーの組合せによって行なうことができる。

アフィニティーカラムはセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）　４　ＢにカップリングしたコンカナバリンＡ　
（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ　）から成り、そして
市販品（Ｃｏｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ）である。ア
フィニティーカラムからのタンパク質の溶出はα−メチ
ルーＤ−マンノシドＷｉ街浴溶液使用して達成される。

該タンパク質の追加的精製はＤＥＡＥセルロースクロマ
トグラフィーにより達成される。

この方法はＭＭＴＶからｇｐ５２を精製するためにＲｉ
ｔｚｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７５．　１
８８　（１９７６）において使用された方法に直接類似
しており、そしてその中に非常に詳しく記載されている
。

ウィルス起源の精製した腫瘍関連タンパク質は、乳ガン
の検出に有用な放射線免疫検定の開発のためＤＮＡ−ポ
リメラーゼに対して前記したと同じ方法で使用すること
ができる。かくして、該タンパク質は公知の方法で宿主
動物中に注入してウィルス起源の腫瘍関連タンパク質に
特異的な抗体を誘発させることができる。更には、精製
した腫瘍関連タンパク質は、放射性標識化することがで
き、好ましくは［＋２５■］ポルトン−ハンター試薬で
放射性ヨウ素化して、ａ激化した、即ちかかる放射性免
疫検定における標識として使用される１２１ニー腫瘍関
連タンパク質を生ザしぬることができる０本発明のこの
観点において使用される放射免疫検定方法は、狭く臨界
的なものではなく、任意の通常の方法を使用することが
できる。好ましくは、使用される検定方法は、ＤＮＡ−
ポリメラーゼの放射性免疫検定に対して使用される既に
前記したブロッキング二重抗体法（（ｂｌｏｃｋｉｎｇ
　ｄ。

ｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）で
あろう。

本発明の更に一つの観点においては、メーソンーフイツ
ツエルモンキーウイルス（ＭＰＭＶ）特異性抗体は、か
なり高率で、ヒト乳ガンＤＮＡ−ポリメラーゼ及びヒト
乳ガンウィルス起源の腫瘍関連タンパク質の両方と交叉
反応することが今回見出された。従って本発明のヒト乳
ガン放射性免疫検定において、かかる抗体及び放射性標
識化した好ましくは１２’Ｉ−ＭＰＭＶを使用すること
が可能である。ＭＰＭＶは組織培養において増殖させる
ことができ、従ってかなりの量を容易に入手できるので
、このことは本発明を広く適用するための特に好都合な
試薬源を提供する。

本発明の更に一つの観点においては、好適な酵素が所望
の抗体に共有結合している。抗体−酵素複合体は依然と
して酵素的に活性であり、そして特有の抗原（ｐｒｏｐ
ｅｒ　ａｎｔｉｇｅｎ）を含有する組織標本と接触させ
て置くと抗体がそれと結合する。次いで酵素の基質を加
えると、その結果活性部位における着色沈澱物の放出が
起こる。特定の態様においては、パーオキシダーゼをメ
ーソンーフイツツエル・ウィルスタンパク質に対する抗
体にカップリングさせた。該着色生成物の出現及び分布
は抗原の存在を同定するのを可能にするのみならず、組
織切片中の悪性腫瘍細胞中の抗原の位置を実際に決定す
るのを可能にする。

この原理を使用する他の方法には、体液（たとえば血漿
）中の同じ抗原の定量的評価が包含される。その方法は
下記の通りである： １）抗体を固体表面（たとえばポリスチレン）上に被覆
し；２）既知容量の患者からの血漿をデユープに加え、
そして表面上に被覆した抗体に試料中に存在する問題の
抗原の何れをも吸着させ；次いで試料を除去し、そして
チューブを洗浄し；４）抗体−酵素複合体を加えそして
付着のためにインキュベートする。次いで、すべての吸
着されていない酵素結合抗体を洗い出し；５）存在する
腫瘍抗原の呈を評価するために測定し得る色又はケイ光
の何れかを与える発色性基質を加える。使用し得る好ま
しい酵素はアルカリ性−ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉ
ｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）及びβ−ガラクトシダ
ーゼを包含し、その両方共優れた発色性基質を有する。

本発明のこの観点の実施に有用な方法に関する更に詳細
なことは先行技術から入手できる。たとえば米国特許第
４，００２，５３２号及び第４．０１６．０４３号参照
。

本発明の方法を構成する種々の検定は、ヒトにおける乳
ガンの存在を検出するために使用することができる。か
かる使用を達成するために、臨床的に確立した乳ガン患
者、正常な患者及び良性腫瘍又は非乳ガン腫瘍を有する
患者からの統計的に有意義な数の血漿試料を、直接ＤＮ
Ａ−ポリメラーゼ活性法、ＤＮＡ−ポリメラーゼ免疫検
定又は腫瘍関連タンパク質免疫検定により検定する。こ
れらの検定において見出される標識タンパク質の濃度は
、正常な及び非乳ガン腫瘍試料に対して見出された水準
に比べると、乳ガン血漿試料の場合には著しく高い６従
って、正常状態又は非乳ガン状態に対応する水準と乳ガ
ンの存在に対応する各検定方法における標識タンパク質
の濃度水準との間に任意な対照水準線（ｃｏｎｔｒｏｌ
　１ｅｖｅｌ　１ｉｎｅ）をひくことが可能である。次
いで未知の血漿試料は、本発明の方法の１つに従って試
料を検定し、そして標識タンパク質が対照水準より過剰
の濃度で存在するかどうかを決定することにより、被験
体の乳ガンの可能性について評価され得る。

或いは、標識タンパク質の患者自身の水準は内部対照と
して役立ち得る。かくして、確認した乳ガンを有する患
者は治療の開始後及び前に検定することができる。標識
タンパク質の水準の顕著な低下は治療の好ましい予後を
示すであろう。標識タンパク質濃度水準の後における実
質的増加は、上記病気の起り得る再発又は転位を示し、
そして主治医が初期における治療を開始することを可能
にする。更に、かかる治、療の有効性は本発明の方法に
より検定され得る。

