JPS6215826B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6215826B2 JPS6215826B2 JP52084325A JP8432577A JPS6215826B2 JP S6215826 B2 JPS6215826 B2 JP S6215826B2 JP 52084325 A JP52084325 A JP 52084325A JP 8432577 A JP8432577 A JP 8432577A JP S6215826 B2 JPS6215826 B2 JP S6215826B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- breast cancer
- tumor
- virus
- dna polymerase
- polymerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 91
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 74
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 56
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 52
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 51
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 45
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 40
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 18
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 14
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims description 3
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 102100032202 Cornulin Human genes 0.000 claims 1
- 101000920981 Homo sapiens Cornulin Proteins 0.000 claims 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 60
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 33
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 241000713821 Mason-Pfizer monkey virus Species 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 6
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- UPBAOYRENQEPJO-UHFFFAOYSA-N n-[5-[[5-[(3-amino-3-iminopropyl)carbamoyl]-1-methylpyrrol-3-yl]carbamoyl]-1-methylpyrrol-3-yl]-4-formamido-1-methylpyrrole-2-carboxamide Chemical compound CN1C=C(NC=O)C=C1C(=O)NC1=CN(C)C(C(=O)NC2=CN(C)C(C(=O)NCCC(N)=N)=C2)=C1 UPBAOYRENQEPJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 3
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 3
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000714205 Woolly monkey sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 108010042747 stallimycin Proteins 0.000 description 2
- 229950009902 stallimycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(O)=O XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- ODPOAESBSUKMHD-UHFFFAOYSA-L 6,7-dihydrodipyrido[1,2-b:1',2'-e]pyrazine-5,8-diium;dibromide Chemical compound [Br-].[Br-].C1=CC=[N+]2CC[N+]3=CC=CC=C3C2=C1 ODPOAESBSUKMHD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ITZMJCSORYKOSI-AJNGGQMLSA-N APGPR Enterostatin Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 ITZMJCSORYKOSI-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 244000045232 Canavalia ensiformis Species 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010001132 DNA Polymerase beta Proteins 0.000 description 1
- 102000016903 DNA Polymerase gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010014080 DNA Polymerase gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100022302 DNA polymerase beta Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000005630 Diquat Substances 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000714188 Friend murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000010617 Phaseolus lunatus Nutrition 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 208000018212 fibroblastic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- VCWNAJUHTLWQQT-YRGDBDHISA-N mpma Chemical compound C([C@@]1(C(=O)C(C)=CC1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)OC)C(CO)=C[C@H]1C1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C VCWNAJUHTLWQQT-YRGDBDHISA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000018791 negative regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001447 template-directed synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
ねずみの乳腺腫瘍モデル（murine mammary
tumor model）による研究は、ウイルス性タンパ
ク質の血漿中濃度（plasmaconcentration）を使
用して固形腫瘍（solid tumor）の存在及び状態
を評価することの可能性を確立した。かかる研究
に使用されたウイルス性タンパク質は、アフイニ
テイー・クロマトグラフイー（affinity
chromatography）を使用してねずみの乳腺腫瘍
ウイルス（MMTV）から単離した52000ダルトン
の糖タンパク質（gp52）であつた。前記方法に
より精製されたgp52が入手可能であることは、
0.1ng／100μよる低い血漿中濃度水準に対して
測定可能のこのタンパク質に対する放射性免疫検
定（radioimmunoassay）の発展を可能にした。
この点に関しては、Ritzi et al.、Virology、
75、188（1976）及びRitziet al.、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、73、No.11、4190（1976）参照。 乳腺腫瘍とgp52の血漿中濃度水準との間の関
係は下記の通りであるこそが見出された： (a) 腫瘍を有する雄又は雌のマウスは血漿中の遊
離可溶性タンパク質としてのgp52の顕著に高
められた水準（100〜1000ng/ml）及び平均腫
瘍寸法と共に増大する平均濃度を示した； (b) 他の悪性腫瘍（malignancy）（白血病）の存
在によつては血漿中のgp52は何ら変化しなか
つた； (c) 移植により乳腺以外に位置した乳腺腫瘍もま
た高い血漿gp52水準により検出される； (d) 腫瘍のないマウスにおいては、それらが高頻
度の自然発生、（spontaneos）乳腺腫瘍により
特徴づけられる種を起源とするものであれ、低
頻度の自然発生乳腺腫瘍により特徴づけられる
種を起源とするものであれ、gp52の低い（２
−10ng/ml）血漿水準が見出される； (e) 腫瘍のない泌乳している雌は、それらの乳汁
がこの蛋白質を平均して20000ng/ml含有して
いるという事実にもかかわらず、通常は低水準
の血漿gp52を示す；そして (f) 腫瘍性（tumorous）動物における循環器の
浄化時間（circulatory clearance time）は十
分に速く（半寿命４−6hr）、観測される高水準
を維持するために連続して補充する必要がある
ことを示唆する。 上記MMTVモデルは、ヒト乳ガン（human
breast cancer）の存在及び状態を監視するため
に、血漿中のウイルス性タンパク質「標識」
（marker）を使用することの可能性を確立するた
めの基礎を提供するものである。ウイルス性タン
パク質標識の使用は、米国特許第3999944号に開
示されているような、腫瘍特異細胞性免疫（cell
mediated immunity）により引起された抗原誘起
白血球粘着阻害を検出することに基づく検定とは
区別されるであろう。 本発明は、血漿試料中の或る種の腫瘍特異性ウ
イルス関連タンパク質（tumor specific viral
related protein）を検定することにより人間にお
けるガンの存在及び状態を検出する方法、及びそ
のために有用な新規な試薬に関する。従つて、か
かる方法は、診断においてたとえば上記病気の早
期検出のための最初のスクリーニングプログラム
において、治療においてたとえば外科、放射線及
び／又は化学療法による治療後の上記病気の状態
を評価するに際して、及び予後においてたとえば
再発又は転移の可能性を検出するに際して有用で
ある。 ガン、特に乳ガンの検出用の標識として使用し
得るウイルス関連タンパク質には、ウイルス酵
素、例えばRNA―依存性DNAポリメラーゼ（逆
転写酵素）（reverse trans criptase）又はウイ
ルス起源の腫瘍関連タンパク質が包含される。 従つて、本発明の第一の観点は血漿標識として
RNA―依存性DNAポリメラーゼを使用すること
によるヒト乳ガンの検出に指向するものである。 ヒト乳ガン粒子はRNA腫瘍ウイルスの多くの
特徴を備えていることが既に知られている。予期
される寸法（600S）及び密度（1.16g/ml）に加え
て、これらの特長は、外膜（outer membrane）
及びDNAポリメラーゼ、並びにマウスの乳腺腫
瘍ウイルス（MMTV）及びメーソン−フイツツ
エル・モンキー・ウイルス（Mason−Pfizer
Monkey Virus）（MPMV）のRNAに対する検出
可能な同族性（homology）を有する大分子量
（70S）RNAを含有する「芯」を取囲む内膜を有
することを包含する。 ヒト乳ガン粒子からのDNAポリメラーゼの精
製及び特性化が今回達成され、これは本発明の一
部をなす。この酵素の重要な性質はMMTV及び
MPMV中に見出された逆転写酵素の性質に非常
に類似している。従つて、これらのウイルス酵素
と同様に、精製したヒト乳ガンDNAポリメラー
ゼは公知のウイルス逆転写酵素を正常細胞の
DNAポリメラーゼから区別する下記の三つの特
徴を示す：（ａ）ポリ（dT）の合成のためのテ
ンプレートとしてオリゴ（dT）：ポリ（dA）に
まさるオリゴ（dT）：ポリ（rA）に対する強い
優先性；（ｂ）ポリ（dG）の形成のためのテン
プレートとして高度に特異性のオリゴ（dG）：
ポリ（rCm）の受容（acceptance）：（ｃ）忠
実なDNA相補的複写（Complementary copy）
を形成するためのテンプレートとしてウイルス
RAN（AMV）を使用し得る能力。MMTV及び
MPMVの逆転写酵素に対するヒトの酵素の類似
性は、それが70000ダルトンの分子量を有するこ
と及びMn++よりもMg++に対するそれの優先性に
おいて更に広がる。今日まで、これらの性質を有
する酵素は正常な乳房組織（breast tissues）又
は良性の乳腺腫瘍（tumors of the breast）にお
いては検出されなかつた。 ヒト乳ガンDNAポリメラーゼの単離は、乳ガ
ン組織を均質化そして不連続なサツカロース濃度
勾配の上に重ねることによつて達成された。1.16
〜1.19g/c.c.における密度領域をプールし、希釈
