JPS63240798A - 抗ヒト癌モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗ヒト癌モノクローナル抗体、その製造法並び
にこれを利用したヒト癌診断薬に関する。

〔従来の技術］ １９７５年、ケーラーとミルスタイン（Ｋ′６ｈｌｅｒ
、Ｇ。

ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，）は、マウスミエロー
マＰ、にの誘導変異株であるＰｓＸｓ＋５−Ａｇ３　（
ＨＧＰＲＴ　欠ｔＡ　２’Ｊｉ、　）と、抗ヒツジ赤血
球マウス抗体産生細胞よりハイブリドーマを作製し、こ
のハイブリドーマが自律増殖性と抗ヒツジ赤血球マウス
抗体産生能を共に有していることを報告した。１９７９
年Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　らは、悪性ａ瘍に対するモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを作製し、モノ
クローナル抗体の試薬としての有用性を示すと共に治療
薬としての可能性を示唆して以来、特に腫瘍関連抗原に
対するモノクローナル抗体については、この技法が注目
を浴びている。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、ヒト癌には極めて多くの種類があること
から、その抗原性もまた多様であり、特定の癌抗原に対
して特異的に反応するモノクローナル抗体を創製するこ
とは、特定の癌抗原を検出することすなわちヒト癌診断
において極めて重要である。

〔問題点を解決するための手段〕

斯かる実状において本発明者らは、ヒト肺腺癌由来細胞
株を用い、細胞融合により該細胞株に特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを得、このハイブ
リドーマを利用すればヒト肺腺癌由来細胞株に特異的な
モノクローナル抗体が得られること、さらに該モノクロ
ーナル抗体の標識体を利用すればヒト癌診断が極めて的
確かつ容易になることを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はヒト肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）
を特異的に認識する抗ヒト癌モノクローナル抗体および
その製造法並びに酵素若しくは放射性同位元素で標識さ
れたヒト肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）を特異的に認識
する抗ヒト癌モノクローナル抗体を含有するヒト癌診断
薬を提供するものである。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒト肺腺癌由来細胞株
（ＰＣ−９）で免疫した動物から採取した抗体産生細胞
と骨髄腫細胞の細胞融合によって作製したハイブリドー
マを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹
水中に蓄積せしめ、該培養物又は腹水から採取すること
により製造される。

本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
は、いわゆる細胞融合によって製造される。すなわち、
抗原としてヒト肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）を用いて
免疫した動物から抗体産生細胞を調製し、これを骨髄腫
細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを選択的に増
１ｆｉさせ、該ハイブリドーマから抗体産生バイブリド
ーマを検索し、クローニングにより目的とするモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを得る。

抗体産生細胞としては、例えばヒト肺腺癌由来細胞株（
ＰＣニー９）又はこれから得られる抗原を免疫させた動
物から得られるＨ’ｊｌＶａ細胞、リンパ節細胞、Ｂ−
リンパ球が挙げられる。免疫させる動物としてはマウス
、ラット、ウサギ、ヤギ、馬などが挙げられる。免疫は
、例えばヒト肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）をそのまま
動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に約１０７個相当分
／回を月１〜２回、２〜４ケ月間投与することにより行
われる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日
後先後免疫動物分取することにより行われる。

骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のも
のが使用できる。抗体産生細胞と骨ａｍ細胞とは同種動
物由来であることが好ましい。

細胞融合は、例えばケーラーとミルスタインの方法（Ｋ
Ｍｈｌｅｒ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｔｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，、
Ｎａｔｕｒｅ。

廊、４９５　（１９７５）　）又はこれに準する方法に
よって行われる。すなわち、ＲＰＭ１１６４０培地など
の培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを混合すること
により行われる。このときポリエチレングリコール等の
融合促進剤を添加することが好ましい。

細胞融合終了後、ＲＰＭ１１１ｉ４０培地等で適当に希
釈し、遠心分離し、沈漬をＨＡＴ培地等の選択培地に懸
濁し、培養することによりハイブリドーマを選択する。

次いで培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイ
ブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニング
を行い、本発明モノクローナル抗体を産生ずるバイブリ
ドーマを得る。