本発明を下記実施例により更に説明する。

実施例１ 瘍組　の　　レベルｒ　の　号　５ｕｂｃｅｌｌｕｌａ
ｒ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）入手し得る材料の量
に依存して、腫瘍９２乃至３０ノをとかし、細かく切り
刻み、４倍容量の冷い５％サッカロース（Ｗ／Ｖ）−Ｔ
ＮＥ　（０，０１ＭＴｒｉｓ−１ＨＣ１，ｐＨ８，０，
０，１５ＭＮａＣｌ、３ｍＨＥＤＴ＾）中に懸濁させ、
そしてシルバーソン（ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）ホモジナイ
ザー中でブレンドした。

均質化物を、それぞれ核及びミトコンドリアを除去する
ために、４０００Ｘｇ及び１０．ＯＯＯＸｇで遠心分離
した。トリプシンを最終濃度０．５ｍｇ　／　ｍＡまで
ミトコンドリア除去後の上澄液（ｐｏｓｔ−ｍ１ｔｏｃ
ｈｏｎｄｒｉａｌ　５ｕｐ６ｒｎａｔａｎｔ）に加えた
。１２０℃で１０分間インキュベーションした後、タン
パク分解活性は、２種類のポリペプチド、リマビーン（
Ｉｉ糟ａ　ｂｅａｎ）　）リブシン阻害剤（１倍過剰）
及びトラシロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）　（１００Ｋ　
Ｉ　Ｕ／ｍＪ　）の添加により阻害した。その試料を５
０％スクロース−Ｔ　Ｎ　Ｅ　６　ｄ及び２５％スクロ
ース−ＴＮＥＢｒａｇから成る不連続スクロース濃度勾
配の上に重ねた。スピンコ（Ｓｐｉｎｃｏ）　Ｓ　Ｗ　
−２７０−ター中４°で９０分間２５，０ＯＯｒｐ鵠で
遠心分離して、２５１５０％界面の試料を集め、ＴＮＥ
で希釈し、そして線状２０−５０％スクロース−ＴＮＥ
濃度勾配上に重ねた。該試料を１６時間上記の如く遠心
分離し、そしているいろの密度領域を集めた。

ＲＮＡ腫瘍ビールスが局在する密度領域（１，１６１，
１９９／ｃｃ）をプールし、希釈し、そして９０分間上
記の如く遠心分離した。得られるベレットを０．１Ｍ）
リス−ＨＣ１、ｐＨ８，０、約０　、６　ｍｊｉ中に再
懸濁した。

６つのロットの腫瘍を上記方法で酵素用に処理した。こ
れらのうちの４種（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）は特性を決める
に十分な酵素を生成せしめた。１つの調製物（Ａ＞、転
位性肝臓腫瘍は単一患者からのものであり、他はすべて
多数の種々の個体からプールした材料である。

ボ１アク１ルアミドアガロースゲル−゛。

再懸濁したペレットをＫＣ１（０，４Ｍ）　、ＤＴＴ（
ジチオスレイトール、０．ＯＩＭ）及びトライトンＸ−
１００の如き非イオン性界面活性剤（０，６％）の添加
により１５分間Ｏ℃で可溶化した（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚ
ｅｄ　ａｎｄ　ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）　、その試料的０
．９−を、！ｆＩ液Ａ（２ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００及び１
０％グリセロール）中、ｐＨ８，０，０，３Ｍリン酸カ
リウムと平衡したポリアクリルアミドアガロースゲル（
ＩＪＩｔｒｏｇｅ１＾Ｃ＾４４）の０．９Ｘ５０ｃａ＋
カラムに加えた。０．３Ｍリン酸塩緩衝新液で流速的２
　ｗ＋ｉ　／　ｈｒで溶出した。両分（０、５ｍＡ　）
をＤＮＡポリメラーゼ活性及び未満トランスフェラーゼ
活性について下記の如く検定した。

ホスホセルロース　クロマトグラフイーウルトロゲル力
ラムからのピーク画分をプールしく　３　ｖａｌ　）そ
してトラジオールを１００ＫＩＵ／ｌｌ１ｉの濃度にな
るように加えた。その試料を、リン酸塩濃度が０．０２
Ｍより小さくなるまで、０．０１Ｍリン酸カリウム、ｐ
Ｈ７，２［新液Ａに対して透析し、次いで同じ緩衝液と
平衡した０、９×ｉｏａｍホスホセルロースカラム（Ｗ
ｈａｔｍａｎ　Ｐ−１１）に添加した。このカラムを０
．０１Ｍリン酸塩緩衝液３０−で洗浄し、そして酵素活
性（画分）を１４ｍ１／ｈｒの流速で０．０１　Ｍ〜０
．５　Ｍリン酸カリウム緩新液Ａ、ｐＨ７，２の１２０
ｍＡ”Ｊ、状勾配で溶出した。両分（１，２＠Ｑ）をＤ
ＮＡポリメラーゼ及び末端トランスフェラーゼ活性につ
いて検定した。ポリメラーゼ活性の主要ピークをプール
し、そしてトラジオールを１００ＫＩＵ／ｄまで加えた
。この酵素画分（ＰＣ酵素と呼ばれる）をアクアシト１
ｌ−Ａ（＾ｑｕａｃｉｄｅ　１１−Ａ　）の如き浸透圧
的に活性な、高分子量合成重合体に対して０℃で透析に
より濃縮した。

グリセロールム　　心 分子量を評価するために、濃縮したＰＣ酵素を０．１Ｍ
リン酸カリウム、ｐＨ８，０で３倍に希釈し、そして０
．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ８，０，２ｍＭ　ＤＴＴ及
び０，０２％トライトンＸ−１００を含有する線状１０
−３０％グリセロール勾配上に重ねた。スピンコ５Ｗ−
５０．１０−ター中１″で１２時間４８．ＯＯＯｒｐｍ
で遠心分離を行なった０両分を底部から集め、そしてテ
ンプレートとしてオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）により
逆転写酵素活性を検定した。ウシ血清アルブミンを平行
勾配における沈澱物標識として用いた。

