KR930002735B1 - B형 간염 전표면항원 및 표면항원의 정제방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

B형 간염 전표면항원 및 표면항원의 정제방법

제 1 도는 본 발명에 따른 친화성 크로마토그람 결과를 나타낸 것.

제 2 도는 본 발명에 따른 젤여과 크로마토그람 결과를 나타낸 것.

제 3 도는 본 발명에 따른 소수성 크로마토그람 결과를 나타낸 것.

제 4 도는 본 발명에 따른 음이온 교환 크로마토그람 결과를 나타낸 것.

본 발명은 재조합 효모로부터 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 정제하는 방법에 관한 것이다.

유전자 조작된 효모로부터 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 발현시키는 방법은 본 출원인의 대한민국 공개 특허공보 제88-588호 및 동일자 특허출원의 명세서에 상세히 기술되어 있으며, 본 발명에서는 상기 공보에 언급된 균주를 대량으로 배양하여 얻은 효모케익을 전처리하여 항원을 조정제한 후 크로마토그라피 과정을 거쳐 항원 단백질을 정제하는 방법을 제공하고자 한다.

크로마토그라피 법을 이용하여 효모로부터 B형 간염 표면항원을 정제하는 종래의 기술로서 유럽특허 제0135 435호, 미합중국 특허 제4, 649, 192호, 제4, 738, 926호, 제4, 742, 158호 등이 있다.

유럽특허 제0135 435호에 기술된 방법은 B형 간염 표면항원에 대한 항체를 젤에 고정시킨 친화성 크로마토그라피나 부틸세파로스[Pharmacia사 제품] 크로마토그리피를 이용한 방법으로, 친화성 크로마토그라피는 부적합하여 부틸세파로스를 유럽특허 제0135 435호에서는 최종 공정용 크로마토그라피로 선택하였다. 그러나 전처리과정에서 투입된 계면활성제 트리톤-엑스 100을 제거하여야만 부틸 세파로스 크로마토그라피를 할 수 있는 단점이 있다.

미국특허 제4, 649, 192호에서는 헥실세파로스, 페닐세파로스 크로마토그라피를 수행하였는데 이는 실리카 전처리 과정에서 사용한 요소와 트윈 20으로 인하여 표면항원이 부틸기에 잘 결합하지 않는 점을 해결하고자 부틸기보다 소수성이 큰 헥실기나 페닐기가 있는 소수성 크로마토그라피를 한 것이다.

미국특허 제4, 738, 926호에 기술된 크로마토그라피법은 젤여과 크로마토그라피와 하이드록시아파타이트 크로마토그라피법으로서, 젤여과 크로마토그라피에서 B형 간염 표면항원은 분자량이 2, 000, 000 내지 3, 000, 000인 고분자 단백질이므로 저분자량의 불순단백질로부터 쉽게 분리되는 점을 이용하였으나, 샘플처리량이 흡착 크로마토그라피 보다 적은 단점이 있다.

미국특허 제4, 742, 158호는 알부민 응집체와의 선택적 결합성을 이용하여 알부빈 응집체 친화성 크로마토그라피에 의하여 B형 간염 전표면항원을 효모로부터 분리하였다. 그러나 이 경우에도 알부민 응집체 친화성 크로마토그라피를 공업용 크로마토그라피로 사용하기에는 여러가지 점이 있는바, 즉 관능기가 지지체로부터 떨어져 나온다든가 오랫동안 크로마토그라피를 운전하는 중에 미생물에 의해 관능기가 분해되는 등의 단점이 있다.

본 발명자들은 상기에서 언급한 바와 같이 종래의 방법들은 효모로부터 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 정제하는데에 불합리한 점이 있어 보다 개선된 정제방법을 개발하고자 예의 연구한 결과 효모추출액으로부터 전표면항원이나 표면항원을 조정제한 다음, 음이온 크로마토그라피를 사용함으로써, B형 간염 표면항원 및 전표면항원을 고순도로 정제할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 목적은 효모로부터 B형 간염 표면항원 및 전표면항원을 순수한 상태로 정제하는 방법을 제공하는데 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 효모로부터 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 정제하는데 있어서, (가) B형 간염 전표면항원 및 표면항원이 발현된 효모세포를 파괴하고, 세포잔유물을 제거한 다음, (나) 그 상등액을 산처리하여 pH를 강하시킨 후 생성된 침전물을 제거하고, 그 상등액을 알카리 처리하여 pH를 상승시킨 후 생성된 침전물을 제거한 다음, (다) 그 상등액을 정밀여과하여 여과액을 얻은 후, 한외여과하여 농축하고, (라) 그 농축액을 실리카 처리하여 실리카에 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 흡착시킨 후, 그 실리카를 카보네이트 완충용액으로 처리하여 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 회수하고, (마) 음이온 교환크로마토그라피 하는 것임을 특징으로 하는 B형 간염 전표면항원 및 표면항원의 정제방법을 제공하는 것이다.

