JPS63249054A - ハプテンを決定するための装置、方法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、免疫化学に関するものであり、特に、畜産
において受精の最適時期を決定するためのプロゲステロ
ンの決定における特別かつ模範的な応用を伴う、ハプテ
ンの免疫検定法に関するものである。

発明の背景 多くの源からの生物学的流体中でハプテンを決定するこ
とは、かなり科学的、医学的、かつ、成る場合には、経
済的かつ法廷の価値がある。たとえば、科学的調査の上
で、代謝経路または免疫化学現象を決定するため特定の
ハプテンの存在または非存在を決定することは重要なこ
とである。医学的には、治療の特定のコースを規定する
上で、もしくは特定の薬の服用量レベルを規定する上で
、１つのファクタ、しばしば重要なファクタとして、流
体中の特定のハプテンの存在および／または量を決定す
ることは重要である。法学的および医学的には、種々の
ハプテンの存在、非存在または濃度のレベルを決定する
ことは、薬の乱用が我々の社会に浸透しているので、非
常に重要になってきている。牛の飼育者にとって、いつ
雌牛に受精し妊娠に導（かを知ること、および受精した
雌牛が妊娠したかどうかを決定し受精の追跡を可能にす
ることは、非常に経済的かつ実際的に重要なことである
。この発明は一般的に生物学的流体中でのハプテンの決
定に広く応用されるが、重要なこの発明の利点は例示的
なかつ模範的な実施例として、かつこの発明の概念を限
定するものではないものとして、牛のミルク中のプロゲ
ステロンの決定において説明される。たとえば、同じ原
理および技術は、他の動物の受精のための最も有利な時
期を決定するのに用いることができ、その技術は以下に
示すように非常に一般的な応用を有している。

ミルクの少量中のプロゲステロン含有量は、動物が、こ
の例では雌牛が、発情期もしくは妊娠しているかどうか
を示す良好なインジケータである。

卵胞の時期（ｆｏ、１１ｉｃｕｌａｒ　　ｐｈａｓｅ）
の間、妊娠していない雌牛からのミルクのプロゲステロ
ン含有量は、発情期つまり“さかり″の始まりまでは、
約１０ナノグラム／ミリリツターもしくはそれ以上に留
まっており、発情期の始まりにはプロゲステロンレベル
が５ｎｇ／ｍｕに低下し、そしてしばしば発情期の間に
は１　ｎ　ｇ／ｍ　Ｑ−よりも低くなり、ちょうど排卵
の前に、受精および妊娠の可能性が最大である受精の理
想的な時期を知らせる。プロゲステロンの量は、妊娠の
間、および妊娠していない雌牛では発情期の始まりまで
、高く維持されており、発情期の始まりにはプロゲステ
ロンの量が周期的な繰返しとして再び低下する。したが
って、人工受精における精液の有効利用および自然受精
における雄牛の有効性において、雌牛が妊娠を最も受け
やすい時期に受精を行なうことは重要なことである。

ミルク全体の中でのプロゲステロンの量の決定のため利
用し得る多くの技術があり、それらのほとんどは実行す
るには高価であり、かつ低い感度である。伝統的に、放
射線免疫検定（ＲＩＡ）法がプロゲステロン決定に用い
られてきている。プロゲステロン決定のためのより新し
いアプローチでは、酵素連鎖の免疫検定（ＥＬＩＳＡ）
技術が用いられている。

Ｄｒ、Ｅｖａ　　Ｅｎｇｖａｌｌら、Ｅｎｇｖａｌｌ、
Ｅ、およびＰｅｒｌｍａｎｎ、Ｐ、により始められた開
拓的な仕事、酵素一連鎖イムノソルベントアッセイ（Ｅ
ｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
　　ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ））、Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍ、８：８７１−８７４．１９７１、および５ｃｈｕ
ｕｒｓおよび協働者の仕事以来、酵素免疫検定は、広く
知られるようになり、多くの試験、論文、化学雑誌およ
び特許で記載されている。たとえば、ＶａｎＷｅｅｍｅ
ｎの抗原−酵素共役体（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｎｚｙｍｅ
　　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ、１５：２３２−２３６゜１９７１を参照されたい
。また、５ｃｈｕｕｒｓらが発明者として記されている
いくつかの米国特許、たとえば、米国特許第ＲＥ３１，
００６号、第３．６５４，０９０号、第３，８３９，１
５３号、第３，８５０，７５２号、第３．８６２．３０
２号、第３，８６２，９２８号、第３．８７９゜２６２
号および第４，０１６，０４３号を参照さたい。酵素免
疫検定における単クーロン性の抗原は、米国特許第４．
３７６．１１０号およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇの仕事な
らびにＥｎｇｖａｌｌ。

Ｒｏｕｓ　１ａｈｔ　ＬおよびＵｏｔｉｌｌａの仕事で
よく知られている。

酵素免疫検定（ＥＮＺＹＭＥ　　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡ
Ｙ）　、　　Ｉ　ｓ　ｈ　ｉ　ｋａｗａ、　Ｍ、　Ｄ、
　、　Ｔａｄａｓｈｉ、Ｋａｗａｉ、およびＫｉｙｏｓ
ｈｉ。

Ｍｉｙａｉ、＠、ＩＧＡＫＵ−ＳＨＯＩＮ、ＮｅｗＹｏ
ｒｋ　　１９８１には、酵素免疫検定を含めた原理およ
び実践がかなり基礎的に詳細に記載されており、これに
はブローゲステロンの免疫検定への応用が含まれており
、プロゲステロンの競合免疫検定（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉ
ｖｅ　　Ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙ　　ｏｆ　　Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）。

Ｆｅｒｄｉｎａｎｄ　　ＤｒａｙおよびＣ１ａｕｄｅ　
　Ｇｒｏｓｓ著、酵素免疫（ＥＮＺＹＭＥ　　ＩＭＭＵ
ＮＯＡＳＳＡＹ）、５ｕｐｒａ、ｐｉ）、１４６〜１５
６が参照され、ここにはＳｅｅｇｅ　ｒらの「馬の血漿
中のプロゲステロンの酵素免疫検定」　（Ａｎ　　ｅｎ
ｚｙｍｅ　　ｉｍｍｕｎｏａｓＳａｙ　ｏｆ　　ｐｒｏ
ｇｅｓｔｅｒｏｎｅ　　１ｎｈｏｒｓｅ　　ｐｌａｓｍ
ａ’）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８：
２１１〜２１７゜１９７９、およびプロゲステロンの決
定において応用されるかもしれない種々のＲＩＡおよび
ＥＩＡ法の記載された他の文献が引用されている。参考
文献には、またこの分野の他のテキストおよび論文が挙
げられており、たとえば生物科学における免疫化学法（
ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩ　ＣＡＬＭＥＴＨＯＤＳ　　Ｉ
Ｎ　　ＴＨＥ　　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　　５ＣＩＥＮ
ＣＥＳ）；酵素および蛋白質（ＥＮＺＹＭＥＳ　　ＡＮ
Ｄ　　ＰＲＯＴＥＩＮＳ）。