し、そして遠心分離した。そしてペレツトの懸濁
液をポリアクリルアミドアガロースゲル過によ
り分別した。DNAポリメラーゼ検定により活性
であることが見出された画分をプールし、そして
ホスホルセルロースカラムによりクロマトグラフ
にかけた。0.1M〜0.5Mリン酸塩緩衝液pH7.2の
線状濃度勾配により溶出した。ポリメラーゼ活性
の主要ピークをプールし、そして該酵素を透析に
より濃縮した。 精製したヒト乳ガンDNA―ポリメラーゼは多
数の方法においてヒト乳ガンに対する診断検定を
開発するのに使用することができる。好ましくは
完全なフロインド・アジユバント（Freunds
adjuvant）のエマルジヨン中の精製したヒト乳ガ
ンDNA―ポリメラーゼを、或る期間にわたつ
て、家兎、モルモツト、やぎ、馬等の如き適当な
宿主動物に注入し、次いで宿主を（から採血し
て）〔通常増強注入（booster injection）を行な
つた後〕所望の抗血清（antisera）を得ることに
よつて、ヒト乳ガンDNA―ポリメラーゼ特異性
抗体を誘発させるのに前記ポリメラーゼを使用す
ることができる。 更に、上記精製酵素は放射性ヨウ素化のための
基質として使用して〔125I〕酵素を生成せしめる
ことができる。放射性ヨウ素化のための好適な方
法は、上記酵素を〔125I−〕−３−（４−ヒドロキ
シフエニル）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（Bolton−Hunter試薬）で処
理し、続いてＧ−100カラムにより精製すること
を包含する。 前記した抗体及び標識した酵素は、ヒト血漿試
料中におけるヒト乳ガンDNA―ポリメラーゼに
対する放射性免疫検定において使用することがで
きる。好適な放射性免疫検定方法は当業界におい
て公知である。従つて、たとえば使用し得る類似
した法法がRitzi et al.、Virology、75、188
（1976）に記載されている。かかる方法において
は、緩衝化した試料を抗血清、即ち家兎の抗―
DNA―ポリメラーゼで処理し、次いで37℃で約
45分間インキユベーシヨンの後、〔125I〕−標識酵
素を加えた。試料を更に37℃で２時間インキユベ
ートし、そして結合放射能（bound radio
activity）を、正常なIgG（家兎）及びIgG（家
兎）の最大量の（optimal）沈殿を生ぜしめるた
めに十分な量の第二の抗体（ヤギの抗−家兎
IgG）を加えることにより遊離の放射能から分離
した。 上記試料におけるDNA―ポリメラーゼの濃度
は、結合した及び／又は遊離の画分において観測
された放射能の計数を、同じ検定法でいろいろな
既知量のDNA―ポリメラーゼを使用して得られ
た標識曲線と比較することによつて決定すること
ができる。 別の方法において、血漿試料中の酵素濃度水準
は、上記酵素を単離しそして酵素活性を測定する
ことにより決定することができる。単離は、血漿
試料を硫酸アンモニウムで処理して酵素を沈殿せ
しめ、続いて再溶解（reconstitute）した沈殿物
を、酵素に対する合成テンプレートを共有結合せ
しめてあるセフアロースビーズ（sepharose
beads）のカラムによりアフイニテイー・クロマ
トグラフイーに付することによつて容易に達成す
ることができる。この目的に好適なテンプレート
は、ポリリボアデニレート〔Poly（rA）〕又はポ
リ（2′−Ｏ−メチルシチジレート）〔Poly
（rCm）〕を包含する。カラムからの酵素の溶出は
PH7.2で緩衝された0.01Mリン酸塩中の0.01MKCl
〜1.0MKClの勾配を使用して達成される。単離し
た酵素のDNA―ポリメラーゼ活性は、前記した
乳ガン組織からの酵素の精製を行なう際に使用し
たのと同じ検定方法を使用して検定することがで
きる。 本発明の方法の更に一つの態様は、ウイルス起
源のヒト腫瘍関連タンパク質の発見に関する。一
つのかかるタンパク質はヒト乳ガン組織標本の細
胞間空隙に実質的濃度で見出されるのみならず乳
ガン患者の血漿中にも循環していることが証明さ
れ得る。腫瘍関連タンパク質は、ウイルスが乳房
細胞に感染した後のウイルスにより産生された又
はウイルス制御下に該細胞自体により産生された
過剰のタンパク質であると考えられる。従つて本
発明の更に一つの観点は、たとえば乳ガンの如き
ガンに対する診断及び予後の試験として血漿試料
中におけるこの腫瘍関連タンパク質の存在を検定
することである。 均質化したガン組織からの腫瘍関連タンパク質
の単離は、アフイニテイー・クロマトグラフイー
及びカラムクロマトグラフイーの組合せによつて
行なうことができる。アフイニテイーカラムはセ
フアロース（Sepharose）4Bにカツプリングした
コンカナバリンＡ（Concanavalin Ａ）から成
り、そして市販品（Con Ａ Sepharose）であ
る。アフイニテイーカラムからのタンパク質の溶
出はα―メチル―Ｄ―マンノシド緩衝溶液を使用
して達成される。該タンパク質の追加的精製は
DAEセルロースクロマトグラフイーにより達成
される。この方法はMMTVからgp52を精製する
ためにRitzi et al.、Virology、75、188（1976）
おいて使用された方法に直接類似しており、そし
てその中に非常に詳しく記載されている。 ウイルス起源の精製した腫瘍関連タンパク質
は、乳ガンの検出に有用な放射線免疫検定の開発
のためのDNA―ポリメラーゼに対して前記した
と同じ方法で使用することができる。かくして、
該タンパク質は公知の方法で宿主動物中に注入し
てウイルス起源の腫瘍関連タンパク質に特異的な
抗体を誘発させることができる。更には、精製し
た腫瘍関連タンパク質は、放射性標識化すること
ができ、好ましくは〔125I〕ボルトン−ハンター
試薬で放射性ヨウ素化して標識化した、即ちかか
る放射性免疫検定における標識として使用される
125I−腫瘍関連タンパク質を生ぜしめることがで
きる。本発明のこの観点において使用される放射
免疫検定方法は、狭く臨界的なものではなく、任
意の通常の方法を使用することができる。好まし
くは、使用される検定方法は、DNA―ポリメラ
ーゼの放射性免疫検定に対して使用される既に前
記したブロツキング二重抗体法（blocking
double antibody procedure）であろう。 本発明の更に一つの観点においては、メーソン
−フイツツエル・モンキー・ウイルス
（MPMV）特異性抗体は、かなり水準で、ヒト乳
ガンDNA―ポリメラーゼ及びヒト乳ガンウイル
ス起源の腫瘍関連タンパク質の両方と交叉反応す
ることが今回見出された。従つて本発明のヒト乳
ガン放射性免疫検定において、かかる抗体及び放
射性標識化した好ましくは125I−MPMVを使用す
ることが可能である。MPMVは組織培養におい
て増殖させることができ、従つてかなりの量を容
易に入手できるので、このことは本発明を広く適
用するための特に好都合な試薬源を提供する。 本発明の更に一つの観点においては、好適な酵
素が所望の抗体に共有結合している。抗体―酵素
複合体は依然として酵素的に活性であり、そして
特有の抗原を含有する組織標本と接触させて置く
と抗体がそれと結合する。次いで酵素の基質を加
えると、その結果活性部位における着色沈殿物の
放出が起こる。特定の態様においては、パーオキ
シダーゼをメーソン−フイツツエル・ウイルスタ
ンパク質に対する抗体にカツプリングさせた。該
着色生成物の出現及び分布は抗原の存在を同定す
るのを可能にするのみならず、組織片中の悪性腫
瘍細胞中の抗原の位置を実際に決定するのを可能
にする。 この原理を使用する他の方法には、体液（たと
えば血漿）中の同じ抗原の定量的評価が包含され
る。その方法は下記の通りである： (1) 抗体を固体表面（たとえばポリスチレン）
上に被覆し；(2)既知容量の患者からの血漿をチユ
ーブに加え、そして表面上に被覆した抗体に試料
中に存在する問題の抗原の何れをも吸着させ；次
いで試料を除去し、そしてチユーブを洗浄し；(4)
抗体―酵素複合体を加えそして付着のためにイン
キユベートする。次いで、すべての吸着されてい
ない酵素結合抗体を洗い出し；(5)存在する腫瘍抗
原の量を評価するための測定し得る色又はケイ光
の何れかを与える発色性基質を加える。使用し得
る好ましい酵素はアルカリ性―ホスフアターゼ及
びβ―ガラクトシダーゼを包含し、その両方共優
れた発色性基質を有する。 本発明のこの観点の実施に有用な方法に関する
更に詳細なことは先行技術から入手できる。たと
えば米国特許第4002532号及び第4016043号参照。 本発明の方法を構成する種々の検定は、ヒトに
おける乳ガンの存在を検出するために使用するこ
とがきる。かかる使用を達成するために、臨床的
に確立した乳ガン患者、正常な患者及び良性腫瘍
又は非乳ガン腫瘍を有する患者からの統計的に有
意義な数の血漿試料を、直接DNA―ポリメラー
ゼ活性法、DNA―ポリメラーゼ免疫検定又は腫
瘍関連タンパク質免疫検定により検定する。これ
らの検定において見出される標識タンパク質の濃
度は、正常な及び非乳ガン腫瘍試料に対して見出
された水準に比べると、乳ガン血漿試料の場合に
は著しく高い。従つて、正常状態又は非乳ガン状
態に対応する水準と乳ガンの存在に対応する各検
定方法における標識タンパク質の濃度水準との間
に任意な対照水準線（control level line）をひく
ことが可能である。次いで未知の血漿試料は、本
発明の方法の１つの従つて試料を検定し、そして
標識タンパク質が対照水準より過剰の濃度で存在
するかどうかを決定することにより、被験体の乳
ガンの可能性について評価され得る。 或いは、標識タンパク質の患者自身の水準は内
部対照として役立ち得る。かくして、確認した乳
ガンを有する患者は治療の開始後及び前に検定す
ることができる。標識タンパク質の水準の顕著な
低下は治療の好ましい予後を示すであろう。標識
タンパク質濃度水準の後における実質的増加は、
上記病気の起り得る再発又は転位を示し、そして
主治医が初期における治療を開始することを可能
にする。更に、かかる治療の有効性は本発明の方
法により検定され得る。 本発明を下記実施例により更に説明する。 実施例 １ 乳腺腫瘍組織の細胞レベル以下の分別
（Svbcellwlar Fractionation） 入手し得る材料の量に依存して、腫瘍9g乃至
30gをとかし、細かく切り刻み、４倍容量の冷い
５％サツカロース（Ｗ／Ｖ）―TNE（0.01MTris
−HCl、PH8.0、0.15MNaCl、3mM EDTA）中に
懸濁させ、そしてシルバーソン（silverson）ホ
モジナイザー中でブレンドした。均質化物を、そ
れぞれ核及びミトコンドリアを除去するために、
4000Xg及び10000Xgで遠心分離した。トリプシ
ンを最終濃度0.5mg/mlまでミトコンドリア除去後
の上澄液（post−mitochondrial supernatant）
に加えた。20℃で10分間インキユベーシヨンした
後、タンパク分解活性は、２種類のポリペプチ
ド、リマビーン（lima bean）トリプシン阻害剤
（１倍過剰）及びトラシロール（Trasylol）
（100KIU／ml）の添加により阻害した。その試料
を50％スクロース−TNE6ml及び25％スクロース
−TNE8mlから成る不連続スクロース濃度勾配の
上に重ねた。スピンコ（Spinco）SW−27ロータ
ー中４°で90分間25000rpmで遠心分離して、
25／50％界面の試料を集め、TNEで希釈し、そ
して線状20―50％スクロース−TEN濃度勾配上
に重ねた。該試料を16時間上記の如く遠心分離
し、そしていろいろの密度領域を集せた。RNA
腫瘍ビールスが局在する密度領域（1.16―1.19g/
c.c.）をプールし、希釈し、そして90分間上記の如
く遠心分離した。得られるペレツトを0.1Mトリ
ス−HCl、PH8.0、約0.6ml中に再懸濁した。 ６つのロツトの腫瘍を上記方法で酵素用に処理
した。これらのうちの４種（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）
は特性を決めるに十分な酵素を生成せしめた。１
つの調製物（Ａ）、転位性肝臓腫瘍は単一患者か
らのものであり、他はすべて多数の種々の個体か
らプールした材料である。 ポリアクリルアミドアガロースゲル過 再懸濁したペレツトをKCl（0.4M）、DTT（ジ
チオスレイトール、0.01M）及びトライトンＸ−
100の如き非イオン性界面活性剤（0.6％）の添加
により15分間０℃で可溶化した（solubilized
and disvupted）。その試料約0.9mlを、緩衝液Ａ
（2mM、DTT、1mM、EDTA、0.02％TritonX−
100及び10％グリセロール）中、PH8.0、0.3Mリ
ン酸カリウムと平衡したポリアクリルアミドアガ
ロースゲル（Ultrogel AcA44）の0.9×50cmカラ
ムに加えた。0.3Mリン酸緩衝液Ａで流速約２ml/
ｈｒで溶出した。画分（0.5ml）をDNAポリメラー
ゼ活性及び末端トランスフエラーゼ活性について
下記の如く検定した。 ホスホセルロース クロマトグラフイー ウルトロゲルカラムからのピーク画分をプール
し（３ml）そしてトラシロールを100KIU／mlの
濃度になるように加えた。その試料を、リン酸塩
濃度が0.02Mより小さくなるまで、0.01Mリン酸
カリウム、PH7.2緩衝液Ａに透析し、次いで同じ
緩衝液と平衡した0.9×10cmホスホセルロールカ
ラム（WhatmanP−11）に添加した。このカラム
を0.01Mリン酸塩緩衝液30mlで洗浄し、そして酵
素活性（画分）を14ml/hrの流速で0.01M〜0.5M
リン酸カリウム緩衝液Ａ、PH7.2の120ml線状勾配
で溶出した。画分（1.2ml）をDNAポリメラーゼ
及び末端トランスフエラーゼ活性について検定し
た。ポリメラーゼ活性の主要ピークをプールし、
そしてトラシオールを100KIU／mlまで加えた。
この酵素画分（PC酵素と呼ばれる）をアクシア
ード11−Ａ（Aquacide 11−Ａ）の如き滲透圧的
に活性な、高分子量合成重合体に対して０℃で透
析により濃縮た。 グリセロール勾配遠心分離 分子量を評価するために、濃縮たPC酵素を
0.1Mリン酸カリウム、PH8.0で３倍に希釈し、そ
して0.1Mリン酸カリウム、PH8.0、2mM DTT及
び0.02％トライトンＸ−100を含有する線状10−
30％グリセロール勾配上に重ねた。スピンコSW
−50.1ローター中１°で12時間48000rpmで遠心
分離を行なつた。画分を底部から集め、そしてテ
ンプレートとしてオリゴ（dG）：ボリ（rC）に
より逆転写酵素活性を検定した。ウシ血清アルブ
