JPS63237790A - ＯｍｐＡシグナルペプチドを用いたヒトス−パ−オキシドデイスムタ−ゼ及びグラム陰性細菌による細胞外分泌生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野コ この発明は、非分泌性細胞内在蛋白質またはポリペプチ
ド、特に好ましくは一般式［Ｉ］で表わされるヒトスー
パーオキシドディスムターゼ（以下ｈ−８ＯＤという）
の製造方法及びこれに用いられる新規遺伝子に関する。 Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｘｚ　−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｓｎ
−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−
Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｇ−Ｖａｌ−丁
ｒｐ−ＧＩｙ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｌｙｓ−ＧＩｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｇ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−１１ｉｓ−Ｖａｌ−旧ｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉ
ｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−９ｅｒ−Ａｒｇ
−Ｌｙｓ−旧ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−＾
５ｐ−３ｅｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｇ−Ｘ、　−１１ｅ−１１ｅ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
旧ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｇ−＾１ａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌａ
ｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｌａ−
Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｇ　Ｉｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｒｇ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ＋−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−１１ｅ
−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ　　　　　　　　［
■］（ただし式中、Ｌ及び×３は同−又は異なってそれ
ぞれ１つのアミノ酸を示す、） ［従来の技術］ スーパーオキシドディスムターゼ（以下ＳＯＤという）
は、１９６９年フリートピッチとマツコード等によりキ
サンチンオキシダーゼの研究において、その中間生成物
のスーパーオキシドを分解する非分泌性細胞内在性の酵
素として、最初に見出された化合物であり、種々の手段
、例えば加熱処理（特公昭４５−３９８３２号）、同４
９−４８７２１号、杉浦ら、ジャーナル・オブ・ファー
マコピオー・ダイナミックス（Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｄ
ｙｎ、）ｊ、　ｐｐ、２３５−２４４゜（１９８１）等
）、硫安塩析及び有機溶媒を用いる沈殿法（特開昭５７
−１５５９９１号）、ステラフェン・ニー・ジーら、バ
イオキミカ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｉｃａ　Ａｃｔａ）、世
、　ｐｐ、　２７６−２８：１（１９７２））　、ゲル
ろ過クロマトグラフィー（特開昭５６−１０２７８７号
）等の方法により精製される。このＳＯＤは、生体の酸
素毒性防御機構という観点から注目され、現在は抗炎症
剤として、慢性関節リウマチ変形性関節症、放射線照射
による副作用、ある種の泌尿器疾患等の治療に用いられ
ており、特にウシ肝臓からのＳＯＤが臨床的に利用され
ている。 また最近、ヒト−赤血球Ｃｕ−４ｎ−ＳＯＤのアミノ酸
配列が報告され（ヤブシュウら（Ｊａｂｕｓｃｈ　ｅｔ
ａｌ）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）、！９゜２３１Ｇ−２：１１６　（１９８０）　、及
びバラら（Ｂａｒｒａ　ｅｔ　ａｌ）、フェデレーシン
・オブ・ユーロビアン・バイオケミカル・サイエンティ
スト・レターズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ）、１２０．
５３−５５（１９８Ｇ））　、さらにまた、ｈ−９ＯＤ
の遺伝子の塩基配列の報告があり（ジャーマンら（Ｓｈ
ｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・サイエンス・オブーＵＳ　Ａ　
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ）、８０゜５４６５−５４６９（１９８３））、ｈ
−ＳＯＤの遺伝子操作による大腸菌での発現、酵母での
発現も報告されている（＃開閉６０−１３７２８６号公
報）。 ＳＯＤを、特に抗炎症剤として、又は他の医療目的のた
めに臨床的に使用するためには、生理的に許容されるＳ
ＯＤが安定に供給されることが必要である。また１人体
に対してＳＯＤを生体内で使用するためには、予想され
る免疫的な問題からＳＯＤがｈ−ｓｏｏあるいは少なく
とも免疫的に許容される範囲のｈｓＯＤ類似ポリペプチ
ドで、しかも均質な酵素であることが要求される。 ［従来技術の欠点］ しかしながら、ｈ−ｓｏｏをヒトから分離するのは安定
供給の面から問題があった。また、安定供給の観点から
遺伝子工学的手法によりｈ−ｓｏｏを製造する方法が好
ましいが、以下の問題点がある。 すなわち、遺伝子工学的に非分泌性細胞内在蛋白質また
はポリペプチドであるｈ−ＳＯＤを製造する場合の宿主
としては種々利用されているが、グラム陰性細菌、例え
ばエシェリヒア属に属する大腸菌（エシェリヒア・°コ
リー）を利用した場合、非分泌性細胞内在蛋白質または
ポリペプチドである異種蛋白質はその菌体内に産生され
、１１ｔ積されることから、菌体内蛋白質分解酵素によ
り産生された異種蛋白質が分解され、その収率の低下を
もたらし、さらに異種蛋白質の菌体内からの精製回収に
おいても菌体の細胞賀蛋白賀との共存から十分な精製過
程が必要であった。ざらにｈ−ＳＯＤのほかに、γ−グ
ルタミルトランスフェラーゼ、グルタメイト・オキザロ
アセテート・トランスフェラーゼ、グルタメイト・ピル
ベート・トランスフェラーゼなどの非分泌性細胞内在蛋
白質またはペプチドの遺伝子工学的手法による製造の場
合も同様の問題があった。 ［発明か解決しようとする問題点］ この発明の目的は、産生されたこれらの非分泌性細胞内
在蛋白質また゛はポリペプチド、例えばｈ−５ＯＤが細
胞質内の蛋白質分解酵素によって分解をされることが少
なく３がつ、精製回収が容易な、遺伝子工学的手法によ
るｈ−ＳＯＤの製造方法及びそれに用いられる新規遺伝
子を提供することである。 ［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、非分泌性細胞内在蛋
白質またはポリペプチドであるｈ−ｓｏ。 のＮ東側にＯｍｐＡ（ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　
ＰｒｏｔｅｉｎＡ）のシグナルペプチド、すなわち、Ｎ
東側がらＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−丁ｈｒ−Ａｌａ−Ｉ
　１ｅ−Ａｌａ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｐｈｅ−Ａ　１ａ−Ｔｈｒ
−Ｖａ　Ｉ　−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｎ−屓ａで示されるポ
リペプチドか結合されたものを発現させることにより、
非分泌性細胞内在蛋白質またはポリペプチドであるｈ−
ＳＯＤを細胞質膜外のペリプラズム空間に蓄積させるこ
とに成功し、この発明を完成した。 すなわち、この発明は、非分泌性細胞内在蛋白質または
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしてなるＤＮＡ配
列の上流に０ｉｐＡシグナルペプチドのＤＮＡ配列を結
合する遺伝子、その蛋白質またはポリペプチドの製造方
法、およびベクターを提供するもので、好ましくは、下
記一般式［Ｉ］で表わされるアミノ酸配列又はその同等
物をコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝子を提供する
。 １ｉ１ｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−１１ｅ
−＾１ａ−＋１ｅ−Ａｌａ−ＶａｌＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−″Ａｌａ−丁ｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｘａ　　−Ｖａｌ、−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｇ！ｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−ＧＩｎ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−ＧＩｙ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−１
１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ
−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＧＩｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−