Ｍａｙｅｒ、ＲｏＪ、およびＷａｌｋｅｒ、Ｊ。

Ｈ０著、Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　ＮｅｗＹ
ｏｒｋ　　１９８０、および定量的酵素免疫検定（ＱＵ
ＡＮＴＩＴＡＴＩＶＥ　　ＥＮＺＹＭＥＩＭＭＵＮＯＡ
ＳＳＡＹ）、Ｅｎｇｖａ　１１．Ｅ。

およびＰｅ５ｃｅ、Ａ、Ｊ、著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ｐｕｂｌｉｃａｔｔｏｎｓ
、Ｌｏｎｄｏｎ、（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ　　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９７
８）、ならびに酵素免疫検定に含まれる原理および通常
の実践の包括的な開示のためその中で引用される文献が
ある。ＥＬＩＳＡｓの原理は、Ｂｅｌａｎｇｅｒ、Ｌ、
の「酵素免疫検定におけるもう１つのアプローチＪ（Ａ
ｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｅ　　　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）、５
ｃａｎｄ、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、Ｖｏｌ　　
　８゜５ｕｐｐ１．７．３３−４１．１９７８　（定量
的酵素検定（ＱＵＡＮＴＩＴＡＴＩＶＥ　　ＥＮＺＹＭ
Ｅ　　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ）、５ｕｐｒａの第４章
）で議論されている。

たとえば、抗原−抗体もしくはハプテン−抗体カップル
のような免疫化学カップルの一方の部材の固体支持体の
多くの形態が、開示されてきている。初期の頃の通常の
固体支持体の形態は、成る種の免疫種を結合するため放
射線免疫検定（ＲＩＡ）の研究からよく知られているポ
リスチレンの、板、チューブまたはビーズであった。フ
ィルタペーパ、ガラス、種々のプラスチック、（化学ポ
リマー）、および他の固体支持体表面が長年の間使用さ
れてきている。抗体（もしくは抗原）をコートしたポリ
スチレンのビーズを用いるそのようなシステムの例は、
米国特許第４．４２４，２７９号１９８４年１月３日、
および米国特許第４，４５８．０２０号１９８４年７月
３日の中で、Ｂ。

ｈｎらにより述べられており、その中ではコートされた
ボールが特有の形状で用いられている。Ｋａｔｚらは、
免疫原のアビジン−ビオチン結合について述べている。

米国特許第４，４５８，０２０号を参照されたい。

蛋白質化学は非常に発展しており、免疫学者により使用
できる多くのよく知られた蛋白質がある。

そのような蛋白質の１つである牛の血清アルブミン（Ｂ
　Ｓ　Ａ）は、ここでは一般的に蛋白質の使用の一例と
して単に使用するのであるが、非常によく知られており
、免疫学の分野において広く使用される蛋白質であり非
常に多くの用途において使用されてきている。たとえば
、Ｌｅｈｒｅｒの米国特許第４，３５１，８２４号では
、非自動膠着ポリスチレンを安定化するためＢＳＡが用
いられており、Ｒｕｐｃｈｏｃｋらの米国特許第４，３
６６．２４３号では、ＢＳＡをアボグルコーズオキシダ
ーゼ（ａｐｏｇｌｕｃｏｓｅ　　ｏｘｉｄａｓｅ）組成
物を安定化するためにＢＳＡを用いており、Ｂｕｓｂｙ
らの米国特許第４，３１７．８７９号では、ＢＳＡをポ
リテトラフルオロエチレン−グルコースオキシダーゼ電
極の調製において用いており、ＣｏｏｐｅｒおよびＯ’
Ｂｅ１ｒｎｅの米国特許第４．４１０６３４号、１９８
３年１０月１８日発行では、ハプテン、たとえばジゴキ
シンをＢＳＡと結合させ、それから結果として生じたハ
プテン−担体結合体を固相表面に吸収させている。Ｃｏ
ｏｐｅｒおよびＯ’Ｂｅ１ｒｎｅ。

５ｕｐｒａによれば、免疫活性のハプテンは、ハプテン
に対する選択された高分子キャリアの使用によって、チ
ューブの表面またはマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔ
ｅｒ）のウェル（ｗｅｌｌ）のような手頃な固相に抵抗
なく吸収される。１３ＳＡ１人間の血清アルブミン、卵
のアルブミンおよびポリリジンは、適当なキャリアとし
て述べられている。薬、動物および植物ホルモン、抗性
物質ならびに殺虫剤はハプテンとして述べられている。

述べられている特定の固相は、たとえば、ポリスチレン
、ポリエチレンまたは他のプラスチックなどのような、
プラスチック試験管、マイクロタイタのウェルおよび他
の容器である。これらおよび他のほとんどのハプテンに
関連したＢＳＡの用途においては、この高分子は基本的
に他の方法では中に入らずもしくは関連する免疫化学反
応に大きな影響を与えるキャリアとして、基本的に使用
されている。知られる限りにおいては、たとえばＢＳＡ
は、固体基質の両方およびハプテン、抗体もしくは抗原
と共有結合するスペーシング分子として使用されてきて
いない。

より感度が高く、かつより信頼性があり、より簡易な酵
素免疫検定を発展させてきた数多くの試みにもかかわら
ず、はとんどの免疫検定は、低い感度、低い信頼性、表
示における困難性、非常に複雑な取扱いなどの種々の欠
点を有しており、そして簡便性、信頼性および感度にお
ける改良が望まれ続けている。したがって、この発明の
重要な特徴は、高い感度、信頼性および比較的簡単な酵
素免疫検定方法、装置およびキットを提供することにあ
り、これらは、特にハプテンの決定によく適合しており
、さらにミルク中のプロゲステロンの決定によく適合し
ている。

