JPS63270629A - 組換え体ｂ型肝炎表面抗原の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母にＳける組換え体Ｂ型肝炎ビールス表面抗原の生産
において、狭雑する６０，０００ダルトンの酵母蛋白が
Ｂ型肝炎ビールス表面抗原と会合し、表面抗原の精製過
程を通して伴われ最終標品中に出現する。占該狭雑酵母
蛋白は表面抗原と密接に会合しており、通常の分離性て
はｚ、ｏｏｏ、ｏｏｏ，０００ダルトン表面抗原から除
去されない。該Ｓ母不純物は該表面抗原粒子の内部に取
り込まれているように見える。

ワクチン産物中に状体する酵母蛋白が存在することは望
ましくない。

従って、形質転換体酵母により生産されたポリペプチド
および蛋白を精製するための４入された方法を与えるこ
とか１本９３明の目的である。もう一つの目的は、形質
転換体酵母中で生産された蛋白およびポリペプチドから
酵母不純物を除去する方法を与えることである。本発明
のこれらおよび他の目的は以下の説明より明らかになろ
う。

酵母由来の蛋白は、形質転換体酵母により生産されたポ
リペプチドまたは蛋白から、該ポリペプチドまたは蛋白
を解離剤とともに、約５０．［＋００ダルトン以上だか
約１，０００，０００ダルトン以丁、好ましくは、約１
００，０００ダルトンから約３００，０００ダルトンの
分子量のものをカットする性質を有する膜を通してダイ
アフィルター濾過することにより除去される。

未発１１は、形質転換体酵母中て生産された望まれる蛋
白から状体する酵母蛋白を除去する方法に関する。

典型的には、本発明の方法は望まれる蛋白またはポリペ
プチドをコートするベクターで形質転換された酵母の発
酵を含む。

この様にして得られた抗原は、細胞破壊、破壊細胞の抽
出、ｆｆ１Ｍアンモニウムによる塩析、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマトクラフィー、ポリエチレングリコールに
よる分画、アフィニチー　りロマトクラフイー、蔗糖お
よび塩化セシウムまたは臭化ナトリウムによる密度勾配
超遠心などのような、生物学的に活性な物質の単離に常
習的に用いられる通常の精製法により精製される。本発
明は＋ｌＢｓＡｇ　　（訳注二Ｂ型肝炎ビールス表面抗
原の略称）をコードする形質転換体酵母について説明さ
れているか、発現されたポリペプチドまたは蛋白から無
関係な酵母蛋白を除去することか望まれる時、形質転換
体酵母により発現された如何なる他のポリペプチドまた
は蛋白にも応用され得ることは当然理解されるべきであ
る。

通常の精製法に続いて、該望まれる蛋白は状体する酸ｍ
蛋白を除くために本発明に従って処理される。本発明に
よる処理は、該望まれるポリペプチドまたは蛋白を解離
剤とともに、約５０，０００ダルトン以上たか約ｉ、ｏ
ｏｏ、ｏｏ。

，０００ダルトン以下、好ましくは約１００，０００ダ
ルトンから約３００，０００，０００ダルトンの分子量
のものをカットする膜を通してダイアフィルター濾過す
ることからなる。

発酵の終りに、酵母は破壊され望まれる蛋白またはポリ
ペプチドを遊離し、細胞及び細胞破片は遠心により除去
される。該−上清は次いで、不要蛋白を除去するために
例えば濃縮およびダイアフィルター濾過により処理され
る。該産物を含む液体は次いてエアロシル（融合シリカ
）に吸着され状体蛋白を除去するだめに洗浄される。該
エアロシルは適当な緩衝液により溶出され、該蛋白また
はポリペプチド含有素材は濃縮され、タイアフィルター
ａ過され、場合によっては遠心される。

遠心の上清液はブチルアガロースカラムを通され、吸着
した抗原は適当な緩衝液中に溶出される。該素材は次い
でｅ１ｓ７１され、セファロース６Ｂカラムにかけられ
る。セファロースカラムからの抗原含有分画は集められ
、望まれる蛋白濃度に希釈され、カオトロープで希釈さ
れ酵母蛋白のＢ型肝炎ビールス蛋白からの解離に至る。