Ｔｈｒ−Ａｌａ−ＧＩｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｔ（ｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｇｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｇｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ａｒｇ−Ｈｊｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−１
，ｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖ
ａｌ−８ｅｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｖａ
ｌ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
−１１ｉｓ−Ｌ　−１１ｅ−１１ｃｍＧｌｙ−Ａｒｇ−
Ｔｌｉｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｉｌｌｉｓ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−＾ｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−８ｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ”　　　　　　　　　　［Ｉ］（ただし式中、×２
及びＸ、は同−又は異るそれぞれ１つのアミノ酸を示す
。） さらにまた、この発明は、上記一般式［Ｉ１で表わされ
るアミノ酸配列又はその同等物をコードするＤＮＡを含
むグラム陰性細菌を培養し、該アミノ酸配列又はその同
等物を発現し、式［Ｉ１の＊から口の部分を有するポリ
ペプチドを細胞質外に分泌せしめ、これを採］枳するこ
とから成るｈ−ｓｏ。 の製造方法を提供する。 ［発明の効果］ この発明の方法によると、細胞質内で産生された非分泌
性細胞内在蛋白質またはポリペプチド、例えばｈ−８Ｏ
Ｄと０ｉｐＡシグナルペプチドとの結合物が細胞質膜を
通過し、　ｈ−ＳＯＤが細胞質外のペリプラズム空間に
蓄積される。従って、産生されたｈ−ｓｏｏが細胞質内
の蛋白質分解酵素によりほとんど分解されないので従来
法に比べて収率が高くなる。また、ペリプラズム空間は
細胞質内よりも蛋白質の量及び種類がはるかに少ないの
て、ｈ−ｓｏｏの精製が従来法よりもはるかに容易にな
る。 ［発明の詳細な説明コ 上記一般式［Ｉ）の＊から哀ｔまでて示されるｈ−ＳＯ
Ｄ又はその誘導体をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
は、例えばプロシーディング・オツ・ナショナル・アカ
デミ−・サイエンス・オブ・’ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　８０
．５４５５−５４６９　（１９８：ｌ）　、特開昭６０
−１３７２８６号公報、若しくは特願昭６１−１９１２
３５号記載のように遺伝子ライブラリーから、又は遺伝
子操作における周知の技術により得ることができる。遺
伝子操作における周知の技術とは遺伝子操作に関する多
数の文献、例えば （１）高木康敬編著　遺伝子操作マニュアル　講談社 （２）高木康敬編　遺伝子操作実験法　　講談社（３）
ティー、マニアチスら（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ
　ａｌ）モレキュラー・クローニング・コールド・スプ
リング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）ラボラトリ−刊（米国） （４）レイ・ウーら（Ｒａｙ　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ）、メ
ソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｎｏｌｏｇｙ）１０１、アカデミツク・
プレス刊（米国）等の実験書に従って実施すればよい。 例えば、ヒト肝臓からｈ−９ＯＤ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの分
子クローニングを行ない肝臓ｃＤＮＡライブラリーを得
、この肝臓ｃＤＮＡライブラリーにより宿主微生物を形
質転換し、得られた形質転換体についてコロニーパイプ
リダイゼーション法を用いてクローンの選択を行ない、
ｈ−ｓｏｏをコードしているプラスミドを得、このｈ−
ｓｏｏをコードしている領域を発現ベクターに組み込め
ばよい。 ｈ−ＳＯＤをコードするＤＮＡとしてはこのようにして
得られる天然型のものを用いることができることは言う
までもない、しかしながら、一般に生理活性を有する蛋
白質において、その生理活性を示す構造は一通りに特定
されるのではなく、実質上同一の生理活性を示すために
ある範囲の構造的相違が許容されることは当業者により
広く認識されているところである。従って、　ｈ−ＳＯ
Ｄの誘導体であって、天然型ｈ−ＳＯＤの構造か部分的
に変形されたもの、例えば一部のアミノ酸が他のアミノ
酸に置き換えられ、一部のアミノ酸が除去され、又は一
部のアミノ酸が付加された蛋白質でなおｈ−ＳＯＤの活
性を有するアミノ酸配列（特許請求の範囲では同等物と
呼んでいる）をコードするＤＮＡもこの発明において用
いることができる。 例えば、天然型ｈ−ｓｏｏの一部のアミノ酸が他のアミ
ノ酸に置換された誘導体をコードするＤＮＡは、例えば
エクスベリメンタル・マニピユレーション・オブ・ジー
ン・エクスプレジョン（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍ
ａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ）、　２９１−３０３　（１９８３）アカデミ
ツク・プレス刊）に記載された部位特異的変異方法によ
り得ることかできる。すなわち、　ｈ−ｓｏｏを含む閉
環構造のプラスミドを開環し、エキソヌクレアーゼ■を
作用させ、変異させたい部分のＤＮＡを一本鎖の状態と
する０次いで変異点を有した合成ヌクレオチドをこの一
部一本鎖のプラスミドにアニールさせ、ｄＮＴＰ存在下
でＤＮＡポリメラーゼ及びＴ、ＤＡＮリガーゼを作用さ
せ、合成ヌクレオチドをプラスミド中に結合させればよ
い、この変異法に用いられる合成ヌクレオチドとしては
１例えば下記第１表の種々のものが挙げられ、これを用
いて、対応するプラスミドが得られる。後述の参考例に
おいては、このようにして天然型ｈ−ＳＯＤのＡｌａか
ら数えて１１１位のＸｚ−Ｃｙｓ（ＴＧＣ）が５ｅｒ（
ＴＣＣ）に置換されたＤＮＡを有するプラスミドｐｓＯ
Ｄ１４が得られた。 さらに、上記部位特異的変異法の他に文献記載の他の方
法も適用することができる（Ｐｒｏｃ。 Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８１．
４００８　（＋９８４）；　Ｎｕｃｌ。 ＾ｃｉｄ、　Ｒｅｓ、、　１０．６４８７（１９８２）
）　。 また１例えばＡｌａから数えて６位のＸ、＝Ｃｙｓを他
のアミノ酸に変換するには、遺伝子操作の慣用技術に従
い、ｈ−ｓｏｏ遺伝子断片を単離し１次いで６位Ｃｙｓ
をコードしたＴＧＣの下流の適宜な位置を制限酵素にて
切断し、さらにＴＧＣに代わるアミノ酸をコードしたコ
ドンを有する合成ヌクレオチド、例えばＳｅｒのコドン
ＴＣＣを有する５゛−ＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧ
Ｇ−３’を付加させればよい、後述の参考例においては
、上記ｐｓＯＤＩ４を出発材料として用いて上記方法を
行ない、ｈ−ｓｏｏの６位及び１１１位のＣｙｓがいず
れもＳｅｒに置換されたｈ−ｓｏｏを産生するＤＮＡが
得られた。 ６位及び１１１位のアミノ酸が置換した誘導体はいずれ
もｈ−ＳＯＤ活性を有しており、この発明に用いること
ができる。これらの誘導体のうち、好ましいものとして
×２が中性アミノ酸１例えばＣｙｓ　、　Ｓｅｒ、Ａｌ
ａ又はＴｈｒであり、島が中性アミノ酸、例えばＳｅｒ
、Ａｌａ、Ｔｈｒであるものを挙げることができる。 次にこの発明の遺伝子を得るためには、天然型ｈ−ｓｏ
ｏ又はその誘導体のＮ末端のＮｅｔが除去されたものに
ＯｍｐＡのシグナルベブチトが結合されたポリペプチド
をコードするＤＮＡをつくる必要がある。これは種々の
方法により行なうことができる９例えば、ｈ−ＳＯＤ又
はその誘導体をコードする遺伝子を有するプラスミドか
ら該遺伝子を包含するＤＮＡｌｌｌｆ片を切り出し、次
にｈ−ｓｏＤ又はその誘導体の構造遺伝子中に切断部位
を有する適当な制限酵素（ｈ−ＳＯＤのＮ末端から２１
番目のＰｈｅと２２＃目のＧｌｕをコードするＤＮＡの
一部分によりＴａｑ　１部位が形成されているので、　
Ｔａｑ＋を好ましく用いることができる）で処理して該
構造遺伝子を切断し、切断されたＤＮＡの上流に切断に
より欠失した構造遺伝子部分からＮ末端のｌ１ｌｅｔコ
ドンを除去したものにＯｍｐＡシグナルベブチトをコー
ドするＤＮＡが結合された化学合成りＮＡ断片を結合し
、これを適当なベクターに組み込むことができる。また
、Ｏ■ｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡはこの
ように化学合成したものを用いることもできるが、これ
を含むプラスミドが入手可能であるので、このようなプ
ラスミド由来のものを用いることもできる。このような
プラスミドとして例えばｐＩＮ−１１（ＩｐｐＰ−５）
−ｏｍｐＡ−Ｎａｅｌ　にューヨーク州立大学ストーニ
ュープルツク校、弁上すみ子博士より分与）を挙げるこ
とができる。このプラスミドは、０鳳ｐ＾シグナルベブ
チトのＣ末端のＡｌａ対応コドンの直後にＮａｅｌの平
滑末端部位を有するので、Ｎａｅ　Ｉで切断した下流に
、ｈ−ＳＯＤ又はその誘導体のＮ末端のＭｅｔ対応コド
ンを除去したｈ−ＳＯＤ又はその誘導体の構造遺伝子を
結合することができる。この構造遺伝子は、上記と同様
、ｈ−ＳＯＤ又はその誘導体をコードする遺伝子を有す
るプラスミドから該遺伝子を包含するＤＮＡ断片を切り
出し１次にｈ−８ＯＤ又はその誘導体の構造遺伝子中に
切断部位を有する例えば上記Ｔａｑ　Ｅのような適当な
制限酵素で処理して該構造遺伝子を切断し、切断された
ＤＮＡの上流に切断により欠失した構造遺伝子部分から
Ｎ末端のＩｇｅｔコドンを除去した化学合成りＮＡを結
合することによりて得ることができる。後述の実施例で
は後者の方法を採用している。 また、このようにして得られる０■ｐＡシグナルペプチ
ド−ｈ−ＳＯＤ構造遺伝子の全部を含むＤＮＡ断片を適
当な制限酵素で切り出し、他の所望の発現ベクターに組