発明の要約 ここでの検定は、一般的な言い方で、蛋白質でスペース
されたハプテンの競合検定として述べることができる。

この検定は、ビーズ、紙、ディスクなどのような形態で
あろう固体支持体を含む。

模範的な形状は、少なくとも１つのセルロース繊維のパ
ッド（たとえばフィルタペーパ）を付着して有するディ
ツプスティックである。（免疫薬に対する支持体はパッ
ドであり、“パッド“の言葉はここでは、実施例で述べ
る模範的なパッドに関連して用い、そしてまた、固体支
持体の特定の形状にかかわらず免疫薬を結合する固体支
持体を含む。）パッドは“スペーサ°蛋白質、模範的な
ものとしてはＢＳＡを結合している。ＢＳＡは例として
使用するのであるが、（ａ）水の中で溶解しまたは溶解
させることができ、（ｂ）固体支持体と結合することが
でき、（ｃ）ハプテンと共有結合させることができ、そ
して（ｄ）決定におけるハプテンの免疫化学反応と競合
もしくは干渉することのない他の蛋白質を用いることが
できる。そのような蛋白質は、一般的にＢＳＡと等価で
あると考えることができるであろう。決定すべきタイプ
のハプテンはスペーサ蛋白質と結合している。

この発明で用いる他の薬には、ラベル化されたハプテン
の抗体そして、必要であれば抗体上のラベルのための発
現剤も含まれる。螢光、発光、放射性同位体および他の
レベルを用いることができる。

しかしながら、今のところ利用し得る最も便利なラベル
は、既に背景のところで述べたタイプのＥＬＩＳＡ決定
において以前から用いられている酵素ラベルであり、ま
た既に議論しかつ詳細については引用した参考文献にあ
る適当な発現薬とともに用いられる。したがって、この
発明の検定法は一般的な言い方では、“蛋白質でスペー
スされたハプテンの競合ＥＬＩＳＡ”タイプの決定法と
言うことができる。

この発明は全体的にはハプテンのための従来の競合ＥＬ
　Ｉ　ＳＡと似ているが、それを改良するものである。

ハプテンのための従来技術の競合ＥＬＩＳＡの１つの形
態においては、決定すべきハプテン（“既知のハプテン
”）の所定量は固体支持体と結合しており、ハプテンの
ラベル化された抗体のための決定すべきハプテン（“未
知のハプテンｍ）と競争する。このタイプのＣＥＬ　Ｉ
　ＳＡは免疫化学的に理論的に思われるのであるが、大
きな改良が発見された。それはこの発明の基礎となる発
見である。固体支持体と“既知のハプテン”との間に“
スペーサ蛋白質°を結合させることにより、非常に驚く
べき、衝撃でさえある増加が感度において達成すること
ができることがここで発見されたのである。固体支持体
は以下により一般的に述べることができる。

ディツプスティック：パッド： スペーサ蛋白質：既知のハプテン ここで、コロン“：”は、物理的、化学的または免疫化
学的に適切な結合を示している。パッドは、物理的もし
くは化学的にディツプスティックに付着させることがで
き、スペーサ蛋白質は化学的にパッドに結合しており、
そしてハプテンは化学的もしくは免疫化学的にスペーサ
蛋白質に結合している。好ましい実施例の記載において
は、上述の付着物を伴う固体支持体を、“ディツプステ
ィック“と呼ぶ。しかしながら、他の固体支持体もまた
予期されるものである。

この発明を行なうにおいて、固体支持体およびラベル化
された抗体と順に結合しているスペーサ蛋白質と結合し
た、決定されるべきタイプのハプテンを有した、ディツ
プスティック（または他の固体支持体）が、サンプル中
に導かれる。ディツプスティック上の“既知のハプテン
”は、ハプテンの、ラベル化された抗体上の抗原のサイ
トに対し、サンプル中で、（もしあるなら）“未知のハ
プテン”と競争する。もしサンプル中に未知のハプテン
がないなら、すべてのラベル化された抗体は固体支持体
上のスペーサ蛋白質を介して結合されるハ、ブテンと結
合し、発現して、ディスビックパッド上で強い色を結果
として生じる。もしサンプル中に高いレベルの未知のハ
プテンがあれば、ラベル化された抗体のはんんどの部分
が未知のハプテンと結合し、そして溶液中で残存し、デ
ィツプスティックパッド上にはほとんど強い色を結果と
して生じない。したがって、色は、サンプル中のハプテ
ンの濃度と逆比例する。

感度の異常な上昇は、たとえばセルロース繊維などのよ
うな固体支持体の間にスペーサ蛋白質を用いることによ
り生じ、従来技術は酪農場の雰囲気の中で高い信頼性で
使用することができる検定法および検定用キットと、そ
れができない方法およびキットの間に相違を生じさせる
。

この発明は、固体支持体表面、その固体支持体表面と共
有結合した牛の血清アルブミン（または他のスペーサ蛋
白質）およびその牛の血清アルブミンと共有結合したプ
ロゲステロン（または他のハプテン）を備える、ミルク
中でのプロゲステロンの決定のための装置により具体的
に表現される。

１つの形態においては、固体支持体表面と、その固体支
持体表面と共有結合したスペーサ蛋白質の塗膜とを備え
、そのスペーサ蛋白質は、決定されるべきタイプのハプ
テンと共有結合しており、かつ（ａ）水の中で可溶性で
あるかまたは可溶性にすることができ、（ｂ）固体支持
体と結合することができ、（ｃ）ハプテンと共有結合す
ることができ、（ｄ）決定においてハプテンの免疫化学
反応と競争または干渉することがないことで特徴づけら
れる、ハプテン決定のための装置としてこの発明は具体
化される。

好ましい形態においては、この発明は、長尺のスティッ
クと、そのスティック上の免疫原で処理された少なくと
も１つのパッドとを備える、免疫種を決定するための改
良されたディツプスティックであって、そのディツプス
ティックがミルク中のプロゲステロンを決定するのに適
するように改良されているディツプスティックとして具
体的に表現される。ディツプスティックは通常２つのパ
ッドを含むが、繊維、粒子、および互いに結合すること
により多孔性の層を形成する繊維と粒子との組合わせか
らなるグループから選択されるパッド形成成分で形成さ
れた大きな表面積のパッドから本質的に構成される少な
くとも１つのディツプスティックパッドを常に含んでい
る。牛の血清アルブミンは、そのパッド形成成分と共有
結合しており、そしてプロゲステロンはそのパッド形成
成分と結合している牛の血清アルブミンと共有結合して
いる。