ＤＮＡボリポリ＝（１支 合成重合体テンプレートを有するポリメラーゼ活性に対
する検定混合物は（１００μ！中）：５μｓｏｌ）リス
−ＨＣｌ　、ｐＨ８，０，０，５μｓｏｌＭｇＣ１２、
Ｏ、’ｌ　μａ＋ｏｌ　ＤＴＴ並びに、重合体及びｄＮ
ＴＰｓの下記組合せ−０，４μ３オリゴ（ｄＧ）：ポリ
（ｒＣ）又はオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣｍ）、０．０
２μｍｏｌ　ｄＣＴＰ及び１．Ｏｎ　ｍｏｌ　［コＨ］
ｄＧＴＰ　（４０００ｃｐｎ／Ｐモル）；０．４μｇオ
リゴ（ｄＴ）：ポリ（ｒＡ）又はオリゴ（ｄＴ）：ポリ
（ｄＡ）、０．０２ＭモルｄＡＴＰ及び１．Ｏｍｍｏｌ
　［３Ｈ］　ｄＴＴＰ　（４０００ｃｐｍ／ｐモル）を
含有していた。オリゴ（ｄＧ）：ポリそ（ｒＣｍ）との
反応においてはＭｇｃ１２の代りにＭ　ｎ　ＣＩ　２（
０，０２μ５ｏｌ）を用いた。

ＡＭＶ　　ＲＮＡを使用する検定は（１００ＪＪ、Ｎ中
）　：　５μｓｏｌ　）リス−ＨＣ１，ｐＨ８，０，０
，８μｓｏｌ　ＭｇＣｌ２．０．１μｓｏｌ　ＤＴＴ、
１０ｔｔｇアクチノマイシンＤ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏｒ
ｐ）　、５μｙデイスタマイシン（ｄｉｓｔａＩＩＩｙ
ｃｉｎ）Ａ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２μ、ＡＭＶ
７０Ｓ’　ＲＮＡ、０．１μｇオリゴ（ｄ　Ｔ　）　＋
□−１６、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰが各々Ｑ、１
μｍｏｌ及び５ｎモル［’Ｈ］　ｄＣＴＰ（１，５Ｘ　
１０’ｃｐ＋ａ／ｐｍｏｌ）を含有していた。

すべての反応を１５−３０分間３６°でインキュベート
し、そして冷い０．０６７Ｍピロリン酸ナトリウム−１
Ｍリン酸ナトリウム、ＰＨ７，２０，５ｄを添加し続い
て冷８０％ＴＣＡ０．５ａ＋ｊを添加して停止させた。

酸不溶性放射性活性を膜濾過器で集めそしてシンチレー
ション計数管により測定した。

末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ活性を
相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　）重合体テンプ
レートの不存・布下に［Ｈ］　ｄ　ＧＴ　Ｐの重合によ
り測定した。重合体ｄＮＴＰ組合せを０．４μｇオリゴ
（ｄ　Ｇ　）　Ｉｏ−＋ｓ＋〇　、０２μｍｏｌｄｃＴ
Ｐ及び１．Ｏｎ　ｍｏｌ［’Ｈ］ｄＧＴＰで代替したこ
とを除けば反応は前記した如くして行なった。

すべての合成オリゴ−及びポリヌクレオチド三重水素化
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰは市販のものであった
。ＡＭＶ７０ＳＲＮＡをＷｅｉｓｓ　ｅｔａｌ、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ　７１　、２４２　（１９７６）に記載の如
くして精製ウィルスから単離した。

ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｇａｔｉｏｎ
　ｒｅａｃｔｉｏｎ） ハイブリダイゼーション及びＳ、ヌクレアーゼによるそ
れらの分析方法は、Ｗｅｉｓｓ他（上記参照）により報
告されている。＾ｘｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ
　２３５．３２　（１９７２）に開示されたＣ８２ＳＯ
，平衡密度遠心分離に対する条件を、０．０２は％ラジ
ウムＮ−ラウロイルサルコシネート及び大腸菌（Ｅ、Ｃ
ｏ１１）　ＤＮＡ及びＲＮＡの各々２０ｔｔｇを前記勾
配液に添加することにより改変した。

屹」 下記したデータは四種の異った腫瘍採集物（標識した人
ないしＤ）からの独立の酵素単離物に基づく。分別期間
中の挙動及び乳腺腫瘍ポリメラーゼの特性は調製のロッ
トによって有意差がなかった。

ポリラーゼ調製物Ａを乳ガンを有する患者の肝臓中の転
位病巣から単離した。腫瘍９ｇを均質化し、そして１．
１６　１．１９ｙ　／ｍ／！、の密度でバンドをなす微
粒子材料を前記した如くして集めた。

回収したベレットをトライトンＸ−１００の添加により
可溶化し、次いでポリアクリルアミド−アガロースゲル
（Ｕｌｔｒｏｇｅｎ　Ａ　ＣＡ　　４４　）カラムによ
り分別した。各カラム画分を、１）オリゴ（ｄ　Ｇ　）
　＋２−ＩＩ　：ポリ（ｒＣ）をテンプレートとしてＤ
ＮＡポリメラーゼ（活性）について及び２）プライマー
（ｐｒｉｍｅｒ）としてオリゴ（ｄＧ）＋２−＋ｓを使
用して末端トランスフェラーゼについて検定した。ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性の３つのピーク（２つは大きく、１
つは小さい）が観測され、そして第一の大きなピークも
また末端トランスフェラーゼを含有することは明らかで
ある。２つの大きなピークは、（Ｉｄｅｎｆｒｉｅｎｄ
　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　１７比、８７１　（
１９７２）のフルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａ＋
＊１ｎｅ）法により測定して、加えたポリメラーゼ活性
の９０％及びタンパク質３％を含有することが見出され
たく表１）。〉 上記で観測されたポリラーゼ活性の分離の実現性を検討
するために、前記２つの大きなピークをプールし、透析
してリン酸塩緩衝液濃度を減少せしめ、次いで線状（０
，ＯＩＭ〜０．５Ｍ＞リン酸塩勾配を用いてホスホセル
ロースカラム（ｐｃ）によりクロ゛？トゲラフイーに付
した。ポリメラーゼ活性は再び２つの大きなピークに分
解することが見出され、一方は０．０８Ｍリン酸塩で溶
出し、他方は０．１８Ｍで溶出する。ここでも第二の大
きなポリメラーゼピークは末端トランスフェラーゼ活性
がないことが注目される。後者は２つのピークに分かれ
、１つは０．０８Ｍリン酸塩における第一のＤＮＡポリ
メラーゼ活性と関連しており、他方は０．２３Ｍリン酸
塩において自体溶出する。