斯くして得られた抗体産生ハイブリドーマを利用して本
発明モノクローナル抗体を製造するには、該ハイブリド
ーマが本発明モノクローナル抗体産生能を有しているの
で、これを適当な培地上又は生体内で培養し、該培養物
から採取することによって行われる。就中、大量に製造
するには、該ハイプリドーマを骨Ｍ［［細胞の由来細胞
と同種の動物の腹腔内に投与し、その腹水中に本発明モ
ノクローナル抗体を蓄積せしめ、該腹水から採取する方
法が好ましい。抗体産生ハイブリドーマの投与に先だっ
てブリステン等の鉱物油を投与するのが好ましい。

培養物又は腹水からの本発明モノクローナル抗体の採取
は、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン
交換体もしくはプロティンＡカラムによるクロマトグラ
フィーによって実施される。

斯くして得られる本発明モノクローナル抗体は、これを
産生ずるハイブリドーマの種類により１３０−２２およ
び１４５−９の二種類存在する。これらのモノクローナ
ル抗体は、いずれもグロブリンクラスがＩｇＧ、であり
、抗原であるＰＣ−９細胞に特異的に反応し、他の癌細
胞および白血球とは反応しない。またＰＣ−９細胞に対
する結合親和定数は１３０−２２が１４５−９より高い
。さらに本発明モノクローナル抗体は、正常ヒト組織と
は反応せず、肺腺癌組織および卵巣癌組織とのみ反応し
、他の癌組織とも反応しない。

本発明モノクローナル抗体は、肺腺癌由来細胞と特異的
に反応するので、これを酵素、放射性同位元素、蛍光物
質で標識すれば癌診断薬として利用できる。

標識に用いられる酵素としては、パーオキシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙
げられ、放射性同位元素としては、＋２Ｊ、　＋３１１
．１１１１１．９９ｍ７ｃ、＋２Ｊ等が挙げられる。こ
れらの標識物質による本発明モノクローナル抗体の標識
は常法に従って行われる。

本発明癌診断薬を用いて癌を診断するには、インビトロ
の方法として、本発明モノクローナル抗体標識体を利用
した種々の免疫測定法、例えば競合法やサンドイツチ法
による凝集反応や凝集阻止反応により抗原を定量または
定性することができる。ここで、免疫測定法の実施にあ
たっては、ポリスチレンビーズ等の担体に抗体を固定化
した固相化抗体を利用し、免疫反応を該固相化抗体上で
行わせることもできる。次にインビボの方法として、本
発明モノクローナル抗体に１２３１．１３１工、！１１
１ｎ、９９＋ｓ７Ｃ等の放射性同位元素を標識して、肺
癌や卵巣癌等の患者に投与すると、本発明モノクローナ
ル抗体標識体は患者の癌組織に集積する。そこで、患者
の外部よりシンチカメラ等で、放射線を計測することに
より癌の位置や大きさを撮像することができる。

このように、本発明モノクローナル抗体標識体は、イン
ビトロおよびインビボの方法により癌の診断が可能とな
る。

（発明の効果〕 本発明モノクローナル抗体は肺腺癌細胞膜に存在する糖
蛋白に特異的と考えられ、肺腺癌を認識し、かつ正常組
織由来培養細胞、白血球、赤血球及び正常組織とは反応
せず、癌特異な表面抗原を認識するものと推測される。

従って本発明癌診断薬を使用することにより、癌の早期
発見が可能になるとともに、癌の進行、治癒経過を的確
に把握することができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

実施例１．ハイブリドーマの作製 ヒト肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）をそのままＢａ１ｂ
／Ｃマウスの腹腔内に投与した。免疫はヒト肺腺癌由来
細胞株（ＰＣ−９）約１０７個相当分／回を月１回、２
ケ月間投与、最終免疫の３日後に肺臓を摘出し、肺臓細
胞浮遊液を調製した。融合の親細胞として、マウス骨髄
腫細胞（ＮＳ−１）を培養して準備した。

上記で調製したマウス肺臓細胞を１０：１の割合で混合
し１，３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。

得られた沈漬を５０％ポリエチレングリコール（４，０
００）を含むＲＰＭ１１６４０培地１　　ｍｊ２に浮遊
させ、１分間放置した。次いで、ＲＰＭ１１６４０培地
１０　ｍｌを徐々に加えて希釈後、９００ｒｐｍで３分
間遠心した。次いで、得られた細胞を）ＩＡＴ培地５０
ｍｆｌに懸濁し、０．１ｍｕずつを９６ウエルの組織培
養プレートに分注した。この状態で１週間培養すると、
９０〜９５％程度の穴にコロニーが認められた。ある程
度コロニーが生育したのちに（１０〜１３日後）培養上
清を用いて、抗体価を酵素抗体法により測定し、適切な
ウェルから限界希釈法により、求めるハイブリドーマの
クローニングを行った。