２つのパッドを使用する場合において、ディツプスティ
ックはそのスティック上に参照パッドを含むことが好ま
しく、その参照パッドは、繊維、粒子、および互いに結
合して多孔性の層を形成する繊維と粒子との組合わせか
らなるグループから選択されるパッド形成成分で形成さ
れた大きな表面積のパッドと共有結合している参照カッ
プリングペアの一方の部材から本質的に構成され、その
参照カップリングペアは、その参照カップリングペアの
成分がいずれも、プロゲステロンもしくはプロゲステロ
ンの抗体のいずれとも反応しないことにより特徴づけら
れる。好ましい参照カップリングペアはアビジンおよび
ビオチンである。

この発明はまた、ミルク中のプロゲステロンを決定する
ためのキットとして具体化することができる。キットは
通常、長尺の固体支持スティック、およびその支持ステ
ィック上の少なくとも２つの大きな表面積のパッドであ
って、前記パッドの一方が繊維、粒子、および互いに結
合して多孔性の層を形成する繊維と粒子の組合わせから
なるグループから選択されるパッド形成成分で形成され
た大きな表面積のパッドから本質的に構成される参照パ
ッドであることで特徴づけられるパッドを備え、パッド
形成成分と結合している参照カップリングペアの一方の
部材を伴い、その参照カップリングペアは、その参照カ
ップリングペアの部材のいずれもがプロゲステロンもし
くはプロゲステロンの抗体のいずれの反応にも反応せず
または干渉しないことで特徴づけられる、ディツプステ
ィックを備えているであろう。前記パッドの他方は、繊
維、粒子、および互いに結合して多孔性の層を形成する
繊維と粒子の組合わせからなるグループから選択される
パッド形成成分で形成された大きな表面積のパッドから
本質的に構成されるテストパッドであり、牛の血清アル
ブミンの塗膜は、前記パッド形成成分と共有結合してお
り、プロゲステロンはその牛の血清アルブミンと結合し
ている。

好ましくは、キットは所定量の酵素でラベル化された抗
プロゲステロン抗体と、抗体をラベル化したのと同じ酵
素でラベル化された参照カップリングペアの他方の部材
の所定量を含んでいる。

好ましい実施例の説明 この発明の原理の応用は、ミルク中のプロゲステロンの
量の決定について述べられるが、これは単に例示的なも
のであり、この発明を限定するものではない。

プロゲステロンは、卵巣サイクルの黄体時期（ｌｕｔｅ
ａｌ　　ｐｈａｓｅ）の間および妊娠の間、分泌される
Ｃ２１のステロイドである。それはすべてのステロイド
分泌細胞中の中間体として形成され、黄体および胎盤に
よりホルモンとして生産され分泌される。プロゲステロ
ンは、受精した卵子の着床および妊娠の持続における子
宮の収縮の抑制に必要である。プロゲステロンは子宮お
よび乳房組織の分泌線の部分の成長を刺激し、排卵の間
、雌牛にさかりを導くことを伴う。

妊娠していない雌牛は、卵巣サイクルの黄体時期の間に
出すミルク全体中に、少なくとも、ミリリッター当たり
１０ナノグラム（ｎ　ｇ／ｍ　ｉ）の比較的一定量を有
することが知られている。発情期の間の排卵時期の直前
には、ミルク中のプロゲステロンの量は、約３〜５ｎｇ
／ｍｆＬ以下で、通常はｌｏｇ／ｍｕより少ない量まで
急激に低下する。もし正確に決定することができれば、
ミルク全体のプロゲステロンの含有量の低下は、約２１
日間の間隔で起こる排卵の始まり、したがって、妊娠に
おいて最も好ましい結果を生じるであろう　　　　′受
精の時期を見分けるのに用いることができる。

排卵後約２４時間で、ミルク全体中のプロゲステロンの
含有量は再び増加する。もし受精が妊娠の結果をも入ら
すならば、プロゲステロンは高く維持される。もし受精
が妊娠の結果をもたらさないならば、プロゲステロンの
濃度は発情期の始まりにまで再び低下し、受精を繰返す
ことの必要性を示すであろう。

このような知識を伴い、免疫検定法が牛のミルク中のプ
ロゲステロンの量を決定できるよう発展した。この特定
の用途においては、正確な量的決定は不要である。しか
しながら、プロゲステロン−の量が約Ｌｏｎｇ／ｍＪｌ
の概ねの範囲なのであるのかもしくはそれ以上であるの
か、または１〜３ｎ　ｇ／ｍ　Ｌの概ねの範囲であるの
かもしくはそれ以下であるのかを知ることは必要である
。したがって、２つの概ねの量を明らかに区別できる性
能を伴う高い感度が必要である。試験は、この分野にお
いて半熟線の酪農労働者が使用するよう設計されている
ので、結果は正確に違いないものであり、かつ明らかに
ポジティブもしくは明らかにネガティブ、すなわち雌牛
が、（ａ）自然であれ人工的であれ、受精が最も成功す
るであろう排卵サイクルにある（すなわちさかりにある
）のか、（ｂ）妊娠しているもしくは発情期にないのか
が明らかになるに違いない。

最初の試みでは、参照パッドおよびテストパッドを伴う
ディツプスティックが調製された。免疫化学的に関連す
る薬で処理する前は、パッドは同一であり、たとえば、
繊維もしくは粒子、または層もしくは層から切断された
ボディの中にともに結合する繊維もしくは粒子の組合わ
せのような、大きな表面積に結果としてなる成分で形成
される。

たとえばフィルタペーパのような、セルロース繊維のシ
ートがよく用いられるが、しかし一般的に述べたいかな
る大きな表面積のパッドも使用することができる。参照
パッドの繊維はアビジンによりコーティングし、プロゲ
ステロンは、従来技術の調製法およびカップリング試薬
および手法を用いて、テストパッドの繊維に共有結合さ
れた。