み込むことも可能であることは言うまでもない。 このような発現ベクターとしては、グラム陰性細菌１例
えば大腸菌で用いられる広範囲の種類のベクターを使用
することができ、プラスミド及びウィルスから必要に応
じて誘導することができる。ベクターは、クローニング
及び／又は発現のために機能するものであり、ベクター
に関しては多くの文献が存在し、また、多くのベクター
は市販されている。これらのベクターは通常、選択を可
能にするマーカーを含有し、このマーカーとしては細胞
毒耐性、栄養要求性などがあり、しばしば異なる特性を
もたらす多数のマーカーを１ベクター中に有し、転写開
始及び停止の前制御シグナルを有する。 次いで、このようにして得られた一般式［Ｉ１で示され
るアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するプラスミ
ドベクターは、常法に従つてグラム陰性細菌１例えば大
腸菌３８２２１　、　Ｗ６２０ｒｅｃＡ又はＤＨｌ等に
取り込ませることにより形質転換体を得ることができる
。 一般式［Ｉ１で表わされるｈ−８ＯＤ又はその誘導体を
形質転換体に産生させるための培地としては、このよう
な目的に用いられる公知の培地が挙げられるが、銅及び
／又は亜鉛イオンを含むものが好ましい。 一般式［Ｉｒｌで表わされるｈ−ＳＯＤ又はその誘導体
は、形質転換体を上記培地中、公知の方法、例えば通気
攪拌培養、振盪培養、回転培養、静置培養等により、３
０〜４２℃、好ましくは３７℃付近で３時間〜４８時間
、培養することにより得られる。一般式［Ｉｌｌで表わ
されるｈ−ＳＯＤ又はその誘導体は細胞質の外に産生さ
れるもので、細胞培養物が高濃度に達した時に、遠心分
離により細胞を分離し、細胞外膜を除去し、そして公知
の種々の方法１例えば抽出、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、
透析又はこれらの組合せによりｈ−８００又はその誘導
体を分離精製する。 なお１本発明方法によれば、まず一般式

【■】で表わさ
れる銅及び／又は亜鉛を配位しないもの及びこれらを配
位し、２（一般式［Ｉｌｌのポリペプチド）・Ｙ、Ｃｕ
”・Ｙ、Ｚｎ”　　（式中、　Ｙｔ及びＹ、はそれぞれ
Ｏから４の整数を示し、ＹＩ＋Ｙｔは０から４である）
で表わされる二量体、好ましくはＹｌ及びＹ、がともに
２であるもの又はＹ、が４でＹオが０であるものが得ら
れ、さらに、このような二量体から常法により一般式［
Ｉ１で表わされる単量体が得られる。 後述の実施例で明らかになるように、この発明の方法に
よると、ｈ−ｓｏｏ又はその誘導体は、細胞質の外、特
にペリプラズム空間に産生される。 後述の実施例でＩＪＩらかになるように、ペリプラズム
空間中の他の蛋白質は細胞質内よりもはるかに少ないの
で、この発明の方法により生産されるｈ−８ＯＤ又はそ
の誘導体は、従来法に比較して容易にかつ高い純度で精
製することができる。また、産生されたｈ−ＳＯＤ又は
その誘導体は細胞質内の蛋白質分解酵素の作用を受けな
いので、収率が高くなる。さらにこのｈ−ＳＯＤの代り
に、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、グルタメイト
・オギザロアセテート・トランスアミナーゼやグルタメ
イト・ピルベート・トランスアミナーゼなどの非分泌性
細胞内在蛋白質またはポリペプチドについても、同様の
技術を用いることにより容易になし得るものである。 次に参考例及び実施例を挙げ、本発明を説明するか、本
発明はこれらに限定されるものではない。 参考例１ ｈ−ＳＯＤポリ（Ａ）ゝＲＮＡの調整：（ｉ）ヒト正常
肝組織５ｇを２５ｍ！の４Ｍグアニジンイソチオシアネ
ート中でホモジナイズしたのち６０℃に保ち、等量のフ
ェノールを加え一様に攪拌した。１８ゲージの太さの注
射針を１０回通してＤＮＡを切断し粘度を下げ、１２．
５　ｍｌの０．１Ｍ酢酸ソーダ、１０ＩＩＭトリスー塩
酸（ｐＨ７，４）及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡ混合溶液と２
５１１のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：
１）とを加えた。 ６０℃で１０分間攪拌してから氷冷し。 １０．０００ｒｐｍ　ｌ　０分間の遠心で水層を分取し
た。この水層に等量のクロロホルム−フェノールを加え
６０℃で１０分間攪拌し、水冷した。　１０，０００ｒ
ｐｍｌＯ分間の遠心で水層をとり、等量のクロロホルム
−イソアミルアルコールで２回フェノールを抽出除去し
たのち、２倍量の工・タノールを加え。 −２０℃で２時間放置した。　１０，０００ｒｐ謹３０
分の遠心で沈殿物を集め、これを２５１の０．１Ｍ）−
リス−塩酸（ｐＨ７，４）　、　５０ｍＭ　　Ｎ、ＣＩ
、ｌｏｍＭＥＤＴＡ　Ｏ，２％５ＤＳ（ナトリウムｌく
デシルスルフェート）、５ｍｇプロテイネースＫ（プロ
テアーゼ；メルク社製）で溶解し、３７°Ｃて１．５時
間保温した。６０℃に温度を上げて、フェノール１２．
５ｍｌ及びクロロホルム−イソアミルアルコール１２．
５ｍｌを加え、６０℃で１０分間攪拌したのち氷冷し、
１０．０００ｒｐｍ　１０分の遠心で水層を分取した。 この水層を再びフェノール処理し、クロロホルム抽出を
２回行ない、２倍容のエタノールを加えて遠心し、沈殿
を集め、減圧乾燥した。この様にして４．０４Ｈの粗１
１ＮＡを得た。 （ｉｉ）　　この沈殿を５ｍｌの滅菌水で溶解後６５℃
で５分間保温し、急冷して５１の４０ｍＭ）−リス−塩
酸（ｐＨ７，６）、　１．ロ　Ｍ　　ＮａＣｌ　　、　
　２ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　Ｏ，２％ＳＤＳを加えた。こ
の溶液全量を２０ＩＩＭトリスー塩酸（ｐＨ７，６）、
０．５　Ｍ　ＮａＣｌ、　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び（１
，１％　ＳＯ３で平衡化した０、２ｇのオリゴ（ｄＴ）
−七ルロース（コラボラテイブ社製）カラムを通過させ
吸着させた。１０ｍ１の同じ溶液で洗浄したのちまず５
１の２０＋ａＭ）−リス−塩酸（ｐＨ７，６）、１３Ｍ
Ｍａｉ１．　１　ｍｌ！ｌ　ＥＤＴＡ及び０．１＄　Ｓ
ＤＳの溶液でポリ（Ａ）　”ＲＮＡ以外のＲＮＡを溶出
させた。次に１０ｍＭトリス−塩Ｗ＃　（ｐ）Ｉ　７．
５）、１　　ｍＭ　ＥＤＴＡ及びＱ、０５％Ｓ［ｌＳ　
（７）溶液でポリ（Ａ）”ＲＮＡを溶出させ、１ｍｌ毎
の分画を行ない、　ＯＤ、、。値を測定してＮｏ、　２
〜Ｎｏ、８の分画をポリ（Ａ）４ＲＮＡ画分とした。こ
の両分に’／、、量の２．５Ｍ酢酸ソーダ及び２倍容の
エタノールを加え、−２０℃で一晩放置し、２５，００
口「９１２０分の遠心で沈殿を集め減圧乾燥した。この
様にして１１４．４弘１ｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡを得た
。 参考例２ ｃＤＮＡ合成とクローニング： （ｉ）ｃＤＮＡの合成とクローニングは岡山−ベルブ（
Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　）法［Ｍｏ１．　Ｃｅ１１
．　Ｂｉｏｌ、２　。 １５１（１９８２）　ｌに従い行なった。参考例１で得
たポリ（Ａ）　”ＲＮＡ（１１４，４島ｇ）を１００．
１の水に溶解し、その４湊１をマイクロチューブに移し
減圧乾燥した。これを１０μｍの５層間トリスー塩酸（
ｐｌ＋８．３）で溶解し、６５°Ｃで５分間加熱した。 ３７℃に移したのち、２０ｇ＋の５０１Ｍトリス−塩酸
（ｐＨ８，：ｌ）　、　８　ｍＭ　ＭｇＣＩｇ、　３０
　ｍＭ　ＫＣＩ、０．３ｇＭジチオスレイトール及び２
■閘のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰの等量混合物）、１０ＪＬＣｉ［α−３”Ｐ］ｄＣ
ＴＰ。 １．４　ルｇのベクターブライマーＤ　Ｎ　Ａ　（ＰＬ
−バイオケミカル社製）と５　ｕｎｉｔの逆転写酵素（
ライフサイエンス社製）を加え３７℃２０分間反応させ
た。２井１の０．２５Ｍ　ＥＤＴＡと１＃Ｌ＋の１０％
ＳＤＳを加えて反応を停止させ、次いで２０ル１のフェ
ノール−クロロホルムで処理し、遠心により分取した水
層に等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと８０絡ｌのエタノー
ルを加え、−７０℃で１５分間放置した。　Ｉｓ、００
０ｒｐｍ　１０分の遠心沈殿物を１０ｐｌのｌＯＩＩＭ
　トリス−塩酸（ｐＨ８，０）−１鳳−ＥＤＴＡ混Ｗ１
（以下ＴＥと略すことがある）に溶かし、再びエタノー
ル沈殿をくり返し、５０ＩＬ！の７５％エタノールで１
回洗浄後減圧乾燥した。これを１５ＪＬｇの１４０園Ｍ
カコジール酸ソーダ。 ３０ｍＭト！７スー塩ｍ　（ｐｌ＋　６．８）、１　ｍ
Ｍ　ＧＯＣＩｔ　　及び０．１　ｍｌジチオスレイトー
ル、０．２　、ｇポリＡ（シクマ社製）、１０　ｕ［ｉ
［ａ−３２Ｐ］　ｄｃＴＰ”ｔ’溶解し、３７℃で保温
しながら１８ｕｎｉｔのターミナルトランスフェラーゼ
（乱−バイオケミカル社製）を加え、３７℃で２０分間
反応させ、フェノール−クロロホルム処理、エタノール
沈殿、エタノール洗す、乾燥を行なワたのち減圧乾燥し
た。これを１０１Ｌ＋の５０ｌｓＭ　　ＮａＣ１，１ｈ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１ｇ　　及びｌｓＭｍｌジチオスレイトール解し、２
．５　ｕｎｉｔの旧ｎｄｍ（全酒造社製）を加えて３７
℃て１時間保温した。クロロホルム−フェノール処理、
エタノール沈殿、エタノール洗浄、乾燥を行なったのち
、沈殿を１０１ＬｌのＴＨに溶かし、３４１のエタノー
ルを加えて一２０℃に保存した。この溶液１ｐｌに７ｍ
ｇのオリゴｄＧ付加リンカ−ＤＮＡ（乱−バイオケミカ
ル社製）を１０μｍの丁Ｅ　（ｐＨ７，５）、０．１Ｍ
ＮａＣ１で溶解したものを加え、６５℃で５分、４２℃
で３０分保温したのち０℃に冷やした０次Ｃ２０ｍＭト
リＸ　　’！１ｍ　（ｐＨ７，５）、４　ｍＭ　ＭｇＣ
Ｉｇ、１　０　ｍＭ　　（ＮＩ＋４）２ＳＯ４，Ｏ，Ｉ
Ｍ　　ＫＣＩ、０．１ｍＭ／３−ＮＡＤ、５０　ＪＬｇ
　／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ　、　０．６　ｇｇ　Ｅ、ｃｏｌ
ｉＤＮＡリガーゼ（ＰＬ−バイオケミカル社製）を加え
全量を１００Ｐ＋とし１２℃−晩装置した。これに１Ｉ
Ｌｌの４會ＭｄＮＴＰ、１終１の１５■閾β−ＮＡＤ、
ｌ　＃ｌのＥ、　ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ（０，
４μｇ　；　ＰＬ−バイオケミカル社製）、１μｇのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ　（０，３μｇ；乱−バイオケミカ
