JPS63218628A - 抗体接合体およびその調製方法 - Google Patents

抗体接合体およびその調製方法

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JPS63218628A
JPS63218628A JP62305505A JP30550587A JPS63218628A JP S63218628 A JPS63218628 A JP S63218628A JP 62305505 A JP62305505 A JP 62305505A JP 30550587 A JP30550587 A JP 30550587A JP S63218628 A JPS63218628 A JP S63218628A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 土−光凱■互量 この発明は、癌治療法の有効性を迅速に決定するための
手段、並びにラベルまたは薬学的に活性な分子に接合さ
れた、壊死を起こした、すなわち損傷を起こした腫瘍組
織についての抗体を用いることにより、このような治療
法を促進するための手段に関する。
癌の非外科的処理についての最近の技術には、化学療法
、放射線療法、化学療法および放射線療法の組み合わせ
、並びに免疫療法を含む、臨床技術および実験技術の双
方がある。それぞれにおいて、治療法の目的は、悪性腫
瘍細胞を殺すことである。このような治療法において、
現在のところ、あるいは将来に有効な抗腫瘍剤には、細
胞毒性医薬、生物学的応答修飾体、放射線感受性化合物
、毒物および放射性核種がある。
癌治療法に関連する一つの困難な点は、ある特定の治療
法の有効性が、癌の種類によって大きく変動し、さらに
同じ種類の癌を有する患者間においても大きく変動する
ことである。事実、−人の患者内の個々の腫瘍が不均一
であることもあり、これらの腫瘍は、利用されている特
定の治療法に対して他の細胞よりも受容的であったり、
抵抗的であったりする細胞を含んでいる。これらの理由
により、ある特定の種類の癌を有するある特定の患者に
ついての有効な癌治療方法の選択は、正確な科学とはい
えないが、最終的には実験的に決定されなければならな
いものである。
Ａ？ム　　の　ｔ　のモニ　１ング 最適の処理方法を確立する基準が欠如していることによ
り苦しむのは患者である。化学療法および放射線療法に
よる副作用はよ（知られており、かつこれらの副作用に
は、体重の減少、嘔吐、聴力障害、脱毛、胃腸障害およ
び骨髄障害がある。
従って、利用されている特定の治療法の効果をモニター
するために、医師は最大限の努力をしている。治療法が
有効でない場合、できるだけ早くこの治療法を中止し、
代わりの治療法を開始する。
化学療法、放射線療法および他の非外科的癌治療法の有
効性をモニターするための一般的な方法には、ＣＡＴス
キャン、肝臓−膵臓スキャン、Ｘ線、磁気共鳴（ＭＲ）
スキャン、および腫瘍の触診があり、これらはすべて腫
瘍の大きさの低下を検出するものである。変化を確認す
るには腫瘍の大きさがかなり小さくなることが必要であ
るため、これらの技術は、一般的には３ないし４週間の
治療を行った後においてのみ有用である。従って、これ
らの診断方法が完了するまで、患者はある特定の治療法
に（並びに付随する副作用に）さらされることになる。
比較的短期間に、各特定の患者における特定の治療法の
有効性を臨床医が決定することを可能とするモニター技
術は、最適な治療法に到達することを極めて容易にし、
そうするのに必要な時間を短縮するであろう、また、こ
のような技術は、付随する副作用および有効でない治療
法に患者が晒されている時間を、治療している医師が短
縮させることをも可能とするであろう。
旦−促進府立 大半の腫瘍は不均一性を有するため、ｉｔ瘍中の細胞の
すべてが必ずしも治療法に応答するとは限らない、不均
一な腫瘍を有する細胞のすべてではないがいくらかは、
ある特定の化学療法剤に対して感度がよいかも知れない
。さらに、放射線療法および抗増殖化学療法剤は、本質
的には、急速に成長している細胞にのみ損傷を与えるも
のである。
いつでも、成長相にある細胞数は、腫瘍内の総細胞数の
うちの少数であることが多い、これらの理由により、こ
のような治療法は腫瘍の程度を低減することはあるが、
除去するものではない、従って、この状況の下では、残
りのｍ瘍細胞を破壊するための有効な方法が求められて
いる。
ＣＩ　についての　たな 結局、さまざまな種類の腫瘍が不均一であるため、多く
の種々の治療法が用いられてきており、臨床医師および
患者は腫瘍の種類を決定するための広範なかつ高価な臨
床的、放射線学的かつ実験的な調査を行うことを強いら
れてきた。よって、広範囲な種々の癌に対してより均一
に適用し得る治療法を開発することが強く求められてい
る。
抗体、特にモノクローナル抗体に、癌研究分野における
強い関心が集められている。抗体は、多数の悪性腫瘍に
ついての細胞−表面抗原について開発されてきているが
、限られた範囲の腫瘍についてのみ有用である。このよ
うに腫瘍に対する診断、局在化２および治療を可能とす
るための、薬学的に活性な薬剤または標識体にこのよう
な抗体を接合する技術が知られている。現在公知のこの
ような結合技術もまた、限られた範囲の腫瘍に対しての
み有用である。
最近の研究により、独特の明確ではない抗原の同定並び
にそれに対するモノクローナル抗体の開発が導かれてき
ている。たとえば、エイ、エプスタインおよびシー、タ
レベンジャ−の」皿紅競Ｌｉｎ　　Ｎｏｎ−旧５ｔｏｎ
ｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（［、Ｂｅｋ
ｈｏｒｅｄ、　１９８５　）　、第１１’ｌのＩｄｅｎ
ｔｉｆｉｃａｔｌｏｎ　ｏｆＮｕｃｌｅａｒ　　Ａｎｔ
ｉｇｅｎｅｓ　　ｉｎ　　Ｈｕｓ＋ａｎＣｅｌｌｓ　　
ｂｙＩｓｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、　Ｉｍ＋
＊ｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ。
ａｎｄ　　Ｔｍｍｕｎｏｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　　ＵｓｉｎｇＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ八ｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ　　；シへ、フレベンジャ−およびエ
イ、エプスタインのＥｘ　、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、第
１５１巻、第１９４〜２０７貞（１９８４）のＩｄｅｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ａ　　Ｎｕｃｌｅａ
ｒ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｒ　　
Ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍａｔｉｎ　Ｇｒａｎｕｌｅｓ　　
ｔｌｓｉｎｇ　ａ　　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂ
ｏｄｙ　　ａｎｄ　　Ｉｍｗｕｎｏｇｏｌｄ　　Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｎ　　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　　：およびシー
、フレベンジャ−およびエイ、エプスタインの一旧１遵
に垣１ニー」す止−」ｂ山匹旬１ユ、第３２巻、第７５
７〜７６５　（１９８４）のＬｌｓｅ　ｏｆＩｍｓｕｎ
ｏｇｏｌｄ　　［！１ｅｃｔｒｏｎ　　Ｍｉｃｒｏｓｃ
ｏｐｙ　　ａｎｄ　　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ　　ｉｎ　　ｔｈｅ　　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ＮｕｃｌｅａｒＳｕｂｓ　ｔｒ
ｕｃ　ｔｕｒｅｓ　＋　　を参照されたい、このような
抗体は、ラベリングされており、かつ核種内での構造を
同定するのに用いられてきている。同じ文献を参照され
たい。
心臓の蛋白質ミオシンが周知である。この蛋白質は、心
臓細胞内においては見られるが細胞壁上では見られない
、細胞内筋肉蛋白質である。ミオシン−特異性抗体が開
発されてきており、かつ心筋梗塞により損傷を受けた心
臓組織をｉｎ　　ｖｉＶＯにおいて映像化するためにラ
ベリングされている。ジー、ベラ−、ビー、コー、イー
、ヘイバーおよびティー、スミスのＣ１ｒｃｕｌａｔｉ
ｏｎ　　、第５５巻、第７４〜７８頁（１９７７）の Ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅ
ｌｅｄ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｍｙｏｓｉｎ−ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｉｎ　　Ｍｙｏｃａｒｄ
ｉａｌ　　ｒｎｆａｒｃｔｓ、　　を参照されたい。
■　９の　■のｉ　なｆ濃− この発明は°、関連する抗原もまた正常な細胞中に存在
するという公知の事実にも関わらず、ｊｎｖｉｖｏにお
いてＭｒ１ｉＩ細胞に対する選択的な局在化を示すよう
に、細胞の不溶性細胞内成分に対する抗体が投与され得
ることを観察することを利用するものである。このよう
な局在化は、この抗体の特異性および特徴のみならず、
ある割合の癌細胞の示す異常透過性に基づくものである
。
この発明の一局面によれば、哺乳類においてｉｎ　　ｖ
ｉｖｏで悪性腫瘍細胞を殺すように仕向けられた治療法
の有効性を測定するための方法が提供され、該方法は、
哺乳類の腫瘍細胞および正常細胞に細胞内成分に対して
特異的であるが細胞外成分に対しては特異的でないモノ
クローナル抗体を得るステップを備え、このモノクロー
ナル抗体はラベリングされている。さらに、ｉｎ　　ｖ
ｉｖＯで腫瘍細胞を殺すための治療法を受けた哺乳類の
組織に、該ラベリングされた抗体を接触させるステップ
と、ラベリングされた抗体の変成腫瘍細胞の細胞内成分
との結合を測定することにより、この治療法の有効性を
決定するステップとを備える。
ある好ましい実施例では、この抗体は、不溶性の細胞内
抗原についてのものであり、かつ接触ステップは、好ま
しくは、ラベリングされた抗体をｉｎ　　ｖｉｖｏで哺
乳類に投与するステップを備える。好ましいラベルは、
放射性核種、磁気共鳴促進剤および放射線不透性材料で
あり、抗体の抗原への結合を測定するための好ましい方
法には、シンチグラフ、磁気共鳴および放射線グラフ映
像を含む映像化技術がある。
この発明の他の実施例は、Ｉｎ　　ｖｉｖｏで悪性腫瘍
細胞を殺す治療法の有効性を哺乳動物で促進する方法を
備えており、該方法は、生存細胞の外側に存在しておら
ず、血清中を循環している不溶性細胞内性抗原に特異的
な抗体を得るステップを儒え、ここでは抗体は医学的に
活性な試剤、好ましくは抗腫瘍性薬剤に接合されており
、さらにｉｎ　　ｖｉｖｏで悪性Ｍ１瘍細胞を殺すため
に哺乳動物内で治療を開始し、それによっていくらかの
悪性腫瘍細胞を損傷させあるいは壊死させるステップと
、抗体が壊死を起こした悪性腫瘍細胞に結合されるよう
に哺乳動物に抗体接合体を投与し、それによって薬理学
的に活性な薬剤をこれらの細胞の座に与えるステップと
を備える。抗腫瘍剤は、好ましくは、細胞毒性剤、毒物
、生理学的応答修飾体、放射線感受性化合物、アルファ
ー発光放射性核種、ベーター発光放射性核種または抗増
殖剤である。壊死を引き起こすのに用いる治療法は、好
ましくは、化学療法、放射線療法または免疫療法でよい
。
一次腫瘍および転移体を含む悪性の腫瘍では、不溶性細
胞内抗原に対する薬理学的にラベリングされた抗体は、
腫瘍細胞を治療的に有効に殺すことを引き起こすのに十
分な癌病巣に対する選択的局在化を示す、この発明のこ
の実施例では、細胞内抗原に対する薬理学的にラベリン
グされた抗体は、−次的な治療様相として働き、かつ結
像用アイソトープに結合された同様の抗体を用いる腫瘍
の前映像とともに、あるいはこの前映像なしに用いるこ
とができる。
従って、この発明の他の実施例では、１ｎｖｉｖｏで腫
瘍細胞を殺すために、−次腫瘍および転移体の双方を含
む広範囲の種類の腫瘍についての基本的なまたは新しい
治療法を与えるための方法を備えており、該方法は、不
溶性細胞内抗原についての抗体を得るステップを備え、
ここでは抗体は不溶性細胞内抗原に対して発生された一
連の抗体をスクリーニングし、かつ腫瘍細胞および正常
細胞の双方に存在する不溶性細胞内抗原に対して特異的
であるが、細胞の死により一般的な循環系に放出された
抗原または生存細胞の外部の抗原に対しては特異的では
ない抗体を選択することにより選択され、ここでは、こ
の抗体は抗腫瘍剤に接合されており、さらに腫瘍を有す
る哺乳動物に抗体−抗ｌＩ！ｌｒｇｌ剤を投与し、それ
によって抗体接合体が一次癌または転移癌内に存在する
細胞に透過し得るように選択的に結合され、その結果抗
腫瘍剤を周囲の腫瘍細胞に与えることにより、直接的に
哺乳動物内の腫瘍に対する治療を開始するステップを備
える。
この発明のさらに他の実施例は、不溶性細胞内抗原に対
するモノクローナル抗体を備えており、ここでは抗体は
アルファー発光放射性核種もしくはベーター発光放射性
核種、または化学療法剤もしくは免疫療法剤または生物
学的応答修飾体に結合されている。
また、この発明は、抗体接合体を調製するための方法も
含み、該方法は、腫瘍細胞および正常細胞内に存在する
が生存細胞の外部には存在しない不溶性細胞内抗原につ
いてのモノクローナル抗体を得るステップを備え、この
ような抗体は壊死を起こした組繊に特異的であるが生存
している組織には特異的ではなく、さらにこの抗体を、
アルファー発光放射性核種、ベーター発光放射性核種、
放射線不透性材料、抗腫瘍剤、免疫療法剤または生物学