プロゲステロンの検定は、最初、抗プロゲステロン抗体
が参照パッドに結合したディツプスティックを用い、ミ
ルクのサンプルに、アルカリ性フォスファターゼ（Ａ　
Ｌ　Ｐ）でラベル化したビオシンおよびＡＬＰでラベル
化したプロゲステロンを添加し、この混合物をインキュ
ベイトして行なった。１から１０ｎｇ／ｍｌｌの既知の
プロゲステロン含有量のサンプルを用いることにより、
典型的な競合検定応答曲線、すなわちテストパッドの色
がサンプル中のプロゲステロンの量と逆比例する結果が
得られるであろうことが予測された。しかしながら、プ
ロゲステロンに対する検定の感度が低いためその分野の
使用において適当な感度および信頼性の試験に発展させ
ることができないことがわかった。

この問題を解消する梯々の努力がなされ、究極的にはテ
ストパッドを作るすべてのアプローチが放棄され、新し
いアプローチが採用された。

もし、プロゲステロンがたとえばＢＳＡもしくはそれの
同等物のようなスペーサ蛋白質と共有結合し、そのスペ
ーサ蛋白質がパッドの繊維もしくは粒子と共有結合した
ならば、ポジティブおよびネガティブの結果の相違を非
常に明確に与える非常に高い感度の検定が得られること
が発見された。

ＢＳＡは（抗体の大きさに比べて）大きなスペーサとし
て働き、プロゲステロン抗体を繊維表面から遠ざけるよ
う位置づけ、プロゲステロンとの結合のため抗体の決定
基の部分を露出させるか、あるいは多分立体的もしくは
空間的な障害を抑えることが仮定される。

この発明の方法は、ミルク中のプロゲステロンを決定す
るための方法として例示され、以下の工程を備える。参
照パッドは、参照カップリングペアの一方の部材が結合
する大きな表面積のパッドから本質的に構成され、その
参照カップリングペアは、その参照カップリングペアの
いずれの部材もプロゲステロンもしくはたとえばプロゲ
ステロンのような決定されるべきハプテンの抗体のいず
れの反応にも反応または干渉しないことで特徴づけられ
、決定されるべきハプテンを含んでいると思われるサン
プル中に挿入される。テストパッドは本質的に大きな表
面積のパッドから構成され、牛の血清アルブミンと共有
結合した決定されるべきタイプのハプテンを有したパッ
ド上の牛の血清アルブミンの塗膜も、またサンプル中に
挿入される。所定量の酵素でラベル化された、たとえば
抗プロゲステロン抗体のような抗ハプテン抗体と、その
抗プロゲステロン抗体がラベル化されたのと同じ酵素で
ラベル化された参照カップリングペアの他方の部材の所
定量とが、そのサンプルに添加される。好ましい実施態
様では、ＡＬＰでラベル化されたビオチンは経験的に定
められた量添加され、５ｎｇ／ｍＪＬの量で参照パッド
が結果として示すのと同じ強度の色を結果として生じる
。それからサンプルは前述の薬とともにその中でインキ
ュベイトされ、パッドはサンプルから分離され、好まし
くは洗浄されて、それからラベル化する酵素を発現し、
それによって参照パッドおよびテストパッド上に色を現
わす。テストパッドの色は、サンプル中のプロゲステロ
ンまたは他のハプテンの量の測定として、肉眼であるい
は機械的に参照パッドの色と比較される。もしテストパ
ッドの色が参照パッドの色よりも濃いならば、テストは
ブゝ。

ロゲステロンの低い量を示しており、雌牛は発情期にあ
るかもしくは排卵の初期にあるということ、および受精
により妊娠しそうであることを使用者に教えてくれる。

もしテストパッドが参照パッドよりも薄ければ、高い量
のプロゲステロンが存在し、受精が適当ではないであろ
うことを示す。

ここで、図面、特に第１図を参照すると、この発明はミ
ルク中のプロゲステロンを決定するための装置１０とし
て具体的に表わされ、この装置は固体支持体表面１２、
この固体支持体表面と共有結合している牛の血清アルブ
ミンおよびこの牛の血清アルブミンと結合しているプロ
ゲステロンを備えている。

より一般的な意味では、この発明は、固体支持体表面、
その固体支持体表面と結合している不活性な可溶性スペ
ーサ蛋白質の塗膜、およびその蛋白質と共有結合してい
る決定すべきタイプのハプテンとを備える、ハプテン決
定のための装置として具体的に表わされる。

好ましい形態においては、この発明は、長尺のスティッ
ク１０、およびそのスティック上の免疫源で処理された
少なくとも１つのパッド、たとえば１２を備えたタイプ
の免疫種を決定するための改良されたディツプスティッ
クとして具体的に表わされ、ディツプスティックがミル
ク中のプロゲステロンを決定するのに適するよう改良さ
れている。ディツプスティックは通常２つのパッド１２
および１４を含むが、常に繊維、粒子、および互いに結
合して多孔性層を形成する繊維および粒子の組合わせか
らなるグループより選ばれるパッド形成成分で形成され
た大きな表面積のパッドから本質的に構成される少なく
とも１つのディツプスティックテストパッド１２を含ん
でいる。牛の血清アルブミンは、パッド形成成分と共有
結合しており、プロゲステロンはその牛の血清アルブミ
ンと共有結合している。

２つのパッドを用いる場合、好ましくはディツプスティ
ックはスティック上の参照パッド１４を含んでおり、そ
の参照パッドは、繊維、粒子および互いに結合して多孔
性層を形成する繊維および粒子の組合わせからなるグル
ープより選択されるパッド形成成分で形成された大きな
表面積のパッドと共有結合する参照カップリングペアの
一方の部材から本質的に構成され、その参照カップリン
グペアは、その参照カップリングへアのいずれの成分も
が、プロゲステロンもしくはプロゲステロンの抗体のい
ずれとも反応しないことで特徴づけられている。好まし
い参照カップリングペアはアビジンおよびビオチンであ
るが、ハプテン−抗ハプテン反応と干渉もしくは免疫化
学的に携わるものでないいかなる参照カップルをも使用
することができる。たとえば、ラビットＩｇＧ−抗ラビ
ットＡＬＰまたはＤＮＰ−抗ＤＮＰ−ＡＬＰまたは他の
参照カップルがいくらでも用いることができる。実際、
１〜５　ｎ　ｇ／ｍ　ｆＬの量で決定することのできる
、いかなる非干渉のおよび非反応性のカップルが、参照
カップルとして用いることができる。