ミンを平行勾配における沈降物標識として用い
た。 DNAポリメラーゼ検定 合成重合体テンプレートを有するポリメラーゼ
活性に対する検定混合物は（100μ中）：５μ
molトリス−HCl、PH8.0、0.5μmolMgCl2、0.1μ
molDTT並びに、重合体及びdNTPsの下記組合
せ−0.4μｇオリゴ（dG）：ポリ（rC）又はオリ
ゴ（dG）：ポリ（rCm）、0.02μmoldCTP及び
1.0nmol〔3H〕dGTP（4000cpm／ｐモル）＝0.4
μｇオリゴ（dT）：ポリ（rA）又はオリゴ
（dT）：ポリ（dA）、0.02μモルdATP及び
1.0mmol〔3H〕dTTP（4000cpm／ｐモル）を含
有していた。オリゴ（dG）：ポリ（rCm）との
反応においては、MgCl2の代わりにMnCl2（0.02
μmol）を用いた。 AMV RNAを使用する検定は（100μ中）：
５μmolトリス−HCl、PH8.0、0.8μmolMgCl2、
0.1μmolDTT、10μｇアクチノマイシンＤ
（Sigma Corp）、５μｇデイスタマイシン
（distamycin）Ａ（Calibochem）、２μ
gAMV70S′RNA、0.1μｇオリゴ（dT）12-18、
dATP、dGTP、dTTPが各々0.1μmol及び5nモ
ル〔3H〕dCTP（1.5×104cpm／pmol）を含有し
ていた。 すべの反応を15―30分間36°でインキユベート
し、そして冷い0.067Mピロリン酸ナトリウム−
1Mリン酸ナトリウム、PH7.2 0.5mlを添加し続い
て冷80％TCA0.5mlを添加して停止させた。酸不
溶性放射性活性を膜過器で集めそしてシンチレ
ーシヨン計数管により測定した。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ活性を相補的（complementary）重合体テン
プレートの不存在下に〔3H〕dGTPの重合により
測定した。重合体dNTP組合せを0.4μｇオリゴ
（dG）10-18＋0.02μmoldCTP及び1.0nmol〔3H〕
dGTPで代替したことを除けば反応は前記した如
くして行なつた。 すべての合成オリゴー及びポリヌクレオチド三
重水素化dGTP、dTTP及びdCTPは市販のもの
であつた。AMV70SRNAをWeisset at、
Virology71、242（1976）に記載の如くして精製
ウイルスから単離した。 ハイブリダイゼーシヨン（hybridigation
Reactions） ハイブリダイゼーシヨン及びS1ヌクレアーゼに
よるそれらの分析方法は、Weiss他（上記参照）
により報告されている。Axel et al.、Nature
235、32（1972）に開示されたCs2SO4平衡密度遠
心分離に対する条件を、0.02％ソジウムＮ−ラウ
ロイルサルコシネート及び大腸菌（E.Coli）
DNA及びRNAの各々20μｇを前記勾配液に添加
することにより改変した。 結 果 下記したデータは四種の異つた腫瘍採集物（標
識したＡないしＤ）からの独立の酵素単離物に基
づく。分別期間中の挙動及び乳腺腫瘍ポリメラー
ゼの特性は調製のロツトによつて有意差がなかつ
た。 ポリメラーゼ調製物Ａを乳ガンを有する患者の
肝臓中の転位病巣から単離した。腫瘍9gを均質
化し、そして1.16―1.19g/mlの密度でバンドをな
す微粒子材料を前記した如くして集めた。回収し
たペレツトをトライトンＸ−100の添加により可
溶化し、次いでポリアクリルアミド−アガロース
ゲル（Ultrogen ACA−44）カラムにより分別し
た。各カラム画分を、(1) オリゴ（dG）12-18；ポ
リ（rC）をテンプレートとしてDNAポリメラー
ゼ（活性）について、及び(2)プライマー
（primer）としてオリゴ（dG）12-18を使用して末
端トランスフエラーゼについて検定した。DNA
ポリメラーゼ活性の３つのピーク（２つは大き
く、１つは小さい）が観測され、そして第一の大
きなピークもまた末端トランスフエラーゼを含有
することは明らかである。２つの大きなピーク
は、Udenfriend et al.、Science 178、871
（1972）のフルオレスカミン（fluorescamine）法
により測定して、加えたポリメラーゼ活性の90％
及びタンパク質３％を含有することが見出された
（表１）。
tumor model）による研究は、ウイルス性タンパ
ク質の血漿中濃度（plasmaconcentration）を使
用して固形腫瘍（solid tumor）の存在及び状態
を評価することの可能性を確立した。かかる研究
に使用されたウイルス性タンパク質は、アフイニ
テイー・クロマトグラフイー（affinity
chromatography）を使用してねずみの乳腺腫瘍
ウイルス（MMTV）から単離した52000ダルトン
の糖タンパク質（gp52）であつた。前記方法に
より精製されたgp52が入手可能であることは、
0.1ng／100μよる低い血漿中濃度水準に対して
測定可能のこのタンパク質に対する放射性免疫検
定（radioimmunoassay）の発展を可能にした。
この点に関しては、Ritzi et al.、Virology、
75、188（1976）及びRitziet al.、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、73、No.11、4190（1976）参照。 乳腺腫瘍とgp52の血漿中濃度水準との間の関
係は下記の通りであるこそが見出された： (a) 腫瘍を有する雄又は雌のマウスは血漿中の遊
離可溶性タンパク質としてのgp52の顕著に高
められた水準（100〜1000ng/ml）及び平均腫
瘍寸法と共に増大する平均濃度を示した； (b) 他の悪性腫瘍（malignancy）（白血病）の存
在によつては血漿中のgp52は何ら変化しなか
つた； (c) 移植により乳腺以外に位置した乳腺腫瘍もま
た高い血漿gp52水準により検出される； (d) 腫瘍のないマウスにおいては、それらが高頻
度の自然発生、（spontaneos）乳腺腫瘍により
特徴づけられる種を起源とするものであれ、低
頻度の自然発生乳腺腫瘍により特徴づけられる
種を起源とするものであれ、gp52の低い（２
−10ng/ml）血漿水準が見出される； (e) 腫瘍のない泌乳している雌は、それらの乳汁
がこの蛋白質を平均して20000ng/ml含有して
いるという事実にもかかわらず、通常は低水準
の血漿gp52を示す；そして (f) 腫瘍性（tumorous）動物における循環器の
浄化時間（circulatory clearance time）は十
分に速く（半寿命４−6hr）、観測される高水準
を維持するために連続して補充する必要がある
ことを示唆する。 上記MMTVモデルは、ヒト乳ガン（human
breast cancer）の存在及び状態を監視するため
に、血漿中のウイルス性タンパク質「標識」
（marker）を使用することの可能性を確立するた
めの基礎を提供するものである。ウイルス性タン
パク質標識の使用は、米国特許第3999944号に開
示されているような、腫瘍特異細胞性免疫（cell
mediated immunity）により引起された抗原誘起
白血球粘着阻害を検出することに基づく検定とは
区別されるであろう。 本発明は、血漿試料中の或る種の腫瘍特異性ウ
イルス関連タンパク質（tumor specific viral
related protein）を検定することにより人間にお
けるガンの存在及び状態を検出する方法、及びそ
のために有用な新規な試薬に関する。従つて、か
かる方法は、診断においてたとえば上記病気の早
期検出のための最初のスクリーニングプログラム
において、治療においてたとえば外科、放射線及
び／又は化学療法による治療後の上記病気の状態
を評価するに際して、及び予後においてたとえば
再発又は転移の可能性を検出するに際して有用で
ある。 ガン、特に乳ガンの検出用の標識として使用し
得るウイルス関連タンパク質には、ウイルス酵
素、例えばRNA―依存性DNAポリメラーゼ（逆
転写酵素）（reverse trans criptase）又はウイ
ルス起源の腫瘍関連タンパク質が包含される。 従つて、本発明の第一の観点は血漿標識として
RNA―依存性DNAポリメラーゼを使用すること
によるヒト乳ガンの検出に指向するものである。 ヒト乳ガン粒子はRNA腫瘍ウイルスの多くの
特徴を備えていることが既に知られている。予期
される寸法（600S）及び密度（1.16g/ml）に加え
て、これらの特長は、外膜（outer membrane）
及びDNAポリメラーゼ、並びにマウスの乳腺腫
瘍ウイルス（MMTV）及びメーソン−フイツツ
エル・モンキー・ウイルス（Mason−Pfizer
Monkey Virus）（MPMV）のRNAに対する検出
可能な同族性（homology）を有する大分子量
（70S）RNAを含有する「芯」を取囲む内膜を有
することを包含する。 ヒト乳ガン粒子からのDNAポリメラーゼの精
製及び特性化が今回達成され、これは本発明の一
部をなす。この酵素の重要な性質はMMTV及び
MPMV中に見出された逆転写酵素の性質に非常
に類似している。従つて、これらのウイルス酵素
と同様に、精製したヒト乳ガンDNAポリメラー
ゼは公知のウイルス逆転写酵素を正常細胞の
DNAポリメラーゼから区別する下記の三つの特
徴を示す：（ａ）ポリ（dT）の合成のためのテ
ンプレートとしてオリゴ（dT）：ポリ（dA）に
まさるオリゴ（dT）：ポリ（rA）に対する強い
優先性；（ｂ）ポリ（dG）の形成のためのテン
プレートとして高度に特異性のオリゴ（dG）：
ポリ（rCm）の受容（acceptance）：（ｃ）忠
実なDNA相補的複写（Complementary copy）
を形成するためのテンプレートとしてウイルス
RAN（AMV）を使用し得る能力。MMTV及び
MPMVの逆転写酵素に対するヒトの酵素の類似
性は、それが70000ダルトンの分子量を有するこ
と及びMn++よりもMg++に対するそれの優先性に
おいて更に広がる。今日まで、これらの性質を有
する酵素は正常な乳房組織（breast tissues）又
は良性の乳腺腫瘍（tumors of the breast）にお
いては検出されなかつた。 ヒト乳ガンDNAポリメラーゼの単離は、乳ガ
ン組織を均質化そして不連続なサツカロース濃度
勾配の上に重ねることによつて達成された。1.16
〜1.19g/c.c.における密度領域をプールし、希釈
し、そして遠心分離した。そしてペレツトの懸濁
液をポリアクリルアミドアガロースゲル過によ
り分別した。DNAポリメラーゼ検定により活性
であることが見出された画分をプールし、そして
ホスホルセルロースカラムによりクロマトグラフ
にかけた。0.1M〜0.5Mリン酸塩緩衝液pH7.2の
線状濃度勾配により溶出した。ポリメラーゼ活性
の主要ピークをプールし、そして該酵素を透析に
より濃縮した。 精製したヒト乳ガンDNA―ポリメラーゼは多
数の方法においてヒト乳ガンに対する診断検定を
開発するのに使用することができる。好ましくは
完全なフロインド・アジユバント（Freunds
adjuvant）のエマルジヨン中の精製したヒト乳ガ
ンDNA―ポリメラーゼを、或る期間にわたつ
て、家兎、モルモツト、やぎ、馬等の如き適当な
宿主動物に注入し、次いで宿主を（から採血し
て）〔通常増強注入（booster injection）を行な
つた後〕所望の抗血清（antisera）を得ることに
よつて、ヒト乳ガンDNA―ポリメラーゼ特異性
抗体を誘発させるのに前記ポリメラーゼを使用す
ることができる。 更に、上記精製酵素は放射性ヨウ素化のための
基質として使用して〔125I〕酵素を生成せしめる
ことができる。放射性ヨウ素化のための好適な方
法は、上記酵素を〔125I−〕−３−（４−ヒドロキ
シフエニル）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（Bolton−Hunter試薬）で処
理し、続いてＧ−100カラムにより精製すること
を包含する。 前記した抗体及び標識した酵素は、ヒト血漿試
料中におけるヒト乳ガンDNA―ポリメラーゼに
対する放射性免疫検定において使用することがで
きる。好適な放射性免疫検定方法は当業界におい
て公知である。従つて、たとえば使用し得る類似
した法法がRitzi et al.、Virology、75、188
（1976）に記載されている。かかる方法において
は、緩衝化した試料を抗血清、即ち家兎の抗―
DNA―ポリメラーゼで処理し、次いで37℃で約
45分間インキユベーシヨンの後、〔125I〕−標識酵
素を加えた。試料を更に37℃で２時間インキユベ
ートし、そして結合放射能（bound radio
activity）を、正常なIgG（家兎）及びIgG（家
兎）の最大量の（optimal）沈殿を生ぜしめるた
めに十分な量の第二の抗体（ヤギの抗−家兎
IgG）を加えることにより遊離の放射能から分離
した。 上記試料におけるDNA―ポリメラーゼの濃度
は、結合した及び／又は遊離の画分において観測
された放射能の計数を、同じ検定法でいろいろな
既知量のDNA―ポリメラーゼを使用して得られ
た標識曲線と比較することによつて決定すること
ができる。 別の方法において、血漿試料中の酵素濃度水準
は、上記酵素を単離しそして酵素活性を測定する
ことにより決定することができる。単離は、血漿
試料を硫酸アンモニウムで処理して酵素を沈殿せ
しめ、続いて再溶解（reconstitute）した沈殿物
を、酵素に対する合成テンプレートを共有結合せ
しめてあるセフアロースビーズ（sepharose
beads）のカラムによりアフイニテイー・クロマ
トグラフイーに付することによつて容易に達成す
ることができる。この目的に好適なテンプレート
は、ポリリボアデニレート〔Poly（rA）〕又はポ
リ（2′−Ｏ−メチルシチジレート）〔Poly
（rCm）〕を包含する。カラムからの酵素の溶出は
PH7.2で緩衝された0.01Mリン酸塩中の0.01MKCl
〜1.0MKClの勾配を使用して達成される。単離し
た酵素のDNA―ポリメラーゼ活性は、前記した
乳ガン組織からの酵素の精製を行なう際に使用し
たのと同じ検定方法を使用して検定することがで
きる。 本発明の方法の更に一つの態様は、ウイルス起
源のヒト腫瘍関連タンパク質の発見に関する。一
つのかかるタンパク質はヒト乳ガン組織標本の細
胞間空隙に実質的濃度で見出されるのみならず乳
ガン患者の血漿中にも循環していることが証明さ
れ得る。腫瘍関連タンパク質は、ウイルスが乳房
細胞に感染した後のウイルスにより産生された又
はウイルス制御下に該細胞自体により産生された