ＰＣカラムで見られたポリメラーゼ活性の第二の（０，
１８Ｍリン酸塩）ピークは正常な組織（乳房組ｍ３式試
料及び膵臓組織から３試料）中又は良性の乳腺線維腫瘍
（ｆｉｂｒｏａｄｅｎｏ＋ａａ　ｏｆ　ｔｈｅｂｒｅａ
ｓｔ）　　（各々３−４線維Ｍｉｇ３１−ル）中に見出
されず、従って乳ガン組織に特有のＤＮＡポリメラーゼ
である。ＰＣカラムのピーク２から成る画分は加えたＤ
ＮＡポリメラーゼ活性６５％及びタンパク質８％を含有
することが見出される。これらの両分をプールし、そし
て前記の如くして濃縮して乳腺腫瘍ポリメラーゼを得る
。表１に、典型的精製の三工程の各々における活性及び
タンパク質の収率を要約する。

実施例２ ＲＮＡ腫瘍ウィルスの逆転写酵素を正常な明乳動物ＤＮ
Ａポリメラーゼと区別するいくつかの通常の基準がある
。ウィルス性逆転写酵素はオリゴ（ｄＴ）：ポリ（ｄＡ
）よりもオリゴ（ｄＴ）：ポリ（ｒＡ、）樟対して優先
性を示し、そしてそれらはポリ（ｄＧ）の合成用の優れ
たテンプレートとしてオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）及
びオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣｍ）も受容する。他の、
更に大きい診断的特徴は、該合成において使用したテン
プレートに対するｃＤＮＡの特有のバック−ハイブリダ
イゼーション（ｐｒｏｐｅｒ　ｂａｃｋ−ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａＬｉｏｎ）により証明される如く、忠実な相補的
ＤＮＡの合成を指向するのにペテロ重合体ＲＮＡを使用
する逆転写酵素の能力である。

合成ポリリボヌクレオチドに対する４種の乳ガンポリメ
ラーゼの反応を表２に要約する。結果は、活性パターン
が真正の動物ＲＮＡ腫瘍ウィルスから単離した逆転写酵
素に関して得られた活性パターンと如何に完全に一致し
ているかを示す、即ち、すべての場合において、ポリ（
ｄＴ）の合成に対してはオリゴ（ｄＴ）：ポリ（ｒ　Ａ
）はオリゴ（ｄＴ）：ポリ（ｄＡ）に優っている。更に
、オリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）及びオリゴ（ｄＧ）：
ポリ（ｒＣｍ）の両方共ポリ（ｄＧ）の生成のための優
れたテンプレートであった。ここに記載した４種の乳腺
腫瘍酵素調製物に加えて、進行性病状の更に別の患者か
ら得られた多くの他の上記調製物（５０種より多く）を
いろいろの分別法を用いて異なる精製段階において同じ
方法で検査したところ、それらはすべて表２に記載した
反応パターンを示した。

逆トランスクリプターゼの操作上の定義は、ＤＮＡ転写
（Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　）をつくるた
めにそれがヘテロ重合体ＲＮＡを使用し得ることを示す
ことを必要とする。鳥類の骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ
）のＲＮＡに対する乳ガンポリメラーゼの反応（表３）
はへテロ重合体ＤＮＡの合成から予期されることである
。必要な３種の標識していないデオキシリボシドトリホ
スフェートの何れか１種又はすべてを省くと、ＲＮＡテ
ンプレートを省いた際に起こる如き合成活性の同じ実質
的消失が起こる。

１、完全な　　　　　　０．２００　　　０．１７０２
、−ｄＡＴＰ　　　　　　　　　　　Ｏ，０１３０，０
１１３、−ｄＧＴＰ　　　　　　　　　　　Ｏ，０２５
０，０２２４、−ｄＴＴＰ　　　　　　　　　　　Ｏ，
０１２０，００５５、−ｄＡＴＰ、ｃｆＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ　　　Ｏ，００８０，０１１６、−ｃｌＲＮＡ　　　
　　　　　　　　　Ｏ，０２６０，０１６テンプレート
としてＡＭＶ　　ＲＮＡを使用してポリメラーゼ調製物
Ａ及びＢをＲＮＡ−依存性ＤＮＡ合成に対して検定した
。

反応を実施例１に記載の条件下に３６°Ｃで３０分間イ
ンキュベートした。

推定上の逆転写酵素反応の最も有効な試験はＤＮＡ転写
の忠実度の検査による。これは３ＨＤＮＡ生成物を単離
すること、及び合成において使用したＲＮＡテンプレー
トとのア二一リング（ａｎｎｅａ　ｌ　ｉｎｇ）反応に
おいてそれを添加することを必要とする。このために、
２ｍｌでの反応をＤＮＡポリメラーゼｉＦＩ製物Ａ及び
テンプレートとしてのＡＭＶ−ＲＮＡと共に１５分間実
施し、２Ｘ１０’ｃｐｓ／μｊにおいて約３ｎｇの［コ
Ｈ］　ＤＮＡを合成した。この［’Ｈ］　ＤＮＡ生成物
を精製し、そして通常の方法により回収し、次いでＡ〜
■Ｖ及びＲＬＶ７０Ｓ　　Ｒ，ＮＡｓと共にアニーリン
グした。生成物をＣ３２ＳＯ４勾配中の分離及びＳ１ヌ
クレアーゼに対する抵抗性により検査した。両方法とも
無関連のＲＬＶ−ＲＮＡに対して５％より少ないアニー
リングを生ぜしぬ、そして合成を指向するために使用し
たテンプレートであるＡＭＶ−ＲＮＡに対しては８０％
乃至８５％のハイブリダイゼーションを生ぜしめた。そ
れ故に、これらの結果は［’Ｈ］ＤＮＡがＡＭＶ−ＲＮ
Ａの一本窟状相補体（ｓｉｄｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）であることつを示唆している。