이와 같은 본 발명의 정제방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

효모로부터 B형 간염 전표면항원 및 표면항원(이하, B형 간염 항원이라 함)을 정제시키기 위하여는, 먼저 B형 간염 항원이 발현된 효모세포를 파괴하고, 이 효모파괴를 원심분리하여 세포잔유물을 제거한다.

그 다음, 상기에서 얻어진 B형 간염 항원을 함유하고 있는 상등액을 산처리하여 pH를 강화시킨 후, 생성된 침전물을 원심분리하여 제거한다. 이때, pH는 3 내지 5정도로 강하시키는 것이 바람직하다. 이어서, 그 상등액을 알카리 처리하여 pH를 상승시킨 후, 생성된 침전물을 다시 원심분리하여 제거하며, 이때 pH는 8 내지 13 정도로 상승시키는 것이 바람직하다.

이상과 같이 전처리된 B형 간염 항원 함유액을 정밀여과하는데, 이때 막으로는 구멍직경이 0.2 내지 0.4㎛인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 여기서 얻어진 여과액은 한외여과하여 농축하며, 이때 막으로는 분자차단 계수가 30, 000 내지 300, 000인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 단계에서 얻어진 농축액은 실리카 처리하여 B형 간염 항원을 실리카에 흡착시킨 후, 인산완충용액으로 세척해 내고, 실리카를 카보네이트 완충용액으로 처리하여 B형 간염 항원을 회수한다. 이때 카보네이트 완충용액의 pH는 9 내지 11로 조정한다.

그런 다음, 상기 단계에서 얻어진 B형 간염 항원 함유액을 Tris 완충용액으로 치환하여 음이온 교환 크로마토그라피한다. 본 발명에서 음이온 교환 크로마토그라피를 위한 수지로는 디에틸아미노에틸이나 4가 암모늄 관능기를 갖는 젤을 사용할 수 있다. 특히 디에틸아미노에틸 음이온 교환수지는 1950년대 이후 오랫동안 사용되어온 크로마토그라피 젤로서 관능기가 부착되는 지지체가 셀룰로오스, 아가로스, 덱스트란, 실리카인 것 등 다양하다. 이 음이온 교환수지는 젤 내부에 있는 공간의 크기를 조절할 수 있어 단백질 크기에 따라 젤을 선택할 수 있다. 단백질 크기에 따라 선택가능한 젤의 기공 크기는 단백질 분자량 기준으로 3×10⁴, 2×10⁵, 10⁷이며, 본 발명에서 정제하고자 하는 표면항원과 같은 분자량 2×10⁶의 크기의 응집체 단백질도 젤 내부에 침투할 수 있다. 관능기 디에틸 아미노에틸은 pH2 내지 9의 범위에서 양의 전하를 띄며 표면항원은 pH6.8에서 음의 전하를 갖고 있으므로(실시예 4 참고) 디에틸아미노에틸기에 표면항원이 결합할 수 있다. 즉, 음이온 교환수지를 이용함으로써 표면항원을 이온 교환 크로마토그라피 할 수 있다.

본 발명의 그 다음 단계로 소수성 크로마토그라피와 젤여과 크로마토그라피를 수행할 수도 있는데, 상기 소수성 크로마토그라피에는 페닐 세파로스 젤이 적합하게 사용될 수 있으며, 젤여과 크로마토그라피에는 CL-4B를 사용하는 것이 바람직하다. 상기한 소수성 크로마토그라피와 젤여과 크로마토그라피는 실시할 수도 있고 않할 수도 있다.