過剰のタンパク質であると考えられる。従つて本
発明の更に一つの観点は、たとえば乳ガンの如き
ガンに対する診断及び予後の試験として血漿試料
中におけるこの腫瘍関連タンパク質の存在を検定
することである。 均質化したガン組織からの腫瘍関連タンパク質
の単離は、アフイニテイー・クロマトグラフイー
及びカラムクロマトグラフイーの組合せによつて
行なうことができる。アフイニテイーカラムはセ
フアロース（Sepharose）4Bにカツプリングした
コンカナバリンＡ（Concanavalin Ａ）から成
り、そして市販品（Con Ａ Sepharose）であ
る。アフイニテイーカラムからのタンパク質の溶
出はα―メチル―Ｄ―マンノシド緩衝溶液を使用
して達成される。該タンパク質の追加的精製は
DAEセルロースクロマトグラフイーにより達成
される。この方法はMMTVからgp52を精製する
ためにRitzi et al.、Virology、75、188（1976）
おいて使用された方法に直接類似しており、そし
てその中に非常に詳しく記載されている。 ウイルス起源の精製した腫瘍関連タンパク質
は、乳ガンの検出に有用な放射線免疫検定の開発
のためのDNA―ポリメラーゼに対して前記した
と同じ方法で使用することができる。かくして、
該タンパク質は公知の方法で宿主動物中に注入し
てウイルス起源の腫瘍関連タンパク質に特異的な
抗体を誘発させることができる。更には、精製し
た腫瘍関連タンパク質は、放射性標識化すること
ができ、好ましくは〔125I〕ボルトン−ハンター
試薬で放射性ヨウ素化して標識化した、即ちかか
る放射性免疫検定における標識として使用される
125I−腫瘍関連タンパク質を生ぜしめることがで
きる。本発明のこの観点において使用される放射
免疫検定方法は、狭く臨界的なものではなく、任
意の通常の方法を使用することができる。好まし
くは、使用される検定方法は、DNA―ポリメラ
ーゼの放射性免疫検定に対して使用される既に前
記したブロツキング二重抗体法（blocking
double antibody procedure）であろう。 本発明の更に一つの観点においては、メーソン
−フイツツエル・モンキー・ウイルス
（MPMV）特異性抗体は、かなり水準で、ヒト乳
ガンDNA―ポリメラーゼ及びヒト乳ガンウイル
ス起源の腫瘍関連タンパク質の両方と交叉反応す
ることが今回見出された。従つて本発明のヒト乳
ガン放射性免疫検定において、かかる抗体及び放
射性標識化した好ましくは125I−MPMVを使用す
ることが可能である。MPMVは組織培養におい
て増殖させることができ、従つてかなりの量を容
易に入手できるので、このことは本発明を広く適
用するための特に好都合な試薬源を提供する。 本発明の更に一つの観点においては、好適な酵
素が所望の抗体に共有結合している。抗体―酵素
複合体は依然として酵素的に活性であり、そして
特有の抗原を含有する組織標本と接触させて置く
と抗体がそれと結合する。次いで酵素の基質を加
えると、その結果活性部位における着色沈殿物の
放出が起こる。特定の態様においては、パーオキ
シダーゼをメーソン−フイツツエル・ウイルスタ
ンパク質に対する抗体にカツプリングさせた。該
着色生成物の出現及び分布は抗原の存在を同定す
るのを可能にするのみならず、組織片中の悪性腫
瘍細胞中の抗原の位置を実際に決定するのを可能
にする。 この原理を使用する他の方法には、体液（たと
えば血漿）中の同じ抗原の定量的評価が包含され
る。その方法は下記の通りである： (1) 抗体を固体表面（たとえばポリスチレン）
上に被覆し；(2)既知容量の患者からの血漿をチユ
ーブに加え、そして表面上に被覆した抗体に試料
中に存在する問題の抗原の何れをも吸着させ；次
いで試料を除去し、そしてチユーブを洗浄し；(4)
抗体―酵素複合体を加えそして付着のためにイン
キユベートする。次いで、すべての吸着されてい
ない酵素結合抗体を洗い出し；(5)存在する腫瘍抗
原の量を評価するための測定し得る色又はケイ光
の何れかを与える発色性基質を加える。使用し得
る好ましい酵素はアルカリ性―ホスフアターゼ及
びβ―ガラクトシダーゼを包含し、その両方共優
れた発色性基質を有する。 本発明のこの観点の実施に有用な方法に関する
更に詳細なことは先行技術から入手できる。たと
えば米国特許第4002532号及び第4016043号参照。 本発明の方法を構成する種々の検定は、ヒトに
おける乳ガンの存在を検出するために使用するこ
とがきる。かかる使用を達成するために、臨床的
に確立した乳ガン患者、正常な患者及び良性腫瘍
又は非乳ガン腫瘍を有する患者からの統計的に有
意義な数の血漿試料を、直接DNA―ポリメラー
ゼ活性法、DNA―ポリメラーゼ免疫検定又は腫
瘍関連タンパク質免疫検定により検定する。これ
らの検定において見出される標識タンパク質の濃
度は、正常な及び非乳ガン腫瘍試料に対して見出
された水準に比べると、乳ガン血漿試料の場合に
は著しく高い。従つて、正常状態又は非乳ガン状
態に対応する水準と乳ガンの存在に対応する各検
定方法における標識タンパク質の濃度水準との間
に任意な対照水準線（control level line）をひく
ことが可能である。次いで未知の血漿試料は、本
発明の方法の１つの従つて試料を検定し、そして
標識タンパク質が対照水準より過剰の濃度で存在
するかどうかを決定することにより、被験体の乳
ガンの可能性について評価され得る。 或いは、標識タンパク質の患者自身の水準は内
部対照として役立ち得る。かくして、確認した乳
ガンを有する患者は治療の開始後及び前に検定す
ることができる。標識タンパク質の水準の顕著な
低下は治療の好ましい予後を示すであろう。標識
タンパク質濃度水準の後における実質的増加は、
上記病気の起り得る再発又は転位を示し、そして
主治医が初期における治療を開始することを可能
にする。更に、かかる治療の有効性は本発明の方
法により検定され得る。 本発明を下記実施例により更に説明する。 実施例 １ 乳腺腫瘍組織の細胞レベル以下の分別
（Svbcellwlar Fractionation） 入手し得る材料の量に依存して、腫瘍9g乃至
30gをとかし、細かく切り刻み、４倍容量の冷い
５％サツカロース（Ｗ／Ｖ）―TNE（0.01MTris
−HCl、PH8.0、0.15MNaCl、3mM EDTA）中に
懸濁させ、そしてシルバーソン（silverson）ホ
モジナイザー中でブレンドした。均質化物を、そ
れぞれ核及びミトコンドリアを除去するために、
4000Xg及び10000Xgで遠心分離した。トリプシ
ンを最終濃度0.5mg/mlまでミトコンドリア除去後
の上澄液（post−mitochondrial supernatant）
に加えた。20℃で10分間インキユベーシヨンした
後、タンパク分解活性は、２種類のポリペプチ
ド、リマビーン（lima bean）トリプシン阻害剤
（１倍過剰）及びトラシロール（Trasylol）
（100KIU／ml）の添加により阻害した。その試料
を50％スクロース−TNE6ml及び25％スクロース
−TNE8mlから成る不連続スクロース濃度勾配の
上に重ねた。スピンコ（Spinco）SW−27ロータ
ー中４°で90分間25000rpmで遠心分離して、
25／50％界面の試料を集め、TNEで希釈し、そ
して線状20―50％スクロース−TEN濃度勾配上
に重ねた。該試料を16時間上記の如く遠心分離
し、そしていろいろの密度領域を集せた。RNA
腫瘍ビールスが局在する密度領域（1.16―1.19g/
c.c.）をプールし、希釈し、そして90分間上記の如
く遠心分離した。得られるペレツトを0.1Mトリ
ス−HCl、PH8.0、約0.6ml中に再懸濁した。 ６つのロツトの腫瘍を上記方法で酵素用に処理
した。これらのうちの４種（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）
は特性を決めるに十分な酵素を生成せしめた。１
つの調製物（Ａ）、転位性肝臓腫瘍は単一患者か
らのものであり、他はすべて多数の種々の個体か
らプールした材料である。 ポリアクリルアミドアガロースゲル過 再懸濁したペレツトをKCl（0.4M）、DTT（ジ
チオスレイトール、0.01M）及びトライトンＸ−
100の如き非イオン性界面活性剤（0.6％）の添加
により15分間０℃で可溶化した（solubilized
and disvupted）。その試料約0.9mlを、緩衝液Ａ
（2mM、DTT、1mM、EDTA、0.02％TritonX−
100及び10％グリセロール）中、PH8.0、0.3Mリ
ン酸カリウムと平衡したポリアクリルアミドアガ
ロースゲル（Ultrogel AcA44）の0.9×50cmカラ
ムに加えた。0.3Mリン酸緩衝液Ａで流速約２ml/
ｈｒで溶出した。画分（0.5ml）をDNAポリメラー
ゼ活性及び末端トランスフエラーゼ活性について
下記の如く検定した。 ホスホセルロース クロマトグラフイー ウルトロゲルカラムからのピーク画分をプール
し（３ml）そしてトラシロールを100KIU／mlの
濃度になるように加えた。その試料を、リン酸塩
濃度が0.02Mより小さくなるまで、0.01Mリン酸
カリウム、PH7.2緩衝液Ａに透析し、次いで同じ
緩衝液と平衡した0.9×10cmホスホセルロールカ
ラム（WhatmanP−11）に添加した。このカラム
を0.01Mリン酸塩緩衝液30mlで洗浄し、そして酵
素活性（画分）を14ml/hrの流速で0.01M〜0.5M
リン酸カリウム緩衝液Ａ、PH7.2の120ml線状勾配
で溶出した。画分（1.2ml）をDNAポリメラーゼ
及び末端トランスフエラーゼ活性について検定し
た。ポリメラーゼ活性の主要ピークをプールし、
そしてトラシオールを100KIU／mlまで加えた。
この酵素画分（PC酵素と呼ばれる）をアクシア
ード11−Ａ（Aquacide 11−Ａ）の如き滲透圧的
に活性な、高分子量合成重合体に対して０℃で透
析により濃縮た。 グリセロール勾配遠心分離 分子量を評価するために、濃縮たPC酵素を
0.1Mリン酸カリウム、PH8.0で３倍に希釈し、そ
して0.1Mリン酸カリウム、PH8.0、2mM DTT及
び0.02％トライトンＸ−100を含有する線状10−
30％グリセロール勾配上に重ねた。スピンコSW
−50.1ローター中１°で12時間48000rpmで遠心
分離を行なつた。画分を底部から集め、そしてテ
ンプレートとしてオリゴ（dG）：ボリ（rC）に
より逆転写酵素活性を検定した。ウシ血清アルブ
ミンを平行勾配における沈降物標識として用い
た。 DNAポリメラーゼ検定 合成重合体テンプレートを有するポリメラーゼ
活性に対する検定混合物は（100μ中）：５μ
molトリス−HCl、PH8.0、0.5μmolMgCl2、0.1μ
molDTT並びに、重合体及びdNTPsの下記組合
せ−0.4μｇオリゴ（dG）：ポリ（rC）又はオリ
ゴ（dG）：ポリ（rCm）、0.02μmoldCTP及び
1.0nmol〔3H〕dGTP（4000cpm／ｐモル）＝0.4
μｇオリゴ（dT）：ポリ（rA）又はオリゴ
（dT）：ポリ（dA）、0.02μモルdATP及び
1.0mmol〔3H〕dTTP（4000cpm／ｐモル）を含
有していた。オリゴ（dG）：ポリ（rCm）との
反応においては、MgCl2の代わりにMnCl2（0.02
μmol）を用いた。 AMV RNAを使用する検定は（100μ中）：
５μmolトリス−HCl、PH8.0、0.8μmolMgCl2、
0.1μmolDTT、10μｇアクチノマイシンＤ
（Sigma Corp）、５μｇデイスタマイシン
（distamycin）Ａ（Calibochem）、２μ
gAMV70S′RNA、0.1μｇオリゴ（dT）12-18、
dATP、dGTP、dTTPが各々0.1μmol及び5nモ
ル〔3H〕dCTP（1.5×104cpm／pmol）を含有し
ていた。 すべの反応を15―30分間36°でインキユベート
し、そして冷い0.067Mピロリン酸ナトリウム−
1Mリン酸ナトリウム、PH7.2 0.5mlを添加し続い
て冷80％TCA0.5mlを添加して停止させた。酸不
溶性放射性活性を膜過器で集めそしてシンチレ
ーシヨン計数管により測定した。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ活性を相補的（complementary）重合体テン
プレートの不存在下に〔3H〕dGTPの重合により
測定した。重合体dNTP組合せを0.4μｇオリゴ
（dG）10-18＋0.02μmoldCTP及び1.0nmol〔3H〕
dGTPで代替したことを除けば反応は前記した如
くして行なつた。 すべての合成オリゴー及びポリヌクレオチド三
重水素化dGTP、dTTP及びdCTPは市販のもの
であつた。AMV70SRNAをWeisset at、
Virology71、242（1976）に記載の如くして精製
ウイルスから単離した。 ハイブリダイゼーシヨン（hybridigation
Reactions） ハイブリダイゼーシヨン及びS1ヌクレアーゼに
よるそれらの分析方法は、Weiss他（上記参照）
により報告されている。Axel et al.、Nature
235、32（1972）に開示されたCs2SO4平衡密度遠
心分離に対する条件を、0.02％ソジウムＮ−ラウ
ロイルサルコシネート及び大腸菌（E.Coli）
DNA及びRNAの各々20μｇを前記勾配液に添加
することにより改変した。 結 果 下記したデータは四種の異つた腫瘍採集物（標
識したＡないしＤ）からの独立の酵素単離物に基
づく。分別期間中の挙動及び乳腺腫瘍ポリメラー
ゼの特性は調製のロツトによつて有意差がなかつ
た。 ポリメラーゼ調製物Ａを乳ガンを有する患者の
肝臓中の転位病巣から単離した。腫瘍9gを均質
化し、そして1.16―1.19g/mlの密度でバンドをな
す微粒子材料を前記した如くして集めた。回収し
たペレツトをトライトンＸ−100の添加により可
溶化し、次いでポリアクリルアミド−アガロース
ゲル（Ultrogen ACA−44）カラムにより分別し
た。各カラム画分を、(1) オリゴ（dG）12-18；ポ
リ（rC）をテンプレートとしてDNAポリメラー
ゼ（活性）について、及び(2)プライマー
（primer）としてオリゴ（dG）12-18を使用して末
端トランスフエラーゼについて検定した。DNA
ポリメラーゼ活性の３つのピーク（２つは大き
く、１つは小さい）が観測され、そして第一の大
きなピークもまた末端トランスフエラーゼを含有
することは明らかである。２つの大きなピーク
は、Udenfriend et al.、Science 178、871