ル社製）、１ｇｌのＥ、　ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅＨ（１
ｕｎｉｔ　；　ＰＬ−バイオケミカル社製）を加え、１
２°Ｃ１時間、次いで２５℃１時間保温した。 （ｉｉ）　１００ｍ１の８１１１培地（ディフコ社製：
牛脳と牛心臓の抽出物含有培Ｊ′Ｉ！りで培養した。対
数増殖期の大腸菌ＤＨ１［ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉａ＋、　）
　１６６．５５７（＋９８３）；ジェネテイック・スト
ックセンター、エール大学医学部より分与を受けた大腸
菌（ストック番号ＣＧＳＣ５ｔｒａｉｎ　６０４０月を
集菌し、４０＋ｓｌの氷冷した３０１Ｍ酢酸カリウム、
　＋００　ｍＭ　ＲｂＣ１，１０ｍＭ　ＣａＣＩｇ、　
　５０　ｍＭ　ＭｎＣ１，及び１５％グリセリン（ｐＨ
ｓ、ａ）で懸濁したのち、０℃で５分間放置後遠心集菌
シ、　サラニ４ｍｌノ１０ｇＭ　ＭＯＰＳ　Ｉｓ衝液（
トータイ社製）　、　７５ｍＭ　Ｃａ１ｌｓ、１０　ｍ
Ｍ　ＲｈＣｌ及び１５％グリセリン（ｐ）！　６．５）
に懸濁し、０°Ｃで１５分間放置してコンピテント細胞
とした。 （ｉｉｉ）この大腸菌懸濁液２００ルｌに（ｉ）で調整
したＤＮＡ溶液２０ル１を加え、３０分間０℃て放置し
た。４２℃９０秒間熱処理し、ＬＢ　（Ｌｕｒｉａ−Ｂ
ｅｒｔａｎｉ　）媒地（バクトドリブトンＬｏｇ、バク
トイ−ストエキス５　ｇ、　ＮａＣ１１０ｇ、水１１、
（ｐＨ７，５）　８００　ル１を加え、３７℃９０分間
保温した。この１００ｇ１をアンピシリン５０ＩＬｇ／
−１を含んだＬＢ寒天プレートにまき、−晩培養して形
質転換体を得た。 参考例３ ｈ−ＳＯＤクローンのスクリーニングニー夜培養して得
られた形質転換体についてコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法を用いてｈ−ＳＯＤ遺仏子のクローンの選択を行
なった。ＬＢ寒天上に生育したコロニーをニトロセルロ
ース膜上に移した後、この膜のコロニーの付着した面を
上にして、クロラムフェニコール（］００ｐｇ／重００
Ｐ含んだ寒天培地上にのせ、３７℃−晩培養し、菌体中
のプラスミドを増巾させた。この膜を０．５ＮＮａＯｔ
ｌで５分、１Ｍ）リス−塩酸（ｐ）Ｉ　７．４）で３分
、０．５Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）　−１，５ＭＮ
ａＣ１で５分処理した後、８０℃で３時間乾燥した０次
にこの膜をビニール袋に入れ、３０−１の３倍濃度ＳＳ
Ｃ（Ｎａ（？Ｉ　２６．２８ｇ、クエン酸ナトリウム１
３．２３　ｇ、水１ｆＬ）、０．１％ＳＤＳを用い。 ６０℃で１５分間洗節処理を行なった。この処理をさら
に２回くり返した。洗浄処理終了後この膜を５０４ｇ／
ｍｌサケＤＮＡを含んだ３倍濃度５ＳＣ１１０倍デンハ
ルト液（フィコール５０ｇ、ポリビニルピロリドン５０
ｇ、牛血清アルブミン５０ｇ、水５００膳１）、０．１
％ビロリン酸ナトリウムにひたし、６０℃で一夜放置し
た。Ｈを３０ｍ１の４倍ＳＳＣ（ＮａＣ１３５，０４ｇ
　、クエン酸ナトリウム１７．６４ｇ、水１文）、１０
倍デンハルト液、０．１％ビロリン酸ソーダで２回洗浄
した後、５゛端を３２Ｐでラベルした合成ヌクレオチド
（１０’　　ｃｐｓ／　　ｇｇ　　）−５’　　ＡＴＧ
ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣ３′−（この合成ヌクレオチ
ドはｈ−ｓｏ。 のＮ末５アミノ酸部分（Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｙ
ｓ、Ａｌａ）をコードする塩基配列である）をプローブ
として４３°Ｃで一晩ハイブリダイズさせた。その後、
４倍ＳＳＣ，１０倍デンハルト液、０．１％ＳＤ３て室
温１５分２回洗浄したのち、乾燥し、オートラジオグラ
フィーを行なった。この様にしてコロニーを検索した結
果、ｈ−ＳＯＤ遺伝子を有するクローンを得、これを９
ＳＯＤ１と命名した。 参考例４ ｈ−ＳＯＤ遺伝子の塩基配列決定： ｐｓＯＤ］　Ｄ　Ｎ　Ａをリゾチーム−３ＤＳ法とセシ
ウムクロライド−エチジウムブロマイド法［マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｇ）ら：モレキュラー・クローニング
８６〜９４、コールドスプリングハーバ−１（１’１８
２）］により大量に調製した後、制限酵素Ｐｓｔ１．Ｐ
ｖｕ！Ｉ（宝酒造（株）製）を用い、ｈ−ＳＯＤ遺伝子
を含んだ約７００　ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。こ
の断片について制限酵素７ｔｈ［ＨＳＩ、５ｔｕｌ、Ｈ
４ｎｆｌ、Ｒｓａｌ、Ｆｏｋｌ、５ａｕ３Ａ［、（以上
宝酒造（株）製）Ｆｎｕ４！（Ｉ（ＮＥＢ）を用いて切
１ｆｒｊｉ図を作成した。これを第２図に示す、この制
限酵素地図をもとにマクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法［ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙ寵ｏ１．
５５．４４９　（１９７９）］を用いてｈ−ＳＯＤポリ
ペプチドのコード領域の塩基配列を決定した。この結果
を第３図に示す、得られた塩基配列からｈ−５ＯＤ遺伝
子は１５４のアミノ酸をコードしていることが判明した
。 参考例５ ｈ−ＳＯＤの大腸菌内での発現： （１）参考例４で得られたｈ−ＳＯＤ遺伝子の塩基配列
をもとに、大腸菌用の発現ベクターであるｐＩＮ−１−
Ａ２（特Ｂｌｌ昭５７−１４０８００号に記載のｐＫＥ
＋１０３９と同一物、　Ｅ＆ｌＢＯ，Ｊ、旦　７７１−
７７５．１９８２．ニューヨーク州立大より入手、４．
９　Ｋｂｐ　Ａｍｐ’　）ノＥｃｏＲＩ、Ｂａ■旧サイ
トを用い、ｈ−ｓｏｏの大腸菌内での発現を試みた。　
Ｐｇｔｌ−Ｐｖｕｌｌ　７００　ｂｐのＤＮＡ断片を含
んだ溶液２ル１、（０，１ルｇ）に１Ｍトリス−塩酸（
ｐＨ８，（］）　２延１　、０．Ｉ　Ｍ　ＭｇＣＩｚ　
２．４牌１、ｌ　Ｍ　　ＮａＣ＋　２１Ｌｌ、０．３Ｍ
ジチオスレイトール０．８ｐｌ　、５ｄ　　ｄＮＴＰ２
ｇｌ　、３　　ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝
酒造（株）製）及び水を加え全量５０ト１とした。３７
°ＣＬＯ分の反応後、フェノールクロロホルム処理、エ
タノール沈殿を行ない、洗浄後減圧乾燥した。これを７
０終１の水で溶解し、１Ｍ）−リス−塩酸（ｐｌ＋７．
６）　６．５井１．０．１Ｍ　Ｍｇ（：＋よ　１０ｇ１
．ｌｃ１＠Ｉ＋ＩＡＴＰｌＯＪＬＩ　、０．３　Ｍジチ
オスレイトール１．５ｐ＋、５°ゾリン化Ｂａｇ旧リン
カー（ＣＧＧＡＴＣＣＧ　（宝酒造）１疼ｇ／浜１）１
湊ｌ、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ２　ｕｎｉｔを加え、２２℃
−夜装置し、フェノール−クロロホルム処理した。これ
をＢａｇ旧　（宝酒造（株）製）で消化後、バクチリア
ルアルカリ性ホスファターゼ０．６　ｕｎｉｔ　（以下
ｒＢＡＰＪと略す、；宝酒造（株）製）処理したクロー
ニングベクターｐＡＣＹＣ１８４［ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー、１３４．１１４１（１９７Ｂ）；Ａ
ＴＣＣ３７０３：ｌ］Ｄ　ＮＡ　１　ｇｇを含んだ水溶
液７０ｋｌで溶解した。１０倍のライゲーションバッフ
ァー（０，５Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ７，４）、０．１
　Ｍ　ＭｇＣ１ｔ。 ０．１　Ｍジチオスレイトール、１０Ｍスペルミジン、
ｌＯ■ＭＡＴＰ）ＩＯＪＬＩ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１
　　ｕｎｉｔを加え、全量を水でｔｏｏｇ＋として４℃
で一晩放置した。フェノール−クロロホルム処理、エタ
ノール沈殿洗浄、減圧乾燥後ｌＯル１の丁Ｅ　（ｐＨ８
，０）に溶解した。得られたＤＮＡを用い、参考例２の
（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に準じて大腸菌ＤＩｌ＋を形質
転換した。得られた形質転換体中からＳＯＤ遺伝子を含
んだＤＮＡ断片をＢａ■旧消化で切り出すことのできる
プラスミドを得、これをｐｓＯＤｓと命名した。 （ｉｉ）　　大ｉ調製したｐｓＯＤｓ　ＤＮＡ　　１５
０ルｌ　（１００μｇと１０倍のＢａｍ旧切断用バッフ
ァー（１００１Ｍトリス−塩酸（ｐＨａ、ｏ）、７０１
踵關ｇｃ１．．　　ＬＭＮａＣｌ、ｌｏ＊Ｍジチオスレ
イトール）１８１Ｌ！及びＢａｍＨＩ　８０　　ｕｎｉ
ｔに水を加えてｔａｏｇ＋とじ、３７℃で３時間消化し
た。０．７％アガロースゲル電気泳動により、約７００
　ｂｐのＤＮＡ断片を含んだゲルを切り出し、ゲル中よ
りＤＮＡを抽出後フェノールークロロホルム処理で精製
し、エタノール沈殿洗浄後、減圧乾燥した。これを４４
ｇ１のＴＥ（ｐＨ８，０）に溶解した。１０倍の７ｔｈ
ＨＢ８１切断用バツフアー（１００■Ｍトリス−塩酸（
ｐｏ　７．５）、１００　ｍ１ｌｌ　ＭｇＣＩｔ、ＬＭ
　ＮａＣ１、１０ｍＭジチオスレイトール６ルＩ　、　
ＴｔｈＨＢ８Ｔ　　（宝酒造（株）製）１０　ＪＬ　Ｉ
（８０ｕｎｉｔ）を加え、３７℃３時間氷解し、０．７
％アガロースゲル電気泳動により約６００ｂｐのＤＮＡ
断片を分離し、上述の方法で精製後。 １００ｇ１の水に溶解した。このＤＮＡ断片は、両端上
ＴｔｈＨＢ８ＩとＢａｍＨＩの粘着末端を有し、７ｔｈ
）１８８１側にＳＯＤポリペプチドの２２番目のアミノ
酸であるグルタミン酸以下のアミノ酸をコードする塩基
配列が含まれていた。 （ｉｉｉ）別にｈ−ＳＯＤ発現のために下の１２木のヌ
クレオチドを化学的に合成した。 ５’ＡＡＴＴＣＴＧＡＴＡＡＧ　　　　　３’ＧＡＧＧ
ＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧ ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＧ ＴＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧ ＣＧＡＣＧＧＣＣＣＡＧＴＧＣ ＡＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴ ＧＡＣＣＴＣＣＴＴＡＴＣＡＧ ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴ ＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴ ＧＣＣＧＴＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧ ＣＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧ これらの合成ヌクレオチド１ｇｌ（ＩＪＬｇ）に１０倍