［’Ｈ］　ＤＮＡ生成物の更に詳しい検討はアニーリン
グ反応の速度論的検討により与えられる。２種類の［”
Ｈ］Ｉ）ＮＡ生成物、即ち１つはＡ　Ｍ　Ｖ逆転写酵素
によりＡＭＶ−ＲＮＡの指向下に合成されたもの及び他
は同じテンプレートにより指令されたヒトの乳ガンポリ
メタラーゼにより合成されたもの、のＡＭＶ−ＲＮＡに
対するアニーリング速度論の比較を行なった。上記２種
類のＤＮＡ生成物のＡＭＶ−ＲＮＡに対するアニーリン
グの速度論は区別できないこしとが示された。故にヒト
の酵素はどの点から見ても鳥類のウィルスから精製した
同種の逆転写酵素と全く同じＡＭＶ−ＲＮＡの逆転写（
ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇ）において有
効である。

実施例３ ンポリメラーゼの他の、性 テンプレートとしてオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）及び
オリゴ（ｄＴ）：ポリ（ｒＡ）を使用して乳ガンポリメ
ラーゼのいくつかの調製物の活性に対する温度及びｐＨ
を変化させた際のそれらの効果を調べた１重合速度は７
．０〜８．５のｐＨ範囲にわたって５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ
　Ｃ１２中３７℃で起こった。

逆転写酵素の二価イオン要求は、それらがもとのウィル
スを種々の群に分けるのに役立つ故にいくらか興味深い
、従って、いろいろなソースからの全部で６株のＭＭＴ
ＶはＭｎ″＋比較してＭｇ＋″に対する強い優先性を有
する逆転写酵素を含む。

同じことが、メーソンーフイツツエル　モンキーウィル
ス、ブロモデオキシウリジン誘起モルモットウィルス及
びウシ白血病ウィルスにあてはまる。反対に、ねずみの
白血病及び肉腫ウィルスの逆転写酵素はＭｎ”の存在下
にはるかに有効に働く。ヒトの乳ガン酵素に対してはそ
の最適のＭ　ｎ　”Ｍ　ｇ　”で得られる活性の約１７
７を成功せしめるにすぎない。ねずみの乳腺腫瘍及び白
血病ウィルス間におけると同ン←ヒトの乳ガン酵素は乳
腺腫瘍ウィルス性逆転写酵素に最も密接に類似する二価
イオン要求を示すことは明らがである。

乳ガン酵素の分子寸法は線状（１０−，３０％）グリセ
ロール勾配による沈降により評価した。この酵素はＡＭ
Ｖ−ＲＮＡをテンプレートとする両分を検定することに
より見つけ出された。この酵素活性はウシ血清アルブミ
ン標識よりも僅かにはや＜５８と６Ｓ間で沈降し、分子
量は約７０，０００ダルトンに定まる。この結果はまた
ウルトロゲルに対するこれらの同じタンパク質の相対的
溶出位置とも一致している。種々の乳腺腫瘍源がらの多
数の酵素調製物は同一沈降値を与えた。

実施例４ 旺脛植 ウィルス　メーソンーフイッツエルモンキーウィルスを
正常なヒトのリンパ球細胞株（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ
ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）　ＮＣ−３７の懸濁培養液中で生
長させ、そしてＳｃｈｌｏｍ　ａｎｄ　Ｓｐｉｅｇｅｌ
ｍａｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、＾、６８．１６１３（１９
７１）により既に記載されている通りに濃縮した。この
ウィルスを、１００％グリセロールのパッド上へＴＮＥ
緩衝液（０，ＯＩＭ）リス−ＭＣＩ、ＰＨ８゜３．０．
１５Ｍ　ＮａＣ１，０，００２ＥＤＴＡ）中２０％グリ
セロールの８−カラムを通して４゜で６０分間９８．Ｏ
ＯＯＸｇで遠心分離することにより更に精製した。ＤＮ
Ａポリメラーゼ精製に対して上記ベレットを直ちに使用
した。

鳥類骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ　　ＢＡＩ株−Ａ）、
サルの肉腫ウィルス株−１（ＳＳＶ−１＞、フレンド白
血病（Ｆｒｉｅｎｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）ウィルス（Ｆ
ＬＹ）、ネコの白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）及びラウシ
エル（Ｒａｕｓｃｈｅｒ　）白血病ウィルス（ＲＬＶ）
もこの実施例において使用した。すべてのウィルス性濃
縮物を前記した如く精製した。

ヒトの悪性乳腺腫瘍からの逆転写酵素を同密度分離によ
り精製した粒子から０ｈｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓｅｉ、Ｌｌ、Ｓ、＾、７４，７
６４　（１９７７）により既に記載されている如くして
調製した。

Ｏｏで１５分間０．２％トライトンＸ−１００中でのイ
ンキュベーションによる破壊（ｄｉｓｒｖｐｔｉｏｎ）
の後、試料のいくつかを、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕ
ｓ）ポリメラーゼ活性及びそれぞれポリ（ｄＧ）及びポ
リ（ｒＡ）のオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）及びオリゴ
（ｄＴ）：ポリ（ｒＡ）により指向された合成に対して
解析した。破壊したウィルス密度領域をポリアクリルア
ミドアガロースカラム（Ｕ　ｌ　ｔｒ。