（1972）のフルオレスカミン（fluorescamine）法
により測定して、加えたポリメラーゼ活性の90％
及びタンパク質３％を含有することが見出された
（表１）。
【表】
上記で観測されたポリメラーゼ活性の分離の実
現性を検討するために、前記２つの大きなピーク
をプールし、透析してリン酸塩緩衝液濃度を減少
せしめ、次いで線状（0.01M〜0.5M）リン酸塩勾
配を用いてホスホセルロースカラム（PC）によ
りクロマトグラフイーに付した。ポリメラーゼ活
性は再び２つの大きなピークに分解することが見
出され、一方は0.08Mリン酸塩で溶出し、他方は
0.18Mで溶出する。ここでも第二の大きなポリメ
ラーゼピークは末端トランスフエラーゼ活性がな
いことが注目される。後者は２つのピークに分か
れ、１つは0.08Mリン酸塩において第一のDNAポ
リメラーゼ活性と関連しており、他方は0.23Mリ
ン酸塩においてそれ自体溶出する。 PCカラムで見られたポリメラーゼ活性の第二
の（0.18Mリン酸塩）ピークは正常な組織（乳房
組織３試料及び脾臓組織から３試料）中又は良性
の乳腺線維腫瘍（fibroadennoma of the
breast）（各々３―４線維腫瘍３プール）中に見
出されず、従つて乳ガン組織に特有のDNAポリ
メラーゼである。PCカラムのピーク２から成る
画分は加えたDNAポリメラーゼ活性65％及びタ
ンパク質８％を含有することが見出される。これ
らの画分をプールし、そして前記の如くして濃縮
して乳腺腫瘍ポリメラーゼを得る。表１に、典型
的精製の三工程の各々における活性及びタンパク
質の収率を要約する。 実施例 ２ 乳ガンポリメラーゼが逆転写酵素であることの証
拠 PNA腫瘍ウイルスの逆転写酵素を正常な哺乳
動物DNAポリメラーゼと区別するいくつかの通
常の基準がある。ウイルス性逆トランスクリプタ
ーゼはオリゴ（dT）：ポリ（dA）よりもオリゴ
（dT）：ポリ（rA）に対して優先性を示し、そ
しててそれらはポリ（dG）の合成用の優れたテ
ンプレートとしてオリゴ（dG）：ポリ（rC）及
びオリゴ（dG）：ポリ（rCm）も受容する。他
の、更に大きい診断的特徴は、該合成において使
用したテンプレートに対するCDNAの特有の逆−
ハイブリダイゼーシヨン（proper back−
hybridization）により証明される如く、忠実な
相補的DNAの合成を指向するのにヘテロ重合体
RNAを使用する逆転写酵素の能力である。 合成ポリリボヌクレオチドに対する４種の乳ガ
ンポリメラーゼの反応を表２に要約する。結果
は、活性パターンが真正の動物RNA腫瘍ウイル
スから単離た逆転写酵素に関して得られた活性パ
ターンと如何に完全に一致しているかを示す。即
ち、すべての場合において、ポリ（dT）の合成
に対してはオリゴ（dT）：ポリ（rA）はオリゴ
（dT）：ポリ（dA）に優つている。更に、オリ
ゴ（dG）：ポリ（rC）及びオリゴ（dG）：ポリ
（rCm）の両方共ポリ（dG）の生成のための優れ
たテンプレートであつた。ここに記載した４種の
乳腺腫瘍酵素調製物に加えて、進行性病状の更に
別の患者から得られた多くの他の上記調製物（50
種より多く）をいろいろの分別法を用いて異なる
精製段階において同じ方法で検査したところ、そ
れらはすべて表２に記載した反応パターンを示し
た。
現性を検討するために、前記２つの大きなピーク
をプールし、透析してリン酸塩緩衝液濃度を減少
せしめ、次いで線状（0.01M〜0.5M）リン酸塩勾
配を用いてホスホセルロースカラム（PC）によ
りクロマトグラフイーに付した。ポリメラーゼ活
性は再び２つの大きなピークに分解することが見
出され、一方は0.08Mリン酸塩で溶出し、他方は
0.18Mで溶出する。ここでも第二の大きなポリメ
ラーゼピークは末端トランスフエラーゼ活性がな
いことが注目される。後者は２つのピークに分か
れ、１つは0.08Mリン酸塩において第一のDNAポ
リメラーゼ活性と関連しており、他方は0.23Mリ
ン酸塩においてそれ自体溶出する。 PCカラムで見られたポリメラーゼ活性の第二
の（0.18Mリン酸塩）ピークは正常な組織（乳房
組織３試料及び脾臓組織から３試料）中又は良性
の乳腺線維腫瘍（fibroadennoma of the
breast）（各々３―４線維腫瘍３プール）中に見
出されず、従つて乳ガン組織に特有のDNAポリ
メラーゼである。PCカラムのピーク２から成る
画分は加えたDNAポリメラーゼ活性65％及びタ
ンパク質８％を含有することが見出される。これ
らの画分をプールし、そして前記の如くして濃縮
して乳腺腫瘍ポリメラーゼを得る。表１に、典型
的精製の三工程の各々における活性及びタンパク
質の収率を要約する。 実施例 ２ 乳ガンポリメラーゼが逆転写酵素であることの証
拠 PNA腫瘍ウイルスの逆転写酵素を正常な哺乳
動物DNAポリメラーゼと区別するいくつかの通
常の基準がある。ウイルス性逆トランスクリプタ
ーゼはオリゴ（dT）：ポリ（dA）よりもオリゴ
（dT）：ポリ（rA）に対して優先性を示し、そ
しててそれらはポリ（dG）の合成用の優れたテ
ンプレートとしてオリゴ（dG）：ポリ（rC）及
びオリゴ（dG）：ポリ（rCm）も受容する。他
の、更に大きい診断的特徴は、該合成において使
用したテンプレートに対するCDNAの特有の逆−
ハイブリダイゼーシヨン（proper back−
hybridization）により証明される如く、忠実な
相補的DNAの合成を指向するのにヘテロ重合体
RNAを使用する逆転写酵素の能力である。 合成ポリリボヌクレオチドに対する４種の乳ガ
ンポリメラーゼの反応を表２に要約する。結果
は、活性パターンが真正の動物RNA腫瘍ウイル
スから単離た逆転写酵素に関して得られた活性パ
ターンと如何に完全に一致しているかを示す。即
ち、すべての場合において、ポリ（dT）の合成
に対してはオリゴ（dT）：ポリ（rA）はオリゴ
（dT）：ポリ（dA）に優つている。更に、オリ
ゴ（dG）：ポリ（rC）及びオリゴ（dG）：ポリ
（rCm）の両方共ポリ（dG）の生成のための優れ
たテンプレートであつた。ここに記載した４種の
乳腺腫瘍酵素調製物に加えて、進行性病状の更に
別の患者から得られた多くの他の上記調製物（50
種より多く）をいろいろの分別法を用いて異なる
精製段階において同じ方法で検査したところ、そ
れらはすべて表２に記載した反応パターンを示し
た。
【表】
逆トランスクリプターゼの操作上の定義は、
DNA転写（DNA transcript）をつくるためにそ
れがヘテロ重合体RNAを使用し得ることを示す
ことを必要とする。鳥類の骨随芽球症ウイルス
（ANV）のRNAに対する乳ガンポリメラーゼの反
応（表３）はヘテロ重合体DNAの合成から予期
されることである。必要な３種の標識していない
デオキシリボシドトリホスフエートの何れか１種
又はすべてを省くと、RNAテンプレートを省い
た際に起こる如き合成活性の同じ実質的消失が起
こる。
DNA転写（DNA transcript）をつくるためにそ
れがヘテロ重合体RNAを使用し得ることを示す
ことを必要とする。鳥類の骨随芽球症ウイルス
（ANV）のRNAに対する乳ガンポリメラーゼの反
応（表３）はヘテロ重合体DNAの合成から予期
されることである。必要な３種の標識していない
デオキシリボシドトリホスフエートの何れか１種
又はすべてを省くと、RNAテンプレートを省い
た際に起こる如き合成活性の同じ実質的消失が起
こる。
【表】
推定上の逆転写酵素反応の最も有効な試験は
DNA転写の忠実度の検査による。これは3H
DNA生成物を単離すること、及び合成において
使用したRNAテンプレートとのアニーリング
（annealing）反応においてそれを添加することを
必要とする。このために、２mlでの反応をDNA
ポリメラーゼ調製物Ａ及びテンプレートとしての
ANV−RNA共に15分間実施し、２×107cpm／μ
ｇにおいて約3ngの〔3H〕DNAを合成した。この
〔3H〕DNA生成物を精製し、そして通常の方法に
より回収し、次いでAMV及びRLV70S、RNAsと
共にアニーリングした。生成物をCs2SO4勾配中
の分離及びS1ヌクレアーゼに対する抵抗性により
検査した。両方法とも無関連のRLV−RNAに対
して５％より少ないアニーリングを生ぜしめ、そ
して合成を指向するために使用したテンプレート
であるAMV−RNAに対しては80％乃至85％のハ
イブリダイゼーシヨンを生ぜしめた。それ故に、
これらの結果は〔3H〕DNAがAMV−RNAの一本
鎖状相捕体（single−stranded complement）で
あることを示唆している。〔3H〕DNA生成物の更
に詳しい検討はアニーリング反応の速度論的検討
により与えられる。２種類の〔3H〕DNA生成
物、即ち１つはAMV逆転写酵素によりAMV−
RNAの指向下に合成されたもの及び他は同じテ
ンプレートにより指令されたヒトの乳ガンポリメ
タラーゼにより合成されたもの、のANV−RNA
に対するアニーリング速度論の比較を行なつた。
上記２種類のDNA生成物のAMV−RNAに対する
アニーリングの速度論は区別できないことが示さ
れた。故にヒトの酵素はどの点から見ても鳥類の
ウイルスから精製した同種の逆転写酵素を全く同
じAMV−RNAの逆転写（revevse
transcribing）において有効である。 実施例 ３ 乳ガンポリメラーゼの他の特性 テンプレートとしてオリゴ（dG）：ポリ
（rC）及びオリゴ（dT）：ポリ（rA）を使用し
て乳ガンポリメラーゼのいくつかの調製物の活性
に対する温度及びPHを変化させた際のそれらの効
果を調べた。重合の最大速度は7.0〜8.5のPH範囲
にわたつて5mMMgCl2中37℃で起こつた。 逆転写酵素の二価イオン要求は、それらがもと
のウイルスを種々の群に分けるのに役立つ故にい
くらか興味深い。従つて、いろいろなソースから
の全部で６株のMMTVはMn++と比較してMg++
に対する強い優先性を有する逆転写酵素を含む。
同じことが、メーソン−フイツツエル モンキー
ウイルス、ブロモデオキシウリジン誘起モルモ
ツトウイルス及びウシ白血病ウイルスにあてはま
る。反対に、ねずみの白血病及び肉腫ウイルスの
逆転写酵素はMn++の存在下にはるかに有効に働
く。ヒトの乳ガン酵素に対してはその最適の
Mn++はMg++で得られる活性の約１／７を生成せ
しめるにすぎない。ねずみの乳腺腫瘍及び白血病
ウイルス間におけると同じく、ヒトの乳ガン酵素
は乳腺腫瘍ウイルス性逆転写酵素に最も密接に類
似する二価イオン要求を示すことは明らかであ
る。 乳ガン酵素の分子寸法は線状（10―30％）グリ
セロール勾配による沈降により評価した。この酵
素はAMV−RNAをテンプレートとする画分を検
定することにより見つけ出された。この酵素活性
はウシ血清アルブミン標識よりも僅かにはやく
5Sと6S間で沈降し、分子量は約70000ダルトンに
定まる。この結果はまたウルトロゲルに対するこ
れらの同じタンパク質の相対的溶出位置とも一致
している。種々の乳腺腫瘍源からの多数の酵素調
製物は同一沈降値を与えた。 実施例 ５ 材料及び方法 ウイルス メーソン−フイツツエルモンキーウ
イルスを正常なヒトのリンパ球細胞株
（lymphocytic cell line）NC−37の懸濁培養液中
で生長させ、そしてSchlom and Spiegelman.
Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.68、1613（1971）によ
り既に記載されている通りに濃縮した。このウイ
ルスを、100％グリセロールのパツド上へTNE緩
衝液（0.01Mトリス−HCl、PH8.3、0.15MNaCl、
0.002EDTA）中20％グリセロールの８mlカラム
を通して４゜で60分間98000xgで遠心分離するこ
とにより更に精製した。ウイルスペレツトは
TNE緩衝液に溶解してTNE中32シユクロースの
20〜50％連続濃度勾配中で平衡になるまで
98000xgで16時間遠心分離した。密度1.14〜1.19
g/mlの粒子を集め、希釈し、４℃にて98000xgで
45分間遠心分離した。DNAポリメラーゼ精製に
対して上記ペレツトを直ちに使用した。 鳥類骨髄芽球症ウイルス（AMV BAI株−
Ａ）、サルの肉腫ウイルス株−１（SSV−１）、フ
レンド白血病（Friend leukemia）ウイルス
（FLV）、ネコの白血病ウイルス（FeLV）及びラ
ウシエル（Rauscher）白血病ウイルス（RLV）
もこの実施例において使用した。すべてのウイル
ス性濃縮物を前記した如く精製した。 ヒトの悪性乳腺腫瘍からRNA−指令DNAポリメ
ラーゼ（RNA−instructed DNApolymerase）の
調製 ヒトの悪性乳腺腫瘍からの逆転写酵素を同密度
分離により精製した粒子からOhno et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.74、764（1977）により既
に記載されている如くして調製した。０゜で15分
間0.2％トライトンＸ−100中でのインキユベーシ
ヨンによる破壊の後、試料のいくつかを、内因性
（endogenous）ポリメラーゼ活性及びそれぞれポ
リ（dG）及びポリ（rA）のオリゴ（dG）：ポリ
（rC）及びオリゴ（dT）：ポリ（rA）により指
向された合成に対して解析した。破壊したウイル
ス密度領域をポリアクリルアミドアガロースカラ
ム（Ultrogel AcA44、LKB、Co.）によりクロマ
トグラフイーに付し、そして溶出した酵素ピーク
をホスホセルロール（Whatman 11）カラムに添
加した。酵素を0.01〜0.5Mリン酸カリウム勾配
で溶出し、そしてOhno et al.（前記参照）に記
載されている如くして濃縮した。 ヒトの白血病及びホジキン脾（Hodgkin′s
Spleen）からウイルス性領域の調製 ヒトの慢性リンパ球白血病（CLL）、慢性骨髄
性（myelogenous）白血病（CML）及びホジキ
ン リンパ腫を有する患者からの脾臓をウイルス
密度領域調製物のソースとして使用し、そしてポ
リメラーゼ活性をWitkins et al.、Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A72、4133（1975）により記載さ
れている如き内因性速度論
（endogenouskinetics）により解析した。 MPMVポリメラーゼの調製 前記した如くして調製したMPMVペレツト
（ウイルス）を0.05Mトリス−HCl、PH9.2、
0.001MEDTA及び2MKCl上に再懸濁し、超音波
処理し、次いで98000Xgで120分間遠心分離し
た。このペレツトを使用して、Witkins et al.