免疫化学においては、非常に多くの固体支持物質が用い
られてきている。これらのより一般的なものの中では、
ビード、チューブ、プレート、スティック、および他の
形態での、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、
ポリジビリルベンゼンなどの合成ポリマー（プラスチッ
ク）や、天然ポリマーがあり、最も一般的天然ボリマー
とじては、パッド、ディスク、ビーズ、ペーパー、また
は他の便利な形態のセルロースがある。これらのおよび
その他の免疫学的に不活性な固体支持体は、この発明に
おいて利用され得るものである。

ＥＬＩＳＡ法を使用するのに適している酵素増幅技術お
よび他の技術は、一般的に、この発明の原理から逸脱し
ない限りにおいて、この発明と関連して用いることがで
きる。たとえば、非ラベル化のマウスの誘導抗プロゲス
テロン抗体を、サンプルに添加してハプテン−抗体カッ
プルを形成し、過剰のラベル化した山羊の抗マウス抗体
をその固体層と反応させてもよい。それぞれのマウス抗
体は２つの山羊の抗体と結合するので、色の強度および
色の分解能は、ラベル化された抗ハプテン抗体を直接用
いるときに比べて約２倍にすることができる。もちろん
、これは、この発明の原理内で使用することのできるＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ関連の多くの方法の一例にすぎない。

この発明はまた、第２図に表わすような、ミルク中のプ
ロゲステロン決定のためのキットとじて具体的に表現す
ることができる。このキットは、通常既に述べたような
ディツプスティックを備えており、テストチューブ２０
および３０のような２つの容器を含むかもしれない。こ
のキットは、所定量の酵素でラベル化した抗プロゲステ
ロン抗体２２、および抗プロゲステロン抗体がラベル化
されたのと同じ酵素でラベル化した所定量の、参照番号
２４で示される、参照カップリングペアの他方の部材を
含んでいる。従来のストッパ２６が通常与えられる。キ
ットはまた、ストッパ３４を伴う、チューブ３０中の発
現基質３２を含むことができる。

この発明は、次の工程を含み、第３図に参照される、ミ
ルク中のプロゲステロンの決定のためのプロセスまたは
方法として具体的に表わされる。

サンプルを得て、チューブ２０に添加し、これによって
参照カップリングペアの一方の部材が結合している大き
な表面積のパッドから本質的に構成される参照パッドと
結合し、参照カップリングペアは、その参照カップリン
グペアの部材のいずれもが、プロゲステロンまたは、た
とえばプロゲステロンのような決定されるべきハプテン
の抗体の反応と、反応または干渉を起こさないことによ
って特徴づけられ、テストパッドは本質的に大きな表面
積のパッドから構成され、牛の血清アルブミンと共有結
合した決定されるべきハプテンを有した、前記大きな表
面積の牛の血清アルブミンと共有結合した塗膜もまた、
サンプル中に挿入され、所定量の酵素でラベル化された
、たとえば抗プロゲステロン抗体などのような抗ハプテ
ン抗体、およびその抗プロゲステロン抗体がラベル化さ
れたのと同じ酵素でラベル化された参照カップリングペ
アの他方の部材の所定量が、サンプルに添加されれる。

それから、サンプルの混合物は、既に述べた薬でその中
でインキュベイトされ、パッドはサンプルから分離され
、そして好ましくは洗浄されて、次にラベル化する酵素
が発現され、それによって参照パッドおよびテストパッ
ド上の色が発現される。テストパッドの色は、サンプル
中のプロゲステロンまたは他のハプテンの測定として、
参照パッドの色と視覚的もしくは機械的に比較される。

この発明の検定における感度の階段関数的増加は、従来
の方法と比較して、増加した感度が、実際の用途に適し
た検定と、実際の用途に適さず、研究所の制御された雰
囲気の下でしか限られた価値のない検定とに差を生じさ
せるということは驚くべきことであった。酪農または飼
養の作業の雰囲気および環境の中で洗練された研究所を
動かしていくということは実静的ではないので、牛のミ
ルク中のプロゲステロンの決定において、これは非常に
実際的でかつ経済的に重要なものである。

今のところ考えられる、最も大きな利点を与えるこの発
明の実行に対する最も良好な態様は上述のようなもので
あるが、この発明の概念および原理はそのように限定さ
れるものではない。そのような強烈な結果をもたらす応
用である牛のミルク中でのプロゲステロンの決定に加え
て、この方法はいかなるミルクまたは他の流体中でのプ
ロゲステロンの決定に応用することができ、他のハプテ
ンの決定にも有利なものである。テスト溶液中に溶ける
または溶かすことのできる体液または組織中に身い出す
ことのできるいかなるハプテンの決定も予期されるもの
である。チロキシン、トリョードチロニン、エストリオ
ール、ビタミンＢ１２、およびジゴキシンのようなハプ
テン一般、エストラジオール、テストステロン、プロゲ
ステロン、オエストロゲン、コルチゾン、コルチコステ
ロン、および他のステロールを含むステロイド一般は、
他のハプテンと同様に、この発明を用いて決定すること
ができる。興味のあるハプテンの中には、“乱用の薬°
がある。乱用の薬には、摂取もしくは注射されたときに
種々の生理学的な反応を有する広い範囲の薬が含まれる
。これらのもので最も一般的な中で、乱用の薬としては
、麻酔薬、催眠薬、鎮静薬、精神病発現薬、筋肉弛緩薬
および神経系の刺激薬として働く薬がある。特に、この
発明が応用できる乱用の薬の重要なものには、モルヒネ
、コカイン、アンフェタミン、パルピッレート、フェン
シフリジン、テトラヒドロカナピノール（ＴＨＣ）　、
メタトン、バリウム（オキサゼパム）、およびそれらの
代謝物のようなオピエートが含まれる。

この発明の原理に従い検出できるオピエートとしては、
モルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルホン、オキシモルホン
、メトポン、コディン、ヒドロコディン、ジヒドロコデ
ィン、ジヒドロヒドロキシコデイノン、フォロコデイン
、デキストロメトルファン、フェナゾシンおよびジオニ
ンがある。