実施例２．モノクローナル抗体の精製および特異性の検
討 Ｂａ１ｂ／ｃマウスの腹腔内にブリステン０．５ｍｊ２
を投与し、７日後にハイブリドーマ１０７個を腹腔内に
原種、１０日から１４日後に腹水を得た。腹水はさらに
既知のプロティンＡセファロースカラムおよび硫安分画
法を利用してモノクローナル抗体を精製した。

得られた精製モノクローナル抗体のクラス、サブクラス
をオフタロニー法により検討した結果、１３０−２２．
１４５−９　ともマウスＩｇＧ、であることが判明した
。

モノクローナル抗体の特異性の確認は癌細胞を固定化し
た系および手術で患者より得られた癌組織標本を用い、
市販のキット（モノクローナルスクリーニングシステム
、ニューイングランドニュークリア社製、米国）を利用
した酵素抗体法により行った。すなわち、表１に示す１
１ｆｆｆｉ類の癌細胞株およびヒト末梢白血球を９６ウ
エルのプレートに固定化して反応性を検討した。

結果を表１に示す。

以下余白 表１．モノクローナル抗体の特異性 ヒト肺腺癌　　　　ＰＣ−９＋　　　　＋ヒト肺腺癌　
　　　Ｒｕｗｅｌｌｅｒ−−ヒト肺腺癌　　　　ＰＣ−
３−− ヒト肺偏平上皮癌　ＡＯＩ　　　　　−−ヒト胃癌　　
　　　Ｋａｔｏ　−ＩＩＩ　　　−−ヒト大腸癌　　　
　Ｌｏｖｏ　　　　　−−ヒト前立腺癌　　　ＰＣ−３
（ＡＴ（ｆｌ：）　　−−ヒト腎癌　　　　　ＲＣＣ−
ＪＡ　　　　−一ヒト子宮頚癌　　　Ｈｅ１ａ　　　　
　−−ヒト悪性黒色腫　　Ｍｌ　　　　　　−−ヒト膀
胱癌　　　　Ｔ−２４−− ヒト末梢白血球　　　　　　　　−− その結果、抗体１３０−２２．１４５−９はともに抗原
であるＰに−９細胞とのみ反応し、他のヒト癌細胞、白
血球とは反応しなかった。

本発明のモノクローナル抗体と正常組織、癌組織標本と
の反応性は、既知のＡＢＣ法（ベクタスティン■ＡＢＣ
キット）により免疫組織染色により検討した。癌組織と
の反応性についての結果を表２に示す。

表２．酵素抗体法によるモノクローナル抗体とヒト癌組
織との反応 肺癌 腺　　癌　　　　　　　　　　　２／２扁平上皮癌　　
　　　０１５ 胃　　癌　　　　　　　　　　　　　　　０／１犬腸癌
　　　　　　　　０／１ 乳　　癌　　　　　　　　　　　　　０／１卵巣癌　　
　　　　　　１／１ その結果、患者より得られた正常の胃、腸、肺、腎臓、
肝臓、膵臓、膵臓、卵巣組織や胃癌、大腸癌、乳癌組織
とは反応しなかった。しかし、肺腺癌、卵巣癌組織は強
く染色された。

実施例３．放射性同位元素で標識した抗体を用いる血清
中抗原濃度の測定 実施例２で示した酵素抗体法による検討と同じ（、放射
性ヨード（１−１２５）で標識したモノクローナル抗体
も抗原であるＰＣニー９細胞に結合する。その結合は非
標識抗体の添加で阻害され、スキャチャード解析ではｌ
−１２５標識１３０−２２抗体の方が１４５−９のそれ
よりも結合親和定数が高い。１３０−２２とＰＣ−９細
胞の結合親和定数は１．２　Ｘ　１０９Ｍ−’だった。

モノクローナル抗体と反応する抗原濃度の定量的な測定
は以下のサンドインチ法により行った。

まず検体１００μ℃と抗体を固相化したポリスチレンビ
ーズおよびｌ−１２５標識した抗体２００μ℃を室温に
て２０〜２４時間反応せしめた、洗浄を繰り返した後、
ポリスチレンビーズに結合した放射活性をガンマカウン
ターで計測した。