（上記参照）により既に記載されている如くして
カラムクロマトグラフイーにより精製したDNA
ポリメラーゼを調製した。 抗血清の調製 MPMV−DNAに対する抗血清をニユージーラ
ンド白色家兎に誘発させた。抗−ポリメラーゼ
IgGの所望の力価を達成するのに３サイクルの免
疫が必要である。各サイクルにおいて、酵素（１
分間につき導入されたTMP1×103pモル）を等容
量のフロインド・アジユバントで乳化させ、そし
て２つの後足肉趾（hind footpads）に注入し
た。同じ部位に２週間間隔で更に２回の同様な接
種を行なつた。 血清をセフアデツクスＧ−200、0.1Mトリス−
HCl、PH8.0によるクロマトグラフイーにより分
別した。家兎ガンマグロブリンをヤギの抗家兎
IgG抗血清による免疫拡散により血清学的に同定
した。問題の画分を硫酸アンモニウム沈殿（50％
飽和）により濃縮し、そして0.1Mトリス−HCl、
PH8.0に対して透析た。IgG画分のタンパク質濃度
をローリーの方法により測定した。 DNAポリメラーゼ検定 合成重合体テンプレートによるポリメラーゼ活
性に対する検定の反応混合物（100u中に）、５
μmol トリス−HCl、PH8.0、0.5μmol
MgCl2、0.1μmol DTT、及び下記組合せの重合
体及びdNTPs：0.4μｇオリゴ（dG）：ポリ
（rC）又はオリゴ（dG）：ポリ（rCm）、0.02μ
moldCTP及び1.0nmol〔3H〕dGTP（4000cpm／
pmol）、0.4μｇオリゴ（dT）：ポリ（rA）又は
オリゴ（dT）：ポリ（dA）、0.02μmoldATP及
び1.0nmol〔3H〕dTTP（4000cpm／pmol）を含
有していた。オリゴ（dG）：ポリ（rCm）との
反応において、MnCl2（0.02μmol）をMgCl2に
代替した。 内因性RNAを使用する検定は（100μ中
に）：５μmolトリス−HCl、PH8.0、8.0μ
molMgCl2、0.1μmolDTT、10μｇアクチノマイ
シンＤ、５μｇデイスタマイシン（distamycin）
Ａ、0.1μｇオリゴ（dT）12-18、dATP、dGTP、
dTTPの各々0.1μmol、及び5nmol〔3H〕dCTP
（1.5×104cpm／pmol）を含有していた。 すべての反応は指示された如く36゜で15―30分
間インキユベートし、そして0.5ml冷0.067Mピロ
リン酸ナトリウム、1Mリン酸ナトリウム、PH7.2
の添加、続いて0.5ml、冷80％TCAの添加により
停止させた。酸不溶性放射能を膜過器により集
め、そしてシンチレーシヨン計数管で測定した。 末端デオキシヌクレオチドトランスフエラーゼ
活性を相補的重合体テンプレートの不存在下に
〔3H〕dGTPの重合により測定し、その際後者を
0.4μｇオリゴ（dG）10-18により代替した。 DNAポリメラーゼ活性に対する抗体の効果 DNAポリメラーゼ活性の中和のための反応混
合物（全容量55μ）はウシ血清アルブミン
（BSA）及びDNAポリメラーゼ25μｇに加えて、
指示された量（25−150μｇ）の精製IgG画分を
含有していた。使用した緩衝液は0.01Mトリス
HCl、PH8.0、塩化カリウム0.15Mであつた。４゜
で15分インキユベーシヨンの後、オリゴ
（dG）：ポリ（rC）を使用して上記のようにポリ
メラーゼ検定を行なつた。或る例においては、内
因性RNAによる活性に対する抗体の効果を調べ
た。 グリセロール勾配による抗体―酵素複合体の検出 濃縮した酵素（MPMV又はヒトの悪性乳腺腫
瘍からの逆転写酵素画分はウシ血清アルブミン
0.5mg/mlを含有する0.1Mリン酸カリウム、PH8.0
で３回流して希釈した。そして指示した量の精製
したIgG画分を加えた。４゜で15分間インキユベ
ーシヨンの後、その試料を0.1Mリン酸カルシウ
ム、PH8.0、0.002Mジチオスレイトール
（dithiothreitol）及び0.02％トライトンＸ−100と
なるように調節した10―30％グリセロール勾配上
に重ねた。その試料を１゜でスピンコSW50−１
ローター中で12時間48000rpmで沈降させた。画
分をチユーブの底部から滴下により集め、そして
酵素活性を前記の如くして検定した。 結 果 いろいろなポリメラーゼに対する抗―MPMV
DNAポリメラーゼIgGの効果の比較 多数のウイルス性DNAポリメラーゼ及びヒト
乳ガン粒子の対応する酵素に対する抗―MPMV
DNAポリメラーゼの効果を比較した。これらの
実験において、前記材料及び方法のところで記載
した如くして精製した等密度バンドの粒子を
DNAポリメラーゼのソースとして使用し、そし
てオリゴ（dG）：ポリ（rC）をテンプレートと
して使用した。抗体は80％より多くのMPMV−
DNAポリメラーゼを阻害しそしてヒト乳ガン粒
子と関連したDNAポリメラーゼの26％阻害を達
成する。対照的に、鳥類骨髄芽球症ウイルス
（AMV）、ラウシエル及びフレンドねずみ白血病
ウイルス（RLV及びFLV）、ネコの白血病ウイル
ス（FeLV）、サルの肉腫ウイルス（SSV−１）
又はネズミの乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）を包
含する他の動物のオンコルナウイルス（oncorna
viruses）の何れものDNAポリメラーゼに対して
は検出され得る効果は見出されなかつた。 抗−MPMVポリメラーゼIgGによる阻害の特異性 乳ガン粒子酵素に関して見出された阻害がこの
悪性腫瘍に限られているかどうかに中心をおいて
次の組織を検査した。当業界で知られている如
く、間葉ガン（mesenchymal cancers）を有す
る患者からの脾臓は粒子酵素の好都合なソースを
構成し、そしてこれらが免疫的比較のために選ば
れた。粒子画分を調製しそして内因性ポリメラー
ゼ活性をヒトの乳腺腫瘍に対して及び間葉新形成
（neoplasis）を伴なつた脾臓に対して前記した如
くして検定した。各種の新生組織（neoplastic
tissue）の少なくとも５種の例を検査し、そして
代表的結果を表４に示す。
DNA転写の忠実度の検査による。これは3H
DNA生成物を単離すること、及び合成において
使用したRNAテンプレートとのアニーリング
（annealing）反応においてそれを添加することを
必要とする。このために、２mlでの反応をDNA
ポリメラーゼ調製物Ａ及びテンプレートとしての
ANV−RNA共に15分間実施し、２×107cpm／μ
ｇにおいて約3ngの〔3H〕DNAを合成した。この
〔3H〕DNA生成物を精製し、そして通常の方法に
より回収し、次いでAMV及びRLV70S、RNAsと
共にアニーリングした。生成物をCs2SO4勾配中
の分離及びS1ヌクレアーゼに対する抵抗性により
検査した。両方法とも無関連のRLV−RNAに対
して５％より少ないアニーリングを生ぜしめ、そ
して合成を指向するために使用したテンプレート
であるAMV−RNAに対しては80％乃至85％のハ
イブリダイゼーシヨンを生ぜしめた。それ故に、
これらの結果は〔3H〕DNAがAMV−RNAの一本
鎖状相捕体（single−stranded complement）で
あることを示唆している。〔3H〕DNA生成物の更
に詳しい検討はアニーリング反応の速度論的検討
により与えられる。２種類の〔3H〕DNA生成
物、即ち１つはAMV逆転写酵素によりAMV−
RNAの指向下に合成されたもの及び他は同じテ
ンプレートにより指令されたヒトの乳ガンポリメ
タラーゼにより合成されたもの、のANV−RNA
に対するアニーリング速度論の比較を行なつた。
上記２種類のDNA生成物のAMV−RNAに対する
アニーリングの速度論は区別できないことが示さ
れた。故にヒトの酵素はどの点から見ても鳥類の
ウイルスから精製した同種の逆転写酵素を全く同
じAMV−RNAの逆転写（revevse
transcribing）において有効である。 実施例 ３ 乳ガンポリメラーゼの他の特性 テンプレートとしてオリゴ（dG）：ポリ
（rC）及びオリゴ（dT）：ポリ（rA）を使用し
て乳ガンポリメラーゼのいくつかの調製物の活性
に対する温度及びPHを変化させた際のそれらの効
果を調べた。重合の最大速度は7.0〜8.5のPH範囲
にわたつて5mMMgCl2中37℃で起こつた。 逆転写酵素の二価イオン要求は、それらがもと
のウイルスを種々の群に分けるのに役立つ故にい
くらか興味深い。従つて、いろいろなソースから
の全部で６株のMMTVはMn++と比較してMg++
に対する強い優先性を有する逆転写酵素を含む。
同じことが、メーソン−フイツツエル モンキー
ウイルス、ブロモデオキシウリジン誘起モルモ
ツトウイルス及びウシ白血病ウイルスにあてはま
る。反対に、ねずみの白血病及び肉腫ウイルスの
逆転写酵素はMn++の存在下にはるかに有効に働
く。ヒトの乳ガン酵素に対してはその最適の
Mn++はMg++で得られる活性の約１／７を生成せ
しめるにすぎない。ねずみの乳腺腫瘍及び白血病
ウイルス間におけると同じく、ヒトの乳ガン酵素
は乳腺腫瘍ウイルス性逆転写酵素に最も密接に類
似する二価イオン要求を示すことは明らかであ
る。 乳ガン酵素の分子寸法は線状（10―30％）グリ
セロール勾配による沈降により評価した。この酵
素はAMV−RNAをテンプレートとする画分を検
定することにより見つけ出された。この酵素活性
はウシ血清アルブミン標識よりも僅かにはやく
5Sと6S間で沈降し、分子量は約70000ダルトンに
定まる。この結果はまたウルトロゲルに対するこ
れらの同じタンパク質の相対的溶出位置とも一致
している。種々の乳腺腫瘍源からの多数の酵素調
製物は同一沈降値を与えた。 実施例 ５ 材料及び方法 ウイルス メーソン−フイツツエルモンキーウ
イルスを正常なヒトのリンパ球細胞株
（lymphocytic cell line）NC−37の懸濁培養液中
で生長させ、そしてSchlom and Spiegelman.
Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.68、1613（1971）によ
り既に記載されている通りに濃縮した。このウイ
ルスを、100％グリセロールのパツド上へTNE緩
衝液（0.01Mトリス−HCl、PH8.3、0.15MNaCl、
0.002EDTA）中20％グリセロールの８mlカラム
を通して４゜で60分間98000xgで遠心分離するこ
とにより更に精製した。ウイルスペレツトは
TNE緩衝液に溶解してTNE中32シユクロースの
20〜50％連続濃度勾配中で平衡になるまで
98000xgで16時間遠心分離した。密度1.14〜1.19
g/mlの粒子を集め、希釈し、４℃にて98000xgで
45分間遠心分離した。DNAポリメラーゼ精製に
対して上記ペレツトを直ちに使用した。 鳥類骨髄芽球症ウイルス（AMV BAI株−
Ａ）、サルの肉腫ウイルス株−１（SSV−１）、フ
レンド白血病（Friend leukemia）ウイルス
（FLV）、ネコの白血病ウイルス（FeLV）及びラ
ウシエル（Rauscher）白血病ウイルス（RLV）
もこの実施例において使用した。すべてのウイル
ス性濃縮物を前記した如く精製した。 ヒトの悪性乳腺腫瘍からRNA−指令DNAポリメ
ラーゼ（RNA−instructed DNApolymerase）の
調製 ヒトの悪性乳腺腫瘍からの逆転写酵素を同密度
分離により精製した粒子からOhno et al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.74、764（1977）により既
に記載されている如くして調製した。０゜で15分
間0.2％トライトンＸ−100中でのインキユベーシ
ヨンによる破壊の後、試料のいくつかを、内因性
（endogenous）ポリメラーゼ活性及びそれぞれポ
リ（dG）及びポリ（rA）のオリゴ（dG）：ポリ
（rC）及びオリゴ（dT）：ポリ（rA）により指
向された合成に対して解析した。破壊したウイル
ス密度領域をポリアクリルアミドアガロースカラ
ム（Ultrogel AcA44、LKB、Co.）によりクロマ
トグラフイーに付し、そして溶出した酵素ピーク
をホスホセルロール（Whatman 11）カラムに添
加した。酵素を0.01〜0.5Mリン酸カリウム勾配
で溶出し、そしてOhno et al.（前記参照）に記
載されている如くして濃縮した。 ヒトの白血病及びホジキン脾（Hodgkin′s
Spleen）からウイルス性領域の調製 ヒトの慢性リンパ球白血病（CLL）、慢性骨髄
性（myelogenous）白血病（CML）及びホジキ
ン リンパ腫を有する患者からの脾臓をウイルス
密度領域調製物のソースとして使用し、そしてポ
リメラーゼ活性をWitkins et al.、Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A72、4133（1975）により記載さ
れている如き内因性速度論
（endogenouskinetics）により解析した。 MPMVポリメラーゼの調製 前記した如くして調製したMPMVペレツト
（ウイルス）を0.05Mトリス−HCl、PH9.2、
0.001MEDTA及び2MKCl上に再懸濁し、超音波
処理し、次いで98000Xgで120分間遠心分離し
た。このペレツトを使用して、Witkins et al.