的応答修飾体から選択された材料に接合するステップを
備える。この接合体は、注射可能な薬学的担体に組み合
わせてもよい。
また、この発明は、哺乳動物における腫瘍細胞を殺すよ
うに仕向けられた治療法を受ける哺乳動物においてのｉ
ｎ　　ｖｉｖｏでｍｒｔｉｔ性組織を映像化するために
、並びにこの目的のための薬剤を調製するのに、この発
明の接合体を用いることをも意図するものである。さら
に、この発明は、悪性腫瘍疾患を処理するため、あるい
は抗Ｌｆｆｉ瘍療法の効果を促進するために薬品を調製
するために、この接合体を用いることをも含む。
■　　ましい　　　の　　な− 動物では細胞死および細胞の溶解により主として細胞質
から細胞の可溶性成分が放出される。壊死を起こしてい
る細胞の残りの部分は、組織内において、そのまま［固
定されて」残存している種々のほぼ不溶性の材料から構
成される［細胞幻影」を含む、不溶性細胞幻影は、食作
用および酵素の減成によって次第に破壊される。少なく
ともある量の細胞幻影が、数週間の間そのまま残存する
。ある細胞内性細胞幻影成分は抗原性であることが発見
された。これらの抗原は、核抗原、構造要素および機能
質を含む。
この発明は、それぞれ、診断および治療のために不溶性
細胞内抗原を用いる。この発明による診断テストは、不
溶性細胞内抗原に対してポリクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体を用いる。この抗体は、−ｆｆｉ的な方法に
よりラベリングされている。大半の場合、不溶性抗原に
ついての抗体は、ｉｎ　　ｖｉｖｏで局在化された抗体
の映像化を可能とするために、一般的な放射線不透性材
料またはガンマ−発光放射性核種によりラベリングされ
るであろう、Ｎ理学的に活性な試剤に結合された同一の
抗体を、治療目的のために用いてもよい。
八−症生曵皿盟 この発明において用いる抗体は、従来のポリクローナル
またはモノクローナル抗体調製技術により得ることがで
きる。抗原は、この抗体が向けられた種の細胞から得る
ことができる。人の細胞内抗原に向けられた抗体につい
ては、悪性腫瘍細胞系が抗原の一般的な源泉である。
不溶性抗原は、好ましくは、遠心分離技術により分離さ
れてもよい、細胞膜は、凍結および解凍により、機械的
技術により、または他の適当な方法によって破壊する。
１１００Ｏｘにおいて数分間の遠心分離が、はぼ不溶性
の構造要素および核から可溶性の細胞質部分を分離する
のにほぼ十分である０次に、所望の免疫応答を生じさせ
るために受は入れられる手順に従って、実験動物が定期
的に免疫化されてもよい。
モノクローナル抗体を発生させるために、免疫化された
動物からのネズミの膵臓細胞を、適当な骨髄種細胞系と
融合する。融合した細胞を、選択的な成長培地で培養し
、かつ活性細胞培養体の上澄みについて抗体活性をテス
トする。正の培養体を同定し、かつ拡張する。
生存細胞にほとんど結合していない、あるいは結合され
ていない細胞幻影に特異的に結合するモノクローナル抗
体をスクリーニングするために、等置部の正常生存細胞
および腫瘍生存細胞を用意する。細胞幻影を得るために
腫瘍性細胞および正常細胞の各々一部を、数回の急速凍
結−乾燥サイクルにかけ、次に緩衝液で洗浄し、可溶性
成分を除去する。テストされた培養物からのモノクロー
ナル抗体の、それぞれ、細胞幻影およびそのままの細胞
への結合部を定量した。１つの適切な測定技術は放射線
免疫分析法である。従って、ネズミのモノクローナル抗
体を用Ｃ）る場合には、放射性元素でラベリングされた
抗−マウスＩｇＧを、結合されたマウスの抗体の量を定
量するのに用いてもよい、直接的または間接的な免疫蛍
光スクリーニング技術を用いてもよい、細胞幻影に結合
された抗体の量を、そのままの細胞に結合された量と比
較することにより、不溶性細胞内抗原に対する特異性を
決定することができる。
次に、上記のようにして同定した細胞内抗原に対する抗
体の、壊死を起こしている培養物からの上澄みに対する
結合を測定することにより、正常細胞および腫瘍細胞の
壊死を起こしている培養体から得た可溶性抗原に結合し
ていないことを確保するために、問題の抗体をスクリー
ニングする。
一般的な放射線免疫分析技術を用いてもよい。
映像化のために、周知の医薬用放射性核種のいずれかを
用いることができる。適切な放射性核種には、ＴＣ−９
９ｍ、ｌ−１２３、ｌ−１２５、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−
１１３ｍ、Ｇａ−６７または他の適当なガンマ発光体が
ある。
２　　　・　　゛　　　・ 放射線不透性材料も抗体のラベリングに用いることがで
きる。好ましい放射線不透性材料は周知であり、かつこ
れには、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合
物、タリウム化合物などがある。放射線不透性材料の具
体的な例には、バリウム、ジアドリゾエート、エチオダ
イズドオイル、酒石酸ガリウム、ヨーカルミン酸（ｉｏ
ｃａｒｍｉｃａｃｉｄ）　、ヨーカルミン酸（ｉｏｃｅ
ｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ　）、ヨードアミド、ヨーシバミ
ド、ヨーカルミン酸（１ｏｄｏｘａ＊ｉｃ　ａｃｉｄ　
）、ヨーグルアミド（ｉｏｇｕｌ−ａｓｉｄｅ　）　、
ヨーヘキソール（１ｏｈｅｘｏｌ　）、ヨーシミドール
（１ｏｐａｓｉｄｏｌ　）、ヨーパノ酸、ヨーカルミン
酸、ヨーセフアミン酸、ヨーセリン酸、ヨースルアミド
　メグルミン、ヨーカルミン酸（ｉｏｓｕｍｅｔｉｃ　
ａｃｉｄ　）、ヨータスル（１ｏｔａｓｕｌ　）、ヨー
セリン酸（１ｏｔｅｔｒｉｃ　ａｃｉｄ　）、ヨーシバ
ミドｆｍ　（ｉｏｔｈａｌａｍｉｃ　ａｃｉｄ　）、ヨ
ートロキシン酸（１ｏｔｒｏｘｉｃ　ａｃｉｄ　）　、
ヨーカルミン酸（ｉｏｘａ−ｇｌｉｃ　ａｃｉｄ　）　
、ヨーキットリゾイン酸（１ｏｘｏｔｒｉ−ｚｏ’＋ｃ
　ａｃｉｄ　）、イボデート（１ｐｏｄａｔｅ　）、メ
グルミン、メトリズアミド（ｍｅｔｒｉｚａｓｉｎｅ　
）、メトリシェード、プロピリドンおよび塩化タリウム
がある。
３　　　ｗ北、−２ 磁気共鳴映像装置により検出することができ、あるいは
この効果を高める材料も、抗体に接合してもよい、適当
な従来の磁気共鳴−増大化合物には、ガドリニウム、銅
、鉄およびクロムがある。
これらの金属原子は、一般的な有機金属キレートの形態
で調製し、次に抗体に結合することが好ましい。
逅−ｍ医 多数の抗腫瘍剤が知られており、これらの多くは公知の
技術を用いてこの発明の抗゛体に接合することができる
。これらの抗腫瘍剤には、葉酸塩インヒビター、ピリミ
ジン類、プリン類、アルキル化剤、抗生物質、および放
射線感受性化合物があり得る。このような抗Ｍ瘍剤の具
体的な例には、アシビシン（ａｃｉｖｉｃｉｎ　）　％
アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ　）　、アコ
ダゾール（ａｃｏｄａ−ｚｏｌｅ　）、アドリアマイシ
ン、アメタントロン（ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ　）、ア