ｌ−１２５標識１３０−２２抗体をトレーサーとし、１
３０−２２をビーズに固相化したアッセイ、及びＴ−１
２５標識した抗体と１４　ｊ−９固相化抗体を用いるア
ッセイの２つの測定方法により、ＰＣ−９細胞培養上清
中の抗原濃度、患者血清中の抗原濃度を測定することが
できる。

ＰＣ−９細胞培養上清中の抗原濃度を測定した結果を第
１図に示した。Ｐ（ニー９細胞を過増殖させた培養液ｌ
　　ｖａｆＬ中の抗原濃度を３，０００４位として希釈
し、上記のサンドイツチ法により測定したところＰＣ−
９細胞培養液には大量の抗原が分泌されていることが認
められた。さらに各種悪性腫瘍患者、正常人より得られ
た血清を用いて血清中の抗原濃度を測定したところ、正
常人の血液中には抗原はほとんど検出されないが、卵巣
癌、膵臓癌患者血清中にも高い濃度の抗原が検出された
。結果を第２図に示した。

実施例４．肺癌細胞（ＰＣ−９）移植ヌードマウスにお
ける放射性同位元素で標識した抗 体の体内分布 肺癌細胞（Ｐｆｌニー９）をヌードマウスに移植し、腫
瘍が適当な大きさになるまで飼った後、実施例３で使用
したｌ−１２５標識１３０−２２抗体１μＣｉ（５ｐｅ
ｃ　５　ｍｃｉ／ｍｇ）に非標識抗体を加えて、抗体量
がマウス−匹あたり２０μｇになるようにした液０．２
ｍｊ２を肺癌細胞（Ｐｆｌニー９）移植ヌードマウスに
尾静脈より投与した。

４８時間後、肺癌細胞（ＰＣ−９）移植ヌードマウスを
層殺し、解剖して各臓器の放射活性をガンマ−カウンタ
ーで計測した。

その結果を表３に示した。＋′Ｉ標識抗体は他の臓器よ
りも腫瘍に最も集積しており、肺癌や卵巣癌の診断に応
用出来る。

表３．肺癌細胞ＰＣ−９を移植したヌードマウスに１２
５１標識１３０−２２抗体を投与した際の体内分布（静
脈内投与後４８時間）血　　液　　　　　　　　　　１
．２３〜１．８３肝　　臓　　　　　　　　　　０．６
５〜０．７８腎　　臓　　　　　　　　　　０．４７〜
０．６３腸　　　　　　　０．１〜０．１１ 胃　　　　　　　　　　　　　０．１５〜０．１６肺　
　　　　　　　　　　０．５３〜０，９３筋　　肉　　
　　　　　　　０．１５〜０．２０骨　　　　　　　　
　　　０．１６〜０．２５腫　瘍　　　　　　１．１８
〜１．９６注入薬量％／ｇ

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイ
ンチ法により測定したＰＣ−９細胞過増殖培養液中の抗
原濃度を示すグラフである。 第２図は本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイ
ンチ法により測定した健常人、悪性腫瘍患者血清中の抗
原濃度を示すグラフである。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）を特異的に認識
   する抗ヒト癌モノクローナル抗体。 ２、免疫グロブリンクラスがＩｇＧである特許請求の範
   囲第１項記載の抗ヒト癌モノクローナル抗体。 ３、ヒト肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）で免疫した動物
   から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合によ
   り作製したハイブリドーマが産生するものである特許請
   求の範囲第１項記載の抗ヒト癌モノクローナル抗体。 ４、ヒト肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）で免疫した動物
   から採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞の細胞融合によ
   り作製したハイブリドーマを培養し、培養物よりヒト肺
   腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）を特異的に認識する抗ヒト
   癌モノクローナル抗体を採取することを特徴とするヒト
   肺腺癌由来細胞株（ＰＣ−９）を特異的に認識する抗ヒ
   ト癌モノクローナル抗体の製造法。 ５、酵素若しくは放射性同位元素で標識されたヒト肺腺
   癌由来細胞株（ＰＣ−９）を特異的に認識する抗ヒト癌
   モノクローナル抗体を含有するヒト癌診断薬。