（上記参照）により既に記載されている如くして
カラムクロマトグラフイーにより精製したDNA
ポリメラーゼを調製した。 抗血清の調製 MPMV−DNAに対する抗血清をニユージーラ
ンド白色家兎に誘発させた。抗−ポリメラーゼ
IgGの所望の力価を達成するのに３サイクルの免
疫が必要である。各サイクルにおいて、酵素（１
分間につき導入されたTMP1×103pモル）を等容
量のフロインド・アジユバントで乳化させ、そし
て２つの後足肉趾（hind footpads）に注入し
た。同じ部位に２週間間隔で更に２回の同様な接
種を行なつた。 血清をセフアデツクスＧ−200、0.1Mトリス−
HCl、PH8.0によるクロマトグラフイーにより分
別した。家兎ガンマグロブリンをヤギの抗家兎
IgG抗血清による免疫拡散により血清学的に同定
した。問題の画分を硫酸アンモニウム沈殿（50％
飽和）により濃縮し、そして0.1Mトリス−HCl、
PH8.0に対して透析た。IgG画分のタンパク質濃度
をローリーの方法により測定した。 DNAポリメラーゼ検定 合成重合体テンプレートによるポリメラーゼ活
性に対する検定の反応混合物（100u中に）、５
μmol トリス−HCl、PH8.0、0.5μmol
MgCl2、0.1μmol DTT、及び下記組合せの重合
体及びdNTPs：0.4μｇオリゴ（dG）：ポリ
（rC）又はオリゴ（dG）：ポリ（rCm）、0.02μ
moldCTP及び1.0nmol〔3H〕dGTP（4000cpm／
pmol）、0.4μｇオリゴ（dT）：ポリ（rA）又は
オリゴ（dT）：ポリ（dA）、0.02μmoldATP及
び1.0nmol〔3H〕dTTP（4000cpm／pmol）を含
有していた。オリゴ（dG）：ポリ（rCm）との
反応において、MnCl2（0.02μmol）をMgCl2に
代替した。 内因性RNAを使用する検定は（100μ中
に）：５μmolトリス−HCl、PH8.0、8.0μ
molMgCl2、0.1μmolDTT、10μｇアクチノマイ
シンＤ、５μｇデイスタマイシン（distamycin）
Ａ、0.1μｇオリゴ（dT）12-18、dATP、dGTP、
dTTPの各々0.1μmol、及び5nmol〔3H〕dCTP
（1.5×104cpm／pmol）を含有していた。 すべての反応は指示された如く36゜で15―30分
間インキユベートし、そして0.5ml冷0.067Mピロ
リン酸ナトリウム、1Mリン酸ナトリウム、PH7.2
の添加、続いて0.5ml、冷80％TCAの添加により
停止させた。酸不溶性放射能を膜過器により集
め、そしてシンチレーシヨン計数管で測定した。 末端デオキシヌクレオチドトランスフエラーゼ
活性を相補的重合体テンプレートの不存在下に
〔3H〕dGTPの重合により測定し、その際後者を
0.4μｇオリゴ（dG）10-18により代替した。 DNAポリメラーゼ活性に対する抗体の効果 DNAポリメラーゼ活性の中和のための反応混
合物（全容量55μ）はウシ血清アルブミン
（BSA）及びDNAポリメラーゼ25μｇに加えて、
指示された量（25−150μｇ）の精製IgG画分を
含有していた。使用した緩衝液は0.01Mトリス
HCl、PH8.0、塩化カリウム0.15Mであつた。４゜
で15分インキユベーシヨンの後、オリゴ
（dG）：ポリ（rC）を使用して上記のようにポリ
メラーゼ検定を行なつた。或る例においては、内
因性RNAによる活性に対する抗体の効果を調べ
た。 グリセロール勾配による抗体―酵素複合体の検出 濃縮した酵素（MPMV又はヒトの悪性乳腺腫
瘍からの逆転写酵素画分はウシ血清アルブミン
0.5mg/mlを含有する0.1Mリン酸カリウム、PH8.0
で３回流して希釈した。そして指示した量の精製
したIgG画分を加えた。４゜で15分間インキユベ
ーシヨンの後、その試料を0.1Mリン酸カルシウ
ム、PH8.0、0.002Mジチオスレイトール
（dithiothreitol）及び0.02％トライトンＸ−100と
なるように調節した10―30％グリセロール勾配上
に重ねた。その試料を１゜でスピンコSW50−１
ローター中で12時間48000rpmで沈降させた。画
分をチユーブの底部から滴下により集め、そして
酵素活性を前記の如くして検定した。 結 果 いろいろなポリメラーゼに対する抗―MPMV
DNAポリメラーゼIgGの効果の比較 多数のウイルス性DNAポリメラーゼ及びヒト
乳ガン粒子の対応する酵素に対する抗―MPMV
DNAポリメラーゼの効果を比較した。これらの
実験において、前記材料及び方法のところで記載
した如くして精製した等密度バンドの粒子を
DNAポリメラーゼのソースとして使用し、そし
てオリゴ（dG）：ポリ（rC）をテンプレートと
して使用した。抗体は80％より多くのMPMV−
DNAポリメラーゼを阻害しそしてヒト乳ガン粒
子と関連したDNAポリメラーゼの26％阻害を達
成する。対照的に、鳥類骨髄芽球症ウイルス
（AMV）、ラウシエル及びフレンドねずみ白血病
ウイルス（RLV及びFLV）、ネコの白血病ウイル
ス（FeLV）、サルの肉腫ウイルス（SSV−１）
又はネズミの乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）を包
含する他の動物のオンコルナウイルス（oncorna
viruses）の何れものDNAポリメラーゼに対して
は検出され得る効果は見出されなかつた。 抗−MPMVポリメラーゼIgGによる阻害の特異性 乳ガン粒子酵素に関して見出された阻害がこの
悪性腫瘍に限られているかどうかに中心をおいて
次の組織を検査した。当業界で知られている如
く、間葉ガン（mesenchymal cancers）を有す
る患者からの脾臓は粒子酵素の好都合なソースを
構成し、そしてこれらが免疫的比較のために選ば
れた。粒子画分を調製しそして内因性ポリメラー
ゼ活性をヒトの乳腺腫瘍に対して及び間葉新形成
（neoplasis）を伴なつた脾臓に対して前記した如
くして検定した。各種の新生組織（neoplastic
tissue）の少なくとも５種の例を検査し、そして
代表的結果を表４に示す。
【表】
白血病及びリンパ腫の脾から誘導された粒子酵
素に関しては意義ある程の阻害は見られなかつ
た。しかしながら、乳ガン微粒子酵素は59％から
95％以上まぜ阻害された。これらの内生反応は合
成テンプレートにより指向された合成よりも抗−
MPMAポリメラーゼIgGによつてよりひどく影響
されることに注目されたい。予期される如く、表
４に記載のDNAポリメラーゼ活性はすべてリボ
ヌクアーゼに対して感受性であり、そしてアクチ
ノマイシンＤ（100μｇ／ml）及びデスタマイシ
ン（50μｇ／ml）の存在に対して抵抗性であり、
これはRNA−指向DNAポリメラーゼの特徴であ
る。 表４に示したデータが指示された新生組織から
単離した洗剤破壊した粒子の内生反応により得ら
れる。完全を期するための、オリゴ（dG）：ポ
リ（rC）により指向された対応する精製した酵
素を使用した同様な比較を行なつた。この方法を
使用する実験は、乳ガン及び慢性骨髄性白血病脾
から調製した粒子から精製した逆転写酵素の抗−
MPMVポリメラーゼIgGに対する反応を与えた。
試験したIgGの全濃度範囲にわたつて白血病の逆
転写酵素は意義ある程に影響を受けない。反対
に、抗−MPMVポリメラーゼIgGは試験した全濃
度における乳ガン逆転写酵素の活性を抑制し、反
応混合物当り150μｇにおいて37％阻害を達成す
る。 表５は抗−MPMVポリメラーゼIgGに対する正
常細胞のDNAポリメラーゼの反応を試験するこ
とによつて相互作用の特異性の他の観点を調べ
る。
素に関しては意義ある程の阻害は見られなかつ
た。しかしながら、乳ガン微粒子酵素は59％から
95％以上まぜ阻害された。これらの内生反応は合
成テンプレートにより指向された合成よりも抗−
MPMAポリメラーゼIgGによつてよりひどく影響
されることに注目されたい。予期される如く、表
４に記載のDNAポリメラーゼ活性はすべてリボ
ヌクアーゼに対して感受性であり、そしてアクチ
ノマイシンＤ（100μｇ／ml）及びデスタマイシ
ン（50μｇ／ml）の存在に対して抵抗性であり、
これはRNA−指向DNAポリメラーゼの特徴であ
る。 表４に示したデータが指示された新生組織から
単離した洗剤破壊した粒子の内生反応により得ら
れる。完全を期するための、オリゴ（dG）：ポ
リ（rC）により指向された対応する精製した酵
素を使用した同様な比較を行なつた。この方法を
使用する実験は、乳ガン及び慢性骨髄性白血病脾
から調製した粒子から精製した逆転写酵素の抗−
MPMVポリメラーゼIgGに対する反応を与えた。
試験したIgGの全濃度範囲にわたつて白血病の逆
転写酵素は意義ある程に影響を受けない。反対
に、抗−MPMVポリメラーゼIgGは試験した全濃
度における乳ガン逆転写酵素の活性を抑制し、反
応混合物当り150μｇにおいて37％阻害を達成す
る。 表５は抗−MPMVポリメラーゼIgGに対する正
常細胞のDNAポリメラーゼの反応を試験するこ
とによつて相互作用の特異性の他の観点を調べ
る。
【表】
乳腺腫瘍から単離されたものであれ、Hela細
胞株から単離されたものであれ、DNAポリメラ
ーゼγの調製物は検出できる程に阻害されず、そ
して同じことがDNAポリメラーゼβに対して言
える。同じ水準で抗−MPMVポリメラーゼIgGは
乳ガン逆転写酵素を40％抑制した。正常なDNA
ポリメラーゼαに関して同様な実験を行ない、そ
してこの場合も抗−MPMVポリメラーゼIgGによ
る阻害の証拠は見出されなかつた。 乳ガンDNAポリメラーゼ及び抗−ポリメラーゼ
IgG間の複合体の沈降による証明 乳ガン逆転写酵素と抗−MPMVポリメラーゼ
IgG間の物理的複合物の存在に対して更に証拠を
提供し得るかどうかを調べることは望ましいこと
であつた。第一に、かかる証拠は酵素活性の単純
な抑制から導かれた結論に対して直接の支持を追
加するであろう。第二に、これらの線に沿つての
実験は、抗−MPMV DNAポリメラーゼIgGが乳
ガン逆転写酵素活性の全中和を見かけ上達成でき
ないことの土台となる基礎を同定できるであろ
う。基本的には、阻害の不完全さを説明するのに
２種類の機序が提唱され得る。一つは、酵素調製
物が不均質であり、そして副母集団（sub−
population）のみが添加したIgGとの不活性複合
体を生成することを示唆する。もう一つは、酵素
分子の母集団がこの点において均質であること及
びすべて複合体を形成するが、該複合体はもとの
活性のフラクシヨンの示しうることを仮定する。
これらの二つの可能性は問題のIgGとの反応の前
及び後における酵素活性の沈降分析により容易に
識別され得る。 この方法の有効性を監視するために、MPMV
−DNAポリメラーゼ及びその抗体から成る同族
系に関して陽性の対照実験を行なつた。陰性対照
には同じ家兎からの正常な（免疫前の）IgGの使
用が包含された。酵素及び指示されたIgG150μ
ｇを含有する250μλ反応物を、材料及び方法に
おいて記載した如くして、４゜で15分間インキユ
ベートした。次いで混合物を10−30％勾配上に重
ね、そして１゜で12時間48000rpmで遠心分離し
た。次いで画分を底部から集め、そして逆転写酵
素に対して及び免疫拡散によるIgGの存在に対し
て検定した。正常なIgGに関するインキユベーシ
ヨンによつては外部標識ウシ血清アルブミン
（BSA）に関するMPMV逆トランスクリプターゼ
活性のピークの位置（チユーブ13）は変わらない
ことが見出された。酵素は依然として70000ダル
トンの分子量に対応する速度で沈降する。この同
じ勾配において、上記IgGはチユーブ10、11、及
び12中に見出された。抗−MPMVポリメラーゼ
150μｇとポリメラーゼとのインキユベーシヨン
は酵素活性の80％損失及び残存活性の顕著に異な
つた沈降パターンをもたらす。BSAに近いもと
の位置には酵素は検出されず、そのすべては遊離
酵素又はIgGより速く沈降する複合体として現わ
れる。上記IgGはここでは画分13、14及び15並び
にポリメラーゼ活性のピークを包含する６から10
までの画分の免疫拡散によつて検出される。 ヒトの乳ガン粒子から精製した逆転写酵素によ
る実験において非常に類似した状況が見出され
る。正常なIgGとのインキユベーシヨンはBSA標
識位置の一つとなりのチユーブ内にその通常の位
置（チユーブ15）に上記ヒトの酵素を残し、そし
て上記IgGはチユーブ12〜14において免疫拡散に
より見出される。しかしながら、抗−MPMVポ
リメラーゼIgGとの反応は45％の活性損失をもた
らし、そしてIgGがやはり免疫拡散によつて検出
され得る６から10までの画分中に見出される速く
移動する複合体としてチユーブの下方に残留物を
移動させる。IgGそのもとの位置（12から14まで
の画分）にも見出される。 MPMV逆転写酵素をヒトの乳ガン粒子から単
離されたそれも抗−MPMVポリメラーゼIgGと複
合することができない分子を有意の割合で含有し
ないことは前記した結果から明らかである。酵素
IgG複合物がいくらかの活性を示すことができる
という事実は新らしい現象ではない。実際に、い
くつかの報告例においてはかかる複合物は充分に
活性である。 討 論 ここに記載した実験は抗−MPMV DMA IgG
は、過剰に存在する場合には、ヒトの乳ガン粒子
から単離した逆転写酵素と完全に複合することが
できること及びそれを部分的に阻害し得ることを
示す。阻害の特異性はこの同じ抗体が正常細胞の
DNAポリメラーゼの活性又は動物オンコルナウ
イルス（たとえばAMV、RLV、FLV、FeLV、
SSV−１及びMMTV）からのいろいろな逆転写
酵素の活性に影響を与えることができないことに
より支持される。更に、免疫前に同じ家兎から得
られた正常なIgGはMPMV又はヒトの乳ガン逆転
写酵素の何れとも複合しないか又は何れをも阻害
しない。 その病因学的興味とは別に、MPMVの逆転写
酵素及びヒトの乳ガン粒子間の免疫学的交叉反応
性はより直接的に重要な意味を有する。それは臨
床的有用な方法によりヒトの乳ガンを検査するた
めの基礎を与える。MPMVはその酵素及び他の
タンパク質成分の精製に対して十分な収率で組織
培養において製造することができる。これらは外
科病理学者のための診断手段としての凍結切片を
免疫ケイ光性及び免疫パーオキシダーゼ染色する
際の特異的検出試薬として使用するため抗血清を
発生させるのに使用することができる。更に興味
深いことは、肺ガン、胃ガン、肛門及び結腸ガ
ン、卵巣ガン、脳ガン、骨ガン、リンパ腺のガ
ン、皮膚ガン〔鱗片細胞（squa monscell）及び
基底細胞ガン及び黒色腫（melanoma）〕及び同
様なものの如き乳ガン以外のガンを有する患者の
血漿及び他の体液中の免疫学的関連タンパク質の
全身系検出のための免疫検定におけるかかる発現
の使用である。これらのガンの各々はそれ自身の
明白な粒子関連タンパク質を有する。
胞株から単離されたものであれ、DNAポリメラ
ーゼγの調製物は検出できる程に阻害されず、そ
して同じことがDNAポリメラーゼβに対して言
える。同じ水準で抗−MPMVポリメラーゼIgGは
乳ガン逆転写酵素を40％抑制した。正常なDNA
ポリメラーゼαに関して同様な実験を行ない、そ
してこの場合も抗−MPMVポリメラーゼIgGによ
る阻害の証拠は見出されなかつた。 乳ガンDNAポリメラーゼ及び抗−ポリメラーゼ
IgG間の複合体の沈降による証明 乳ガン逆転写酵素と抗−MPMVポリメラーゼ
IgG間の物理的複合物の存在に対して更に証拠を
提供し得るかどうかを調べることは望ましいこと
であつた。第一に、かかる証拠は酵素活性の単純
な抑制から導かれた結論に対して直接の支持を追
加するであろう。第二に、これらの線に沿つての
実験は、抗−MPMV DNAポリメラーゼIgGが乳
ガン逆転写酵素活性の全中和を見かけ上達成でき
ないことの土台となる基礎を同定できるであろ
う。基本的には、阻害の不完全さを説明するのに
２種類の機序が提唱され得る。一つは、酵素調製
物が不均質であり、そして副母集団（sub−
population）のみが添加したIgGとの不活性複合
体を生成することを示唆する。もう一つは、酵素
分子の母集団がこの点において均質であること及
びすべて複合体を形成するが、該複合体はもとの
活性のフラクシヨンの示しうることを仮定する。
これらの二つの可能性は問題のIgGとの反応の前
及び後における酵素活性の沈降分析により容易に
識別され得る。 この方法の有効性を監視するために、MPMV
−DNAポリメラーゼ及びその抗体から成る同族
系に関して陽性の対照実験を行なつた。陰性対照
には同じ家兎からの正常な（免疫前の）IgGの使
用が包含された。酵素及び指示されたIgG150μ
ｇを含有する250μλ反応物を、材料及び方法に
おいて記載した如くして、４゜で15分間インキユ
ベートした。次いで混合物を10−30％勾配上に重
ね、そして１゜で12時間48000rpmで遠心分離し
た。次いで画分を底部から集め、そして逆転写酵
素に対して及び免疫拡散によるIgGの存在に対し
て検定した。正常なIgGに関するインキユベーシ
ヨンによつては外部標識ウシ血清アルブミン
（BSA）に関するMPMV逆トランスクリプターゼ
活性のピークの位置（チユーブ13）は変わらない
ことが見出された。酵素は依然として70000ダル
トンの分子量に対応する速度で沈降する。この同
じ勾配において、上記IgGはチユーブ10、11、及
び12中に見出された。抗−MPMVポリメラーゼ
150μｇとポリメラーゼとのインキユベーシヨン
は酵素活性の80％損失及び残存活性の顕著に異な
つた沈降パターンをもたらす。BSAに近いもと
の位置には酵素は検出されず、そのすべては遊離
酵素又はIgGより速く沈降する複合体として現わ
れる。上記IgGはここでは画分13、14及び15並び
にポリメラーゼ活性のピークを包含する６から10
までの画分の免疫拡散によつて検出される。 ヒトの乳ガン粒子から精製した逆転写酵素によ
る実験において非常に類似した状況が見出され
る。正常なIgGとのインキユベーシヨンはBSA標