ミノグルテチミド、アンスラマイシン、アスパラギナー
ゼ、アザシチジン（ａｚａｃＨ３ｄｉｎｅ　）　、アゼ
テパ（ａｚｅｔｅｐａ　）、ビサントレン（ｂｉｓａｎ
ｔｒｅｎｅ　）、プレオマイシン、ブスルファン（ｂｕ
ｓｕｌｆａｎ　）、カクチノマイシン、カルステロン、
カラセミド（ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ　）、カルポプラチ
ン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒ
＊ｕｓｔｉｎｏ　）、力ルビシン（ｃａｒｕｂ：ｃｉｎ
　）　、クロランプシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）
、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　）　、シクロフ
ォスホアミド、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ　）
、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダウノル
ビシン、ダウノルビシン、ブザグアニン、ジアジクオン
（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ　）、ドキソルビシン、エビプ
ロピジン（ｏｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ　＞、エトポシド
（５ｔｏｐｏｓｉｄｅ　）　　、エトプリン（ｅｔｏｐ
ｒｉｎｅ　）、フロキスリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎ
ｅ　）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）　、
フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ　）　％
フルオロシタピン（ｆｌｕｏｒｏｃｉｔａｂｉｎｏ　）
、ヒドロキシ尿素、イブロブラテン（１ｐｒｏｐｌａｔ
ｉｎ　）、酢酸ロイプロリド、ロムスチン（ｌｏｍｕｓ
Ｌｉｎｅ　）　％メクロルエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅ
ｔｈａ＊ｆｎｅ　）　、酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅ
ｓｔｒｏｌ　）　、酢酸メレンゲストロール、メルカプ
トプリン、メトトリキサーテ（麟ｅｔｈｏｔｒｅ真ａｔ
ｅ）、メトプリン、ミトクロミン、ミドシリン（曽Ｈｏ
ｇｉｌｌｉｎ　）、ミドマイシン、ミドスパー（ｇ＋１
ｔｏｓｐｅｒ　）、ミドキサントロン（ｍ１ｔｏｘａｎ
ｔｒｏｎｅ　）、マイコフェノール酸、ノコダゾール、
ノガラマイシン、オキシスラン（ｏｘｉｓｕｒａｎ　）
、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ポルフィロマイシ
ン、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉ＋＊ｕｓｔｉｎｅ
　）　、プロカルバジン、塩化水素、プロマイシン（ρ
「０蒙ｙｃｉｎ　）、ビラシフリン、リボプリン、セム
スチン（ｓｅｍｕｓｔ＋ｎｅ＞、スパルソマイシン（ｓ
ｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ　）　、スピロゲルマニウム、ス
ビロムスチン、スピロプラチン、ストレプトゾシン、ク
リソマイシン１、テガファ−（ｔｅｇａｆｕｒ　）　、
テニボシド（ｔｅｎｔｐｏｓｌｄｅ　）　、テロキジロ
ン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ　）、チアミブリン（ｔｈｉ
ａｍｉｐｒｉｎｅ　）　、チオグアニン、隣酸トリシリ
ビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｆｎｅ）、トリエチレンメラミ
ン、トリメトリキサーテ（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ　
）、ウラシルムスタード、ウレデバ（ｕｒｅｄｅｐａ　
）　、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビ
ンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ　）、ビンデシ
ン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ　）　、ビンエピジン（ｖｉｎ
ｅｐｉｄｉｎ　）　、ピンエピジン（ｖｉｎｒｏｓｉｄ
ｉｎｅ　）、ビンシリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ　
）　、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ　）、およ
びゾルビラン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ　）がある。
さらに、アルファ発光およびベーター発光放射性核種を
用いてもよい、これらの化合物には、■−１３１Ｙｔ−
９９、Ｃｕ−６７、Ａｕ−１９８、Ｐ−３２および他の
細胞毒性放射性核種がある。
また、この発明の抗体を、インターロイキン−２、血管
拡張剤、いずれかのインターフェロン、腫瘍壊死因子な
どを含む、生物学的応答修飾体に接合してもよい。
この発明の抗体に結合され得る他の種類の他の化合物は
、リチン、テタノス菌、ジフテリア菌、アブリン、ゲロ
ニン、ヤドリギ（ｍ１ｓｔｌｅｔｏｅ　）および局在化
された壊死を引き起こし得る他の材料のような毒物であ
る。
Ｄ　　−およびｔ、　八　の“　への　人さまざまな分
子を抗体に結合するのに好ましい多くの技術が確立され
てきている０例えば、ニス。
ミルズたちのｊｊＥ回旦懸　、第５巻、第２６５〜第２
７５ｆｆｌ（１９８６）の１２３１−Ｒａｄｉｏｌａｂ
ｅｌｉｎｇｏｆ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ　　ｆｏｒ　　Ｉｎ　　Ｖｉｖｏ　　Ｐｒ
ｏ−ｃｅｄｕｒｅｓ＋　　により述べられているクロラ
ミン−Ｔ法を用いた、ヨウ化法が確立されている。抗体
を放射線不透性にするために、またはｌ−１２５もしく
はｌ−１３１のように放射性核種を結合するために、ヨ
ウ化を果たすのにこの技術を用いてもよい。
ベンジルＥＤＴＡまたはＤＰＴＡ接合法によるキレート
化により、問題の抗体に他の放射性核種を結合してもよ
い、さらに他の好ましい技術には、エム、ピムたちのＩ
ｎｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　、第３０巻、第７５頁（１
９８２）の夏ｎ　Ｖｉｖｏ　Ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ
ｏｆ　Ａｎｔｉ−ＯｓＬｓｏｇｅｎｉｏ　５ａｒｃｏｖ
＊ａ　７９１Ｔ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｌｂｏｄ
ｙ　　によって開示されているヨウ素法、並びに放射線
活性ヨウ化ナトリウムによる直接的なヨウ化法がある。
さまざまの分子、酵素および蛋白質を抗体に結合するに
際し、多くの技術を用いることができる。
例えば、（メソトレキセートのような）大半のカルボキ
シル酸含存化合物を、たとえば該化合物をＮ−ヒドロキ
シ琥珀酸アミドおよびジシクロへキシルカルボジイミド
と反応させて形成された活性エステル中間体により免疫
グロブリンに接合することができる。ティー、デグチた
ちのＣａｎｃｅｒ均１工、第４６巻、第３７５１〜３７
５５頁（１９８６）のＥｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏ
ｔｒｅｘａｔｅ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉ−Ｐｒ
ｏｓｔａｔｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓ
ｅ　　ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｎｊｕｇａｔｅ　ｏｎ　ｌ
ｌｕ＋ｓａｎ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｔｕｍｏｒを参照さ
れたい、クロラールアンプシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃ
ｉｌ　）のような他の物質は、低ｐＨにおいて抗体に直
接結合するであろう、たとえば、ティー、ゴースたちの
Ｅｕｒｏ　、　　Ｊ、　　Ｃａｎｃｅｒ　、第１１？８
、第３２１〜第３２６頁（１９７５）の １＋＊ｍｕｎｏｃｈｅａ＋ｏｔｈｅｒａｐｙ　　ｏｆ　
　Ｈｕｍａｎ　　ＭａｌｉｇｎａｎｔＭｅｌａｎｏｍａ
　　ｗｉｔｈ　　Ｃｈｌｏｒｏａ＋ｍｂｕｃｉｌ−Ｃａ
ｒｒｙｉｎｇ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙを参照されたい。
アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ　）およびダ
ウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ　）のようなアミ
ノ糖含有医薬を、該医薬を過ヨウ素酸塩によって酸化し
、次に酸化された医薬を免疫グロブリンに結合し、さら
に生成物を水素化ホウ素ナトリウムにより還元すること
によって抗体に共有結合してもよい。
イー、フルビッツたちのＣａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、　　
、第３５巻、第１１７５〜１１８１頁（１９７５）のＴ
ｈｅ　　Ｃｏｖａｌｅｎｔ　　Ｂｉｎｄｉｎｇ　　ｏｆ
　　Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ　　ａｎｄ八ｄへｉａｍｙｃ
ｉｎ　ｔｏ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　を参照されたい
。
生物学的免疫修飾体または他の蛋白質を抗体に結合する
ための一般的技術も存在する。遊離チオール基を、抗体
とＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネイト（ＳＰＤＰ）とを反応させて２−ピリジル
　ジスルファイド基を導入することにより、抗体内に導
入してもよく、上記２−ピリジル　ジスルファイド基は
ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅＨｏｌ　）で
還元されて遊離チオール基を放出する。抗体に結合され
るべき蛋白質は、５ＰＤＰとともにインキエベートされ
る。
５ＰＤＰで修飾された蛋白質を、遊離チオール基を含有
する抗体と混合することにより、Ｈｄｌの材料が結合さ
れることになる。
抗体分子に結合される医薬成分の数を増大させるために
、デキストランニー１０スペーサーを用いるような他の
公知技術を、医薬接合体の混合された無水物法のように
、用いることができる。この化合物ｌ−エチル−３−（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド　ヒドロ
クロライド（ＥＣＤＩ）を、アミノ含有医薬を抗体のカ
ルボキシル基に結合するのに用いてもよい０代わりに、
抗体の遊離アミノ基と、それに接合されるべき化合物中
のアミノ基とを架橋するために、ゲルタール゛アルデヒ
ドを用いてもよい。
この発明の一つの診断あるいはモニタリング方法は、不
溶性細胞内抗原に対するラベリングされた抗体を用い、
そこではラベルが、先に議論した形式のガンマ発光−放
射性核種である。このラベリングされた抗体を、化学療
法、放射線療法またはこられの双方を受けてきた患者に
（好ましくは静脈注射により）注入する。結果として生
じている腫１８１１織の壊死が妥当な数の細胞幻影が存
在するのに十分な点に達することを可能とするために、
好ましくは、この方法は治療開始後生なくとも１または
２日後に行う、ラベリングされた抗体を投与して３０分
ないし３日の間に適切なシンチグラフ映像技術を用いて
壊死を起こしている組織内で局在されたラベルを映像化
する。好ましい映像技術には、ガンマ・カメラおよび５
ＰＥＣＤ　（単一フォトン発光のコンピユータ化された
トモグラフィ）技術がある。
映像技術の一つは、ラジオグラフ映像技術である。この
技術では、放射線不透性材料でラベリングされた不溶性
細胞内抗原についての抗体を、化学療法または放射線療
法の開始後、適切な時間に注入する。抗体を壊死を起こ
している組繊の領域に局在させた後、ラジオグラフ映像
を写し出す。
他の適当な技術には、ＣＡＴ　（コンピュータアクシャ
ル・トモグラフィ）スキャン、蛍光コピーおよび従来の
Ｘ線映像技術がある。
Ｆ　　　　・″　　　　　　　　　に　　　る　　　　
　　いる７月り方１に この発明の抗体を治療に用いる抗Ｍ１ｇｋ化合物に接合
することにより、これらの治療剤が、非常に低められた
全身効果とともに腫瘍に直接与えられる。２個の方法を
用いることができる。第１は、腫瘍のすべてもしくは一
部を殺し得る現存の治療様相法の次に用いる促進治療で
あり、第２は治療剤としての抗体に対しである程度の異
常な透過性をすでに示す腫瘍細胞に焦点を合わせる一次
的な新たな治療方法である。
促進療法では、腫瘍の壊死は、化学療法、免疫療法、放
射線療法などのいずれかの従来技術により開始される。
このような治療法の開始後に、壊死が始まり、細胞幻影
がｌｌｌ１ｒＩＩＩ塊内に現れる。この時点において（
通常は一次療法の開始後生なくとも２日後）不溶性細胞
抗原および治療剤化合物、好ましくは抗腫瘍剤に抗体を
合成させたものを、患者に投与する。ｉｅｍの近傍に直
接注入することも考えられるが、静脈内投与が好ましい