상기와 같은 본 발명의 정제방법은, B형 간염 표면항원을 발현시킬 수 있는 효모세포에는 모두 적용될 수 있고, 특히 본 출원인에 의해 재단법인 한국종균협회에 1990년 5월 8일자로 기탁된 기탁번호 KFCC-10691의 재조합 균주 Saccharomyces cerevisiae LUCK-HBV-1Y에 적용되기에 바람직한 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않는다. 하기의 실시예에서는 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 발현시키는 효모로서 Saccharomyces cerevisiae LUCK-HVB-1Y(KFCC-10691)를 사용하였다.

[실시예 1]

아가로스 농도를 0.5, 1, 1.5, 2%로 하여 아크릴 판에 아가로스 젤을 만들었다. 평편 전기영동장치(LKB사 제품)를 이용하여 3번 중심홈에 발색물질인 피로닌 Y 및 브로모페놀 블루를 넣고 1번과 5번 홈에 소혈청 알부민을, 2번과 4번 홈에 실시예 3에서 정제한 표면항원을 넣었다. 완충용액으로는 0.16M Tris 아세테이트, pH6.8을 사용하였고 아가로스 젤과 완충용액의 접촉은 여과지를 사용하였다. 전압을 150V, 전류를 150mA로 하여 4시간 동안 전기영동하였다. 피로닌 Y는 음극쪽으로 브로모페놀 블루는 양극쪽으로 이동하며, 피로닌 Y가 빨리 움직이므로 피로닌 Y가 아가로스 젤의 끝에 닿으면 전기영동을 중단하였다. 전기영동이 끝난 젤을 쿠마시 블루로 염색하였다.

그 결과, 소혈청 알부민과 표면항원은 pH6.8에서 모두 양극쪽으로 움직였는바, 두 단백질이 pH6.8에서 음의 전하를 띄는 것을 알 수 있었다. 아가로스 농도가 낮을수록 단백질 이동거리가 크며, 표면항원이 소혈청 알부민에 비하여 이동거리가 짧았다.

[실시예 2]

효모케익 6.6kg에 12l의 파괴 완충용액[50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.5M NaCl, 5mM EDTA]을 혼합하여 상기 실시예 2와 같은 방법으로 효모를 파괴하고 세파 원심분리기를 이용하여 3.5kg의 세포잔여물을 제거하였다. 그 상등액을 pH4.7로 강하시킨 후 원심분리하여 1.5kg의 침전을 제거한 다음, 트윈 80을 0.1% 되도록 하고, pH를 10.2로 상승시킨 후 원심분리하여 침전을 제거하였다. 이때 상등액을 10l를 얻었다. 이 액을 5l로 농축한 뒤 3l, 2l 두 부분으로 나누어 실리카 전처리 실험을 하였다. 실리카 분말[Fuji-Davison사 제품] 130g을 3l의 액에 혼합하여 상온에서 3시간동안 교반하였다. 이 액을 원심분리하여 실리카를 회수한 다음 2l의 소금이 함유된 인산완충용액으로 실리카를 세척하였다. 실리카에 흡착된 표면항원을 탈착시키기 위하여 pH10.5인 1M요소, 50mM 소듐 카보네이트 완충용액 3l로 밤새 4℃의 저온실에서 실리카와 용액을 교반하였다. 실리카 처리전과 처리후 표면항원의 양을 분석한 결과, 각각 130mg, 90mg의 표면항원이 존재하였는바, 회수율이 70%였다. 상기 5l중 나머지 2l를 처리하기 위하여 실리카 400g을 혼합하였다. 상기와 동일한 방법으로 세척한 후 실리카에 흡착된 표면항원을 pH10.5의 50mM 카보네이트 완충용액 4l로 2번에 걸쳐 탈착시켰다. 1차 탈착된 양은 30mg, 2차 탈착된 양은 8mg이었다.

[실시예 3]

상기 실시예 5에서 얻어진 1M 요소가 포함된 탈착액을 투석 한여과에 대신하여 G-25 젤여과 크로마토그라피를 사용하여 요소를 제거하고 디에틸아미노에틸 음이온 교환 젤을 이용하여 크로마토그라피하였다. 즉, G-25 용출액 일부를 pH6.8, 10mM Tris 완충용액으로 평형시킨 디에틸아미노에틸 음이온 교환 젤에 로딩하였다. 250ml 음이온 교환 젤이 채워져 있는 5cm 직경 컬럼에 0.5mg의 항원이 포함된 200ml의 샘플을 4.2ml/분의 속도로 로딩하였다. 로딩이 끝난 후 1l의 Tris 완충용액으로 씻어주고 150mM 소금, 300mM 소금이 포함된 트리스 완충용액으로 표면항원을 용출시켰다. 그 음이온 교환크로마토그람 결과를 제 4 도에 나타내었다. 150mM 소금 분획풀의 항원양은 0.13mg이고, 300mM 소금 분획풀의 항원양은 0.14mg이었다.