識位置の一つとなりのチユーブ内にその通常の位
置（チユーブ15）に上記ヒトの酵素を残し、そし
て上記IgGはチユーブ12〜14において免疫拡散に
より見出される。しかしながら、抗−MPMVポ
リメラーゼIgGとの反応は45％の活性損失をもた
らし、そしてIgGがやはり免疫拡散によつて検出
され得る６から10までの画分中に見出される速く
移動する複合体としてチユーブの下方に残留物を
移動させる。IgGそのもとの位置（12から14まで
の画分）にも見出される。 MPMV逆転写酵素をヒトの乳ガン粒子から単
離されたそれも抗−MPMVポリメラーゼIgGと複
合することができない分子を有意の割合で含有し
ないことは前記した結果から明らかである。酵素
IgG複合物がいくらかの活性を示すことができる
という事実は新らしい現象ではない。実際に、い
くつかの報告例においてはかかる複合物は充分に
活性である。 討 論 ここに記載した実験は抗−MPMV DMA IgG
は、過剰に存在する場合には、ヒトの乳ガン粒子
から単離した逆転写酵素と完全に複合することが
できること及びそれを部分的に阻害し得ることを
示す。阻害の特異性はこの同じ抗体が正常細胞の
DNAポリメラーゼの活性又は動物オンコルナウ
イルス（たとえばAMV、RLV、FLV、FeLV、
SSV−１及びMMTV）からのいろいろな逆転写
酵素の活性に影響を与えることができないことに
より支持される。更に、免疫前に同じ家兎から得
られた正常なIgGはMPMV又はヒトの乳ガン逆転
写酵素の何れとも複合しないか又は何れをも阻害
しない。 その病因学的興味とは別に、MPMVの逆転写
酵素及びヒトの乳ガン粒子間の免疫学的交叉反応
性はより直接的に重要な意味を有する。それは臨
床的有用な方法によりヒトの乳ガンを検査するた
めの基礎を与える。MPMVはその酵素及び他の
タンパク質成分の精製に対して十分な収率で組織
培養において製造することができる。これらは外
科病理学者のための診断手段としての凍結切片を
免疫ケイ光性及び免疫パーオキシダーゼ染色する
際の特異的検出試薬として使用するため抗血清を
発生させるのに使用することができる。更に興味
深いことは、肺ガン、胃ガン、肛門及び結腸ガ
ン、卵巣ガン、脳ガン、骨ガン、リンパ腺のガ
ン、皮膚ガン〔鱗片細胞（squa monscell）及び
基底細胞ガン及び黒色腫（melanoma）〕及び同
様なものの如き乳ガン以外のガンを有する患者の
血漿及び他の体液中の免疫学的関連タンパク質の
全身系検出のための免疫検定におけるかかる発現
の使用である。これらのガンの各々はそれ自身の
明白な粒子関連タンパク質を有する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト細胞組織又は血漿試料を生体外で、乳ガ
ン特異性ウイルス関連タンパク質とメーソン−フ
イツツエル・モンキー・ウイルスに対する抗体と
の交叉反応性を利用して、該乳ガン特異性ウイル
ス関連タンパク質を免疫学的に検定することを特
徴とする、ヒト乳ガンDNAポリメラーゼまたは
ヒト乳ガン特異性乳腫瘍関連タンパク質から選ば
れる乳ガン特異性ウイルス関連タンパク質の検出
方法。 ２ 対照水準よりも高濃度の該乳ガン特異性ウイ
ルス関連タンパク質の存在が乳ガンの診断的指示
である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 血漿試料を治療の開始の前及び後に該被験体
から採取し、そして該検定を該治療の有効性を監
視するのに役立てる特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ４ 該DNAポリメラーゼを、該血漿試料から酵
素を単離しそして酵素活性を測定することによつ
て検定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 該DNAポリメラーゼを、該血漿試料から硫
酸アンモニウム沈殿、それに続く、該酵素に対す
る合成テンプレートが共有結合されたセフアロー
スビーズより成るカラムを通しての再溶解された
該沈殿のアフイニテイー・クロマトグラフイーに
より単離する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 該合成テンプレートがポリリボアデニレート
及びポリ（2′−Ｏ−メチルシチジレート）から選
ばれる特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 該DNAポリメラーゼを放射性免疫検定によ
り検定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ 該放射性免疫検定において、ヒト乳ガン
DNAポリメラーゼ特異性抗体及び125I−ヒト乳ガ
ンDNAポリメラーゼを使用する特許請求の範囲
第７項記載の方法。 ９ 該放射性免疫検定において、ヒト乳ガン
DNAポリメラーゼと交叉反応するメーソン−フ
イツツエル・モンキー・ウイルス特異性抗体、及
び125I−メーソン−フイツツエル・モンキー・ウ
イルスを使用する特許請求の範囲第７項記載の方
法。 １０ 該腫瘍関連タンパク質を放射性免疫検定に
より検定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１ 該放射性免疫検定において、ウイルス起源
の腫瘍関連タンパク質特異性抗体及び125I−ウイ
ルス起源の腫瘍関連タンパク質を使用する特許請
求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 該放射性免疫検定において、該腫瘍関連タ
ンパク質と交叉反応するメーソン−フイツツエ
ル・モンキー・ウイルス特異性抗体及び125I−メ
ーソン−フイツツエル・モンキー・ウイルスを使
用する特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３ 乳腫瘍ウイルスにより産生され、他のウイ
ルス及び乳房組織成分を本質的に含まず且つ線状
20〜50％サツカロースTNE密度勾配において約
1.16〜1.19g/c.c.の半値幅をもつ領域にバンドを有
するヒト乳ガン特異性乳腫瘍関連タンパク質と交
叉反応性を有するメーソン−フイツツエル・モン
キーウイルス特異性抗体。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US79981077A | 1977-05-23 | 1977-05-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53145913A JPS53145913A (en) | 1978-12-19 |
| JPS6215826B2 true JPS6215826B2 (ja) | 1987-04-09 |
Family
ID=25176811
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8432577A Granted JPS53145913A (en) | 1977-05-23 | 1977-07-15 | Detecting method of cancer |
| JP61083199A Pending JPS61247383A (ja) | 1977-05-23 | 1986-04-10 | ガンの検出方法 |
| JP17498387A Pending JPS6327500A (ja) | 1977-05-23 | 1987-07-15 | ヒト乳ガン特異性乳腫瘍関連タンパク質 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61083199A Pending JPS61247383A (ja) | 1977-05-23 | 1986-04-10 | ガンの検出方法 |
| JP17498387A Pending JPS6327500A (ja) | 1977-05-23 | 1987-07-15 | ヒト乳ガン特異性乳腫瘍関連タンパク質 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (3) | JPS53145913A (ja) |
| CA (1) | CA1108988A (ja) |
| DE (1) | DE2729893A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4409200A (en) * | 1980-04-28 | 1983-10-11 | Research Corporation | Reverse transcriptase from human milk, method for its purification, and its use in the detection of breast cancer |
| IL60987A0 (en) * | 1980-09-05 | 1980-11-30 | Uni Ramot & Ind Dev Ltd | Detection of breast cancer |
| IE820942L (en) * | 1982-04-21 | 1983-10-21 | Bartos Patent Dev Holding | Determining in-viro effectiveness of cytostatic agents |
| JPS6028278B2 (ja) * | 1982-12-23 | 1985-07-03 | 家畜衛生試験場長 | 培養腫瘍細胞による逆転写酵素の生産法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3755086A (en) * | 1971-02-09 | 1973-08-28 | Hoffmann La Roche | Diagnostic method utilizing synthetic deoxyrilionucleotide oligomer template |
| US3859430A (en) * | 1973-01-29 | 1975-01-07 | Us Navy | Radioactive iodine labeling of viruses, enzymes and flourescene isothyiocyanate |
| US3999944A (en) * | 1975-02-28 | 1976-12-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of breast cancer |
-
1977
- 1977-07-01 DE DE19772729893 patent/DE2729893A1/de not_active Ceased
- 1977-07-15 JP JP8432577A patent/JPS53145913A/ja active Granted
-
1978
- 1978-04-13 CA CA301,029A patent/CA1108988A/en not_active Expired
-
1986
- 1986-04-10 JP JP61083199A patent/JPS61247383A/ja active Pending
-
1987
- 1987-07-15 JP JP17498387A patent/JPS6327500A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PVOC NATE ACAD SCI VSA * |
| PVOC NATL ACAD SCI USA * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6327500A (ja) | 1988-02-05 |
| DE2729893A1 (de) | 1978-11-30 |
| CA1108988A (en) | 1981-09-15 |
| JPS61247383A (ja) | 1986-11-04 |
| JPS53145913A (en) | 1978-12-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Strand et al. | Type-C RNA virus gene expression in human tissue | |
| US4379839A (en) | Method for detecting cancer | |
| Gallo et al. | Relationships between components in primate RNA tumor viruses and in the cytoplasm of human leukemic cells: implications to leukemogenesis | |
| US4146603A (en) | Tumor specific glycoproteins and method for detecting tumorigenic cancers | |
| Woodbury et al. | Analysis of normal neoplastic human tissues for the tumor‐associated protein p97 | |
| McGrath et al. | Replication of oncornavirus-like particle in human breast carcinoma cell line, MCF-7 | |
| CA2273847A1 (en) | Diagnosis of disease state using mrna profiles | |
| US5219579A (en) | Biologically active material characterized by catabolic activity generally associated with cachexia-inducing tumors, preparations, production and uses thereof | |
| Krakower et al. | Radioimmunoassay for mammalian type C viral reverse transcriptase | |
| Chandra et al. | Purification, biochemical characterization and serological analysis of cellular deoxyribonucleic acid polymerases and a reverse transcriptase from spleen of a patient with myelofibrotic syndrome | |
| Hoag et al. | The production of creatine kinase isozyme BB in sera of a patient with prostatic carcinoma and in tumor homogenates | |
| Ohno et al. | Purification and characterization of the DNA polymerase of human breast cancer particles. | |
| JPH07503601A (ja) | Ｐ６２の精製およびクローニング | |
| JPS6215826B2 (ja) | ||
| Jacquemin et al. | Antibody response in cats to feline leukemia virus reverse transcriptase under natural conditions of exposure to the virus | |
| JPH05504476A (ja) | ヒト胃癌検出用診断プローブ | |
| US6087117A (en) | Production and use of human nm23 protein and antibodies therefor | |
| Laskov et al. | Membrane immunoglobulins of spontaneous B lymphomas of aged BALB/c mice | |
| JP2532559B2 (ja) | ヒトおよび動物組織からの基底膜タンパクの単離方法 | |
| Ohno et al. | Antigenic relatedness of the DNA polymerase of human breast cancer particles to the enzyme of the Mason-Pfizer monkey virus. | |
| Kimball et al. | Characterization of mouse mammary tumor viruses from primary tumor cell cultures. II. Biochemical and biophysical studies | |
| Koch et al. | A novel polymorphism of human complement component C3 detected by means of a monoclonal antibody | |
| JPH02497A (ja) | ヒト前立腺特異性抗原に対する抗体組成物 | |
| Jun et al. | Establishment of immuno-PCR technique for the detection of tumor associated antigen MG 7-Ag on the gastric cancer cell line | |
| CA2215693A1 (en) | Tumor marker protein for cancer risk assessment |