。
抗腫瘍剤−抗体接合体の投与により、抗体は腫瘍塊内の
細胞幻影に結合し、該塊に抗腫瘍剤を導入する。
致死量の免疫接合体が壊死を起こしている領域に与えら
れたならば、この領域の周囲の健康な活力のある腫瘍細
胞が壊死を起こす状態にされ、余分な量の免疫接合体が
新たに壊死を引き起こす領域を貫通することを可能とす
る。この方法では、壊厄のような効果が生じ得、腫瘍細
胞の破壊は壊死を起こしている腫瘍組織から健康な腫瘍
組織へ急速に進行する。この壊厄のような効果を達成す
るために、ベータ発光またはアルファ発光放射性核種の
ような細胞毒性試剤を用いてもよい。
第２の方法（−次治療）は、（壊死を起こしている初期
数の細胞を作り出すための）他の様相による前処理の必
要性がない点を除いては、上述した方法と同様である。
患者に投与された抗腫瘍剤−抗体接合体の量は、用いる
抗腫瘍剤の種類によって、並びに腫瘍の大きさによって
変動するであろう、しかしながら、一般的には、投与量
は、選択した特定の薬剤の従来療法における投与量と等
しいか、あるいはそれより少ない抗腫瘍剤の総投与量を
投与するように選ばれる。好ましくは、総投与量は、従
来療法の投与量の１％ないし５０％の間であり、最も好
ましくは、該化合物の従来の療法における投与量の２％
〜２５％の間である。しかしながら、すべての癌治療法
と同様に、最適の投与量は、その治療法およびそこから
生じる副作用に対する個々の患者の応答状況に応じて担
当医師により決定されるであろう。
実−」１−例一」− 核抗原に対するモノクローナル抗体を製造するハイブリ
ドーマを生成するために、抗原源として８個の人の悪性
腫瘍リンパ腫細胞および白血病細胞系を用いた。これら
は、ＥＢＶ−正の非生産体ＲａＪｉおよび生産体ＡＧ８
７６アフリカンブルキツトのリンパ腫細胞系、Ｔ−細胞
急性リンパ芽球白血病ＯＥＭ細胞系、ＩｇＢ分泌多発性
骨髄腫Ｕ−２６６細胞系、鼻血白血病に５６２細胞系、
並びに＆ｌＩ織球型の５Ｕ−ＤＨＩ、−１およびＵ−９
３７並びにＢ細胞型の５Ｕ−ＤＨＬ−４拡散組織球リン
パ腫細胞系を含む、これらの培養体に加えて、いくつか
の固体から集められ、かつフィコール−ハイバーク（ｈ
ｙｐａｑｕｅ　）技術により分離された正常な抹消血液
リンパ球を、単独で、かつ５ｕｇ／ｍＩのアメリカヤマ
ゴボウミトゲン（Ｐｏｋｅｗｅｅｄ　ｓ＋ｉｔｏｇｅｎ
　）で４日間刺激した後に用いた。このモノクローナル
抗体を特徴付けかつスクリーニングするのを救けるため
に、ＨｅＬａ細胞、および皮膚穿刺生検法により確立さ
れた正常な全数ヒト線維芽細胞鎖を、免疫蛍光法および
免疫電子顕微鏡実験において用いた。すべての培養体は
、１５％の子牛の胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシ
リン−Ｇおよび１１００ｕ／ｍ＋の硫酸ストレプトマイ
シンを補給されたＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ
）で成長した。大量の細胞を生産するために、約４Ｘ１
０”の細胞を種付けした後に３リツトルの懸垂式バー・
スピナーフラスコを用いた。この細胞を４ないし５日後
に集め、リン酸塩で緩衝された食塩水（ＰＢＳ）内で二
度洗浄し、１０％のグリセロールを含むｌＱｍｌの緩衝
液Ａ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ＝８．０．１ｍＭのＥＤＴＡ。
１ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのフェ
ニルメチルスルフォニルフルオライドおよび１％のアプ
ロチニン）内に再懸濁し、次に用いるために一８５°Ｃ
で凍結した。大まかには、３リツトルの細胞は、１収穫
当たり２．５ｍｌの充填された細胞を与えた。
人の悪性腫瘍リンパ腫および白血病系並びに抹消血液リ
ンパ球から核抽出物を得るために、２゜５ｍｌの充填さ
れた細胞を解凍し、５０ｍ１の遠心分離管内においてＣ
ａ　／　Ｐ　Ｉ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液（０゜０１ＭのＣａ
ＣＬ　、２Ｘ１０−３Ｍのピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス
（２−エタンスルフオニツク酸））で一度洗浄した。す
べての手順は４°Ｃで行い、かつ遠心分離は１１０００
Ｘで１０分間行った０次に、ベレットを、４０ｍ１のＣ
ａ　／　Ｐ　Ｉ　ＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、かつ膨張し
た細胞を破壊するためにモーターで駆動されたポリテト
ラフルオロエチレンからなる乳棒を用いて徹底的にホモ
ジナイズした０次に、細胞質性フラクシヨンとしての曇
った上澄みを残したまま核をベレット化し、さらに１％
のＮＰ−４０（ガラードーシェレジンガー）を含むＣａ
／ＰＩＰＥＳ緩衝液内で再懸濁した０次に、この核を再
度ホモジナイズして核膜を除去し、かつ位相差顕微鏡に
より、細胞質性および膜性のくずによる汚染がないこと
を確認した。
次に、Ｃａ／ＰＩＰＥＳＩＩ衝液で核を２度洗浄して洗
浄剤を除去し、８ｍｌのりん酸塩で緩衝された食塩水に
再懸濁し、より均一な懸濁液を得るために、３０秒の期
間をおいて１５秒間の超音波処理を３度行った。主要な
細胞質性蛋白質の存在しない、得られた核抽出物を、次
に、免疫化処理において用いるために、−８５℃におい
て１ｍｌ単位で凍結した。
８個のヒトリンパ腫および白血病細胞系並びに抹消血液
リンパ球の各々から得られたｌｄ景の核抽出物を解凍し
、再度超音波処理して粘度を低め、２本のガラスシリン
ジおよび２０−ゲージの微小乳化針を用いて、１．５ｍ
ｌの完全フロイント・アジュバント内で乳化した。サン
ブリあたり８週のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃの雌のねずみ
３匹に、２２−ゲージの注射針およびガスシリンジを用
いて多数の箇所において皮下注射した。核抽出物を不完
全なアジュバント内で調製したことを除いて上記と同様
にして、２週間後にこのマウスに再接種した。
このマウスは１０日後に第３回目の抗原の接種を受け、
この時にはアジュバントを用いず、かつ腹腔内に接種し
た。４日後にこのマウスの首を脱臼させて殺し、ハイブ
リドーマ実験のために無菌技術を用いて肺臓を取り出し
た。
分子１１１５４０の４０％のポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）を用いて、住替にされたＢＡＬＢ／Ｃマウスか
ら得られた肺臓細胞を、それぞれ、比率が５：１になる
ように、８−アザグアニン抵抗性マウス骨髄種Ｎ５−１
細胞□と混合した。溶融後、ウェルあたりの細胞数２Ｘ
１０−’の濃度で９６−ウェル微量プレート内において
、１０−’Ｍのヒポキサンチン、４　Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍ
のアミノプテリンおよび１．５Ｘ１０−’Ｍのチミジン