濃度のリンカ−カイネースバッファ（０，７Ｍトリス−
塩酸（ｐＨ７，６）　、　０．１　ＭＭｇＣＩ、５０１
Ｍジチオスレイト−Ｊし）５ＩＬｌ、５０ｓｉｌＡＴＰ
１ｐ＋、水３１ｐ＋、ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造（株）製）　Ｉｇｌ　（１０ｕｎｉｔ　）を加え、３
７℃で１時間、８５℃で１０分保温後徐冷した。この反
応液２５ｐｌに１０倍のライゲーシミンバッファ１０ｐ
１．水６４　ｕ　Ｉ　、　Ｔ４ＤＮＡリガーゼｌ　ＪＬ
Ｉ　（２Ｊ　　ｕｎｉｔ、宝酒造（株）製）を加え、４
℃で一晩放置した。その後フェノール−クロロホルム処
理し、水層を分取した。 （ｉｖ）　　また、これとは別にｐＩＮ−１−Ａ２ベク
ター３ｐｌ　　（２ルｇ）、ｔｏ倍Ｂａ■旧切断用バッ
ファａｐｌ　　、　　ＥｃｏＲｌ　　ｌ　　ＪＬ　＋　
　　（２０ｕｎｉｔ　　）、　　Ｂａｇ旧２Ｂ１　　（
１６ｕｎｉｔ　）及び水２１４１の混合液を３７℃で２
時間保温したのち、ＩＭ）−リス−塩酸（ｐＨ８，０）
５ル１、水６０　ＪＬＩ　、　ＲＡＰ　５　ＪＬｌ　（
０，６ｕｎｉｔ）を加え、さらに３７℃１時間保温した
。その後、フェノール−クロロホルム処理をして水層を
分取した。 （Ｖ）このようにして調製したＴｔｈＨＢ８１−Ｂａ鳳
旧−ｈ−ＳＯＤ遺伝子をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ
断片溶液、合成ヌクレチトを結合した溶液、　ｐＩＮ−
Ｔ−Ａ２ベクター溶液の各１０ｔＬ＋を混合し、３Ｍ酢
酸ソーダ３＃Ｌｌ、エタノール６６終■を加えて一７０
℃で１５分間放置後遠心により沈殿を集めた。減圧乾燥
後、水８９ＩＬｌ及び１０倍ライゲーションバッファ１
ｏｐｌで溶解し１Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７ｚ＋（２，８
ｕｎｉｔ　；宝酒造（株）製）を加え、４℃で一夜放置
した。フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿
、洗浄、乾０！後、１０弘１のＴＥ（ｐＨ１１，［ｌ）
に溶解し、前述の方法でコンピテント化した大腸菌ＤＨ
Ｉを形質転換した。形質転換体を５０ｇｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含んだＬＢ培地にまき、３７℃で一夜培養し
た。このようにして得られたｈ−ＳＯＤ発現クローンを
ｐｓｏｏａと命名した８以上の工程を第４図に示す。 ｈ−ｓｏｏに対する抗体を用いたＥＩＡによる測定の結
果、　ｐｓＯＤ６を保持した大ｍ菌［Ｉ１１１はＢＨＩ
培墳−晩培養で２　ｐ−ｇ　／ｍｌ　（培養液）のｈ−
ＳＯＤを産生じた。 参考例６ ｈ−ＳＯＤのＣｙｓ（］、１．１）のＳｅ「への変換：
部位特異的変異法はプラスクーイノウニ（Ｖｌａｓｕｋ
、Ｉｎｏｕｙｅ　）の方法　【エクスヘリメンタル・マ
ニピユレーション・オブ・シーン・エクスプレッション
（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏ
ｎ　ｏｆＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　）　、　２
！］］　〜３Ｑ３、アカデミツクプレス、　１９８３］
に従った。 （ｉ　）　ｈ−５ＯＤ遺伝子を含んだプラスミドの１つ
であるｐｓＯＤ６　　（５，６ｋｂ、　Ａｐ　）の閉環
構造（ｃｃ）ＤＮＡ５ルｇをＳＯＤル１の５０ｍ１４ト
ソスー塩酸（ｐＨ７，５）、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、
＋００　＋ｉＭ　ＮａＣｌ、　０．１５Ｂ／ｍｌ　　Ｅ
ｔＢｒで溶解し、遮光状態で２００　　ｕｎｉｔのＢ　
ａ　ｍ　ＩＩ　１　（宝酒造（株）製）を加え、３７°
Ｃ９０分保温した。１０μｌの０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ　
（ｐＨ８，０）と　ＳＯＤ．１のフェノール−クロロホ
ルムを加え混合し、遠心により水層を分取し、３０ル１
の３Ｍ＃酸ソーダ、　６６０１のエタノールを加え、−
７０℃で１０分放置し、遠心で沈殿を集め、減圧乾固し
た。これを４０牌１の５６　ｍ１ｌｌ　トリス−塩酸（
ｐＨ８，０）　、０．６６　ｍｂｌ　　ＭｇＣ１ｚ、１
０ｍＭジチオスレイトールに溶解し、　　５０　　ｕｎ
ｉｔのエキソヌクｌ／アーゼＩＩｒ（ＰＬ−バイオケミ
カル）を加え、３７℃で９０分保温した。２延１の０．
５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を加え、フェノール−
クロロホルム処理後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し
、減圧乾固した。これを５０ｇ１のＺＯＯｍＭＮａ［：
Ｉ、１３ｍＭトソスー塩酸（ｐＨ７，６）　、　　９ｚ
Ｍ　ＭｇＣｌ２及び１０ｍＭジチオスレイトールに溶解
し■液とした。別に合成ヌクレオチド５’　ＡＧＡＣＣ
ＡＴＴＣＣＡＴＣＡＴＴＧ　　３’　　（９？ＦＦ目の
Ｃが本来のｈ−ｓｏひ遺伝子てはＧとなっている）ｌＪ
ＬｇをＩＯＰ＋の５０■繭トリス−塩酸（ｐｌ＋　７．
６）　、　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ□、５ｚＭジチオスレ
イトール、０．１　ｍＭスペルミジン、０．１　ｍＭＥ
ＤＴＡ及び、５謹Ｍ　　ＡＴＰに溶解し、これにＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株）製）３．２　　
ｕｎｉｔを加え、３７℃１時間反応させたものを■液と
した。■液５０＃Ｌｌと■液５ル１を混合し、１００℃
で３分間加熱し、急冷の後４℃で２時間放置した。Ｓ■
ＭｄＮＴＰ７勝１，５０ｍＭＡＴＰ２鉢１２丁、ＤＮＡ
ポリメラーゼ（宝酒造（株）製）　３　ｇ！　　（６ｕ
ｎｉｔ）　、　Ｔ、ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）
３ルｌ　　（４，２１１）、水３０ル１を加え、　１２
．５℃で一夜放置後、フェノール処理し、エタノール沈
殿によりＤＮＡを回収し、減圧乾固した。このＤＮＡを
ＴＥ（ｐＨ８，０）　１０ルｌに溶解後、大腸菌Ｄ）＋
１を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体を得た
。 （１１）この形質転換体について、５゛端を３″Ｐでラ
ベルした合成ヌクレオチド−ＡＧＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴ
ＣＡＴＴＧ−（１０’　ｃｐｓ１ｇｇ　）をプローブと
してコロニーパイプリダイゼイシ（ン法を用いてハイブ
リダイズするクローンを選択した。この様にして得られ
たクローンを、５ＯＤＩ４と命名した。　ｐｓＯＤ１４
Ｄ　Ｎ　Ａについて前述同様にＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅ
ｒｔ法を用いて塩基配列を調べ、　Ｃｙｓをコードして
いたＴＧＣがＳｅｒのコードであるＴＣＣに変化してい
ることを確認した。プラスミドｐｓＯＤ１．４ＤＮＡの
塩基配列を第１０図に示す。 （ｉｉｉ）前記の方法て得られたｐｓＯＤ＋４を保有す
る大５ｉ３１　ＤＨＩをＢＨｒ培地（ｐＨ７，４±０．
２）テ３７℃、−晩回転培養した。培養終了後培養液を
１．ｓ、０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、集菌した。 （ｉｖ）　　得られた菌体からの組み変えｈ−９ＯＤの
精製はフリードビッヒ（１，Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ　）ら
の方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔｓ、）　２４４　　
（２２）、５０４９−６０５５、（＋９６９）］の方法
に準じておこなった。 すなわち、菌体２００　ｇ　？：　ｌ　ａＭ　ＣｕＳＯ
４，１ｍＭＺｎＳＯ，、５０ｍＭサッカロースを含む５
ｏＩＩＭトリスー塩酸バッファー（ｐＨ７，６）　６０
０　ｍｌに懸濁した後、ブランソン社製セルデイスラビ
ュータ　９００で３０分間超音波処理を行なって、細胞
を破砕した。破砕液に０．７５容量のクロロホルム−エ
タノール混液（３：５　）を加え、４°Ｃ’１？　１５
分間攪拌し、遠心分離にて、沈殿物を除いた。上澄液に
ＳＯＤｇ／ｌになるようにリン酸二カリウムを溶かし、
エタノール層を塩出させた（約５００　ｍｌ　）、エタ
ノール層を集め、−２０℃で３０分間冷却し、析出した
沈殿物を遠心分離にて除き、上澄をエバポレーターにて
減圧濃縮した（約ＳＯＤ　ｍｌ　）、濃縮液は、５０−
Ｍサッカロースを含む２５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ
７，８）で平衡化した、セファデックスＧ−２５ゲル（
ファルマシア社製）カラム（４，５ｘ６０ｃｍ）を用い
たゲルろ過により同バッファーに置換した。これに、Ｄ
Ｅ５２（ワットマン社製）１０ｇを加え、４°Ｃ１３０
分間攪拌し、不純物を吸着させ、グラスフィルターでろ
過した。ろ液は、５０ｍＭサッカロースを含む２．５　
ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６，５）に対し透析を行な
った後、同バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−セファロ
ーズＣＬ−６Ｂゲル（ファルマシア社製）カラム（１，
６ｘ２０ｃｍ）に流入し、組み変えｈ−ＳＯＤを吸着さ
せた。カラムを同バッファーで洗浄し、リン酸バッファ
ー濃度を２．５　ｍＭから５０ｍＭまで直線的に上昇さ
せ、組み変えｈ−ＳＯＤを溶出した。Ｓ００活性は２つ
のピークに別れた為それぞれ別々にプールし凍結乾燥し
た。２つの活性画分のうち先に溶出したものの凍結乾燥
粉末を１０ｍ１の蒸留水に溶解し、５０ｍＭサッカロー
スを含むｌＯｍＭ）−リスー塩酸バッフｙ−（ｐＨ７，
０）で平衡化したセファデックスＧ−１００（ファルマ
シア社製）カラム（４，５ｘ　　８０ｃｍ）に流入させ
、ゲルろ過積製を行なった０以上の手法により得られた
組み変えｈ−ＳＯＤは前述のフリートビッヒらの方法で
活性な測定すると、ＳＯＤ１ｇ＋ｇあたり、ＳＯＤ０〜
３６００単掻を示し、ヒト赤血球より精製されたｈ−ｓ