ｇｅｔ　Ａｃ＾４４．ＬＫＢ、Ｃｏ）によりクロマトグ
ラフィーに付し、そして溶出した酵素ピークをホスホセ
ルロース（Ｗｈａｔｍａｎｌ　１　）カラムに添加した
。

酵素を０．０１〜０．５Ｍリン酸カリウム勾配で溶出し
、そして０ｈｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　（前記参照）に記
載されている如くして濃縮した。

ヒトの慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ｓ
ｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）及びホジキン
リンパ腫を有する患者からの膵臓をウィルス密度領域調
製物のソースとして使用し、そしてポリメラーゼ活性を
一１ｔｋｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾７２，４１３３（１９７
５）により記載されている如き内因性速度論（ｅｎｄｏ
ｇｅｎｏｕｓｋｉｎｅｔｉｃｓ）により解析した。

ＭＰＭＶポリメー−ゼの；　１ 前記した如くして調製したＭＰＭＶペレット（ウィルス
）を０．０５Ｍ）−リス−ＨＣ１，ｐＨ９，２、Ｏ，Ｏ
ＯＩＭＥＤＴＡ及び２ＭＫＣｌ上に再懸濁し、超音波処
理し、次いで９８．ＯＯＯＸｇで１２０分間遠心分間し
た。このベレットを使用して、１ｆｉｔｋｉｎｓ　ｅｔ
　ａｌ、　（上記参照）により既に記載されている如く
してカラムクロマトグラフィーにより精製したＤＮＡポ
リメラーゼを調製した。

抗ｎ＋λ親ｌ− ＭＰＭＶ−ＤＮＡに対する抗血清をニューシーラント白
色家兎に誘発させた。抗−ポリメラーゼＩｇＧの所望の
力価を達成するのに３サイクルの免疫が必要である。各
サイクルにおいて、酵素（１分間につき導入されたＹＭ
ＰＩＸ１０コＰモル）を等容量のフロイント・アジュバ
ントで乳１ヒさせ、そして２つのｔ＆足肉Ｆ＃（ｈｉｎ
ｄ　ｆｏｏｔ、ｐａｄｓ）に注入した。同じ部位に２週
間間隔で更に２回の同様な接種を行なった。

血清をセファデックスＧ−２００，０、１Ｍ　ｌ・リス
−ＭＣＩ、ｐＨ８，０によるクロマトグラフィーにより
分別した。家兎ガンマグロブリンをヤギの抗家兎ＩｇＧ
抗血清による免疫拡散により血清学的に同定した６問題
の画分を硫酸アンモニウム沈澱（５０％飽和）により濃
縮し、そして０゜１Ｍ）リス−ＨＣ１，ｐＨ８，０に対
して透析した。ＩｇＧ画分のタンパク質濃度をローリ−
の方法により測定した。

ＤＮＡポリメラーゼ 合成重合体テンプレートによるポリメラーゼ活性に対す
る検定の反応混合物はく１００μ！中に）、５μｍｏｌ
トリスーＨＣ１，ｐＨ８，０，０，５μｍｏ１ＭｇＣ１
２，０、１μｍ　ｏ　ｌ　Ｄ　Ｔ　Ｔ、及び下記組合せ
の重合体及びｄＮＴＰｓ：０．４μｇオリゴ（ｄＧ）：
ポリ（ｒＣ）又はオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣｍ＞　、
０．０２μｍｏｌ　ｄＣＴＰ及び１．０ｎｍｏｌ［’Ｈ
］　ｄＧＴＰ　（４０００ｃｐｍ／ｐ　ｍｏｌ）　、０
．４μｇオリゴ（ｄＴ）：ポリ（ｒＡ）又はオリゴ（ｄ
Ｔ）：ポリ（ｄＡ）　、０゜０２μｍｏｌ　　ｄＡＴＰ
及び１．０ｎｍｏｌ［コＨコｄＴＴＰ　（４０００ｃｐ
ｍ／ｐ　　ｍｏｌ）を含有していた。オリゴ（ｄＧ）：
ポリ（ｒ　’Ｃｍ　）との反応において、ＭｎＣ１ｚ（
０，０２μｍｏｌ）をＭｇｃ１２に代替えした。

内因性ＲＮＡを使用する検定はく１００μ！中に）：　
５μｍｏｌ）リス−ＨＣ１，ｐＨ８，０，０，８μｍｏ
ｌ　ＭｇＣ１２，０，１μｍｏｌＤＴＴ、１０Ｍｇアク
チノマイシンＤ、５μｇディスタマイシン（ｄｉｓｔａ
ｍｙｃｉｎ）　Ａ、０．１μｇオリゴ（ｄ’Ｔ　）　＋
２−１＠、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの各々０．１
μｍｏｌ、及び５ｎ　ｍｏｌ［コＨ］ｄＣＴＰ　（１，
５Ｘ１０’ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有していた。

すべての反応は指示された如く３６°で１５−３０分間
インキュベートし、そして０．５ｍｌ冷０．０６７Ｍビ
ロリン酸ナトリウム、１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，
２の添加、続いて０．５ｍｌ、冷８０％ＴＣＡの添加に
より停止させた。酸不溶性放射能を膜濾過器により集め
、そしてシンチレーション計数管で測定した。

末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を相
補的重合体テンプレートの不存在下に［’Ｈ］　ｄＧＴ
Ｐの重合により測定し、その際後者を０．４μｇオリゴ
（ｄＧ）＋。−１８により代替した。

ＤＮＡポリメラーゼ゛性に対する　体の　果ＤＮＡポリ
メラーゼ活性の中和のための反応混合物（全容量５５μ
ｌ）はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＤＮＡポリメ
ラーゼ２５μｇに加えて、指示された量（２５−１５０
μｇ）の精製ＩｇＧ画分を含有していた。使用したｌ１
ｌｌｌ液は０．０１ＭトリスＨＣ１，ｐＨ８，０，塩化
カリウム０．１５Ｍであった。４°で１５分インキュベ
ーションの後、オリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）を使用し
て上記のようにポリメラーゼ検定を行なった。成る例に
おいては、内因性ＲＮＡによる活性に対する抗体の効果
を調べた。