酵母蛋白は望まれる酵母生産蛋白粒子中に取り込まれる
ので、酵母蛋Ｈの分離は妨害され速やかには効果か現わ
れない。典型的には、状体する酵母蛋白か解離するのに
要する時間は、高温ではより短時間で行なわれるか、室
温で約６時間から約２４時間である。該混合物は次いで
ｃｔ＆ｌｉｉされ、少なくとも５借賃の解離剤をダイア
フィルター諸過溶液として用いる１００，０００分子賃
カットホロウファイハー膜」二てダイアフィルター濾過
される。該抗原は次いて、解離剤を除去するために少な
くとも１５倍量の燐酸緩衝生理食塩水でダイアフィルタ
ー濾過される。

該形質転換体酵母は、既知の方法で、コートされたポリ
ペプチドまたは蛋白を発現する酵母細胞に望まれるポリ
ペプチドまたは蛋白をコートする遺伝子を導入すること
により調製される。例えば、形質転換体酵母からの１１
８ｓＡｇ抗原の調製は、バレンツエラ（Ｖａｌｅｎｚｕ
ｅｌａ）ほか、ネイチャー第２９８巻３４７頁以下、１
９８２年に記載されている。酵母起源ＨＢｓ八ｇへ製の
もう一つの既知の方法はミャノハラほか、プロシーシン
ゲス　オブ　ザナショナル　アカデミ−オツ　サイエン
ス米国第８０巻１頁以下、１９８３年により記載されて
いる。

解離剤は、ジオキサンまたはエチレングリコール、尿素
、グアニジン塩酸塩のような極性減少剤、またはα−１
■−１ＣＸＯ，−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＳＣ：Ｎ−または
Ｃ■３Ｃ００−のようなカオトロピック剤でよい。適当
な力オト・ロピック剤の特例としては、過塩素酸ナトリ
ウム、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸ナトリウム３
よびアルカリ金属チオシアネート例えばＮａ５（：Ｎ　
、　ＫＳＣＮおよびＮ１１．ＳＣＮかある。

以下°の実施例は本発明を説明するか、それたけに限定
するものではない。

火ムＡユ ＰＢＳ中の８Ｌの精製されたＢ型肝炎ビールス表面抗原
からなる組換え体Ｂ型肝炎ビールス抗原試料は、ローリ
−（１，ｏｗｒｙ　）蛋白検定により約１００μ９／■
ｌの蛋白を含む。典型例では、測定された蛋白の５パー
セントが狭雑する６０，０００，０００ダルトンの酵母
蛋白からなる。上記の溶液に８ＬのＰＢＳ中６１　ＫＳ
ＣＮか加えられる。生じた１６Ｌの溶液は５０μｇ／■
１の蛋白を含み、３Ｍ　ＫＳＣＮ濃度である。この溶液
は攪拌されつつ４°Ｃ’１？１６時間インキュベートさ
れる。

インキュベーション期間の終りに、該溶液は１００に分
子量除外ホロウファイハー束（アミコン旧ＯＰｌｏｏ−
２０）中で４Ｌに濃縮される。生した濃縮液は３Ｍ　Ｋ
ＳＣＮ中に約２００μｓ／１１の蛋白を含む。ホロウフ
ァイハー東ユニットは次いて、濃縮モードからダイアフ
ィルター濾過モードに切り替えられ、該産物は２０Ｌ　
　の３Ｍ　ＫＳＣＮを用いてダイアフィルター濾過され
る。該ダイアフィルター濾過モードは、フィルター中に
保持される２９口ｏｏ、ｏｏｏダルトンのＢ型肝炎ビー
ルス表面抗原から、フィルターを通過する狭雑する６０
，０圓ダルトン酵母蛋白を除去する。該ダイアフィルタ
ー濾過か完了した後、該産物はＫＳＣＮを除くためにＳ
ＱＬのＰＢＳてさらにダイアフィルターが濾過される。