ｏｎと比活性や物理化学的な性質において同等またはそ
れ以上てあった。 なお、この組み変えｈ−ＳＯＤは、式（ＩＩ）において
Ｘ３が水素原子、×２がＣｙｓ　、　Ｘ、がＳｅｒで表
わされ、Ｙ、及びＹ２か２であることを確認した（　　
ＥＩＡ法及び原子吸光法により測定した）。 （Ｖ）　ｐｓＯＤ１４を保有する大腸菌ＤＨＩのＢＨＩ
培地による菌培養液１１より、菌体を遠心分離にて集め
、上澄液を除いた後、この菌体にｌ　ｍｌ　Ｃｕ５Ｏ，
，１１Ｍ２ｎＳＯ，，５０ｍ１Ａす・ンカロースを含む
５０ｍＭ）リスー塩酸バッファー（ｐＨ７，６）　　１
ｍｌを加えた。水冷下にて、５分間超音波処理（トミー
社製。 １１ａｎｄｙ　５ｏｎｉｃ　ＵＲ−２０Ｐ使用）を行な
い、菌体を破砕した。あらかじめ、２０ｍＭ）リス−グ
リシンバッファー（ｐＨ８，４５）に平衡化した、アガ
ロースゲルフィルム（コーニング社製、ユニバーサル）
試料溝に、破砕液ＩＩＬＩを滴下した。２０ｍＭ）すＸ
　　’ｊ　！Ｊ　シ：／ハッ７７−　（ｐＨ８，４５）
中”？？２５０Ｖ２０分間電気泳動を行なった後、０．
１■鯖リボフラヒ゛ンを含む５　ｓｇ／膳１ニドロブＪ
レーテトラゾリウム溶液に２分間浸した。水切りを行な
い１％テトラメチルエチレンジアミン溶液に１分間浸し
た後、水切りし、白い背景で、ゲル中のコントラストが
表われるまで、白色光中で発色させた０発色後。 蒸留水にて、未反応の試薬を洗い流し、乾燥させた。こ
の結果、プラスミドｐ！１ｉＯＤ１４を保有する大腸菌
の培養物から得られた組み変えｈ−ＳＯＤ　　（左側；
アミノ酸配列１１１番目がＳｅｒ　）は活性バンドの巾
が狭く、アイソマーを生じにくくなっており、安定てあ
った。これに対し、プラスミドｐｓＯＤ６を保有する大
腸菌から得たｈ−ＳＯＤは活性バンドが広がっており、
多くのアイソマーを生じている。 参考例７ 別に合成したヌクレオチド５°ＧＡＧＡＣＣＡＴＡＣＣ
ＡＴＣＡＴＴ　　３’を用いて、参考例６と同様にして
、ｐＳＯひ３５を得た。また参考例６で得たｐｓＯＤ１
４を材料に合成ヌクレオチド５°ＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣ
ＣＡＴＣＡＴＴ　　３°を用いた実験カ６　ｐｓＯＤ３
６を得り、　ｐｓＯＤ：１５及びｐｓＯＤ３６ノ：Ｔ　
−）’しているｈ−５００は１１１；ｆｆ［ＪのＣｙｓ
がそれぞれＴｈｒあるいは＾１ａに変化したものであり
、ｐｓＯＤ３５及びｐｓＯＤ３６をそれぞれ保有する大
腸菌Ｄ１１！の産生するｈ−ＳＯＤは参考例６と同様い
ずれも蛋白的に安定化されたＳＯＤ活性を示す組み変え
ｈ−ＳＯＤであつた。 なお、上記合成ヌクレオチドに代えて前記第１表に示す
合成ヌクレオチドを用い、同様に実施すれば対応する組
み変えｈ−ＳＯＤを得ることができる。 参考例８ 参考例６で得たｐｓＯＤ１４Ｄ　Ｎ　Ａ　　１００ルｇ
（１００ル１）に工０倍のｌｌａｍ旧切断バッファ（１
００謹菫トリス−塩酸（ｐＨ１！、０）、７０■Ｍ　１
１ｇｃ１．。 ＩＭ　　Ｎａｅｌ　、　　１０ｍ１　　ジチオスレイト
ール）１８　ｐｌ　、　Ｂａ＊ＨＩ　　（宝酒造（株）
製）　ｆ２０　　ｕｎｉｔ（１０終１）及び水５２終１
を加え、３７℃で２時間反応させた後、０．７％アガロ
ースゲル電気泳動により、約７００ｂｐのＤＮＡ切断を
前述と同様の方法で抽出精製、乾燥状態とした。このＤ
ＮＡを４４終ＩのＴＥ　（ｐＨ８，０）に溶解し、１０
倍のＴｔｈ）ＩＢ８１切断用バッファ（１００■緬トリ
ス−塩酸、１００　ｓＭ　Ｍｇ（：Ｉｔ、　　Ｉ　Ｍ　
　ＮａＣ１、ＩＯ＋Ｍジチオスレイトール）６ルｌ及び
ＴｔｈｔＩＢＢｌ　　（宝酒造（株）製）８０　　ｕｎ
ｉｔ　　（１０ｇｔ　）を加え、３７℃で３時間氷解し
、約６００ｂｐのＤＮＡ断片を上述同様に分離、精製後
、１００．ＬＬ＋の水に溶解した。別に参考例５（ｉｉ
＋）で使用した１２本の合成ヌクレオチドのうち、５’
　ＴＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧ　　３’、５’Ｃ
ＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴ　３°の代わりに５°Ｔ
ＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧ　　３’と５’　ＣＡ
ＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴ　　３’　　を用い参考例
５（ｖ）の場合と全く同じ方法でｐｓＯＤ５３を得た。 　Ｉ）ＳＯＤ５：ｌのＩ）ＮＡについて前述同様の方法
で塩基配列を決定したところ６番、ｉｉｉ番のＣｙｓを
コードしていたーＴＧＣ−かいずれも−ＴＣＣ−に変化
していることを確認した。 このｐＳＯＤ５３を保有した大腸菌ＤＨＩから実施例１
と同様にして得られた組み変えｈ−８ＯＤは。 ｐｓＯＤ１４を保有した大腸菌り旧の産生じた組み変え
ｈ−５００と同様、アガロース電気泳動的所見から安定
なものであることを確認した。 塞ｍ 以下にｈ−ＳＯＤ大腸菌分泌発現用プラスミドの作製と
そのプラスミド保持菌による発現例を示す。 （１）分泌発現プラスミドの作製 用いた制限酵素、バクチリアル・アルカリン・フォスフ
ァターゼ（ＲＡＰ）　、　丁、Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ及び
ＤＮＡポリメラーゼクレノー断片はベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ社（ＢＲＬ）　　（米ＩＩ）、二ニー
・イングランド・バイオラボ社（米国）、又は宝酒造株
式会社（京都）製のものを使用した。 プラスミドは以下のものを用いた。 ｐＩＮ−１１（１ｐｐＰ５）−ｏｍｐ＾−Ｎａｅｌ　　
（＝　ｘ　−ヨーク州立大学ストニープルツク絞弁上す
み子博士より分与）ｐｌ１ｌ−１］１１１！−＾２　（
文献　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２゜８１−８５
．１９８４　） 大腸菌としては以下のものを用いた。 Ｗ６２０ｒｅ（＾（ワーツェル・イー・ティーら、Ｊ。 Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　！、　６１−６
９．１９８１）３８２２１　　（タカハラ・エムら、Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。 １９８４．２６０．２６７０−２６７４報告中の１ｐｐ
−，７Ｆ’ロリｑＩａｃ”ｐｒｏ”の遺伝マーカーを持
つＪＡ２２１株と同一） ＤＩｌｌ（本記載、ｐ、３１　） プラスミド作製工程を第１工程から第４工程に分けて説
明する。 第１工程（７ この工程は第２工程に用いるフラグメントＡを調製する
ものである。 第７図中に示された合成オリゴヌクレオチド１から８の
各ｏ、ｓ　＃ＬｇをＡＴＰ２０ＪＬＭ、　３鵞Ｐ−γ−
Ａ　Ｔ　　Ｐ　　　Ｏ，６ｐｍｏｌｅ、　　７０曽Ｍ　
　ＴｒｉｓＪＩＣＩ　　ｐＨ７，５、１０ｍ１ＭｇＣＩ
　ｆｆｉ、５ｍＭジチオスレイトール（［ＩＴＴ）及び
１．４単位のＴ４キナーゼを含む液１０ｐｌ中で別々に
３７℃１時間加温した。さらに１■Ｍ　　ＡＴＰ　１　
％１及び０．７単位Ｔ４キナーゼ（０，５，１）を各容
器に加え１５分間３７℃加温した。一部を取り、５°リ
ン酸化の進行を確認した。残り全てを１つの容器に混合
し、１％ＩのＩＭ　　ＤＴＴ、３棒１の１０ｍ１ＡＴＰ
、１０単位のＴ、Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを加え８９ル！の
総体積、冷蔵中４５時間静置した。 ６５℃、２０分間リガーゼを不活化するために加温した
後、２ルｌの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　（４種のデオキシ
ヌクレオシド５°三リン酸、ｄＡＴＰ。 ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２．５ｍＭ）及び３０
単位のクレノー断片を加え、室温で３０分間静置し、さ
らに２終ｌの２．５ｍＭ　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐを加え２０分
間静置した後−２０℃で凍結した。再び融解したこのも
のをエタノール沈殿処理し、沈殿物を減圧乾固した。 これを５０ｍＭ　Ｔｒｉｇ−ＨＣＩ　ｐｌ（８，０，１
０ｍ１ｌ　ＭｇＣ１ｔ、５０ｍ１ｌ　ＮａＣ１及び４０
単位のＴａｑ　Ｉ制限酵素を含む１００ｅｌの溶液中で
６５℃、６時間消化した。 以上の操作によって第７図に示すフラグメントＡが調製
された。 乳スユ１」Ｊ」」υ− この工程は最初の発現プラスミドであるｐＩＮ−１１（
ＩＩ）ＰＰ−５）−ｏ膳ｐ＾−５ＯＤ５を作製するもの
である。 ０■ｐＡシグナルベプチトのＣ末端コドンであるＧＣＣ
の直後にＮａｅｌの切断点を有するｐＩＮ−１１（Ｉｐ
ｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−Ｎａｅ　ＩプラスミドのＲａｍ
旧、Ｎａｅ　１両酵素消化物のうちの大断片２０ｎｇ、
　ｐｓＯＤ５のＢａ■旧切断によって生じる約７００ｂ
ｐ（塩基対）断片をざらに丁ａｑｌて消化することによ
り生じた約５８０ｂｐのＴａｑｌ−Ｈａｍｌｌｌ断片で
あるフラグメントＢ　２０ｎｇ、及び第１工程で得たフ
ラグメントＡ　８ｔｇを２５ｍＭ　Ｔｒｉｇ−ＨＣＩ　
ｐＨ７，８，１０ｄ　ＭｇＣＩｇ、ｌ■鋪ＤＴＴ％０．
６ｍ１ｌＡＴＰ及び１．２単位のＴ、ＤＮＡリガーゼを
加え、総体積１０終１で１２．５℃、１２時間保温した
。この液を以下、　ｌｉｑ、　５ｔｅｐ２と呼ぶ、　ｌ
ｉｑ、　５ｔｅｐ２で大腸菌Ｗ６２０ｒｅｃ＾を形質転
換した。形質転換は以下のようにして行なった。　１０
０　ｍｌのＬＢ液体培地（ルリアーベルタニ培地、１１
当り１０ｇのバクトートリプトン、５ｇのバクトーイー
ストエクストラクト（以上、ディフコ社製）、５ｇのＮ
ａＣ１を含み、オートクレーブ滅菌したもの）で３７℃
、振盪により十分空気中の酸素の溶存化をはかりつつ大
腸菌Ｈ２０ｒｅｃ＾を対数期中期まで増殖させ（クレッ
ト社濁度計で約１００の値の時点）、滅菌チューブに培
養菌体液を移し、氷中５分間静置し、約ＳＯＤ０ｘｇ、
４℃、１０分間の遠心操作でチューブの底部に菌体を集
めた。上清を廃棄し、５０ｍＭの４℃の滅菌ＣａＣ１，
液２０ｍ１を加え検体を懸濁させ、氷中１５分間静置し
た。この懸濁菌体の入った容器を約ＳＯＤ０　ｘ　ｇ、
４℃、１０分間の遠心操作で再びチューブの底部に菌体
を集めた。上清を廃棄し上記の４℃の滅菌Ｃａ１１．液
を２．５■ｌ加え菌体を懸濁した。この菌体はプラスミ
ドＤＮＡの取り込み能が付与されており、コンピテント
セルと呼ばれる。このコンピテントセル懸濁液５０＃Ｌ
＋に上記１ｉｑ、５ｔｅｐ２５　ｇ　１を加え、これら