（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を含む選択的ＨＡＴ培地内で培
養した。この培地を３日毎に代え、１週間後にアミノプ
テリンを中止した。活力的な細胞成長によりウェルから
得られた培養上澄み物を、その抗体活性について、間接
免疫蛍光法により試験した。上澄み液の収穫を助けるた
めに、マルチチャンネルピベ・ントを用いて、この上澄
み液を他の９６−ウェルプレートに移した。ウェルから
ウェルへの相互汚染を防止するために、新しい滅菌ピペ
ット・チップを各上澄み液に対して用いた。正の培養液
を拡張のために２４−ウェルのクラスター・プレートに
移し、ＲＣＭＩ−１６４０培地、２０％の牛胎児血清お
よび抗生物質を含む０．５％ノープル寒天上で一単位量
の細胞をクローニングした。クローニングするに先立っ
て５ＱＸｌＳ■の組織培養ベトリ皿内で寒天プレートを
調製しておき、使用まで４°Ｃで保存した。適当数のコ
ロニーの成長を確保するために、プレートにはｌ容量が
５０ｕ１となるように、５００または１０００個の細胞
を植え付けた。
次に、この細胞を９０℃に曲げられたガラス棒を用いて
寒天の表面に拡げ、このプレートを３７°Ｃで十分に湿
気を与えられた５％のＣＯ，インキュベータ内で１０な
いし１２日間インキエベートした。このとき、ハイブリ
ドーマあたり最大２４コロニーを、パスツール・ピペッ
トで取り出し、持続成長のために９６−ウェル・プレー
トに移した。
次に、培地が酸性になったときに、これらの培養物の上
澄みを４ないし５日後に再度試験した０次に、正の培地
をゆっくりと拡張し、組織培養フラスコ内で活発に成長
した時に、２０％の牛胎児血清、抗生物質および１０％
のジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）を含むＲＰＭ
Ｉ−工６４０培地内でｄあたり５Ｘ１０’細胞数の濃度
で安全貯蔵のために液体窒素中で凍結した。
スー施−Ｕ スクリーニング用の抗体を、実施例１のハイブリドーマ
により生産された抗体を含む細胞内抗原についての一連
のモノクローナル抗体から選択した０選択した抗体を、
以下のようにスクリーニングした。
大きな細胞リンパ腫細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−２）およびア
ゾンカルシノーマ肺癌細胞（Ａ５４９）を２種の等しい
単位に分割した。一方の単位を１ｍｇ／ｍ＋のウシ血清
アルブミンおよび０．０２％のアジドナトリウム（洗浄
緩衝液）を含むＰＢＳにより２度洗浄し、ｌ×１０６細
胞数／管の濃度となるように４ｍｌの試験管に入れた。
他方の単位については、急速に３回凍結−解凍を行い、
洗浄用緩衝液を用いて３度洗浄して可溶性成分を除去し
た０次に、細胞幻影を、第１の単位と同様に４ｍｌの同
数の試験管に分割した０次に、各組からの１本の試験管
を、室温にて連続的に振とうしつつ、１時間の間、モノ
クローナル抗体上澄み１　ｍ　ｌとともにインキュベー
トした。この細胞を洗浄用緩衝液で２度洗浄して結合さ
れていない抗体を除去し、さらに１１０００００ｃｐの
１−１２５ヤギ抗−マウスＩｇＧ放射性元素でラベリン
グされたプローブとともにインキュベートして、結合さ
れたマウスの免疫グロブリン量を定量した。
室温で連続振とうしつつ、１時間インキュベートした後
、洗浄用緩衝液で３度洗浄し、１分間の期間の間ガンマ
・カウンタでカウントした。
この放射線免疫分析法の目的は、サブセットの抗核性モ
ノクローナル抗体の中で、死細胞に特異的に結合してい
るが生細胞にはほとんどあるいはまったく結合していな
いこれらの試薬を同定することにあった。死細胞を結合
しかつ同定するために、ある抗体が広範な人の腫瘍に対
して用いることを示すために、リンパ腫細胞系および肺
癌細胞系を選択した。３種の候補となる抗体、すなわち
８７７−８．８９８−９および８９９−４をこの限定さ
れたスクリーニング法により同定した。この方法の結果
を第１表に示す。
（以下余白） 第　　　１　　　表 〔データは、分あたりのカウント数（ＣＰＭ）で表しで
ある。高カウントは、抗体の結合を示す〕２４４−７　
　５．９３４　　　６．７？２　　３，４２６　　５．
５０９３６４−５　　　７６９　　　　６２２　　　６
５６　　１．０３６３７２−２　　１．５９２　　　　
４３７　　２，０２４　　１．８９６４４３−４　　１
．２１１　　　　９１９　　　５６０　　１．３３７６
５２−２　　６．０１９　　　１．３５５　　１１，６
９７　　９．１７６７８０−３　　　５５７　　　１．
０６３　　３，１６３　　１．２０５７８５−５　　　
７４６　　　　６４８　　１．２１１　　２．１９７８
４１−１９　　１．６４５　　　１．８５１　　３．４
７８　　２．５１７８５９−４　　　３２７　　　１．
５０４　　１．９７４　　３．６０４＄８７７−８　　
１．４８１　　　１．８３３　　１．６４１　　４，６
８０８９Ｌ５　　１，２４７　　　２，８３４　　２．
８５６　　５．９７３＄８９８−９　　３．４４２　　
　２，７２６　　２．３１７　　１３．９４２＄８９９
−４　　１，９８０　　　８．１９３　　２．２３２　
　３．５３４１４１５−１　　５．５５０　　　６．１
５８　　３．８２１　　６．３６３１７０２−５　　４
．７１１　　　１．７８６　　４．６９６　　２．６６
６（負の対照）　　　５５２　　　　５０７　　　３４
６　　　７３８第１表中のデータの重要性を理解するた
めには、［生存しているＪｌｎ　　ｖｉｖｏの培養物で
さえ、ｉｎ　　ｖｉｖｏにおける同様の細胞数に比べて
、比較的多数の壊死を起こしている細胞を含んでいるで
あろうことを認識することが重要である。従って、不溶
性細胞内抗原にのみ特異的である抗体を用いた場合でさ
え、［生存している」細胞培養物に対するい（らかの結
合を期待することができる。また、抗体がスクリーニン
グ法において用いた細胞系のいずれかの表面蛋白質また
は抗原に特異的でないかも知れないとしても、（＆ｌｌ
ｌｌ細球系のような）ある種の腫瘍細胞系が免疫グロブ
リンに対する活性された結合を示す表面成分を有するこ
とを認識すべきである。
動物実験を進めるに先立って、抗体を用いることを予定
している哺乳動物内のすべての細胞内で見られる不溶性
細胞内抗原に対して、該抗体が特異的であることを確認
するために、前述したスクリーニング法により同定され
た候補となる抗体を、正常な生存細胞および死細胞に対
してさらにスクリーニングする。また、抗体が可溶性の
細胞内抗原に結合しないことを確認するために、壊死を
起こしている細胞の上澄みに対して抗体をスクリーニン
グする。
実−」１−例−Ｊ− 正常なまたは悪性腫瘍の細胞の細胞表面に存在しない不
溶性細胞内抗原に対して特異的な抗体を、実施例２の方
法に従って同定する。
結果として得られる抗体接合物の大きさを小さくするた
めに、精製したモノクローナル抗体を３７℃で２０時間
ペプシンにより消化し、（Ｆａｂ’）ｚ断片を調製する
０次に、これらの（Ｆａｂ’）。
断片を、セファデックスＧ−１００（９０ｘ２゜５ｃｍ
）カラム・クロマトグラフィによりそのままの抗体およ