カタコールアミンおよびその関連化合物であるエピネフ
リン、アンフェタミンならびに他の関連化合物も、この
発明の方法および装置により決定を受ける。ベロナール
（ｖｅｒｏｎａｌ）、メジナール（ｍｅｄ　ｉ　ｎａ　
ｌ）　、ルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）、プロミナール
（ｐｒｏｍｉｎａｌ）、ソネリル（ｓｏｎｅｒｙｌ）、
ネムブタール（ｎｅｍｂｕｔａｌ）、アミクール（ａｍ
ｙ　ｔ　ａ　１）、シアル（ｄｉａｌ）、フエナドルン
（ｐｈｅｎａｄｏｒｎ）、セコナール（ｓｅｃｏｎａｌ
）、エビパン（ｅｖｉｐａｎ）、フエノバルビタール（
ｐｈｅｎｏｂａ　ｒｂ　ｉ　ｔ　ａ　ｌ）およびベント
クール（ｐｅｎｔｏｔｈａｌ）のようなパルピッレート
は、この発明の原理に従い検出することができる。

現在非常に広く乱用されている薬であるコカインおよび
その誘導体、ならびに同じく広く乱用されているマリフ
ァナは、この発明により検出することができる。

メブロバメートおよびベンズジアゾシクロへブタンのよ
うなトランキライザもまた、乱用されており、この発明
に従い検出されるものである。

アミノ酸、ペプチドおよびポリペプチドもまだ、特定の
単クロール性抗体が生産され得る他の抗原基質および有
機体のように、この発明に従い検出されるものである。

この発明により検出される他の基質には、ペニシリン、
クロロマイセチン、アクチノマイシン、テトラサイクリ
ン、テラマイシンのような抗生物質、ヌクレオシドおよ
びヌクレオチドのような核酸またはその誘導体、ストロ
イド、ホルモン、殺虫剤、殺真菌薬、殺菌剤および殺線
虫薬などが含まれる。

均一タイプのＥＩＡ中で使用することのできる多くの種
類のラベリング酵素は、文献に報告されてきている。こ
のような酵素の典型として、オキシドレダクターゼおよ
びヒドロラーゼがある。これらの酵素を選択する基準は
よく知られており、ＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎおよびＵｌｌ
ｍａｎの米国特許第４，０６７．７７４号にかなり詳し
く議論されている。しかしながら、この発明において使
用される酵素の選択の基準は、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎお
よびＵｌｌｍａｎにより議論されている基準とは異なる
。この発明においてラベルとして用いるのに特に適して
いる酵素には、ホースラディツシュパーオキシダーゼ（
ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　　ｐｅ？ｏｘｉｄａｓｅ（Ｈ
ＲＰ））、ベータガラクトシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇａｌ
ａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、アシッドフォスファターゼ（
ａｃｉｄ　　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）およびアルカリ
性フォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ　　ｐｈ。

５ｐｈａｔａｓｅ　（ＡＬＰ））が含まれ、これらは多
くの利用できる酵素の模範的なものとして用いられる。

多くのものがよく知られており、一般にこの技術に用い
られている放射性ラベル、螢光ラベルおよび触媒ラベル
を用いることができる。しかしながら、既に述べたよう
に、好ましいラベルの部類は酵素であり、これは特別な
機械の使用または特別な安全の警戒の必要なしに用いる
ことができる簡単で安全な方法だからである。

一般に、適当な固体支持体に結合させることができる、
いかなる免疫学的不活性もしくは免疫学的不干渉非接合
もしくは球状の蛋白質はスペーサとして使用することが
できる。一般に血清アルブミンは最も好ましいが、これ
はそれらがよく特性づけられておりかつ容易に利用し得
るからである。

人間の血清アルブミンや、たとえば牛の血清アルブミン
（ＢＳＡ）のような一般の唾乳動物の血清アルブミンは
、単に便利さおよび利用性の下に好ましいものである。

既に述べた実施例ではＢＳＡを用いているが、これはこ
の発明の原理を単に例示するためであり、限定のための
ものではない。

どのような特定の可溶性蛋白質をも固体表面に結合させ
ることができ、かつ決定に関係するハプテンまたは抗体
と結合せずもしくは他の方法で免疫化学的に反応させな
いことを確かにするには、わずかに適度な努力のみが必
要である。このようなプロティンを簡単のために、免疫
学的に不活性な水溶性蛋白質と呼ぶ。

上述の議論および実施例から、工程、工程の順序または
連続、特定の薬、ならびに方法および装置の応用すべて
について、この発明から逸脱しない限り、多くの変更が
可能であることがわかるであろう。

工業的母応用 この発明の範囲は、前述の実施例で限定されるものでは
ない。特定的に指摘しかつ明確にこの発明を定義する特
許請求の範囲が言及するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明のディツプスティックの側面図であ
る。第２図は、この発明の原理を具体化したキットの１
つの形態を示す図である。第３図は、この発明の方法の
工程を表わすブロック図である。 手続補正書 昭和６３年４り／？日 昭和６３年特許願第５４７２４号 ２、発明の名称 ハプテンを決定するための装置、方法およびキット３、
補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　　アメリカ合衆国、カリフォルニア州、う・ホ
イアノース・トリー・パインズ・ロード、１１０７７名
　称　　クイデル 代表者　　ジョウゼフ・ステムラ− ４、代理人 住　所　大阪市北区南森町２丁目１番２９号　住友銀行
南森町ビル電話　大阪（０６）３６１−２０２１　（代
）−８２氏名弁理士（６４７４）深見久部　−１≧″−
５− ”ご。 ５、補正命令の日付　　　　　　　　　　　　　　　　
　″−−−。 自発補正 ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容 （１）明細書の第３４頁第１８行目の「１２」を「１４
」に訂正致します。 （２）明細書の第３５頁第２行目から第３行目の「パッ
ド１２および１４」を「パッド１４および１６」に訂正
致します。 （３）明細書の第３５頁第７行目から第８行目の「ディ
ツプスティックテストパッド１２」を「ディツプスティ
ックテストパッド１４」に訂正致します。 （４）明細書の第３５頁第１３行目の「参照パッド１４
」を「参照パッド１６」に訂正致します。 以上