の混合液の入った容器を水中、ときどき軽く容器を振盪
しながら１時間保温した。続いて容器を４２℃の恒温槽
中に入れ、２分間層いた。この操作はヒートショックと
呼ばれる。この後、室温（約２５℃）で１０分間静置し
、０．６１のＬＢ液体培地を加え、３７℃、１時間振盪
した。 この菌体懸濁液を１００ｐｌづつ５０ＪＬｇ／會■のア
ンピシリンを含むＬＢ寒天（上記ＬＢ液体培地組成を含
む、オートクレーブ滅菌１．５＄　ｗ／ｖバクトーアガ
−（ディフコ社製）プレート（直径約８ｃｍ）培地上に
加え滅菌スプレッダ−でプレート上に広げた。このプレ
ートを３７°Ｃの恒温箱に静置し、−夜培養した。アン
ピシリン耐性を獲得し、上記プレート上てコロニーを形
成した転換体のうち１８個を無作為に選び、プラスミド
ＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡの調製は以下のよ
うにして行なった。上記１８個の別々のコロニーを５０
ｐｇ／履１のアンピシリンを含むＬＢ液体培地１．５１
に植菌し、３７°Ｃ１−夜振盪培養した′。 この菌体を含む培養液をエツベントルフチューブ（エッ
ペンドルフ社製）に移し、冷蔵筒中（４°Ｃ）の小型遠
心器（工・ンベンドルフ社製）にて１５０００ｒｐ■、
３０秒間遠心し、生じた上清を廃棄し、チューブの底部
に菌体を集めた。この容器に１００．１のりゾチーム液
（２０＄　ｗ／ｖグルコース。 ５０　＋＊ＭＴｒｉｓ−ＩＣＩ（ｐＨ８，０）　、　　
ｌ　ｍＭＥＤＴＡを含む溶液１１当り２ｍｇのチキン・
エラグホワイトリゾチーム（シグマ社製）を溶かした酵
素溶液）を加え、菌体を懸濁し、容器を氷中ｌＯから２
０分間静置した。続いて２００ｇ＋の０．２Ｎ　Ｎａ０
１１、ＩＳ　ＳＤＳ溶液を各容器に加えよく混合し、容
器を氷中５分から１０分間静置した。さらに各容器に１
．５０ＰＩの３Ｍ酢酸ナトリウムｐｌ＋４．８を加えよ
く混合し、容器を氷中２時間静置した。この後、上記冷
蔵筒中の小型遠心機でＩＳＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠心
し、生じた上清をそれぞれ別のエッペンドルフチューブ
に移した。この上清に１ｍｌの無水エタノールを加えよ
く混合し、−７０°Ｃて約１０分間冷却した。この冷却
された上清及びエタノール混合液の入った容器を上記小
型遠心機て１．５００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心し、生じ
た上清を廃棄し４００ｇ１の０．３Ｍ酢酸ナトリウム液
を容器に加え、よく混合することにより、底部に生じて
いた沈殿物を溶解した。さらにこの溶解液に無水エタノ
ール１ｍｌを加え、よく混合した後、この容器を一７０
℃、約１０分間冷却した。再び上記小型遠心機で１．５
０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、生じた上清を廃棄し、
キャピラリーで残存するエタノールを含んだ液体部分を
できるだけ除去した。この容器のふたを開き、バラフィ
ルム（アメリカン・キャン・カンパニー社製）を用いて
月をし、これに画鋲を用いて５〜ｌＯ個の小さな孔を開
けた後、耐圧ビンにこれらのチューブを入れ、チューブ
底部に生じていた沈殿を真空ポンプにより１０分間減圧
乾固した。乾固物にｓｏ、ｉのＴＥを加え、溶解した。 こうしてプラスミドＤＮＡをＴＥ溶解物として得た。こ
のようにして１８クローンからのプラスミドＤＮＡを得
、このうち２クローンが、第６図中のフラグメントＢを
ニックトランスレーションによりｆｆ２ｐラベルしたプ
ローブによるサザンハイプリダイゼーションで陽性と判
明した。このうちの１つがさらに３’ＣＧＣＴＧＣＴＴ
ＣＣＧＧＣＡＣＡＣＧＣＡＣ５’の配列、すなわちｈ−
ＳＯＤ構造遺伝子の第２番目のアミノ酸Ａｌａから第８
番目のアミノ／ｉ＠ＶａｔまでをコードするＤＮＡ配列
に相補的な配列を持つＤＮＡ−ｍローブでのドツトハイ
ブリダイゼーションで陽性と判明した。このプラスミド
のＸｂａ　１部位からｈ−ＳＯＤ構造遺伝子方向へのＤ
ＮＡ配列の確認をマキサム−ギルバート法及びＭ　］、
　３ファージベクターを用いるジデオキシ法を併用して
行ない、さらに同様にしてその３′下流の塩基配列を確
認した。確認された塩基配列を第１図に示す。 さらに他の制限酵素（ｘｂｇｌ、Ｒａｍ旧、５ｔｕｌ（
Ａａｔ■と同じ認識部位を持つ）　、　Ｔａｑ［）切断
断片のゲル上での分析をし、上記の両プローブで陽性で
あったプラスミドをｐＩＮ−ｒＩ　（ｌｐｐＰ−５）”
　ｏｍｐＡ−ＳＯＤ５と命名し、第６図にその概要を示
した。 第３工程（第８図） この工程はＯｍｐＡシグナルペプチド−ｈ−ｓｏｏハイ
ブリッド遺伝子をｐＩＮ−ＩＩｌタイプらｐＩＮ−ＩＩ
Ｉタイプに移すためのものである。　ｐＩＮ−ｒｌタイ
プでは発現抑制のために必要なＩａｃリプレッサーは宿
主大腸菌からのみ供給されるが、ｐＩＮ−ｍタイプでは
ベクター上に１ａｃｌ遺伝子が組み込まれているので発
現抑制がより強く行なわれる。 ｐＩＮ−ｍ　目’−Ａ２のＰｓｔｉとＢａｍｔｌ１両制
限酵素消化により得た約６　ｋｂｐのＰｓｔｉ　Ｂａ■
旧断片であるフラグメントＣ４０ｎｇと、ｐＩＮ−ＩＩ
　（ｌｐｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−ＳＯＤ５のＰｓｔｌと
Ｂａｍｌｌｌ両制限酵素消化により得た約１．８ｋｂの
Ｐｓｔｌ−Ｂａｍ１ｌ＋断片であるフラグメントＤ５ｎ
ｇを１０分の１量の１０倍ライゲーションバッファー（
０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ　ｐＨ７，４、ＬＩＭ　
ＭｇＣｌ２．０．１ＭＤＴＴ、ＩＯ＋ｓＭＸヘルミジン
、１（ＪｍＭＡ　ＴＰ　）と３５（１量位のＴ、ＤＮＡ
リガーゼを含む溶液１０．１中で４℃、３０時間静置し
、この液を用いて大腸菌Ｄ　１１１を形質転換した。 得られたコロニーより５株を液体培養し、プラスミドＤ
ＮＡを抽出し、ＰｓｔｌとＢａ量旧の切断により断片の
大きさを確認したところ全てが同一のゲル上でのパター
ンを示した。そのうちの工つをｐＩＮ−ｍ　（ｌｐｐＰ
−５）−ｏｍｐＡ−９ＯＤ５と命名し、第８図下段にそ
の構造の概要を示した。 第４工程（第９図） この工程はＯｍｐＡシグナＪレベプチトーｈ−８ＯＤハ
イブリツドタンパク質コ一デイング部分のうちの、ｈ−
ＳＯＤ遺伝子の始まりであるＡｌａから数えて１１１番
目のＣｙｓをＳｅｒに変換したものを発現するプラスミ
ドを得るものである。 ｐＩＮ−Ｉｌｌ　（ＩｐｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−ＳＯＤ
５のＡａｔｌと５ａｌｌ両制限酵素切断で生じた約７ｋ
ｂｐのＡａｔｌ−３ａｌｌ断片であるフラグメントＥ　
６０ｎｇと、ｐｓＯＤ１４のＡａｔ　Ｉと５ａ１１の両
制限酵素で生じた約１．５ｋｂｐのＡａｔｌ−３ａｌｌ
　’ＩＲ片であるフラグメントＦ　２０ｎｇを０．５ｐ
ｌの１０倍ライゲーションバッファーと３５０単位のＴ
、ＤＮＡリガーゼを含む溶液５ｇｌ中で１４℃、１５時
間静置し、大腸菌ＤＩ１１に形質転換した。得られたコ
ロニーから３株を選び液体培養し、プラスミドを調製し
た。このプラスミドＤＮＡを制限酵素切断により分析し
、全てが同一のゲル上でのパターンを示すことを確認し
た。そのうちの１つをｐＩＮ−ｍ　（ＩｐｐＰ−５）−
ｏｍｐＡ−ＳＯＤ１４と命名し、その構造の概要を第９
図下段に示した。 （２）　ｈ−ＳＯＤの発現 先ず（１）で作製されたプラスミドのうち。 ｐＩＮ−Ｕ　（ｌｐｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−ＳＯＤ５を
保持した大腸菌５Ｂ２２１によるｈ−ｓａＤの発現例に
７いて述べる。 培地は０．４＄　ｗ／ｖのカザミノ酸（ディフコ社製、
カゼインの加水分解物）　、４ｍｇ／ｍｌのグルコース
、２０終ｇ／ｍｌのトリプトファン、２０川ｇ／−１の
ロイシン、２ｇｇ／■１のチアミン、５０ｐｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＭ９培地（アドバンスト・バクチリ
アル・ジェネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ）　１９８０．　ｐｐ、２０
３−２０４、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ
−）１８■ｌ中で３７℃て一夜培養した、ｐＩＮ−ｔＩ
　（ＩｐｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−８００５を保持した大
腸菌５Ｂ２２１　　（以下、保持国名／プラスミド名の
ように記し、この場合、　５Ｂ２２１／ｐＩＮ−ＩＩ　
（ＩｐＩ）Ｐ−５）−ｏｍｐＡ−ＳＯＤ５と略記する）
を０．５ｍｌ加え、対数期初期になるまで３７℃でゆる
やかな振盪培養を行なった。この時点で半量を別の容器
に移し、このうちの一方に鍛終濃度ｌ■菖になるようＩ
ＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
サイド（ｌａｃプロモーター活性発現誘導剤）を加え、
さらに１６０分間培養を続けた。この時点で２体を遠心
操作で集め、　１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（
ｐｌ＋７．（１）にもとの培養液中の菌体濃度のｌＯ倍
濃度にして、ａ音波破砕機（トミー精工社製へンディ・
ソニック　モデルＵＦＩ−２０Ｐ）で氷冷下、菌体破砕
を行なった。得られた液より３８．５ＪＬＩ培養当量の
全菌体タンパク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動し、クマジーブリリアントブルー染色したパター
ンを第１１図に示す、レーン１がＩＰＴＧを加えなかっ
たもの、レーン２がＩＰＴＧを加えたもの、レーン３が
大腸菌を用いて菌体内発現させたＮ−α−アセチル化を
受けていないｈ−ＳＯＤ精製品０．５７Ｌｇ、レーン４
が分子量マーカー（オリエンタル酵母社製、チトクロム
Ｃオリゴマー混合物）である、明らかに、大腸菌体内で
発現させた非Ｎ−α−アセチル化ｈ−ＳＯＤと同一の泳
動度を示すタンパク寅がＴＰＴＧ誘導により産生されて
いるのがわかる。すなわち、Ｎ末端のＯｍｐＡシグナル
ベプチトが分泌発現にともなって正しく切断されている
ことを示唆するものである。 次にｐＩＮ−Ｉｌｌ　（１ｐｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−！
１ｉＯＤ５又はｐＩＮ−ｍ（ＩＩ）ｐＰ−５）−ｏｍｐ
Ａ−ＳＯＤ１４を発現プラスミドとした例について記載
する。 アンピシリン５０ｐｇ／ｍｌを含むＢＩＩ培地２０ｓｌ