グリセロールム　による　　−、ム　の出− 濃縮した酵素（ＭＰＭＶ又はヒトの悪性乳腺腫瘍からの
逆転写酵素）画分はウシ血清アルブミン０．５ｍｇ／ｍ
ｉ！を含有する０、１Ｍリン酸カリウム、ＰＨ８，０で
３回流して希釈した。そして指示した量の精製したＩｇ
Ｇ画分を加えた。４°で１５分間インキュベーションの
後、その試料を０゜１Ｍリン酸カルシウム、ｐＨ８，０
，０，００２Ｍジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌ）及び０，０２％トライトンＸ−Ｚｏｏと
なるように調節した１０−３０％グリセロール勾配上に
重ねた。その試料を１°でスビンコ５Ｗ５０−１０−タ
ー中テ１２時間４８．ＯＯＯｒｐｍで沈降させた０両分
をチューブの底部から滴下により集め、そして酵素活性
を前記の如くして検定した。

隨敦 多数のウィルス性ＤＮＡポリメラーゼ及びヒトの乳ガン
粒子の対応する酵素に対する抗−ＭＰＭＶ　ＤＮＡポリ
メラーゼの効果を比較した。これらの実験において、前
記材料及び方法のところで記載した如くして精製した等
密度バンドの粒子をＤＮＡポリメラーゼのソースとして
使用し、そしてオリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）をテンプ
レートとして使用した。抗体は８０％より多くのＭＰＭ
Ｖ−ＤＮＡポリメラーゼを阻害しそしてヒト乳ガン粒子
と関連したＤＮＡポリメラーゼの２６％阻害を達成する
６対照的に、鳥類骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）　、ラ
ウシエル及びフレンドねずみ白血病ウィルス（ＲＬＶ及
びＦＬＹ）　、ネコの白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、サ
ルの肉腫ウィルス（ＳＳＶ−１）又はネズミの乳腺腫瘍
ウィルス（Ｍ　Ｍ　Ｔ　Ｖ　）を包含する他の動物の芽
ンコルナウイルス（ｏｎｃｏｒｎａ−ｖｉｒｕｓｅｓ　
）の何れものＤＮＡポリメラーゼに対しては検出され得
る効果は見出されなかった。

乳ガン粒子酵素に関して見出された阻害がこの悪性腫瘍
に限られているかどうかに中心をおいて次の組織を検査
した。当業界で知られている如く、間葉ガン（ｍｅｓｅ
ｎｃｈｙｍａｌ　ｃａｎｃｅｒｓ）を有する患者からの
碑臓は粒子酵素の好都合なソースを構成し、そしてこれ
らが免疫的比較のために選ばれた。粒子画分を調製しそ
して内因性ポリメラーゼ活性をヒトの乳腺腫瘍に対して
及び間葉新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉｓ）を伴なった［１
に対して前記した如くして検定した。各種の新生組織（
ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｔｉｓｓｕｅ）の少なくとも５
種の例を検査し、そして代表的結果を表４に示す。

白血病及びリンパ腫の稗から誘導された粒子酵素に関し
ては意義ある程の阻害は見られなかった。

しかしながら、乳ガン微粒子酵素は５９％から９５％以
上まで阻害された。これらの内因性反応は合成テンプレ
ートにより指向された合成よりも抗−ＭＰＭＶポリメラ
ーゼＩｇＧによってよりひどく影響されることに注目さ
れたい。予期される如く、表４に記載のＤＮＡポリメラ
ーゼ活性はすべてリボヌクレアーゼに対して感受性であ
り、そしてアクチノマイシンＤ（１００μｇ／ｍｌ’）
及びディスタマイシン（５０μｓ／ｍｉ’）の存在に対
して抵抗性であり、これはＲＮＡ−指向ＤＮＡポリメラ
ーゼの特徴である。

表４にしめしたデータが指示された新生組織から単離し
た洗剤破壊した粒子の内因性反応により得られる。完全
を期するために、オリゴ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）により
指向された対応する精製した酵素を使用して同様な比較
を行なった。この方法を使用する実験は、乳ガン及び慢
性骨髄性白血病牌から調製した粒子から精製した逆転写
酵素の抗−ＭＰＭＶポリメラーゼＩｇＧに対する反応を
与えた。試験したＩｇＧの全濃度範囲にわたって白血病
の逆転写酵素は意義ある程に影響を受けない。

反対に、抗−ＭＰＭＶポリメラーゼＩｇＧは試験した全
濃度における乳ガン逆転写酵素の活性を抑制し、反対混
合物当り１５０μｇにおいて３７％阻害を達成する。

表５は抗ＭＰＭＶポリメラーゼＩｇＧに対する正常ｍ胞
のＤＮＡポリメラーゼの反対を試験することによって相
互作用の特異性の他の観点を調べる。

乳腺腫瘍から単離されたものであれ、ｌ１ｅｌａ［胞株
から単離されたものであれ、ＤＮＡポリメラーゼγの調
製物は検出できる程に阻害されず、そして同じことがＤ
ＮＡポリメラーゼβに対して言える。同じ水準で抗−Ｍ
ＰＭＶポリメラーゼＩｇＧは乳ガン逆転写酵素を４０％
抑制した。正常なりＮＡポリメラーゼαに関して同様な
実験を行ない、そしてこの場合の抗−ＭＰＭＶポリメラ
ーゼＩｇＧによる阻害の証拠は見出されなかった６乳ガ
ン逆転写酵素と抗−ＭＰＭＶポリメラーゼＩｇＧ間の物
理的複合物の存在に対して更に証拠を提供し得るかどう
かを調べることは望ましいことであった。第一に、かか
る証拠は酵素活性の単純な抑制から導かれた結論に対し
て直接の支持を追加するであろう、第二に、これらの線
に沿っての実験は、抗−ＭＰＭＶ　ＤＮＡポリメラーゼ
■ｇＧが乳ガン逆転写酵素活性の全中和を見かけ上達成
できないことの土台となる基礎を同定できるであろう。