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）固体支持体表面と、 （ｂ）その固体支持体表面と結合した牛の血清アルブミ
   ンと、 （ｃ）その牛の血清アルブミンと共有結合したプロゲス
   テロンとを備える、ミルク中のプロゲステロンを決定す
   るための装置。
2. （２）（ａ）固体支持体表面と、 （ｂ）その固体支持体表面と結合したアルブミンの塗膜
   と、 （ｃ）そのアルブミンの表面と共有結合した決定される
   べきハプテンの層とを備える、ハプテンを決定するため
   の装置。
3. （３）長尺のスティックと、そのスティック上の免疫原
   で処理された少なくとも１つのパッドとを備える免疫種
   のタイプを決定するためのディップスティックにおいて
   、 （ａ）繊維、粒子および互いに結合して多孔性の層を形
   成させた繊維と粒子の組合わせからなるグループより選
   ばれたパッド形成成分から形成された、大きな表面積の
   パッドと、 （ｂ）そのパッド形成成分と結合した牛の血清アルブミ
   ンの塗膜と、 （ｃ）その牛の血清アルブミンと共有結合したプロゲス
   テロンから本質的に構成された少なくとも１つのディッ
   プスティックパッドによりミルク中のプロゲステロンの
   決定に適するように改良されたディップスティックを備
   える装置。
4. （４）さらに、 （ｄ）繊維、粒子、および互いに結合して多孔性の層を
   形成させた繊維と粒子の組合わせからなるグループより
   選ばれるパッド形成成分で形成された大きな表面積のパ
   ッドと共有結合した参照カップリングペアの一方の部材
   から本質的に構成され、その参照カップリングペアが、
   その参照カップリングペアの成分のいずれもがプロゲス
   テロンにもプロゲステロンの抗体にも反応しないことで
   特徴づけられる、スティック上の参照パッドをさらに備
   える、請求項３記載の装置。
5. （５）参照カップリングペアがアビジンおよびビオチン
   である、請求項４記載の装置。
6. （６）（ａ）長尺の固体支持スティックと、その支持ス
   ティック上の少なくとも２つの大きな表面積のパッドと
   を備え、そのパッドは、 （ｉ）前記パッドの１つが、繊維、粒子、および互いに
   結合させて多孔性の層を形成させた繊維と粒子の組合わ
   せからなるグループより選ばれるパッド形成成分で形成
   された大きな表面積のパッドから本質的に構成される参
   照パッドであり、参照カップリングペアの一方の部材は
   パッド形成成分に結合しており、その参照カップリング
   ペアは、参照カップリングペアのいずれの部材もプロゲ
   ステロンもしくはプロゲステロンの抗体の反応と反応ま
   たは干渉しないことで特徴づけられ、かつ、 （ｉｉ）前記パッドの１つは繊維、粒子、および互いに
   結合して多孔性層を形成する繊維と粒子の組合わせから
   なるグループより選ばれるパッド形成成分で形成された
   、大きな表面積のパッドから本質的に構成されるテスト
   パッドであり、不活性な可溶性のスペーサ蛋白質の塗膜
   は前記パッド形成成分と結合しており、プロゲステロン
   はそのスペーサ蛋白質と共有結合している ことで特徴づけられる、パッドである、ディップスティ
   ックと、 （ｂ）所定量の酵素でラベル化された抗プロゲステロン
   抗体と、 （ｃ）抗プロゲステロン抗体をラベル化したのと同じ酵
   素でラベル化した所定量の参照カップリングペアの他方
   の部材とを備える、 ミルク中のプロゲステロンを決定するためのキット。
7. （７）参照カップリングベアが本質的にアビジンおよび
   ビオチンから構成される、請求項６記載のキット。
8. （８）さらに、酵素のラベルのための発現基質を備える
   、請求項６記載のキット。
9. （９）（ａ）ハプテンを決定するサンプル中に、 （ｉ）参照カップリングペアの一方の部材が結合したパ
   ッドであり、その参照カップリングペアは参照カップリ
   ングペアのいずれの部材もハプテンもしくはハプテンの
   抗体の反応と反応または干渉することがないことで特徴
   づけられる、大きな表面積のパッドから本質的に構成さ
   れる参照パッドと、 （ｉｉ）大きな表面積のパッドと、大きな表面積の不活
   性な可溶性スペーサ蛋白質に結合した塗膜と、そのスペ
   ーサ蛋白質に結合ハプテンの塗膜とから本質的に構成さ
   れるテストパッドを、 挿入し、 （ｂ）前記サンプルに、所定量の酵素でラベル化した抗
   ハプテン抗体および抗ハプテン抗体をラベル化したのと
   同じ酵素でラベル化した参照カップリングペアの他方の
   部材の所定量を添加し、 （ｃ）サンプルを前記の試薬とその中でインキュベイト
   し、 （ｄ）サンプルからパッドを分離し、 （ｅ）ラベル化した酵素を発現し、それによって参照パ
   ッド上およびテストパッド上の色を発現し、 （ｆ）サンプル中でのハプテンの量の測定としてテスト
   パッドの色と参照パッドの色とを比較する、 各ステップを備えるハプテンを決定するための方法。
10. （１０）参照パッド参照カップリングペアが本質的にア
    ビジンおよびビオチンから構成される、請求項９記載の
    方法。
11. （１１） Ａ、１、参照カップリングペアの一方の部材が結合し、
    その参照カップリングペアが参照カップリングペアのい
    ずれの部材もハプテンもしくはハプテンの抗体の反応と
    反応または干渉することはないことで特徴づけられる、
    パッドから本質的に構成される参照パッドと、 ２、スペーサ蛋白質の塗膜を有し、そのスペーサ蛋白質
    がその蛋白質が水中で可溶性もしくは可溶性にでき （ａ）、固体支持体と結合させることができ （ｂ）、ハプテンと結合することができ （ｃ）、かつ決定中のハプテンの免疫化学的反応と競争
    または干渉しない （ｄ）ことにより特徴づけられるパッドと、その塗膜に
    結合している決定すべきタイプのハプテンから本質的に
    構成されるテストパッドを その上に有するディップスティックと、 Ｂ、所定量の酵素でラベル化された決定すべきハプテン
    の抗体と、 Ｃ、抗ハプテン抗体がラベル化されたのと同じ酵素でラ
    ベル化された参照カップリングペアの他方の部材の所定
    量とを備える、 溶液中でハプテンを決定するためのキット。
12. （１２）（ａ）固体支持体表面と、 （ｂ）その固体表面と結合した蛋白質の塗膜と、 （ｃ）その蛋白質の表面と共有結合した決定されるべき
    ハプテンの層とを備える、 ハプテンを決定するための装置。