に、同じ培地中で一夜培養したＤＨＩ／ｐＩＮ−ｍ　（
ＩｐｐＰ−５）−ｏｗｐＡ−８００５又はＤｌｌｌ／ｐ
ＩＮ−Ｉ［Ｉ　（１９９Ｐ−５）−ｏｉｐＡ−８ＯＤ１
４を０．２１加え培養を始めた。対数期初期に達した時
点で、培養液を２分し２一方に最終濃度２ｉ＋Ｍになる
ようにＩＰＴＧを加え、さらに６時間培養を続けた。こ
こで遠心操作によって菌体を集め、１０ｍＭリン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ７，０）に培養液より１０倍濃
度の菌体濃度になるように懸濁し、上記と同様に菌体破
砕を行なった。得られた各破砕液を５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動、クマジーブリリアントブルー染
色によりタンパク質の分析を行なった。 この結果を第１２図に示す、第１２図中、レーン１はＤ
ＨＩ／ｐＩＮ−ｍ　（ｌｐｐＰ−５）−ｏｉｐＡ−ＳＯ
Ｄ５のＩＰＴＧ非誘導、レーン２は同ＩＰＴＧ誘導、レ
ーン３はＤＨＩ／ｐＩＮ−ＩＩＩ　（ＩｐｐＰ−５）−
ｏ■ｐ八−ＳＯＤ１４のＩＰＴＧ非誘導、レーン４は同
誘導、レーン５は分子量マーカーと大腸菌菌体内生産さ
れた非Ｎ−α−アセチル化体のｈ−ＳＯＤを混合したサ
ンプルの各泳動−染色後のパターンを示す、レーン５の
ハントのうち、下から２番目が非Ｎ−α−アセチル化ｈ
−ＳＯＤのものであるが、レーン２、レーン４中に、こ
れと同一の泳動位置にＩＰＴＧ、Ｊ導による濃いバンド
が見られる。 さらに、上記［ＰＴＧｕ導例より、浸透圧ショック法（
コシ二ランド・ディとボッティン・ディ（１９８０）、
セル（Ｃｅｌｌ）　２０．　ｐｐ、７４９−７６０参照
）により、ペリプラズム画分を得、上記の泳動−染色分
析を行なフた結果を第１３図−１及び第１３図−２に示
す０図中、レーン１はＤＨＩ／ｐＩＮ−ＩＩ［（ｌｐｐ
Ｐ−５）−ｏｉｐＡ−ＳＯＤ５、レーン２はひ旧／ｐＩ
Ｎ−ｍ　（ＩｐｐＰ−５）−ｏｉｐＡ−ＳＯＤ１４より
それぞれ得たペリプラズム画分、レーン３は第１２図の
レーン５と同様な分子量マーカーの泳動−染色パターン
である。ペリプラズムに少なくとも回収されてくる、大
腸菌菌体内で発現された非Ｎ−α−アセチル化ｈ−ＳＯ
Ｄと同一の泳動位置を示す染色バンドがあることがわか
る。 このことはすなわち、０醜ｐＡシグナルベブチトが切断
され、しかもそのことと同時に大腸菌細胞質より外にｈ
−ＳＯＤ構造タンパク質サブユニツトが分泌的に発現さ
れることを示す、また、第１３図ではゲルに現れるバン
ドの数が第１１図及び第１２図に比べてはるかに少ない
ことから、ペリプラズム空間中のタンパク質の数は細胞
質中のタンパク質の数よりもはるかに少ないことがわか
る。従って、この発明の方法により生産されたｈ−ｓｏ
ｏは。 従来法により生産されるｈ−ｓｏｏよりも精製が容易で
あることがわかる。 七Σ１」むしλ嵐遇 ＤＨＩ／ｐＩＮ−Ｉ［［（ＩｐＰＰ−５）−ｏｍｐＡ−
ＳＯＤ５又はｐ旧／ｐＩＮ−ｍ　（ＩｐｐＰ−５）−ｏ
ｍｐＡ−５ＯＤ１４の全細胞抽出液をアガロースゲルフ
ィルム上の電気泳動後、上記と同様なニトロブルーテト
ラゾリウム−リボフラビンを用いる活性染色法によりそ
の活性体の検出を行なワた。結果を第１４図−１及び第
１４図−２に示す０図中、レーン１が大腸菌菌体内発現
した非Ｎ−α−アセチル化ｈ−８ＯＤの精製品、レーン
２がＤＨＩ／ｐ　ＩＮ−ｍ　（ＩｐｐＰ−５）−ｏｍｐ
Ａ−ＳＯＤ５全細胞抽出液レーン３がじ旧／ｐｌＨ−ｍ
　（ｌｐｐＰ−５）−ｏｉｐＡ−ＳＯＤ１４全細胞抽出
液の電気泳動−活性染色パターンである。 レーン１に現れた活性バンドとほぼ同一の位置にレーン
２、レーン３でも活性バンドが現れた。このことより、
この発明の方法により、０醜ｐＡシグナルベブチトかｈ
−ＳＯＤ活性をもたらすために必須な成分の１っである
ポリペプチド部分を分泌的に発現させることにおいて有
効に働いたことが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた０醜ｐＡシグナルベブチト
−ｈ−ＳＯＤポリペプチドのアミノ酸及び塩基８配列を
示す図、 第２図はｈ−３ｏｌ）遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵
素地図、 第３図はｈ−ＳＯＤ遺伝子及びそれに対応した１５３個
のアミノ酸から成るポリペプチドを示す図、 第４図はプラスミドｐｓＯＤ６を得る組換えの概略を示
す図、 第５図はプラスミド、５ＯＤ１４を得る組換えの概略を
示す図、 第６図から第９図は、実施例１におけるブラスミド作製
工程を説明するための図。 第１Ｏ図はプラスミドｐｓＯｔ１１４により産生された
ポリペプチド及びそれなコードするＤＮＡの塩基配列を
示す図、 第１１図は５Ｂ２２１／ｐ　ＩＮ−ＩＩ　、（ＩｐｐＰ
−５）−ｏａｐＡ−ＳＯＤ５から得られたタンパク質の
電気泳動図、ｉ１２図はＤＩｌｌ／ｐＩＮ−１１１（ｌ
ｐｐＰ−５）−ｏａｐＡ−ＳＯＤ５又はｐＩＮ−ＩＩ　
（ＩｐｐＰ−５）−ｏａｐＡ−ＳＯＤ１４から得られた
タンパク質の電気泳動図。 第１３図−１及び第１３図−２はＤＨＩ／ｐＩＮ−ｍ（
ｌｐｐＰ−５）−ｏａｐＡ−ＳＯＤ５又はｐＩＮ−１１
（ＩｐｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−ＳＯＤ１４のペリプラズ
ム空間から得られたタンパク質の電気泳動図、 ５Ｉ、１４図−１及び第１４図−２はＤＨＩ／ｐＨｌｌ
−ｍ（ｌｐｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−ＳＯＤ５又はｐＩＮ
−ＩＩ　（ＩｐｐＰ−５）−ｏｍｐＡ−３Ｏ［ｌ　１４
全細胞抽出液を活性染色法に付した際のパターンを示す
図である。 Ｔ（：ＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＧ（：ＡＡ八へＡＡＴ
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１ フラグメントＡ 第７図 纂８回 ＋０　　　　　２０　　　　　３０　　　　　４０　　
　　　５０　　　　　５０ＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧ
Ｃ（：ＧＴＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧ八ＣＧ
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ＣＣＡＡＴＡＡＡ　ｌａＧ　ＩｙＳｅｒＡｒｇＬｅｕＡ
　１ａｃｙｓＧＩ　ｙＶａ　Ｉ　Ｉ　ＩｅＧ　Ｉｙ　ｌ
１ｅＡ　ＩａＧ　Ｉｎｔｔ？第１０図 鴇１４川−１易１４面一２ 手　続　ネ市　：正　書（自発） 昭和６３年６月９日 −特許庁長官　小川邦夫殿 ｌ　事件の表示 昭和６２年特許願Ｎ４０７：１１８０号２　発明の名称 ４　代理人 ５　補正指令の日、付　　　　　　　　　　　自発補正
６　補正の対象 明細書 ７　補正の内容 （１）明細書第２５頁第４行目にある「細胞外膜を除去
し」を「細胞外膜を破壊もしくは除去し」に補正する。 （２）明細書１ｇ５４頁第５行目にある「（本記載、　
Ｐ、３１）　Ｊを「（本記載、Ｐ、３２）　Ｊに補正す
る。 （３）明細書第５５頁第７行目にある「クレノー断片」
をｒＤＮＡポリメラーゼクレノー断片」に補正する。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）非分泌性細胞内在蛋白質又はポリペプチドのアミ
   ノ酸配列をコードしてなるＤＮＡ配列の上流にＯｍｐＡ
   シグナルペプチドのＤＮＡ配列を結合してなる遺伝子。
2. （２）下記一般式［ I ］で表わされるアミノ酸配列又
   はその同等物をコードしてなるＤＮＡである特許請求の
   範囲第１項記載の遺伝子。 【アミノ酸配列があります】［ I ］ （ただし式中、Ｘ＿２及びＸ＿３は同一又は異るそれぞ
   れ１つのアミノ酸を示す。）
3. （３）Ｘ＿２及びＸ＿３がＣｙｓである特許請求の範囲
   第２項記載の遺伝子。
4. （４）Ｘ＿２がＣｙｓであり、Ｘ＿３がＣｙｓ以外のア
   ミノ酸である特許請求の範囲第２項記載の遺伝子。
5. （５）Ｘ＿２がＣｙｓ以外のアミノ酸であり、Ｘ＿３が
   Ｃｙｓである特許請求の範囲第２項記載の遺伝子。
6. （６）Ｘ＿２及びＸ＿３がＣｙｓ以外のアミノ酸である
   特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。
7. （７）Ｘ＿３がＳｅｒ、Ａｌａ又はＴｈｒである特許請
   求の範囲第４項又は第６項記載の遺伝子。
8. （８）前記遺伝子のＤＮＡ配列が第１図で示される特許
   請求の範囲第１項記載の遺伝子。
9. （９）発現系遺伝子として非分泌性細胞内在蛋白質また
   はポリペプチドのアミノ酸配列をコードしてなるＤＮＡ
   配列の上流にＯｍｐＡシグナルペプチドのＤＮＡを結合
   する遺伝子を含むグラム陰性細菌を培養し、該蛋白質ま
   たはポリペプチドを発現し、これを細胞質外に分泌せし
   め、これを採取することを特徴とする製造方法。
10. （１０）発現系遺伝子として、一般式［ I ］【アミノ
    酸配列があります】［ I ］ （ただし式中、Ｘ＿２及びＸ＿３は同一又は異るそれぞ
    れ１つのアミノ酸を示す。） で表わされるアミノ酸配列又はその同等物をコードして
    なるＤＮＡであって式［ I ］の＊から＊＊の部分を有
    する蛋白質ポリペプチドを細胞質外に分泌せしめてこれ
    を採取してなる特許請求の範囲第１０項記載の製造方法
    。
11. （１１）グラム陰性細菌がエシェリヒア属に属する菌で
    ある特許請求の範囲第９項記載の製造方法。
12. （１２）非分泌性細胞内在蛋白質またはポリペプチドの
    アミノ酸配列をコードしてなるＤＮＡ配列の上流にＯｍ
    ｐＡシグナルペプチドのＤＮＡ配列を結合してなるＤＮ
    Ａを含有する組換えベクター。
13. （１３）組換えベクターが、一般式［ I ］で表わされ
    るアミノ酸配列又はその同等物をコードしてなるＤＮＡ
    である特許請求の範囲第１２項記載のベクター。 【アミノ酸配列があります】［ I ］ （ただし式中、Ｘ＿２及びＸ＿３は同一又は異るそれぞ
    れ１つのアミノ酸を示す。）
14. （１４）ベクターがｐＩＮ−II（ｌｐｐＰ−５）−ｏｍ
    ｐＡ−ＳＯＤ５である特許請求の範囲第１２項記載のプ
    ラスミドベクター。
15. （１５）ベクターがｐＩＮ−III（ｌｐｐＰ−５）−ｏ
    ｍｐＡ−ＳＯＤ５である特許請求の範囲第１２項記載の
    プラスミドベクター。
16. （１６）ベクターがｐＩＮ−III（ｌｐｐＰ−５）−ｏ
    ｍｐＡ−ＳＯＤ１４である特許請求の範囲第１２項記載
    のプラスミドベクター。