基本的には、阻害の不完全さを説明するのに２種類の機
序が提唱され得る。一つは、酵素調製物が不均質であり
、そして副骨集団（５ｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の
みが添加したＩｇＧとの不活性複合体を生成することを
示唆する。もう一つは、酵素分子の母集団がこの点にお
いて均質であること及びすべて複合体を形成するが、該
複合体はもとの活性のフラクションを示しうろことを仮
定する。

これらの二つの可能性は問題のＩｇＧとの反応の前及び
後における酵素活性の沈降分析により容易に識別され得
る。

この方法の有効性を監視するために、ＭＰＭＶ−ＤＮＡ
ポリメラーゼ及びその抗体から成る同族系に関して陽性
の対照実験を行なった。陰性対照には同じ家兎からの正
常な（免疫前の）ＩｇＧの使用が包含された。酵素及び
指示されたＩｇ０１５０μｇを含有する２５０μ人反応
物を、材料及び方法において記載した如くして、４°で
１５分間インキュベートした０次いで混合物を１０−３
０％勾配上に重ね、そして１°で１２時間４８゜０００
ｒｐｍで遠心分離した０次いで両分を底部から集め、そ
して逆転写酵素に対して及び免疫拡散によるＩｇＧの存
在に対して検定した。正常なＩｇＧに関するインキュベ
ーションによっては外部標識ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）に関するＭＰＭＶ逆転写酵素活性のピークの位置（
チューブ１３）は変わらないことが見出された。酵素は
依然として７０，０００ダルトンの分子量に対応する速
度で沈降する。この同じ勾配において、上記ＩｇＧはチ
ューブ１０．１１、及び１２中に見出された。抗−ＭＰ
ＭＶポリメラーゼ１５０μｇとポリメラーゼとのインキ
ュベーションは酵素活性の８０％損失及び残存活性のｍ
著に異なった沈降パターンをもたらす。ＢＳＡに近いも
との位置には酵素は検出されず、そのすべては遊離酵素
又はＩｇＧより速く沈降する複合体として現われる。

上記ＩｇＧはここでは画分１３．１４及び１５並びにポ
リメラーゼ活性のピークを包含する６から１０までの画
分の免疫拡散によって検出される。

ヒトの乳ガン粒子から精製した逆転写酵素による実験に
おいて非常に類似した状況が見出される。

正常なＩｇＧとのインキュベーションはＢＳＡＦＪ識位
置の一つとなりのチューブ内にその通常の位置（チュー
ブ１５）に上記ヒトの酵素を残し、そして上記ＩｇＧは
チューブ１２〜１４において免疫拡散により見出される
。しかしながら、抗−ＭＰＭＶポリメラーゼＩｇＧとの
反応は４５％の活性損失をもたらし、そしてＩｇＧがや
はり免疫拡散によって検出され得る６から１０までの画
分中に見出される速く移動する複合体としてチューブの
下方に残留物を移動させる。ＩｇＧはそのもとの位置（
１２から１４までの両分）にも見出される。

ＭＰＭＶ逆転写酵素もヒトの乳ガン粒子から単離された
それも抗−ＭＰＭＶポリメラーゼＩｇＧと複合すること
ができない分子を有意の割合で含有しないことは前記し
た結果から明らかである。

酵素ＩｇＧ複金物がいくらかの活性を示すことができる
という事実は新らしい現象ではない、実際に、いくつか
の報告例においてはかかる複合物は充分に活性である。

１丸 ここに記載した実験は抗−ＭＰＭＶ　ＤＮＡ　　ＩｇＧ
は、過剰に存在する場合には、ヒトの乳ガン粒子から単
離した逆転写酵素と完全に複合することができること及
びそれを部分的に阻害し得ることを示す、阻害の特異性
はこの同じ抗体が正常細胞のＤＮＡポリメラーゼの活性
又は動物オンコルナウイルス（たとえばＡＭＶ、ＲＬＶ
、ＦＬＶ、ＦｅＬＶ、５ＳＶ−１及びＭＭＴＶ）がらの
いろいろな逆転写酵素の活性に影響を与えることができ
ないことにより支持される。更に、免疫前に同じ家兎か
ら得られた正常なＩｇＧはＭＰＭＶ又はヒトの乳ガン逆
転写酵素の何れとも複合しないか又は何れをも阻害しな
い。

その病因学的興味とは別に、ＭＰＭＶの逆転写酵素及び
ヒトの乳ガン粒子間の免疫学的交叉反応性はより直接的
に重要な意味を有する。それは臨床的有用な方法により
ヒトの乳ガンを検査するための基礎を与える。ＭＰＭＶ
はその酵素及び他のタンパク質成分のＭ製に対して十分
な収率でｊｆｌ職培養において製造することができる。

これらは外科病理学者のための診断手段としての凍結切
片を免疫ケイ光性及び免疫パーオキシダーゼ染色する際
の特異的検出試薬として使用するための抗血清を発生さ
せるのに使用することができる。更に興味深いことは、
肺ガン、胃ガン、肛門及び結腸ガン、卵巣ガン、脳ガン
、骨ガン、リンパ腺のガン、皮膚ガン［鱗片細胞（ｓｑ
ｕａ　５ｏｎｓ　ｃｅｌｌ）及び基底細胞ガン及び黒色
腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）　］及び同様なものの如き乳ガ
ン以外のガンを有する患者の血漿及び他の体液中の免疫
学的関連タンパク質の全身系検出のための免疫検定にお
けるかかる発現の使用である。これらのガンの各々はそ
れ自身の明白な粒子関連タンパク質を有する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、乳腫瘍ウィルスによつて産生され、他のウィルス及
   び乳房組織成分を本質的に含まず、且つ線状２０〜５０
   ％サッカロースＴＮＥ密度勾配において約１．１６〜１
   ．１９ｇ／ｃｃの半値幅をもつ領域にバンドを有するＲ
   ＮＡ核タンパク質複合体からなることを特徴とする＾１
   ＾２＾５Ｉ標識高純度ヒト乳ガン特異性乳腫瘍関連タン
   パク質。