び蛋白質の凝集体から分離する。溶離された第１の蛋白
質のピークは、この抗体の（Ｆａｂ’）、成分を含んで
いる。
この抗体を、前述したニス、ミルズの方法によって１−
１３１でラベリングする。このコラ素化法を用いて、平
均で少なくとも１あるいはそれ以上の１−１３１の元素
を、モノクローナル抗体の各分子に接合する。
一般的な化学療法を、固体腫瘍で苦しんでいる患者に開
始する。適当な化学療法剤を静脈内に投惨する。２４時
間後、１０ｍ１Ｃｉのｌ−１３１によりラベリングした
１ｍｇのモノクローナル抗体を１０ｍ１の滅菌食塩水懸
濁液中に混ぜたものを静脈内に投与する。６時間後、こ
の患者をガンマ・カメラで映像化したところ、腫瘍位置
に放射性元素でラベリングされた抗体が強く局在化され
て結合していることを示す、使用に先立ち、同一条件下
で得た映像と比較すると、腫瘍映像の強度は、化学療法
による腫瘍細胞の死をもたらす程度の指標となる。さら
に、−次腫瘍の視覚化およびかなり大きな転移体の局在
化を可能とする。
化学療法の開始後４８時間後に、（（Ｆａｂ′）２断片
を用いた）不溶性細胞内抗原に対するクロルアンプシル
（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ　）−抗体接合体を静脈内
投与する。この抗体−薬品接合体は、腫瘍の細胞幻影に
対して局在化し、治療効果とともにｌｆｆ１ｌｌＪｌ；
の位置に化学療法アルキル化剤を与える。
特許出願人　　キャンサー・バイオロジクス・インコー
ホレーテッド １５、− （ほか２名）’、：ノ

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）悪性腫瘍細胞および正常細胞中には存在するが生
    存細胞の外部には存在しない不溶性細胞内抗原に対する
    モノクローナル抗体を得るステップを備え、前記抗体は
    壊死を起こしている組織に特異的であるが、生組織には
    特異的でなく、前記抗体を、アルファ発光放射性核種、
    ベータ発光放射性核種、放射線不透性材料、抗腫瘍剤、
    免疫療法剤または生物学的応答修飾体から選択した材料
    に接合するステップをさらに備える、抗体接合体の調製
    方法。
  2. （２）前記材料が抗腫瘍剤である、特許請求の範囲第１
    項記載の抗体接合体の調製方法。
  3. （３）前記材料が放射性核種である、特許請求の範囲第
    １項記載の抗体接合体の調製方法。
  4. （４）前記接合体を不溶性薬学的担体に結合するステッ
    プをさらに備える、特許請求の範囲第１項〜第３項のい
    ずれかに記載の抗体接合体の調製方法。
  5. （５）壊死を起こしている細胞および正常細胞内には存
    在するが、生細胞の外部には存在しない不溶性細胞内抗
    原に対するモノクローナル抗体であって、前記抗体が壊
    死を起こしている組織には特異的であるが、生存してい
    る組織には特異的でなく、前記抗体は、アルファ発光放
    射性核種、ベータ発光放射性核種、放射線不透性材料、
    抗腫瘍剤、免疫療法剤または生物学的応答修飾体から選
    択した材料に接合されている、モノクローナル抗体。
  6. （６）前記抗体が、放射性核種に接合されている、特許
    請求の範囲第５項記載のモノクローナル抗体。
  7. （７）前記抗体が、放射線不透性材料に接合されている
    、特許請求の範囲第５項記載のモノクローナル抗体。
  8. （８）前記抗体が、抗腫瘍剤、免疫療法剤または生物学
    的応答修飾体に接合されている、特許請求の範囲第５項
    記載のモノクローナル抗体。
  9. （９）注射可能な薬学的担体に組み合わされた、特許請
    求の範囲第５項〜第８項のいずれかに記載のモノクロー
    ナル抗体。
  10. （１０）その内部の悪性腫瘍細胞を殺すための治療を受
    けた哺乳動物において、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて悪性腫
    瘍組織を映像化するに際しての特許請求の範囲第６項ま
    たは第７項記載の抗体接合体の使用。
  11. （１１）その内部の悪性腫瘍細胞を殺すように仕向けら
    れた治療を受けた哺乳動物において、ｉｎ　ｖｉｖｏで
    壊死を起こしている組織を映像化するための薬品の調製
    に際しての特許請求の範囲第６項または第７項に記載の
    抗体接合体の使用。
  12. （１２）壊死を起こしている疾患を処理するに際しての
    特許請求の範囲第８項記載の抗体接合体の使用。
  13. （１３）哺乳動物において、ｉｎ　ｖｉｖｏで悪性腫瘍
    細胞を殺す治療法の効果を拡大するための薬品の調製に
    際しての特許請求の範囲第８項記載の抗体−抗腫瘍剤接
    合体の使用。
  14. （１４）前記抗腫瘍剤が、細胞毒性剤、毒物、生物学的
    応答修飾体、放射線感受性化合物、アルファ発光放射性
    核種、ベータ発光放射性核種および抗増殖剤の少なくと
    も一種を含む特許請求の範囲第１２項または第１３項記
    載の使用。
  15. （１５）特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかによ
    り作られた接合体。
  16. （１６）哺乳動物において、ｉｎ　ｖｉｖｏで悪性腫瘍
    細胞を殺すように仕向けられた治療法の有効性を測定す
    るための方法であって、 上記哺乳動物の正常細胞および悪性腫瘍細胞の双方の不
    溶性細胞内成分に対して特異的であるが、細胞外成分に
    対しては特異的でないモノクローナル抗体を得るステッ
    プを備え、前記モノクローナル抗体はラベリングされて
    おり、 前記ラベリングされた抗体を、ｉｎ　ｖｉｖｏで悪性腫
    瘍細胞を殺すための治療法を受けた哺乳動物の組織に接
    触させ、それによって前記抗体が、前記治療法により殺
    された細胞の前記不溶性細胞内成分に選択的に結合する
    ことを可能とするステップと、 前記ラベリングされた抗体の前記不溶性細胞内成分への
    結合を測定することにより前記治療法の有効性を決定す
    るステップとをさらに備える治療法の有効性を測定する
    ための方法。
  17. （１７）前記接触ステップがｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて
    起きる、特許請求の範囲第１６項記載の治療法の有効性
    の測定方法。
  18. （１８）前記接触ステップがｉｎ　ｖｉｖｏにおいて起
    きる、特許請求の範囲第１６項記載の治療法の有効性の
    測定方法。
  19. （１９）前記ラベルが放射性核種である、特許請求の範
    囲第１８項記載の治療法の有効性の測定方法。
  20. （２０）前記ラベルが放射線不透性材料である、特許請
    求の範囲第１８項記載の治療法の有効性の測定方法。
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