生じた産物は典型的には、６Ｌ中に１００μｇ／ｍｌの
蛋白を含み、ＨＰＬＣで測定すると１パーセント以下の
蛋白か酵母不純物である。

叉１１１ス セファロース６Ｂ流出物を含む精製組換え体Ｂ型肝炎ビ
ールス表面抗原は固体ＫＳＣＮを加えることによりにＳ
ＣＮに関して３Ｍにされる。次いで一夜４°Ｃで保たれ
る。この素材２１か８１のＰＢＳ中３Ｍ　ＫＳＣＮと混
合され、次いて：１００．０００，０００ダルトン以上
のものを排除するＸＭ３００　ｖを備えたアミコン　ミ
ニコン濃縮機を用いて２１に濃縮される。次いで５ｍｌ
の３Ｍ　ＫＳＵＮか加えられ、総容量が加圧濾過により
再び２ｍｌ　　に減じられる。もう５ｍｌ　　の３Ｍ　
ＫＳＣＮが加えられ、総容量か１１に減しられる。この
１１の産物は次いでＫＳＣＮを除去するために室温で一
夜ＰＢＳに対して透析される。処理ｔｍおよび後の溶液
かポリアクリルアミドゲルおよびイムノフロットにより
解析され、無処理溶液が酵母不純物に対する抗体により
認められるバンドを示すのに、処理試料は酵母蛋白を含
まないことか見出された。

支厘遺ユ 精製された組換え体Ｂ型肝炎ビールス抗原かにＳＣＨに
関して３Ｍにされた。各々の場合に固体ＫＳＣＮを加え
ることにより、第２の試料はＫＳＣＮに関して２．５Ｍ
に、そして第３の試料はにＳＣＮに関して２Ｍにされた
。インキュベーションの後、これら各試料はＫＳＣＨに
関して等モル濃度を有する５倍量のＫＳＣＮに対して、
ＸＭ３００（３００，旧１０１．Ｗ、カット）膜または
×１］０（１００，０００Ｍ、Ｗ、カット）膜を用いて
ダイアフィルター癌過された。にＳＣＮ処理の後、全て
の試料はにＳＣＮを除去するために室温て一夜ＰＢＳに
対して透析された。全ての試料がポリアクリルアミドお
よびイムノツロットにより解析された。膜サイス３よび
ＫＳＣＮ濃度の全条件か、Ｂ型肝炎ビールス表面抗原か
ら酵母不純物を除去した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、解離剤の存在下で蛋白またはポリペプ チドを約５０，０００ダルトン以上から約 １，０００，０００ダルトンまでの分子量のものをカッ
   トする性質をもつ膜を通してダイア フィルター濾過することからなる、形質転 換体酵母中で生産された蛋白またはポリペ プチドから酵母由来の蛋白性物質を除去す る方法。 ２、解離剤が極性減少剤またはカオトロピック剤である
   、請求項１による方法。 ３、極性減少剤が、ジオキサン、エチレングリコール、
   尿素またはグアニジン塩酸塩で ある、請求項２による方法。 ４、カオトロピック剤が、ＣＣｌ＿３ＣＯＯ＾−、ＣＦ
   ＿３ＣＯＯ＾−、Ｃｌ＾−、ＣｌＯ＿４＾−、Ｉ＾−ま
   たはＳＣＮ＾−である、請求項２による方法。 ５、膜が約１００，０００ダルトンから約３００，００
   ０ダルトンの分子量のものをカットする性質 を有する、請求項１による方法。 ６、蛋白またはポリペプチドの溶液が、ダイアフィルタ
   ー濾過前に解離剤の存在下でイ ンキュベートされる、請求項１による方 法。 ７、蛋白またはポリペプチドの溶液がダイアフィルター
   濾過前に濃縮される、請求項１ による方法。 ８、蛋白またはポリペプチドの溶液がダイアフィルター
   濾過の後除去される、請求項１ による方法。