[실시예 4]

효모케익 3.6kg에 10l의 파괴 완충용액[50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.5M NaCl, 5mM EDTA, 0.1% Tween80]을 혼합하여 상기 실시예 2와 같은 방법으로 효모를 파괴하고, 세파원심분리기를 이용하여 상등액을 얻었다. 다이노밀의 유리구슬에 붙어 있는 표면항원을 파괴완충용액을 이용하여 세척하여 상기 상등액에 합쳐 18l의 용액을 얻었다. 이액에 염산을 첨가하여 pH를 4.7로 저하시킨 후 세파 원심분리기로 침전을 제거하였다. 침전이 제거된 용액에 실리카 1.5kg을 첨가하여 표면항원을 실리카에 흡착시켰다. 상기 실시예 5와 같이 소금인산 완충용액을 세척한 후 원심분리하여 실리카를 회수하였다. 실리카를 50mM 카보네이트 완충용액 20l에 현탁시켜 표면항원을 탈착시키고 20l의 상등액을 원심분리하여 얻었다. 이액을 막[Amiocon Hollow Fiber H10P100]을 이용하여 투석한외여과[Diafiltration]하여 카보네이트 완충용액을 Tris 완충용액으로 치환시켰다. 완충용액을 치환시킨 후 일부를 음이온 크로마토그라피하였다. 5cm 직경×13cm 길이로 젤이 충진된 컬럼에 56mg의 표면항원이 포함된 450ml의 용액을 3.5ml/분의 속도로 로딩하였다. 젤의 평형 완충용액은 pH7.7인 50mM Tris 완충용액이었다. 로딩후 상기 Tris 완충용액으로 세척하여 흡광도 기준선이 0이 되도록 한 후, 300mM 소금이 포함된 Tris 완충용액으로 표면항원을 용출하였다. 용출액은 70ml로 풀하였으며 포함된 표면항원의 양은 18mg이었다.

Claims (5)

1. (가) B형 간염 전표면항원 및 표면항원이 발현된 효모세포를 파괴하고, 세포찌꺼기를 제거한 다음, (나) 그 상등액의 pH를 조절하고, (다) 그 상등액을 정밀여과하여 여과액을 얻은 후, 한외여과하여 농축하고, (라) 음이온 교환 크로마토그라피하여 효모로부터 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 정제하는데 있어서, 상기 (나)단계에서 상등액을 산처리하여 pH3 내지 5의 범위로 강하시킨 후 생성된 침전물을 제거하고, 그 상등액을 알카리 처리하여 pH를 상승시킨 후 생성된 침전물을 제거하여, 상기 (다)단계에서 얻어진 농축액을 실리카처리하여 실리카에 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 흡착시킨 후, 실리카를 카보네이트 완충용액으로 처리하여 B형 간염 전표면항원 및 표면항원을 회수하고, 상기 (라)단계에서 디에틸아미노에틸이나 4급 암모늄 관능기를 갖는 젤을 사용하여 음이온 교환 크로마토그라피하는 것임을 특징으로 하는 표면항원의 정제방법.
2. 제 1 항에 있어서 (나)단계에서 pH를 8 내지 13으로 상승시키는 것임을 특징으로 하는 B형 간염 전표면항원 및 표면항원의 정제방법.
3. 제 1 항에 있어서, (다)단계에의 정밀여과는 구멍직경이 0.2 내지 0.4㎛인 막을 사용하여 수행하는 것임을 특징으로 하는 B형 간염 전표면항원 및 표면항원의 정제방법.
4. 제 1 항에 있어서, (다)단계의 한외여과는 분자차단계수가 30, 00 내지 300, 00인 막을 사용하는 것임을 특징으로 하는 B형 간염 전표면항원 및 표면항원의 정제방법.
5. 제 1 항에 있어서, (라)단계의 카보네이트 완충용액을 그 pH가 9 내지 11인 것임을 특징으로 하는 B형 간염 전표면항원 및 표면항원의 정제방법.

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